CN108715819B - 一种乳杆菌wtmx-2及其在发酵复合饮品中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种乳杆菌WTMX‑2及其在葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品中的应用，通过从新疆南山采集、分离、培养、筛选，以及对所获得菌株进行形态特征、16S rDNA序列测定及系统发育分析，确定了乳杆菌（Lactobacillus sp.）WTMX‑2 CGMCC No.14605具有优良的发酵特性，是一株典型性比较突出的新菌种；将其菌种与葡萄籽鹰嘴豆汁混合，在25℃‑37℃下培养24h‑72h，测定总酸达到33.10°T、pH值达到3.30，获得葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品具有色泽均匀、呈红褐色、性状稳定，具有葡萄籽与鹰嘴豆固有的色泽和香气，无苦涩感，口感偏甜，酸度适中，口感丰满。经功能性试验证实具有显著的抗氧化性，能够去除体内自由基，具有抗氧化的功能性作用，是一种典型性比较突出的新的发酵型饮品品种。

Description

一种乳杆菌WTMX-2及其在发酵复合饮品中的应用
技术领域
本发明涉及微生物菌种及其应用的技术领域，更具体的涉及一种新的乳杆菌WTMX-2及其在发酵复合饮品中应用的技术领域。
背景技术
葡萄籽中多种成分具有极高的营养价值和保健价值。富含有多种功能性成分，其中原花青素、葡萄籽油、白藜葵芦醇、维生素、单宁等成分具有较高的营养价值和美容保健作用。葡萄籽提取物主要含低聚原花青素(简称OPC)，OPC具有较强的抗氧化能力。国外广泛将其应用于食品、饮料、化妆品及保健品行业，起到抗氧化、防腐、延长食品货架期及美容、延缓衰老等功效。葡萄籽蛋白含有18种氨基酸，8种人体必需氨基酸俱全，但尚没有得到合理利用。
鹰嘴豆原产于西亚土耳其一带，2500年前即已传入我国新疆，目前，我国主要在西部、北部等干旱和半干旱地区种植，是新疆特色植物之一。鹰嘴豆在植物分类学上属于豆科鹰嘴豆属，其具有润肺止咳、养颜、强骨、健胃的功效。在防治糖尿病、高脂血症、高血压方面具有较好的效果。它含有多种氨基酸及钙、钾、铜、维生素B1、维生素B2、维生素C、维生素E等营养物质，其蛋白质功效比值、氨基酸含量和消化率等均优于其他豆类，经常食用可以增强免疫力，降低患病率。
随着葡萄酒产业的发展，酿酒副产物葡萄籽的数量也逐年上升，葡萄籽作为一种资源性副产物，具有产量大、易收集的特点。在我国，目前葡萄籽的开发利用程度较低，研究开发主要集中在单一的提取葡萄籽油或者葡萄多酚，如果能够将葡萄籽进行深加工，不仅可以避免环境污染，而且对葡萄酒副产物加工业的产业化发展做出贡献，具有十分重要的经济价值和社会意义。
田歌等在《中国酿造》发表的“响应面法优化葡萄籽鹰嘴豆复合饮料发酵工艺的研究”中指出，以干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)MLS5、乳酸乳球菌(Lactococus lactis)WLB5为发酵菌株，对葡萄籽鹰嘴豆复合饮料进行发酵，最佳发酵条件为：乳酸乳球菌∶干酪乳杆菌＝1∶2，蔗糖添加量为6％，接种量9％，发酵时间73h，发酵温度39℃。在此条件下，葡萄籽鹰嘴豆复合饮料酸度可达30.66°T。此发酵方法客观上存在发酵过程复杂，接种量高，发酵周期长的问题。而现有专利或期刊中都没有披露使用乳杆菌发酵葡萄籽鹰嘴豆获得发酵复合饮品，也没有提供一种能够有效发酵葡萄籽鹰嘴豆的乳杆菌菌株，因此需要进一步探究乳杆菌的特性，提供能够用于发酵葡萄籽鹰嘴豆饮品的方法，对于微生物利用开发技术领域具有现实意义。
发明内容
针对现有技术中尚未记载有关乳杆菌领域新菌种在葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品方面应用的技术现状，且现有葡萄籽作为一种资源性副产物，具有产量大、易收集的特点，本发明旨在为葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品开发提供具有风味口感好且发酵性能稳定的新菌株，提供的新菌种乳杆菌(Lactobacillus sp.)WTMX-2及其在葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品中的应用。本发明通过在新疆牧区采集的自制奶酪中分离筛选出一株乳杆菌(Lactobacillus sp.)WTMX-2CGMCC No.14605，利用分离出的新菌种制备发酵制剂，应用到葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品中，制备的葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品具有色泽均匀、呈红褐色、性状稳定、具有葡萄籽与鹰嘴豆固有的色泽和香气，无苦涩感，口感偏甜，酸度适中，协调性适中，口感丰满，具有良好的均衡性，是一种典型性比较突出的新的发酵复合饮品，对于微生物新菌种应用技术领域具有广泛的应用价值。
