CN103834583B - 一种复合菌种混合发酵制备的降血脂酸马乳及其制备方法 - Google Patents
一种复合菌种混合发酵制备的降血脂酸马乳及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种复合菌种混合发酵制备酸马乳的方法及制备的酸马乳。利用自筛选马克思克鲁维酵母菌（<i>Kluyveromyces？marxianus</i>）WWMJ-1？CGMCC？No.8432基础上，联合乳酸乳球菌（<i>Lactococcus？lactis</i>）、干酪乳杆菌（<i>Lactobacillus？casei</i>）和红曲霉菌（<i>Monascus？ruber</i>）组成复合菌种混合发酵，将接种比例、发酵温度、发酵时间、糖添加量多个单因素试验对发酵酸马乳的影响，采用响应面法优化确定酸马乳的最佳制备工艺参数，制备的酸马乳具有显著的降血脂功效，不仅保留了马乳中丰富的营养，更赋予酸马乳的保健功能，具有广泛的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体的，本发明涉及一种采用微生物菌种混合发酵制备功能酸马乳的技术领域。
背景技术
马乳是新疆少数民族饮食文化中的瑰宝。马乳的营养价值很高，与其他畜类奶相比含有丰富的蛋白质、乳糖、维生素和矿物质，并含有人体不可缺少的氨基酸和脂肪酸。马乳中富含多种营养物质，易被人体吸收利用，特别适合婴幼儿和老弱病人饮用，且具有补虚强身、润燥美肤、清热止渴的作用。
酸马乳是新疆少数民族特色食品中的一种，深受大家的喜爱。马乳中富含多种营养物质，易被人体吸收利用，且具有补虚强身、润燥美肤、清热止渴的作用。临床常用来辅助治疗结核、肝损坏、坏血病、心脏病、高血压、高血脂能等疾病。酸马乳之所以具有良好的医疗保健功能，其一是因为新鲜马乳在微生物的发酵作用下产生了大量的生物活性物质；其二是因为马乳和酸马乳中不饱和脂肪酸含量较高，其中亚油酸和亚麻酸含量则更高，使得酸马乳具有降血脂等功能。据报道，现有成人高血脂症的患病率为每天仍以万人的速度递增，早期控制并及时治疗高脂血症迫在眉睫。目前，国内外未见采用多菌种复合发酵制备具备功能性酸马乳的报道，研究开发具有实用性的微生物菌种获得稳定的具有降血脂功能的酸马乳具有重要的意义。
发明内容
针对现有技术中未见有关利用复合菌种混合发酵制备降血脂酸马乳开发利用的现状，基于新疆地区各民族长期饮用酸马乳的地缘优势，充分利用产地的微生物群落资源，开发适用于降血脂酸马乳的复合微生物菌种制剂。本发明目的在于提供一种复合菌种混合发酵制备的降血脂酸马乳及其制备方法。
本发明的技术方案：通过以新疆产新鲜马乳为原料，利用自筛选马克思克鲁维酵母菌基础上，联合干酪乳杆菌、乳酸乳球菌和红曲霉菌组成复合菌种混合发酵，将接种比例、发酵温度、发酵时间、糖添加量多个单因素试验对发酵酸马乳的影响，在单因素试验的基础上，应用Box-Behnken试验，采用响应面法优化确定酸马乳的最佳制备工艺参数，确定提供一种复合菌种混合发酵制备酸马乳的方法及制备的酸马乳，制备的酸马乳具有降血脂功效，具有广泛的实用性和开发价值，为充分开发利用马乳资源具有重要的现实开发价值。
具体的，本发明提供了一种制备酸马乳的马克思克鲁维酵母菌（Kluyveromycesmarxianus）WWMJ-1。
本发明选用的马克思克鲁维酵母菌（Kluyveromycesmarxianus）WWMJ-1，根据新疆的地理环境的特殊性，通过从新疆乌鲁木齐南山地区哈萨克族牧民家采集的自制传统发酵酸马乳中取样，筛选出一批生长良好的微生物菌株，从酸马乳中进行微生物菌种的培养、分离与筛选，从中优选出一株编号为WWMJ-1的菌株，菌种经培养后菌落呈边缘整齐、表面光滑、乳白色或奶油色，凸起的圆形，细胞呈椭圆或卵圆形，无性繁殖均为芽殖，有时有假菌丝，无子囊孢子和掷孢子；该细菌发酵半乳糖，有时缓慢，不发酵蔗糖及麦芽糖，不发酵蜜二糖，同化蔗糖，氮源同化(NH4)2SO4、KNO3；醇类同化乙醇和山梨醇。水解尿素、明胶液化、硝酸盐还原、类淀粉物质的生成试验均为阴性，能够在15℃生长，具有接种后生长稳定,延迟期短,适应快。经微生物学分类与鉴定为马克思克鲁维酵母菌(Kluyveromycesmarxianus)。
本发明采用的菌种编号为WWMJ-1的马克思克鲁维酵母菌（Kluyveromycesmarxianus），该细菌经YPD培养基分离培养，挑取疑似酵母菌菌落进行显微镜观察，将其初步界定酵母菌菌株；该菌株在YPD培养基平板上划线培养24-48h，能形成菌落呈边缘整齐、表面光滑、乳白色或奶油色，凸起的圆形，细胞呈椭圆或卵圆形，无性繁殖均为芽殖，有时有假菌丝，无子囊孢子和掷孢子；该菌株培养条件：培养温度20-30℃，最适培养温度28℃；优先生长于YPD培养基表面，YPD培养基组分酵母膏10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，葡萄糖20.0g/L，蒸馏水1.0L，YPD固体培养基加琼脂20.0g/L；菌株在YPD固体培养基上菌落直径大小为0.5-3mm，正面呈圆形，侧面凸起；边缘整齐、表面光滑；菌落不透明，呈乳白色或奶油色。该菌种的发酵工艺：在无菌条件下，挑取该菌株，28℃，135r/min培养24-48h。
参照《伯杰氏系统细菌学鉴定手册》（《Bergey,sManualofSystematicBacterio-logy》）第九版和《常用细菌系统鉴定手册》等对马克思克鲁维酵母菌（Kluyveromycesmarxianus）菌株进行形态学测定、生理生化检测，结合该菌种的菌落形态、生理生化特性，以及5.8SrDNA同源分析、系统发育分析结果，确定菌种编号为WWMJ-1菌株为马克思克鲁维酵母菌（Kluyveromycesmarxianus），该菌种于申请日前已保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101,保藏日期是2013年11月5日，保藏号是CGMCCNo.8432。经上述微生物学综合鉴定归属为马克思克鲁维酵母菌（Kluyveromycesmarxianus）。
本发明选用外购菌种。
本发明外购一株乳酸乳球菌（Lactococcuslactis），该菌株具有产酸能力强，发酵周期短的特点。该菌株培养条件：培养温度30-40℃，最适培养温度37℃；h优先生长于MRS培养基,培养基表面；MRS培养基组分牛肉膏10.0g/L，酵母膏5.0g/L，葡萄糖20.0g/L，乙酸钠5.0g/L，柠檬酸氢二胺2.0g/L，吐温-801.0ml/L，磷酸氢二钾2.0g/L，七水硫酸镁0.2g/L，七水硫酸锰0.05g/L，蒸馏水1.0L，MRS固体培养基加琼脂20.0g/L。本发明提供了乳酸乳球菌（Lactococcuslactis）的发酵工艺：在无菌条件下，挑取该菌株，37℃，135r/min培养18-24h。
本发明外购一株干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei），该菌株具有产酸能力强，发酵周期短的特点。该菌株培养条件:培养温度30-40℃，最适培养温度37℃；优先生长于MRS培养基,培养基表面；MRS培养基组分牛肉膏10.0g/L，酵母膏5.0g/L，葡萄糖20.0g/L，乙酸钠5.0g/L，柠檬酸氢二胺2.0g/L，吐温-801.0ml/L，磷酸氢二钾2.0g/L，七水硫酸镁0.2g/L，七水硫酸锰0.05g/L，蒸馏水1.0L，MRS固体培养基加琼脂20.0g/L。本发明提供了干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei）的发酵工艺：在无菌条件下，挑取该菌株，37℃，135r/min培养18-24h。
红曲霉属常见腐生真菌，能产生许多如红曲色素、洛伐他汀（MonacolinK，后文使用缩写M.K）、桔霉素(桔青霉素)等活性成分次级代谢产物。红曲中的M.K是医学界公认的能够降低人体胆固醇的理想药剂，具有高效、安全、低毒的特点。而红曲霉中有一种霉菌毒素--桔霉素已经成为我国红曲及相关产品出口的瓶颈。
本发明选用外购一株红曲霉菌（Monascusruber），该菌株具有产M.K能力高，桔霉素产量低的特点。该菌株培养条件：培养温度28-35℃，最适培养温度30℃；优先生长于麦芽汁培养基,培养基表面；麦芽汁培养基组分麦芽浸粉130g/L、氯霉素0.1g/L，蒸馏水1.0L，麦芽汁固体培养基加琼脂20.0g/L。本发明提供了红曲霉菌（Monascusruber）的发酵工艺：在无菌条件下，挑取该菌株，30℃，135r/min培养48-72h。
同时，本发明提供一种采用如上提供的菌种混合发酵制备酸马乳的方法，具体制备方法步骤如下。
（1）马乳预处理：将新鲜马乳通过过滤除去马乳中的杂质和异物，再将马乳预热到60-65℃，在20MPa条件下均质10-15min，均质后将马乳巴氏杀菌，待发酵用；母发酵液、发酵液1、发酵液2需要预处理好的马乳用量按体积比为3:20:20。
（2）种子发酵液及母发酵液的制备。
种子发酵液：将4℃下保存的乳酸乳球菌（Lactococcuslactis）、干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei）、马克思克鲁维酵母菌（Kluyveromycesmarxianus）WWMJ-1CGMCCNo.8432和红曲霉菌（Monascusruber）菌种在无菌环境下接种，分别将乳酸乳球菌（Lactococcuslactis）和干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei）接种于MRS培养基置于37℃培养18-24h，将马克思克鲁维酵母菌（Kluyveromycesmarxianus）WWMJ-1CGMCCNo.8432接种于YPD培养基置于28℃培养24-48h，将红曲霉菌（Monascusruber）接种于麦芽汁培养基置于30℃培养48-72h活化，备用。
母发酵液：将步骤（1）预处理好的母发酵液选用马乳用量按体积比分为3:3:10:14分装于发酵容器中，在无菌条件下，将上述已活化好的乳酸乳球菌（Lactococcuslactis）、干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei）、马克思克鲁维酵母菌（Kluyveromycesmarxianus）WWMJ-1CGMCCNo.8432和红曲霉菌（Monascusruber）种子发酵液按照体积比计5%接种量分别接入相应的四个发酵容器中，分别置于37℃培养18-24h、28℃培养24-48h和30℃培养48-72h，备用。
(3)发酵液的制备：发酵液由发酵液1和发酵液2组成。
发酵液1的制备：将步骤（2）制备的乳酸乳球菌、干酪乳杆菌、马克思克鲁维酵母菌发酵液用量按照体积比计（1.4-1.5）：（1.4-1.5）：（5-5.2）接种于步骤（1）预处理好选用发酵液1用量的马乳中，在糖添加量为4-4.5g/100mL，发酵温度32-33℃、发酵时间为50-55h条件下发酵得到发酵液1。
发酵液2的制备：将步骤（2）制备的红曲霉母发酵液按照体积比计7-7.5%接种于步骤（1）预处理好选用发酵液2用量的马乳中，在糖添加量为5g/100ml，发酵温度28-29℃、发酵时间7-8d条件下发酵得到发酵液2。
（4）混合发酵液：将步骤（3）制备的发酵液1和发酵液2按照体积比计1:1的比例混合，进行巴氏杀菌后进行无菌灌装，在4℃下保存。
进一步，本发明提供一种采用如上提供的复合菌种混合发酵制备酸马乳的方法，具体制备方法步骤如下。
（1）马乳预处理：将新鲜马乳通过过滤除去马乳中的杂质和异物，再将马乳预热到65℃，在20MPa条件下均质10min，均质后将马乳巴氏杀菌，待发酵用；母发酵液、发酵液1、发酵液2需要预处理好的马乳用量按体积比为3:20:20。
（2）种子发酵液及母发酵液的制备：
种子发酵液：将4℃下保存的乳酸乳球菌（Lactococcuslactis）、干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei）、马克思克鲁维酵母菌菌（Kluyveromycesmarxianus）WWMJ-1CGMCCNo.8432和红曲霉菌（Monascusruber）菌种在无菌环境下接种，分别将乳酸乳球菌（Lactococcuslactis）和干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei）接种于MRS培养基置于37℃培养24h，将马克思克鲁维酵母菌（Kluyveromycesmarxianus）WWMJ-1CGMCCNo.8432接种于YPD培养基置于28℃培养48h，将红曲霉菌（Monascusruber）接种于麦芽汁培养基置于30℃培养48h活化，备用。
母发酵液：将步骤（1）预处理好的选用母发酵液用量的马乳按体积比分为3:3:10:14分装于发酵容器中，在无菌条件下，将上述已活化好的乳酸乳球菌（Lactococcuslactis）、干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei）、马克思克鲁维酵母菌（Kluyveromycesmarxianus）WWMJ-1CGMCCNo.8432和红曲霉菌（Monascusruber）种子发酵液用量按照体积比计5%接种量接入发酵容器中，分别置于37℃培养24h、28℃培养48h和30℃培养48h，备用。
(3)发酵液的制备：发酵液由发酵液1和发酵液2组成。
发酵液1的制备：将步骤（2）制备的乳酸乳球菌、干酪乳杆菌、马克思克鲁维酵母菌发酵液按照体积比计1.5：1.5：5接种于步骤（1）预处理好选用发酵液1用量的马乳中，在糖添加量为4g/100mL，发酵温度33℃、发酵时间为53h条件下发酵得到发酵液1。
发酵液2的制备：将步骤（2）制备的红曲霉母发酵液按照体积比计7%接种于步骤（1）预处理好选用发酵液2用量的马乳中，在糖添加量为5g/100ml，发酵温度29℃、发酵时间7d条件下发酵得到发酵液2。
（4）混合发酵液：将步骤（3）制备的发酵液1和发酵液2按照体积比计1:1的比例混合，进行巴氏杀菌后进行无菌灌装，在4℃下保存。
本发明提供采用上述确定的发酵工艺方法制备的酸马乳，制备的酸马乳具备特有产品典型性，其质量特征如下。
（1）感官指标：色泽：微黄色；香气：具有酸马乳固有的奶味香，酸味适中；滋味：口感微涩；体态：乳浊液容许少许沉淀。
（2）理化指标：总酸：150～160°T，还原糖含量≤6g/L，M.K含量为2.947μg/mL，桔霉素含量未检出。
（3）微生物指标：菌落总数(cfu/mL)≤100；大肠菌群(MPN/100mL)≤3；致病菌：未检出。
通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下技术效果。
（1）本发明提供的用于发酵制备酸马乳的马克思克鲁维酵母菌（Kluyveromycesmarxianus）WWMJ-1CGMCCNo.8432，该菌株发酵能力强、热稳定性好，产香能力强，产生抗生素，且具有抑菌性；在发酵过程中产生主要是二氧化碳和酒精，使其富有更加独特的滋味和气味。