本发明具体采用如下的技术方案：
本发明具体提供一种乳杆菌(Lactobacillus sp.)WTMX-2CGMCC No.14605。通过从新疆南山牧区采集的自制奶酪中分离与筛选，从中筛选出一株编号为WTMX-2的新菌种乳杆菌(Lactobacillussp.)，该菌株能在低pH值时活性较强，热稳定性好，在发酵过程中产生有机酸(主要是乳酸)，使pH值降低来抑制一些腐败菌和致病菌的生长，并改善食品的品质和风味。
本发明根据新疆地理环境的特殊性，通过从新疆南山牧区采集的自制奶酪中进行微生物菌种的培养、分离，筛选一大批优良菌种，并从中优选出一株编号为WTMX-2的乳杆菌(Lactobacillus sp.)，经微生物学分类与鉴定，属于乳杆菌属，该菌株最适生长条件为：温度37℃，最高生长温度为45℃，培养基为MRS培养基，培养时间为48-72h，参照《伯杰氏细菌鉴定手册》(第九版)等对菌株进行形态学、生理生化试验，确定WTMX-2菌株为乳杆菌属中成员，但是具有与常见的乳杆菌属成员菌种不同的特点，具有一些新菌种的特性。
通过对上述菌种乳杆菌(Lactobacillus sp.)WTMX-2CGMCC No.14605基因测序，序列参见附后提供的SEQ ID NO:1所示，经16S rDNA同源分析、系统发育分析，通过BLAST同源比对，确定与实验菌株亲缘关系最近的种属。从数据库获得相关种属的序列，并结合细菌生物多样性研究中心数据库，进行聚类分析和系统进化树构建。WTMX-2菌株归属于乳杆菌(Lactobacillus sp.)，菌株WTMX-2与该属模式菌株序列比对最高同源性仅为77％(Lactobacliius pentosus strain Lb3F2)，与该属其它菌株同源性均低于77％，确定该菌种为乳杆菌(Lactobacillus sp.)属中的新种，具有新菌种典型性的特点，从分类学角度暂命名为乳杆菌(Lactobacillus sp.)WTMX-2。该新菌种已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。保藏日期是2017年09月11日，保藏号是CGMCC No.14605。经微生物学鉴定暂命名为乳杆菌(Lactobacillussp.)WTMX-2。
同时，本发明进一步提供一种利用乳杆菌(Lactobacillus sp.)WTMX-2CGMCCNo.14605发酵制备葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品的方法，具体步骤如下：
(1)菌种的活化：将4℃下保存的乳杆菌(Lactobacillus sp.)WTMX-2CGMCCNo.14605在无菌环境下接种于MRS培养基，置于37℃培养24h，恒温保藏备用。
(2)葡萄籽预处理：筛选颗粒完整，无虫蛀的优质葡萄籽，清洗干燥后的放入600W烘焙环境1-2min后，室温下贮藏备用。
(3)鹰嘴豆预处理：选用颗粒饱满，无霉变的鹰嘴豆，使用质量浓度为0.3％碳酸氢钠溶液浸泡12h，使组织充分软化，利于打浆；清水将原料进行清洗，清洗3-5次，剥去外皮；室温下贮藏备用。
(4)葡萄籽鹰嘴豆汁混合液的制备：按质量百分比计，分别将5.8％的步骤(2)获得的葡萄籽与步骤(3)获得的鹰嘴豆混合均匀，加入纯净水打浆，过滤后室温下保存备用。
(5)母发酵液的制备：按体积百分比计，将10％的步骤(4)得到的葡萄籽鹰嘴豆汁混合液均分装于发酵容器中，在无菌条件下，将按步骤(1)活化的乳杆菌(Lactobacillussp.)WTMX-2CGMCC No.14605按3％接种比例接入发酵容器中，培养条件为37℃培养24h、恒温保藏备用。
(6)发酵：将步骤(5)制备的乳杆菌(Lactobacillus sp.)WTMX-2 CGMCC No.14605发酵液加入步骤(4)制备的剩余90％葡萄籽鹰嘴豆汁混合液中，在37℃下培养24h-72h，发酵终点设定为：测定总酸达到33.10°T，pH值达到3.30。
(7)后处理：待产品至发酵终点后，闪蒸杀菌，冷却后进行无菌灌装制备获得葡萄籽鹰嘴豆复合发酵饮品。
进一步，本发明提供乳杆菌(Lactobacillus sp.)WTMX-2CGMCC No.14605在发酵制备葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品中的应用，制备的葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品色泽呈红褐色，葡萄籽香味伴随着淡淡的鹰嘴豆香气，口感协调、酸度适中、酸甜爽口、无异味，体系稳定，允许少许沉淀，总酸：33.10°T，pH值：3.30，是一种典型性比较突出的新的发酵型饮品品种，具有广泛的应用价值。
通过实施本发明提供上述具体技术方案，实施本发明内容，可以达到以下有益效果：
(1)使用本发明技术方案，制备方法生产效率高、风味良好，制备的葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品色泽均匀、呈红褐色、性状稳定、具有葡萄籽与鹰嘴豆固有的色泽和香气，无苦涩感，口感偏甜，酸度适中，协调性适中，口感丰满，具有良好的均衡性，是一种典型性比较突出的新的发酵型饮品品种。
(2)采用本申请提供的制备方案制备的葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品具有良好的抗氧化作用：实验表明，葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品在发酵前具有较高的抗氧化性，并在发酵后抗氧化性有所提高，发酵前、后其自由基清除率和总还原力均高于0.5mg/mL的GSH、0.5mg/mL的VC两个阳性对照组，并且在样品浓度相同的条件下，发酵后的葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品的各项自由基的清除率和总还原力＞发酵前的葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品＞0.5mg/mL的VC溶液＞0.5mg/mL的GSH溶液。说明葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品具有较好的抗氧化性，并且通过乳杆菌(Lactobacillus sp.)WTMX-2CGMCC No.14605发酵后，抗氧化能力得到有效的提高。
附图说明：
图1显示为乳杆菌(Lactobacillus sp.)WTMX-2CGMCC No.14605的菌落形态图。
图2显示为乳杆菌(Lactobacillus sp.)WTMX-2CGMCC No.14605的系统进化发育树图。
图3显示为葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品制备工艺流程图。
图4显示为不同糖添加量对葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品酸度、pH值的影响图。
图5显示为不同发酵温度对葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品酸度、pH值的影响图。
图6显示为不同发酵时间为对葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品酸度、pH值的影响图。
图7显示为不同接种量对葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品酸度、pH值的影响图。
图8显示为接种量与发酵时间相互作用对酸度影响的响应面图。
图9显示为接种量与发酵时间相互作用对酸度影响的等高线图。
图10显示为接种量与发酵温度相互作用对酸度影响的响应面图。
图11显示为接种量与发酵温度相互作用对酒精发酵影响的等高线图。
图12显示为发酵温度与发酵时间相互作用对酸度影响的响应面图。
图13显示为发酵温度与发酵时间相互作用对酸度影响的等高线图。
图14显示为接种量与发酵时间交互影响pH值的曲面图。
图15显示为接种量与发酵时间交互影响pH值的等高线图。
图16显示为发酵温度和接种量交互影响pH值的曲面图。
图17显示为发酵温度和接种量交互影响pH值的等高线图。
图18显示为发酵时间和发酵温度交互影响pH值的曲面图。
图19显示为发酵时间和发酵温度交互影响pH值的高线图。
图20显示为葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品DPPH自由基清除率图。
图21显示为葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品羟基自由基清除率图。
图22显示为葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品超氧阴离子自由基清除率图。
图23显示为葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品总还原力图。
具体实施方式
下面结合附图1-23和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述，但本发明不限于下述实施例。
本发明采用的样品：新疆南山牧区采集的自制奶酪。
主要仪器设备：LD2X-50KB立式电热压力蒸汽灭菌器；HR40-ⅡA2生物安全柜；DHP-781电热恒温培养箱；DZKW-172电热恒温水浴锅；CH1776J微电脑电磁炉；EYELA水浴锅；pH计。