（2）本发明提供了采用特定发酵工艺方法制备酸马乳，本发明通过筛选获得的马克思克鲁维酵母菌（Kluyveromycesmarxianus）WWMJ-1CGMCCNo.8432基础上，联合乳酸乳球菌（Lactococcuslactis）、干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei）、和红曲霉菌（Monascusruber）组成复合菌种混合发酵，将接种比例、发酵温度、发酵时间、糖添加量多个单因素试验对发酵酸马乳的影响，在单因素试验的基础上，利用Box-Behnken试验设计，采用响应面法优化确定酸马乳的最佳制备工艺参数，制备的酸马乳具备特有产品典型性，且具有显著的降血脂功效，不仅保留了马乳中丰富的营养赋予酸马乳的保健功能，具有广泛的实用性和开发价值。
附图说明
图1显示为采用复合菌种混合发酵制备降血脂酸马乳的工艺流程图。
图2显示为保藏菌株马克思克鲁维酵母菌的菌落形态图。
图3显示为干马克思克鲁维酵母菌保藏菌株的系统进化发育树图。
图4酸马乳发酵接种比例与发酵温度交互作用的响应面图。
图5酸马乳发酵发酵温度与发酵时间交互作用的响应面图。
图6酸马乳发酵糖添加量与发酵温度交互作用的响应面图。
图7显示为不同红曲霉接种量对马乳的影响图。
图8显示为不同发酵温度对马乳的影响图。
图9显示为不同发酵时间对马乳的影响图。
图10接种量和发酵温度交互作用对M.K含量影响的响应面图。
图11接种量和发酵时间交互作用对M.K含量影响的响应面图。
图12发酵时间和发酵温度交互作用对M.K含量影响的响应面图。
具体实施方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。
采用的主要的试剂：MRS培养基；YPD培养基；麦芽汁培养基；洛伐他汀标准品（纯度99.8%，规格25mg）、桔霉素标准品（纯度99.9%，规格10mg）sigma公司；乙腈（色谱纯）FisherChemicals公司；甲醇、95%乙醇、磷酸均为分析纯；阳性对照药品血脂康胶囊，北京北大维信生物科技有限公司产品；胆固醇、猪胆盐，北京奥博星生物技术有限责任公司产品；甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-C)试剂盒及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)试剂盒，均为南京建成生物工程研究所产品；试验动物选用普遍的昆明种小鼠购自新疆医科大学动物实验中心。
本发明中选用的所有原辅材料、试剂和仪器、设备都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
实施例一：马克思克鲁维酵母菌（Kluyveromycesmarxianus）WWMJ-1CGMCCNo.8432的筛选、分离纯化和鉴定
初筛:取传统发酵酸马乳1mL放入装有9mL无菌生理盐水的试管中，在旋涡混合器上充分混合均匀。将发酵酸马乳以10倍级进行稀释，稀释度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。用移液器吸取上述稀释度样液各1mL，采用倾注法倒入YPD培养基，平板置于28℃培养箱中培养24-48h。观察并记录菌落特征并挑取疑似酵母菌菌落，并对疑似的菌种进行编号。
菌种的纯化:将疑似菌株再接种于YPD琼脂培养基，于28℃培养箱恒温培养24-48h，重复3-4次纯化酵母菌。纯化后的酵母菌菌株接种于YPD斜面，28℃培养箱恒温培养24-48h后，4℃保存备用。
根据新疆的地理特殊性，从新疆乌鲁木齐南山地区哈萨克族自制传统发酵酸马乳中进行微生物菌种的培养、分离与筛选，获得一批细菌，从中分离筛选出编号为CGMCCNo.8432的马克思克鲁维酵母菌(Kluyveromycesmarxianus)，其能够产乙醇。参照《伯杰氏系统细菌学鉴定手册》（《Bergey,sManualofSystematicBacterio-logy》）第九版和《常用细菌系统鉴定手册》等对马克思克鲁维酵母菌进行形态学测定，生理生化检测，确定编号为WWMJ-1的马克思克鲁维酵母菌(Kluyveromycesmarxianus)菌株为马克思克鲁维酵母菌(Kluyveromycesmarxianus)中的成员。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101,保藏日期是2013年11月5日，保藏号是CGMCCNo.8432。
菌株编号为WWMJ-1的培养条件：培养温度20-30℃，最适培养温度28℃；优先生长于YPD培养基表面，YPD培养基组分采用酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，固体培养基加入20g/L琼脂。菌株在固体培养基上菌落直径大小为0.5-3mm，正面呈圆形，侧面凸起；边缘整齐；菌落不透明，呈乳白色或奶油色。见附图2。
菌株马克思克鲁维酵母菌（Kluyveromycesmarxianus）WWMJ-1CGMCCNo.8432的鉴定。
（1）生理生化鉴定：该菌种经YPD培养基分离培养，挑取疑似酵母菌菌落进行显微镜观察，将其初步界定酵母菌菌株；该菌株在YPD培养基平板上划线培养24-48h，能形成菌落呈边缘整齐、表面光滑乳白色或奶油色，凸起的圆形，细胞呈椭圆或卵圆形，参见附图2。该细菌发酵半乳糖，有时缓慢，不发酵蔗糖及麦芽糖，不发酵蜜二糖，同化蔗糖，氮源同化(NH4)2SO4、KNO3；醇类同化乙醇和山梨醇。水解尿素、明胶液化、硝酸盐还原、类淀粉物质的生成试验均为阴性，能够在15℃生长，经5.8SrDNA同源分析、系统发育分析结果都表明，编号为WWMJ-1的菌株经生理生化鉴定鉴定为马克思克鲁维酵母菌(Kluyveromycesmarxianus)。
（2）5.8SrDNA序列比对及系统发育分析：将测序得到的5.8SrDNA序列与GenBank数据库中的核苷酸序列进行BLAST分析，从中获取相近的5.8SrDNA序列，用DNAstar构建系统进化树，结果参见附图3所示。菌株WWMJ-1隶属于马克思克鲁维酵母菌(Kluyveromycesmarxianus)，与Kluyveromycesmarxianus亲源关系最近，同源相似性达99%，但从基因序列菌株属性分析存在明显差异，确定菌株WWMJ-1为马克思克鲁维酵母菌，结合上述提供的菌种编号为WWMJ-1的菌落形态、生理生化特性，生物学分类名称为马克思克鲁维酵母菌(Kluyveromycesmarxianus)。菌株WWMJ-1的具体序列参见附后的序列表。
实施例二：培养基的选用
MRS培养基：葡萄糖20g，蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，柠檬酸二胺2g，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，吐温-801mL，蒸馏水1000mL。
YPD培养基：酵母膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL。
麦芽汁培养基：麦芽浸粉130g、氯霉素0.1g，蒸馏水1000mL。
上述各培养基的固体培养基采用相应添加琼脂20.0g/L。