本发明选用的所有原辅材料，设备，以及选用的菌种培养方法都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些材料和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。本发明中涉及到的％都为体积百分比，除非特别指出除外。
实施例一：乳杆菌(Lactobacillus sp.)WTMX-2CGMCC No.14605的分离、筛选及鉴定
(1)分离、筛选
据新疆的地理环境的特殊性，通过从新疆南山牧区采集的自制奶酪中取样，筛选出一批生长良好的微生物菌株，取奶酪25g，放入225mL盐水中，在旋涡混合器上充分混合均匀，取1mL放入装有9mL无菌生理盐水的试管中。以10倍级进行稀释，稀释度为10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。用移液器吸取上述稀释度样液各1mL，采用倾注法倒入改良MRS培养基，平板置于37℃培养箱中培养24h。观察并记录菌落特征并挑取有透明圈的不同形态单个菌落，进行革兰氏染色，挑取革兰氏染色阳性菌落，在显微镜油镜下观察细胞形态，并对疑似的菌种进行编号。
将疑似产透明圈的菌株再接种于MRS琼脂培养基，于37℃培养箱恒温培养24h，重复3-4次纯化乳酸菌。纯化后的乳酸菌菌株接种于改良MRS斜面，37℃培养箱恒温培养24h后，4℃保存备用。
该菌株培养条件：培养温度37℃；优先生长于改良优化后的MRS培养基即乳酸细菌培养基：牛肉膏10.0g/L，酵母膏5.0g/L，葡萄糖20.0g/L，乙酸钠5.5g/L，柠檬酸氢二胺2.0g/L，吐温801.05ml/L，磷酸氢二钾2.0g/L，七水硫酸镁0.18g/L，七水硫酸锰0.07g/L，蒸馏水1.0L，固体培养基加琼脂20.0g/L。菌落形态特征：菌株在固体培养基上菌落直径大小为0.5mm-3mm，正面呈圆形，侧面凸起；边缘整齐、表面光滑；菌落不透明，呈乳白色；具有一定粘稠性，参见附图1。
(2)鉴定
生理生化鉴定：该细菌经MRS培养基分离培养，再经改良MRS培养基中会产生溶钙圈进行初步筛选，将其初步界定乳酸菌菌株；该菌株在MRS培养基平板上划线培养24h，能形成菌落边缘整齐、表面光滑乳白色凸起的圆形，直径0.5-3mm的菌落，参见附图1。进行革兰氏染色，染色鉴定结果为革兰氏阳性杆状细菌。该细菌在过氧化氢酶试验中呈阴性、接触酶呈阴性，不能够还原硝酸盐、不液化明胶、不产生吲哚和H2S、不运动，不发酵鼠李糖，能够在15℃生长，参照《伯杰氏细菌鉴定手册》(第九版)进行分类鉴定，初步经鉴定菌株WTMX-2属于乳杆菌(Lactobacillus sp.)，具有与常见的乳杆菌属成员菌种不同的特点，具有鲜明的新菌种特性。
分子水平鉴定：通过观察乳杆菌(Lactobacillus sp.)WTMX-2CGMCC No.14605菌落形状和生理生化特点，提取乳杆菌(Lactobacillus sp.)WTMX-2的总DNA，采用16S rDNA扩增引物，进行PCR扩增，PCR产物经切胶纯化、测序，其序列参见附后提供的SEQ ID NO:1所示。
将测序得到的16S rDNA序列与GenBank数据库中的核苷酸序列进行BLAST分析，从中获取相近的16S rDNA序列，乳杆菌(Lactobacillus sp.)WTMX-2的基因序列如SEQ IDNO:1所示。用MEGA6.0中Maximum Likelihood法构建系统进化树，结果参见附图2。由系统进化树可知，菌株WTMX-2与Lactobacillus sp.pp3聚在同一支上是其近似种，菌株归属于乳杆菌(Lactobacillus sp.)，菌株WTMX-2与Lactobacliiuspentosus strain Lb3F2的序列最大相似性达仅为77％，具有新菌种典型性的特点，从分类学角度暂命名为乳杆菌(Lactobacillus sp.)WTMX-2，具有与现有技术披露的乳杆菌属成员菌种不同的特点，具有鲜明的新菌种特性。结合上述提供的菌种编号为WTMX-2的菌落形态、生理生化特性和分子水平鉴定分类，综合的在生物学分类名称暂时命名为乳杆菌(Lactobacillus sp.)。
该新菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。保藏日期是2017年09月11日，保藏号是CGMCCNo.14605。经微生物学鉴定暂命名为乳杆菌(Lactobacillus sp.)。本发明提供的乳杆菌(Lactobacillus sp.)WTMX-2CGMCC No.14605能够在适合其增殖的固体培养基或液体培养基中进行增殖培养，利用常规固体斜面培养培养、低温保藏的方法，每次传代可保藏3个月以上，以干燥冷冻法制做的长期保藏菌种，可保藏1年以上，或是以甘油管进行长期保藏。
实施例二：葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品的制备工艺