马克思克鲁维酵母菌（Kluyveromycesmarxianus）WWMJ-1CGMCCNo.8432的生理生化试验培养基：硝酸盐还原培养基：牛膏3g，蛋白胨5g，硝酸钾1g，蒸馏水1000mL，将各成分溶于蒸馏水中，调pH至7.2-7.4,分装试管，每管约5mL，121℃灭菌15min；)产酸培养基:葡萄糖5g，灭菌的CaCO30.5g，酵母浸出液100mL，琼脂2g，灭菌121℃，20min；产酯培养基:葡萄糖5g，10%豆芽汁100ml，分装于50ml三角瓶中，每瓶20ml，灭菌121℃，20min；无维生素基础培养基:硫酸铵5g，葡萄糖10g，组氨酸盐酸盐10mg，甲硫氨酸20mg，色氨酸20mg，硼酸500mg，硫酸铜40mg，碘化钾100mg，三氯化铁200mg，硫酸锰400mg，钼酸钠200mg，硫酸锌400mg，磷酸二氢钾0.85g，磷酸氢二钾0.15g，硫酸镁0.5g，氯化钠0.1g，氯化钙0.1g，蒸馏水1000mL；碳源同化基础培养基：(NH4)2SO45g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O5g，CaCl2·2H2O0.1g，NaCl0.1g，糖或其他碳源5g，酵母膏0.2g，蒸馏水1000mL；氮源同化基础培养基：葡萄糖20g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O5g，酵母膏0.2g，蒸馏水1000mL；尿素水解基础培养基:蛋白胨1g，氯化钠5g，葡萄糖1g，磷酸二氢钾2g，0.4%酚红溶液3mL，20%尿素溶液100mL，蒸馏水1000mL；糖发酵培养基:牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，所试糖、苷或醇5g，1.6%溴甲酚紫酒精溶液1mL，蒸馏水1000mL，加热溶解各成分于蒸馏水中，调pH值至7.4，加入指示剂混匀，分装于装有倒置小玻管的小试管内，121℃灭菌15min。
实施例三：复合菌种混合发酵制备酸马乳
参见附图1，采用自筛选的马克思克鲁维酵母菌（Kluyveromycesmarxianus）WWMJ-1和选用的干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei）、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)和红曲霉菌(Monascusruber)组成的复合菌种发酵制备酸马乳的方法，具体制备方法步骤如下。
（1）马乳预处理：将新鲜马乳通过过滤除去马乳中的杂质和异物，再将马乳预热到60-65℃，在20MPa条件下均质10-15min，均质后将马乳巴氏杀菌，待发酵用；母发酵液、发酵液1、发酵液2需要预处理好的马乳用量按体积比为3:20:20。
（2）种子发酵液及母发酵液的制备。
种子发酵液：将4℃下保存的乳酸乳球菌（Lactococcuslactis）、干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei）、马克思克鲁维酵母菌（Kluyveromycesmarxianus）WWMJ-1CGMCCNo.8432和红曲霉菌（Monascusruber）菌种在无菌环境下接种，分别将乳酸乳球菌（Lactococcuslactis）和干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei）接种于MRS培养基置于37℃培养18-24h，将马克思克鲁维酵母菌（Kluyveromycesmarxianus）WWMJ-1CGMCCNo.8432接种于YPD培养基置于28℃培养24-48h，将红曲霉菌（Monascusruber）接种于麦芽汁培养基置于30℃培养48-72h活化，备用。
母发酵液：将步骤（1）预处理好的母发酵液选用马乳用量按体积比分为3:3:10:14分装于发酵容器中，在无菌条件下，将上述已活化好的乳酸乳球菌（Lactococcuslactis）、干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei）、马克思克鲁维酵母菌（Kluyveromycesmarxianus）WWMJ-1CGMCCNo.8432和红曲霉菌（Monascusruber）种子发酵液按照体积比计5%接种量分别接入相应的四个发酵容器中，分别置于37℃培养18-24h、28℃培养24-48h和30℃培养48-72h，备用。
(3)发酵液的制备：发酵液由发酵液1和发酵液2组成。
发酵液1的制备：将步骤（2）制备的乳酸乳球菌、干酪乳杆菌、马克思克鲁维酵母菌发酵液用量按照体积比计（1.4-1.5）：（1.4-1.5）：（5-5.2）接种于步骤（1）预处理好选用发酵液1用量的马乳中，在糖添加量为4-4.5g/100mL，发酵温度32-33℃、发酵时间为50-55h条件下发酵得到发酵液1。
发酵液2的制备：将步骤（2）制备的红曲霉母发酵液按照体积比计7-7.5%接种于步骤（1）预处理好选用发酵液2用量的马乳中，在糖添加量为5g/100ml，发酵温度28-29℃、发酵时间7-8d条件下发酵得到发酵液2。
（4）混合发酵液：将步骤（3）制备的发酵液1和发酵液2按照体积比计1:1的比例混合，进行巴氏杀菌后进行无菌灌装，在4℃下保存。
采用上述确定的发酵工艺方法制备的酸马乳，制备的酸马乳具备特有产品典型性，其质量特征：感官指标：色泽：微黄色；香气：具有酸马乳固有的奶味香，酸味适中；滋味：口感微涩；体态：乳浊液容许少许沉淀；理化指标：总酸：150～160°T，还原糖含量≤6g/L，M.K含量为2.947μg/mL，桔霉素含量未检出；微生物指标：菌落总数(cfu/mL)≤100；大肠菌群(MPN/100mL)≤3；致病菌：未检出。
实施例四：复合菌种混合发酵制备酸马乳
参见附图1，采用自筛选的马克思克鲁维酵母菌（Kluyveromycesmarxianus）WWMJ-1和选用的干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei）、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)和红曲霉菌(Monascusruber)组成的复合菌种发酵制备酸马乳的方法，具体制备方法步骤如下。
（1）马乳预处理：将新鲜马乳通过过滤除去马乳中的杂质和异物，再将马乳预热到65℃，在20MPa条件下均质10min，均质后将马乳巴氏杀菌，待发酵用；母发酵液、发酵液1、发酵液2需要预处理好的马乳用量按体积比为3:20:20。
（2）种子发酵液及母发酵液的制备。
种子发酵液：将4℃下保存的乳酸乳球菌（Lactococcuslactis）、干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei）、马克思克鲁维酵母菌菌（Kluyveromycesmarxianus）WWMJ-1CGMCCNo.8432和红曲霉菌（Monascusruber）菌种在无菌环境下接种，分别将乳酸乳球菌（Lactococcuslactis）和干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei）接种于MRS培养基置于37℃培养24h，将马克思克鲁维酵母菌（Kluyveromycesmarxianus）WWMJ-1CGMCCNo.8432接种于YPD培养基置于28℃培养48h，将红曲霉菌（Monascusruber）接种于麦芽汁培养基置于30℃培养48h活化，备用。
母发酵液：将步骤（1）预处理好的选用母发酵液用量的马乳按体积比分为3:3:10:14分装于发酵容器中，在无菌条件下，将上述已活化好的乳酸乳球菌（Lactococcuslactis）、干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei）、马克思克鲁维酵母菌（Kluyveromycesmarxianus）WWMJ-1CGMCCNo.8432和红曲霉菌（Monascusruber）种子发酵液用量按照体积比计5%接种量接入发酵容器中，分别置于37℃培养24h、28℃培养48h和30℃培养48h，备用。
(3)发酵液的制备：发酵液由发酵液1和发酵液2组成。
发酵液1的制备：将步骤（2）制备的乳酸乳球菌、干酪乳杆菌、马克思克鲁维酵母菌发酵液按照体积比计1.5：1.5：5接种于步骤（1）预处理好选用发酵液1用量的马乳中，在糖添加量为4g/100mL，发酵温度33℃、发酵时间为53h条件下发酵得到发酵液1。
发酵液2的制备：将步骤（2）制备的红曲霉母发酵液按照体积比计7%接种于步骤（1）预处理好选用发酵液2用量的马乳中，在糖添加量为5g/100ml，发酵温度29℃、发酵时间7d条件下发酵得到发酵液2。
（4）混合发酵液：将步骤（3）制备的发酵液1和发酵液2按照体积比计1:1的比例混合，进行巴氏杀菌后进行无菌灌装，在4℃下保存。
实施例五：降血脂酸马乳发酵试验设计
1.乳酸菌、酵母菌混合发酵试验设计：单因素试验设计
通过初步筛选，试用不同的乳酸菌，确定选用的两种乳酸菌，即干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei）、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)和红曲霉菌(Monascusruber)和自筛选的马克思克鲁维酵母菌（Kluyveromycesmarxianus）WWMJ-1作为制备酸马乳的菌种。
通过接种量为乳酸球菌%：乳酸杆菌%：酵母菌%=1:1:6、1.5:1.5:5、2:2:4、2.5:2.5:3、3:3:2，发酵温度为26、28、30、32和34℃，发酵时间为1、2、3、4和5d及糖添加量2、4、6、8和10g/100mL，接种比例、发酵温度、发酵时间和糖的添加量四个单因素对发酵马乳品质的影响，选择较为显著的影响因素，筛选响应面试验设计可取的因素。
（1）不同接种比例对发酵液的影响：表1不同接种比例对发酵液的影响
发酵剂中乳酸菌和酵母菌的比例对发酵液的影响较明显。将不同接种比例的发酵剂接种到马乳中，30℃发酵48h后，发酵液酸度变化如表1所示，当乳酸球菌%：乳酸杆菌%：酵母菌%=1.5:1.5:5时，发酵液的酸度较高，酒精度和总糖含量适中，当发酵液中乳酸菌的含量过高，反而会对自身生长产生抑制作用酸度呈下降趋势，所以选取1:1:6、1.5:1.5:5、2:2:4这3个水平进行发酵响应面试验。
（2）不同发酵温度对发酵液的影响
表2不同发酵温度对发酵液的影响
发酵液的各项检测指标随发酵温度变化而变化，如表2所示，发酵液的酸度在一定温度范围内呈先上升后下降的趋势，当温度较低时，乳酸菌生长缓慢，产酸较低，但是温度过高，会造成菌体老化；酵母菌的繁殖受到影响，乳酸菌和酵母菌之间的协同作用降低。温度为32℃时，酸度最高为114°T，酒精度较高，总糖含量较低，感官评价分数也最高；因此确定发酵的最适温度为32℃由此确定响应曲面试验设计中发酵温度的3个水平分别为30、32、34℃。
（3）不同发酵时间对发酵液的影响：表3不同发酵时间对发酵液的影响
由表3可知，发酵液的酸度在第2天出现拐点，酸度逐渐下降；酒精度随着发酵时间的延长而呈现不断升高的趋势，这可能是因为发酵液中的酵母菌充分生长，酒精的积累量逐渐升高；随着发酵时间的增加，微生物更充分的利用营养物质，使得总糖含量逐渐降低，感官评价分数也随之降低，发酵第96-120h时，马乳发酵液发苦，风味较差；综上所述，选取发酵时间为24、48、72h做为响应面试验设计3个水平。
（4）不同糖添加量对发酵液的影响：表4不同糖添加量对发酵液的影响
如表4所示，发酵液的酸度、酒精度均比之前单因素值高，其原因是乳酸菌、酵母菌对发酵液中所含碳水化合物的利用率增加所产生的结果。在糖添加量为4g/100ml时，酸度最高值为142°T，酒精度和总糖度为2.6%vol、3.8Bx，感官分数最高为82分。选取不同糖添加量为2、4、6g/100ml做为响应面试验设计3个水平。
实施例六：降血脂酸马乳发酵试验设计
2.响应面试验设计：在实施例五提供单因素试验基础上，选择影响因素较为明显的四个因素展开响应面试验设计，以发酵酸马乳感官评定指标为应变量(Y)，分别选取接种比例(A)、发酵温度(B)、发酵时间（C）、糖添加量(D)为影响因素，设计响应面分析试验，见表5。
表5响应面分析试验因素编码及水平表
2.乳酸菌、酵母菌混合发酵响应面试验
综合单因素试验结果，选取适合的接种比例、发酵温度、发酵时间、糖添加量响应因素，采用Box-BehnkenDesign响应面分析法对其进行优化。响应面试验设计及响应值结果见表6。
按照表6试验数据进行多元回归方程拟合，可建立以发酵液酸度对接种比例(A)、发酵温度(B)、发酵时间(C)、糖添加量（D）的拟合方程为：
Y=150.40-2.92A-3.67B+2.83C+3.92D+15.25AB-0.50AC+5.00AD-4.50BC-6.75BD-3.5CD-10.58A2-22.20B2-7.20C2-7.32D2
表6响应面试验及响应值
表7响应面试验结果及方差分析
注：“*”表示显著（0.01＜p＜0.05）；“**”表示极显著（p＜0.01）
由表7可知，当模型F=25.80时，P＜0.0001，说明模型是极显著的。当失拟项F=1.18时，P=0.4751＞0.05，说明模型失拟项不显著。决定系数R2=0.9627，校正系数R2 Adj=0.9254，表明总酸度的实测值与预测值之间具有较好的拟合度，由此可以说明模型的建立呈显著性，可以利用此模型对发酵过程进行分析和预测。模型一次项与二次项均对发酵液的Y值影响表现出显著水平，交互项AB、AD、BC、BD对发酵液Y值的影响表现为显著水平。
为了考察各个交互项对发酵液酸度的影响，在其他因素固定不变的情况下，利用Design-Expert8.06软件对回归方程进行运算，作出交互项的三维响应面图，能比较直观的解释各个变量和变量之间对响应值的影响。
参见附图4至附图6，由附图4可知，接种比例与发酵温度两个因素之间的交互作用较显著，酸度随着接菌量在一定范围内的增大而升高，发酵温度对发酵产酸量的影响也较大；由附图5可知，发酵温度与发酵时间两个因素之间的交互作用较显著，当发酵时间固定在零水平时，酸度随着温度的升高而增加，达到最大值后开始降低。从附图6可看出，糖添加量与发酵温度两个因素之间的交互作用较显著，等高线趋近于椭圆形。
通过Design-Expert8.06软件，根据所建立的数学模型进行参数的最优化分析，可得出酸马乳发酵液的最佳工艺参数为：接种比例为1.4:1.4:5.2、发酵温度32.77℃、发酵时间为53.28h糖添加量为4.47g/100ml，在此条件下酸度可达151.95°T。同时考虑到实际操作的便利，将最佳条件修正为接种比例为1.4:1.4:5.2-1.5:1.5:5、发酵温度32-33℃、发酵时间为32-33h糖添加量为4-4.5g/100ml，经过3次重复实验，实际得到的酸马乳发酵液平均酸度为149°T，与理论预测值接近，说明该方程与实际情况拟合良好，响应面分析所得到的优化模型是可靠的。
实施例七：红曲霉发酵优化试验设计
单因素试验设计：通过红曲霉菌接种量（4、6、8、10和12%）、发酵温度（22、26、30、34和38℃）及发酵时间（5、6、7、8、9和10d），三个单因素对发酵马乳品质的影响，筛选响应面试验设计可取的因素。
1.1不同接种量对马乳的影响：各发酵液中M.K、桔霉素含量参见附图7所示，不同红曲霉接种量对M.K含量的影响较明显，30℃发酵6天，红曲霉接种量为8%时出现拐点，M.K含量最高含量为1.628μg/mL，当接菌量增加到8%以上时发酵液中M.K含量呈下降趋势；而红曲霉接种量在4%-12%、30℃发酵6天，发酵液中桔霉素含量均未被检出，低于定量限（桔霉素定量限为50μg/L），所以选取接种量为6、8和10%这3个水平进行响应曲面试验。