本发明发酵制备葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品的工艺流程图参见附图3所示。本发明具体提供一种葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品，具体通过如下提供的制备方法制备获得：
(1)菌种的活化：将4℃下保存的乳杆菌(Lactobacillus sp.)WTMX-2CGMCCNo.14605在无菌环境下接种于MRS培养基，置于37℃培养24h，恒温保藏备用。
(2)葡萄籽预处理：筛选颗粒完整，无虫蛀的优质葡萄籽，清洗干燥后的放入600W烘焙环境1-2min后，室温下贮藏备用。
(3)鹰嘴豆预处理：选用颗粒饱满，无霉变的鹰嘴豆，使用质量浓度为0.3％碳酸氢钠溶液浸泡12h，使组织充分软化，利于打浆；清水将原料进行清洗，清洗3-5次，剥去外皮；室温下贮藏备用。
(4)葡萄籽鹰嘴豆汁混合液的制备：按质量百分比计，分别将5.8％的步骤(2)获得的葡萄籽与步骤(3)获得的鹰嘴豆混合均匀，加入纯净水打浆，过滤后室温下保存备用。
(5)母发酵液的制备：按体积百分比计，将10％的步骤(4)得到的葡萄籽鹰嘴豆汁混合液均分装于发酵容器中，在无菌条件下，将按步骤(1)活化的乳杆菌(Lactobacillussp.)WTMX-2CGMCC No.14605按3％接种比例接入发酵容器中，培养条件为37℃培养24h、恒温保藏备用。
(6)发酵：将步骤(5)制备的乳杆菌(Lactobacillus sp.)WTMX-2CGMCC No.14605发酵液加入步骤(4)制备的剩余90％葡萄籽鹰嘴豆汁混合液中，在37℃下培养24h-72h，发酵终点设定为：测定总酸达到33.10°T，pH值达到3.30。
(7)后处理：待产品至发酵终点后，闪蒸杀菌，冷却后进行无菌灌装制备获得葡萄籽鹰嘴豆复合发酵饮品。
通过上述方法制备的葡萄籽鹰嘴豆发酵发酵饮品，有效掩盖了葡萄籽涩苦味，克服了现有技术中葡萄籽再利用的技术瓶颈，制备了一种典型性比较突出的新的发酵型饮品品种，制备的葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品作为新产品具有典型性如下：
(1)感官指标：色泽呈红褐色，具有葡萄籽固有的色泽；香气：葡萄籽香味伴随着淡淡的鹰嘴豆香气，滋味：口感协调，酸度适中，酸甜爽口、无异味；体态：葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品体系稳定，允许少许沉淀。
(2)理化指标：总酸：33.10°T，pH值：3.30。
(3)微生物指标：菌落总数(cfu/mL)≤100；大肠菌群(MPN/100mL)≤3；致病菌：未检出。
本发明中，酸度测定采用酸碱滴定法测定；pH值测定使用pH计测定。
实施例三：葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品中发酵条件单因素试验
实验过程：分别选取乳杆菌(Lactobacillus sp.)WTMX-2接种量为4、6、8、10、12％、培养发酵温度为33、35℃、37、39、41℃，发酵时间为12、24、36、48、60h，糖添加量为2、4、6、8、10％；进行单因素发酵试验，通过测定酸度、pH值，进行单因素考察。
(1)不同接种量对发酵的影响：由附图4可知，当接种比例为10％、12％时，发酵液的酸度最高为33.5°T、36.2°T，但复合饮品产生了大量絮状沉淀，说明复合饮品中产生了大量的乳酸，而pH值为3.02，当接种比例为为8％时，发酵液的酸度为32.6°T，pH值为3.25，且发酵液体系稳定，无絮状沉淀。综合考虑，为保证本发明葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品的口感，因此选择接菌比例8％最为恰当。
(2)不同发酵温度对发酵的影响：根据附图5可以看出，发酵液的总糖随着发酵温度的升高逐渐降低，而酸度逐渐升高，当温度为37℃时，发酵液酸度达到最高为31.5°T，pH值为3.35，达到较低值，但当温度过高超过37℃时，酸度有所下降，pH值逐渐升高，温度过高使菌种的繁殖和代谢能力反而下降，乳酸的积累逐渐减少，综合发酵风味及口感，为保证本发明葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品风格和特点，因此选择37℃为最为最佳发酵温度。
(3)不同发酵时间对发酵的影响：由附图6可知，随着发酵时间的延长，乳杆菌得到了充分的生长，酸度逐渐升高，pH值逐渐降低。在12h-36h时发酵液的酸度逐渐升高，pH值逐渐降低，发酵时间为48h时为拐点，发酵液酸度达到最高为29.6°T，pH值达到最低值为3.03，说明发酵菌种生长旺盛，当发酵时间在48h-60h时，发酵液的组织形态发生变化，产生絮状沉淀，可能是酸度过低引起蛋白质沉淀。综合考虑，为保证本发明葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品质量和典型性风格，选选择发酵时间为48h最佳。