1.2不同发酵温度对马乳的影响：由附图8可以看出，发酵液中M.K的含量随着发酵温度的升高呈现先增高后降低的趋势，发酵温度为28℃时，M.K含量达到最高位2.902μg/mL；随着发酵温度继续升高，红曲霉产生M.K的能力有所降低；而红曲霉发酵温度在24℃-32℃、接种量为8%、发酵6天，各发酵液中均未被检出桔霉素，低于定量限。因此确定响应面试验设计中发酵温度的3个水平分别为26、28和30℃。
1.3不同发酵时间对马乳的影响：由附图9可知，M.K的产量随培养时间的延长而增加，当接种量为8%，28℃培养，随着发酵时间的延长，在发酵第5-7天M.K含量逐渐升高呈快速增加的趋势，在第7-10天M.K含量基本保持不变，而从第5-10天发酵液中均未检出桔霉素含量，说明发酵液中桔霉素含量低于定量限。确定响应面试验设计中发酵时间的3个水平分别为6、7和8d。
响应面试验设计：在单因素试验基础上，选择影响因素较为明显的四个因素展开响应面试验设计，以发酵酸马乳感官评定指标为应变量(Y)，分别选取红曲霉接种量(A)、发酵温度(B)、发酵时间（C）为影响因素，设计响应面分析试验，见表8。
表8响应面分析试验因素编码及水平表
红曲霉发酵响应面试验：综合单因素试验结果，将接菌量、发酵温度、发酵时间进行3因素3水平，以发酵液中M.K含量为评价指标，采用Box-Behnken响应面分析法对其进行优化。响应面试验设计及响应值见表9。
表9响应面试验及响应值
按照表9试验数据，可建立以发酵液M.K含量对接菌量(A)、发酵温度(B)、发酵时间(C)的三个响应因子的二次多项式的回归方程：
Y=2.81-0.20A+0.11B+0.19C-0.18AB-0.24AC+0.18BC-0.40A2-0.15B2-0.35C2
采用Design-Expert8.06软件处理，经二次型进行变异分析(AnalysisofVariance，ANOVA)，二次回归方程方差分析结果见表10。
表10响应面试验结果及方差分析
注：“*”表示显著（0.01＜p＜0.05）；“**”表示极显著（p＜0.01）
由表10可知，当模型F=21.88时，P=0.0003＜0.01，模型极显著，当失拟项F=0,67时，P=0.6148＞0.05，模型失拟项不显著，说明响应面法所得回归方程模型是可行的；因变量与自变量之间的线性关系显著(R2=0.9657)，模型调整复相关系数R2 Adj=0.9215，说明该模型能解释92.15%响应值的变化，表明发酵液中MonacolinK含量的实测值与预测值之间具有较好的拟合度，本试验所得二次回归方程能很好地对响应值进行预测和分析。
模型一次项A、B、C及二次项AB、AC、BC、B2表现为显著，二次项A2、C2表现为极显著，说明它们对响应值影响较大；且所考察因素对响应值影响不是简单的一次线性关系。根据表10，影响发酵液M.K含量的各因素主次顺序为：A＞C＞B。
为了考察各个交互项对发酵液酸度的影响，利用Design-Expert8.06软件对回归方程进行运算，作出交互项的三维响应面图及等高线图，能比较直观的解释各个变量和变量之间对响应值的影响。其响应面曲线图参见附图10-12所示。
由附图10至附图12可以看出各因素对发酵液M.K含量的影响和各因素之间的交互作用。响应曲面的越陡峭表明各因素之间的交互作用越显著；等高线越趋近于椭圆，表明两因素的交互作用越显著，相反则不显著。从附图10可以看出，随着接菌量含量的增大，发酵温度呈现先增大后减小的趋势，整个曲面呈凸形，等高线趋近于椭圆形，M.K含量受接种量的影响大于发酵温度；从附图11可以看出，随着发酵时间的延长，接种量呈现先增大后减小的趋势，曲面弧度很陡，等高线形状接近于椭圆形，二者交互作用对响应值的影响比较明显；从附图12可以看出，着发酵温度的升高，发酵时间呈现先增大后减小的趋势，曲面弧度比较陡峭，等高线趋近于椭圆形，M.K含量受发酵时间的影响大于发酵温度。
通过Design-Expert8.06软件，根据所建立的数学模型进行参数的最优化分析，可得出红曲霉发酵液的最佳工艺参数为：接种量为7.14%、发酵温度28.67℃、发酵时间为7.34d，在此条件下M.K含量可达2.947μg/mL。同时考虑实际操作的方便，将发酵工艺参数修正为接种量7-7.5%、发酵温度28-29℃、发酵时间7-8d，经过3组平行试验，最终得到的M.K含量平均值为2.823μg/mL，与理论值相对误差0.124μg/mL，可见该模型准确可靠，利用该模型在实践中进行预测是可行的，具有一定的实用价值。
实施例八：复合菌种混合制备酸马乳的发酵条件优化
通过上述各实施例的验证，得出如下实验，从本发明提供的降血脂酸马乳的确定的制备工艺及确定的工艺参数综合进行如下实验：
分别对酸马乳发酵中酸度和红曲霉发酵中M.K含量取最大值，由软件自动分析可得到最佳酸马乳发酵条件理论值为：以干酪乳杆菌%:乳酸乳球菌%:酵母菌%的接种量1.4:1.4:5.2、发酵温度32.77℃、发酵时间为53.28h、糖添加量为4.47g/100ml，所测酸度可达151.95°T。考虑实际操作方便，选取干酪乳杆菌%:乳酸乳球菌%:酵母菌%的接种量为1.4:1.4:5.2-1.5:1.5:5、发酵温度32-33℃、发酵时间为32-33h糖添加量为4-4.5g/100ml，进行3次平行试验，实际得到的酸马乳发酵液平均酸度为149°T。通过软件分析可得出红曲霉发酵液最佳理论工艺条件为：接种量为7.14%、发酵温度28.67℃、发酵时间为7.34d，在此条件下M.K含量可达2.947μg/mL。同时考虑实际操作的方便，将发酵工艺参数修正为接种量7-7.5%、发酵温度28-29℃、发酵时间7-8d，经过3组平行试验，最终得到的M.K含量平均值为2.823μg/mL，与理论值相对误差0.124μg/mL，与理论预测值接近，说明两个方程与实际情况拟合良好，响应面分析所得到的优化模型是可靠的，数学模型对优化降血脂酸马乳发酵工艺条件是可行的，具有实用价值。
在单因素试验的基础上，利用响应面软件，分别对酸马乳发酵和红曲霉发酵进行单因素试验，并利用响应面软件分析，得出酸马乳发酵最佳发酵条件分别为：乳酸乳球菌、干酪乳杆菌、酵母菌接种比例为1.4:1.4:5.2-1.5:1.5:5、发酵温度32-33℃、发酵时间为32-33h糖添加量为4-4.5g/100ml，在此条件下测得酸度为149°T。红曲霉发酵最佳条件：红曲霉接种量7-7.5%、发酵温度28-29℃、发酵时间7-8d，在此条件下马乳中M.K含量可达2.823μg/mL。经验证试验所测得的实际酸度和M.K含量与理论值差异较小，证明两个数学模型对优化降血脂酸马乳工艺条件可行，为综合利用马乳提供了理论和现实依据。
实施例九：功能性验证试验
按照实施例三和实施例四提供的复合菌种混合发酵制备工艺制备的酸马乳，经过实施例五至实施例八进一步确定提供的酸马乳，设定为本发明提供的降血脂酸马乳，通过具体详实的饲喂试验和高血脂症功能性验证试验如下：
高脂模型建立：小鼠购入饲养观察1周，使其适应环境后，按体重随机分为：空白对照组；高脂模型组。空白对照组饲喂基础饲料，高脂模型组给予高脂饲料（高脂饲料配方：基础饲料78.8%，胆固醇1%，胆盐0.2%，蛋黄粉10%，猪油10%），自由饮水。喂养4周建立高脂模型，4周后试验小鼠眼球取血,离心得血清测定其总TC、TG、HDL-C、LDL-C含量，检验高脂模型是否建立。
功能性验证试验：小鼠购入饲养观察1周，使其适应环境后，按体重随机分为：空白对照组；高脂模型组；药物对照组；本发明提供的酸马乳低、中、高剂量组共6组，每组10只（雌雄各5只），分笼喂养。空白对照组饲喂基础饲料，其余各组给予高脂饲料（高脂饲料配方：基础饲料78.8%，胆固醇1%，胆盐0.2%，蛋黄粉10%，猪油10%），自由饮水。试验期间正常对照组和高脂模型组灌胃蒸馏水，药物对照组灌胃给予血脂康胶囊(240mg/kg)，降血脂酸马乳低、中、高剂量组(2、6、10mL/kg)灌胃相应剂量的降血脂酸马乳。每日1次，连续给药4周。
1.高脂模型的建立：使用高脂饲料（高脂饲料配方：基础饲料78.8%，胆固醇1%，胆盐0.2%，蛋黄粉10%，猪油10%）喂养小鼠4周后,对空白对照组和高脂模型组小鼠摘除眼球取血,测得小鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C含量，比较结果见表11。
表11空白对照组与高脂模型组的小鼠血脂代谢对比（±s,n=6,mmol/L）
| 组别 | TC | TG | HDL-C | LDL-C |
| 空白对照组 | 3.34±0.25 c | 0.96±0.10 c | 2.09±0.24 a | 1.42±0.23 c |
| 高脂模型组 | 5.04±0.34 | 1.29±0.14 | 1.68±0.18 | 2.31±0.19 |
注:与高脂模型组比较，aP＜0.05，bP＜0.01，cP＜0.001。
试验结果表明：小鼠摄入高脂饲料4周后，高脂模型组小鼠血清中TC、TG、LDL-C含量均较空白对照组明显升高，这说明已经成功诱导高血脂小鼠模型，高血脂模型组建立成功。
2.本发明提供的降血脂酸马乳对高脂血症小鼠血脂的影响：空白对照组和高脂模型组灌胃蒸馏水，药物对照组灌胃给予血脂康胶囊(240mg/kg)，给药低、中、高剂量组(2、6、10mg/kg)灌胃相应剂量的降血脂酸马乳。每日1次，连续给药4周后摘除眼球取血，测得各组小鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C含量见表12。
表12降血脂酸马乳对高脂血症小鼠血脂代谢的影响（±s,n=10,mmol/L）
| 组别 | TC | TG | HDL-C | LDL-C |
| 空白对照组 | 3.78±0.34 c | 0.95±0.22 c | 1.82±0.25 a | 1.74±0.31 c |
| 高脂模型组 | 5.03±0.34 | 1.36±0.18 | 1.53±0.22 | 2.53±0.24 |
| 药物对照组 | 4.52±0.33 b | 1.18±0.16 b | 1.78±0.20 a | 2.17±0.25 c |
| 酸马乳低剂量组 | 4.85±0.24 | 1.27±0.14 | 1.65±0.18 | 2.37±0.27 a |
| 酸马乳中剂量组 | 4.69±0.20 a | 1.18±0.17 b | 1.75±0.17 a | 2.30±0.29 a |
| 酸马乳高剂量组 | 4.45±0.22 b | 1.14±0.15 c | 1.79±0.14 b | 2.21±0.25 c |
注:与高脂模型组比较，aP＜0.05，bP＜0.01，cP＜0.001。
试验结果表明：与高脂模型组比较，药物对照组能有效降低TG、TC、LDL-C水平，升高HDL-C水平，差异有显著性意义(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001)；低剂量组对血脂水平的影响不明显；而酸马奶中剂量组、高剂量组与高脂模型组比较均有不同程度降低，TG、TC、LDL-C水平下调，HDL-C水平升高，差异有显著性意义(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001)。
结论：本试验以采用本发明提供的复合菌种混合发酵制备的酸马乳为原材料，通过小鼠高血脂症模型试验，研究发现：本发明提供酸马乳中剂量组和高剂量组具有显著的降低血脂作用，对高血脂症的发生具有一定的预防和调节作用。
实施例十：功能性验证试验
按照实施例三和实施例四提供的复合菌种混合发酵制备工艺制备的酸马乳，经过实施例五至实施例八进一步确定提供的酸马乳，设定为本发明提供的降血脂酸马乳，通过具体详实的高血脂症功能性验证试验如下：
功能性验证试验：小鼠购入饲养观察1周，使其适应环境后，按体重随机分为：空白对照组；高脂模型组；药物对照组；本发明提供的酸马乳低、中、高剂量组共6组，每组10只（雌雄各5只），分笼喂养。空白对照组饲喂基础饲料，其余各组给予高脂饲料（高脂饲料配方：基础饲料78.8%，胆固醇1%，胆盐0.2%，蛋黄粉10%，猪油10%），自由饮水。试验期间正常对照组和高脂模型组灌胃蒸馏水，药物对照组灌胃给予血脂康胶囊(240mg/kg)，降血脂酸马乳低、中、高剂量组(2、6、10mL/kg)灌胃相应剂量的降血脂酸马乳。每日1次，连续给药4周。
1.本发明提供的降血脂酸马乳对高脂血症小鼠体重的影响
在整个试验期间，小鼠生长状态良好，无不良反应，每周固定称量小鼠体重，结果如表13所示，高脂模型组与空白对照组相比小鼠体重有极显著差异（P＜0.001），说明本试验高脂模型造模成功。4周试验期间，各试验组小鼠体重均有不同程度的增长，给药第1周后，药物对照组、中剂量组和高剂量组与高脂模型组小鼠体重存在极显著差异（P＜0.01），降脂酸马奶开始对高血脂症小鼠的体重发挥调节作用，在给药第4周后，中、高剂量组与高脂模型组小鼠体重存在极显著差异（P＜0.001），说明中、高剂量组对调节高血脂症小鼠体重效果较明显。
表13各试验组小鼠体重质量的变化（n=10,±s,g）
| 组别 | 初重 | 第一周 | 第二周 | 第三周 | 第四周 |
| 空白对照组 | 19.97±1.63 | 24.22±1.40c | 27.98±1.92c | 30.24±2.23c | 32.19±2.02c |
| 高脂模型组 | 20.37±1.85 | 28.50±1.77 | 32.66±2.07 | 37.52±1.80 | 42.65±1.76 |
| 药物对照组 | 20.62±1.72 | 25.65±1.53b | 28.61±1.59c | 31.31±1.96c | 32.22±1.32c |
| 低剂量组 | 19.65±1.84 | 27.48±1.88 | 31.05±2.10 | 36.11±1.88 | 39.02±2.11b |
| 中剂量组 | 20.31±1.48 | 25.92±1.76b | 29.58±2.15b | 34.32±2.62b | 37.71±2.20c |
| 高剂量组 | 19.83±2.21 | 25.88±1.83b | 29.12±1.88b | 33.14±2.07c | 34.06±2.44c |
注:与高脂模型组比较，aP＜0.05，bP＜0.01，cP＜0.001。
2.本发明提供的降血脂酸马乳对高脂血症小鼠脏器指数的影响
由表13可以看，长期食用高脂饲料可导致试验小鼠脏器脂质累积和病变等变化，可以通过脏器指数反映。与药物对照组相比，酸马乳高剂量组肝脏指数存在极显著性差异（P＜0.01），酸马乳中剂量组存在显著性差异（P＜0.05）。结果说明降血脂酸马奶中、高剂量组对实验小鼠肝脏具有一定的保护作用。各剂量组心脏指数、脾脏指数、肾脏指数与高脂模型组相比差异不显著（P>0.05）。试验结果说明降血脂酸马乳对小鼠脏器吸收没有明显影响。
表14降血脂酸马乳对高脂血症小鼠血脂代谢的影响（±s,n=10,mmol/L）
| 组别 | 心脏 | 肝脏 | 脾脏 | 肾脏 |
| 空白对照组 | 0.544±0.069 | 4.450±0.361c | 0.306±0.033 | 1.230±0.039 |
| 高脂模型组 | 0.505±0.033 | 5.399±0.498 | 0.315±0.041 | 1.239±0.031 |