(4)不同糖添加量对发酵的影响：在发酵过程中，由附图7可知，糖添加量在4％-6％之间时，总酸积累量逐渐增加酸度达到最高为31.3°T，pH值达到最小值为2.85，但当加糖量超过6％时，酸度和pH值趋于平稳，菌种发酵能力平缓并有下降的趋势，可能是因为添加蔗糖含量过高，葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品发酵液中的糖浓度过高，抑制了乳杆菌的发酵，综合以上原因，为保证本发明葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品质量和典型性风格，选择加糖量为8％最为恰当。
实施例四：葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品的制备发酵工艺的优化
在实施例三提供的单因素试验结果基础上，根据Box-Behnken的中心组合实验设计原理分别对影响发酵酸度(Z)和pH值(Y)的三个因素：发酵时间(A)、发酵温度(B)、接种量(C)，利用响应面软件Design-Expert 8.05软件，根据Box-Behnken实验组合设计进行三因素三水平实验。响应面试验的因素和水平编码值如表1。
表1：响应面试验的因素和水平编码值
Figure BDA0001674671560000151
发酵响应面优化分析：综合单因素试验结果，采用Box-Behnken响应面分析法对其进行优化。响应面试验设计及响应值结果见表2。
表2：响应面试验及响应值
Figure BDA0001674671560000152
Figure BDA0001674671560000161
按照表2试验数据进行多元回归方程拟合，可建立以发酵液酸度(Y)及pH值(Z)分别对发酵时间(A)、发酵温度(B)、接种比例(C)的拟合方程为：
Y＝32.68-0.61A+0.71B-0.65C+0.85AB-0.18AC-0.47BC-3.52A2-3.97B2-2.64C2
Z＝3.32+0.22A-0.054B+0.18C-0.2AB+0.072AC+0.21BC+0.58A2+0.88B2+0.46C2
表3：酸度响应面试验结果及方差分析
Figure BDA0001674671560000162
注：表3及表4中，“*”表示显著(0.01<p<0.05)；“**”表示极显著(p<0.01)。
表4：pH值响应面试验结果及方差分析
Figure BDA0001674671560000171
回归方程中各变量对指标(响应值)影响的显著性，由F检验来判定，概率P的值越小，则相应变量的显著程度越高。由表3、表4可知，当模型F值分别为F＝178.64，F＝7.18，P<0.0001，说明模型是极显著的。酸度与pH值的失拟项分别为F＝2.45时，P＝0.2029>0.05，F＝1.81，P＝0.2846>0.05说明模型失拟项不显著。决定系数分别为R2＝0.9942，R2＝0.9768，校正系数分别为R2 Adj＝0.9867，R2 Adj＝0.9470表明实测值与预测值之间具有很好的拟合度。由此可以说明模型的建立呈显著性，说明此模型的拟合程度较好，试验操作准确可信，因此可以利用此模型对葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品发酵过程进行分析和预测。
从表3中可以看出，一次项与二次项均对本发明提供的葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品发酵的Y值影响表现出极显著水平，交互项AB对葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品发酵Y值的影响表现为极显著水平，交互项AC对葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品发酵Y值的影响不具有显著水平的影响，交互项BC对葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品发酵Y值的影响表现为显著水平。从表4中可以看出一次项A与二次项A2、B2、C2对葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品发酵液的Z值影响表现出极显著水平，一次项C对葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品发酵液的Z值影响表现出显著水平，交互相AB、BC对葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品发酵液的Z值影响呈现显著水平。
响应面图分析：为了考察各个交互项对发酵液酸度和pH值的影响，在其他因素固定不变的情况下，利用Design-Expert 8.05软件对回归方程进行运算，作出交互项的响应面图。
由附图8-13可以看出，随着接种量的增大，酸度呈先上升后下降的趋势，发酵时间对酸度影响明显，发酵时间与接种量之间的交互作用显著；酸度随发酵温度及接种量的升高呈先上升后下降的趋势，发酵温度及接种量的交互作用显著；随着发酵温度的升高，酸度呈先上升后降低的趋势，二者交互作用显著。
由附图14-19可看出，随着接种比例的增大，pH值呈先下降后上升的趋势，接种量对pH值影响较大，发酵时间对pH值影响明显，发酵时间与接种量之间的交互作用显著；pH值随发酵温度及接种接种量的升高呈先下降后上升的趋势，发酵温度及接种量的交互作用显著；随着发酵温度的升高，pH值呈先降低后上升的趋势，二者交互作用显著。
分别对葡萄籽鹰嘴豆发酵饮复合饮品酵酸度取最大值，pH值含量取最小值，由软件Design-Expert 8.05自动分析可得到最佳发酵条件理论值为：接种量为7.69％、发酵时间为46.58h、发酵温度为37.12℃，所测酸度为32.76°T，pH值为3.28。考虑实际操作方便，选取接种比量为7.7％、发酵时间为47h、发酵温度为37℃，进行3次平行试验，酒精度为32.72°T、33.78°T和32.82°T。pH值为3.25、3.29、3.30，与理论预测值接近，说明方程与实际情况拟合良好，响应面分析所得到的优化模型是可靠的，该数学模型对优化葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品发酵工艺条件是可行的，具有实用价值。
在单因素试验的基础上，利用响应面软件，进行单因素试验，并利用响应面软件分析，得出乳酸发酵最佳发酵条件分别为：接种量(乳杆菌(Lactobacillus sp.)WTMX-2CGMCCNo.14605为7.7％、发酵时间为47h、发酵温度为37℃,糖添加量为8％。在此条件下酸度平均为33.10°T，pH值平均为3.30。经验证试验所测得的实际酸度与理论值差异较小，证明两个数学模型对优化葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品发酵工艺条件可行，为综合利用葡萄籽提供了理论依据。
通过上述系列试验制备的葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品，有效掩盖了葡萄籽涩苦味，克服了现有技术中葡萄籽再利用的技术瓶颈，制备的葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品作为产品具有典型性新型发酵饮品的特点和风格。
实施例五：葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品的典型性感官评定
1.感官评价标准
由不同饮料领域的技术人员(20人)组成的感官评价小组进行数据采样，对采用实施例二提供的技术方案制备的葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品从口感、色泽、风味、甜、酸、香气协调性方面进行综合评价，葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品的感官指标评价标准如表5所示。
表5：葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品感官评分表
Figure BDA0001674671560000201
2.模糊数学评价
按照模糊评判确定评定论域(U)、评语论域(V)、权重向量(A)，并对感官评价结果进行处理，得到模糊评判矩阵，再通过计算综合隶属度，最终得到葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品感官质量综合评判的结果向量，并进行等级划分。
2.1确定评定论域
评定论域是指最能反映该食品质量的一组指标的集合，记为：U＝{u1,u2,u3,…un}，u表示评价指标。选取口感、色泽、风味、甜、酸、香气协调性作为葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品的感官评价指标。挑选食品专业10人组成感官评定小组。可以用u1表示口感，u2表示色泽，u3表示风味，u4表示甜，u5表示酸，u6香气协调性，得到一个关于葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品的评定论域U＝{u1,u2,u3,u4,u5,u6}。
2.2确定评语论域
根据表5的质量等级评定标准，得到一个关于葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品的评语论域V＝{v1,v2,v3,v4}。
2.3确定权重向量
根据表1中各项指标的权重值得到与葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品相关的权重向量为：A＝(0.30,0.10,0.10,0.10,0.10,0.30)。
2.4确定模糊评判矩阵