| 药物对照组 | 0.532±0.068 | 4.780±0.701a | 0.532±0.068 | 1.255±0.045 |
| 低剂量组 | 0.543±0.065 | 5.041±0.185 | 0.543±0.065 | 1.237±0.050 |
| 中剂量组 | 0.531±0.043 | 4.897±0.215a | 0.531±0.043 | 1.247±0.028 |
| 高剂量组 | 0.545±0.071 | 4.724±0.185b | 0.545±0.071 | 1.251±0.064 |
注:与高脂模型组比较，aP＜0.05，bP＜0.01，cP＜0.001。
结论：本试验以采用本发明提供的复合菌种混合发酵制备的酸马乳为原材料，通过小鼠高血脂症模型试验，研究发现：本发明提供酸马乳中剂量组和高剂量组具调节小鼠体重的作用，在控制体重方面也有积极的影响，试验还显示：合菌种混合发酵制备工艺制备的酸马乳对小鼠脏器无毒副作用。
综上实验及各实施例可知，证明了本发明通过筛选获得的马克思克鲁维酵母菌（Kluyveromycesmarxianus）WWMJ-1CGMCCNo.8432基础上，联合乳酸乳球菌（Lactococcuslactis）、干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei）和红曲霉菌（Monascusruber）组成复合菌种混合发酵，将接种比例、发酵温度、发酵时间、糖添加量多个单因素试验对发酵酸马乳的影响，在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken试验设计，采用响应面法优化确定酸马乳的最佳制备工艺参数，制备酸马乳具有明显的突出的降血脂功效，不仅保留了马乳中丰富的营养，更赋予酸马乳的保健功能，具有促进马乳资源的综合利用，提升马乳产业的健康发展，提升我国乳品研究的科技创新能力。
序列表
IndividualApplicant
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<110>LastName:武运
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ApplicationProject
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<120>Title:一种复合菌种混合发酵制备的降血脂酸马乳及其制备方法
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SequenceName:马克思克鲁维酵母菌（Kluyveromycesmarxianus）
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Claims (8)
1.一种适用于酸马乳发酵的马克思克鲁维酵母菌(Kluyveromycesmarxianus)WWMJ-1，其特征在于，马克思克鲁维酵母菌(Kluyveromycesmarxianus)WWMJ-1的菌种保藏编号为CGMCCNo.8432。
2.一种复合菌种混合发酵制备酸马乳的方法，其特征在于，具体制备方法步骤如下：
(1)马乳预处理：将新鲜马乳通过过滤除去马乳中的杂质和异物，再将马乳预热到60-65℃，在20MPa条件下均质10-15min，均质后将马乳巴氏杀菌，待发酵用；母发酵液、发酵液1和发酵液2需要预处理好的马乳用量按体积比为3:20:20；
(2)种子发酵液及母发酵液的制备：
种子发酵液：将4℃下保存的马克思克鲁维酵母菌(Kluyveromycesmarxianus)WWMJ-1CGMCCNo.8432、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)和红曲霉菌(Monascusruber)菌种在无菌环境下接种，分别将乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)和干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)接种于MRS培养基置于37℃培养18-24h；将马克思克鲁维酵母菌(Kluyveromycesmarxianus)WWMJ-1CGMCCNo.8432接种于YPD培养基置于28℃培养24-48h；将红曲霉菌(Monascusruber)接种于麦芽汁培养基置于30℃培养48-72h活化，备用；
母发酵液：将步骤(1)预处理好的母发酵液选用马乳用量按体积比分为3:3:10:14分装于发酵容器中，在无菌条件下，将上述已活化好的马克思克鲁维酵母菌(Kluyveromycesmarxianus)WWMJ-1CGMCCNo.8432种子发酵液按照体积比计5％接种量接入相应的发酵容器中，置于28℃培养24-48h，备用；将上述已活化好的乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)和干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)种子发酵液按照体积比计5％接种量接入相应的发酵容器中，置于37℃培养18-24h，备用；将上述已活化好的红曲霉菌(Monascusruber)种子发酵液按照体积比计5％接种量接入相应的发酵容器中，置于30℃培养48-72h，备用；
(3)发酵液的制备：发酵液由发酵液1和发酵液2组成；
发酵液1的制备：将步骤(2)制备的乳酸乳球菌、干酪乳杆菌、马克思克鲁维酵母菌发酵液用量按照体积比计(1.4-1.5)：(1.4-1.5)：(5-5.2)接种于步骤(1)预处理好选用发酵液1用量的马乳中，在糖添加量为4-4.5g/100mL，发酵温度32-33℃、发酵时间为50-55h条件下发酵得到发酵液1；
发酵液2的制备：将步骤(2)制备的红曲霉母发酵液按照体积比计7-7.5％接种于步骤(1)预处理好选用发酵液2用量的马乳中，在糖添加量为5g/100ml，发酵温度28-29℃、发酵时间7-8d条件下发酵得到发酵液2；
(4)混合发酵液：将步骤(3)制备的发酵液1和发酵液2按照体积比计1:1的比例混合，进行巴氏杀菌后进行无菌灌装，在4℃下保存。
3.如权利要求2所述的复合菌种混合发酵制备酸马乳的方法，其特征在于，所述的马乳预处理中，将马乳预热到65℃，在20MPa条件下均质10min，均质后将马乳巴氏杀菌。
4.如权利要求2所述的复合菌种混合发酵制备酸马乳的方法，其特征在于，所述的发酵液1的糖添加量为4g/100ml，发酵温度33℃、发酵时间为53h条件下发酵。
5.如权利要求2所述的复合菌种混合发酵制备酸马乳的方法，其特征在于，所述的发酵液2的糖添加量为5g/100ml，发酵温度29℃、发酵时间7d条件下发酵。
6.如权利要求2所述的复合菌种混合发酵制备酸马乳的方法，其特征在于，所述的乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)、马克思克鲁维酵母菌(Kluyveromycesmarxianus)WWMJ-1CGMCCNo.8432发酵液按照体积比计1.5：1.5：5接种制备发酵液1。
7.如权利要求2所述的复合菌种混合发酵制备酸马乳的方法，其特征在于，所述的红曲霉菌(Monascusruber)发酵液按照体积比计7％接种制备发酵液2。
8.一种如权利要求2所述复合菌种混合发酵制备酸马乳方法制备的酸马乳。
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