评定人员对葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品的评定结果如表6所示。
表6：葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品的感官评定结果
Figure BDA0001674671560000211
将表6的数据都分别除以品评员总人数20，得到模糊评判矩阵：
Figure BDA0001674671560000221
3.计算综合隶属度
已知葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品6个评价指标的权重向量为A＝(0.30,0.10,0.10,0.10,0.10,0.30)，按照标准的模糊综合评判，用普通矩阵乘法取代取大取小算法并依照综合评分公式计算综合评分。葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品的综合隶属度为Y＝A×R＝(b1,b2,b3…bn)，可得到葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品感官质量综合评判的结果向量：
Figure BDA0001674671560000222
其中:
y1＝0.3×15/20+0.10×13/20+0.10×14/20+0.10×16/20+0.10×13/20+0.30×15/20＝0.73；
y2＝0.3×3/20+0.10×5/20+0.10×3/20+0.10×3/20+0.10×4/20+0.30×4/20＝0.18；
y3＝0.3×2/20+0.10×2/20+0.10×3/20+0.10×1/20+0.10×2/20+0.30×1/20＝0.085；
y4＝0.3×0+0.10×0+0.10×0+0.10×0+0.10×1/20+0.30×0＝0.005。
即：Y1＝(0.73,0.18,0.085,0.005)
根据综合评分公式：
Figure BDA0001674671560000223
计算综合评分：
H1＝1×0.73+2×0.18+3×0.085+4×0.005＝1.335；
葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品的综合评分在1和2之间接近于1，说明葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品品质在很好和好之间偏向于很好。
综合模糊数学感官评定可知，葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品品质在很好，本发明提供的乳杆菌WTMX-2制备的葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品品质特点为：生产效率高、风味良好，葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品色泽均匀、呈红褐色、性状稳定、具有葡萄籽与鹰嘴豆固有的色泽和香气，无苦涩感，口感偏甜，酸度适中，协调性适中，口感丰满，具有良好的均衡性。综上，本申请所选用的乳杆菌WTMX-2适合于发酵葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品，本申请提供的一种发酵制备葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品的方法在提升葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品的口感与风味方面做出了突出贡献。
实施例六：葡萄籽鹰嘴豆复合饮品与现有技术的感官评价试验
将现有技术田歌等人研究的《响应面法优化葡萄籽鹰嘴豆复合饮料发酵工艺的研究》(以下简称“现有技术1”)通过披露的方法进行重现性实验，获得葡萄籽鹰嘴豆复合饮料，和市场常见鹰嘴豆发酵饮品(以下简称“现有技术2”)，将这两种饮品与本申请实施例二制备的葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品进行感官评价实验。选择20名有经验的感官品评人员，按照表7中的评分标准进行打分，取其平均值。
表7：饮料感官评价标准
Figure BDA0001674671560000231
Figure BDA0001674671560000241
感官评定结果见表8所示。
表8：感官评价得分
序号 本申请 现有技术1 现有技术2
1 89 91 83
2 88 83 85
3 93 84 87
4 90 85 86
5 85 80 78
6 85 79 80
7 89 82 75
8 95 91 85
9 86 83 88
10 93 90 85
11 90 85 87
12 89 89 83
13 84 80 90
14 92 88 84
15 95 91 87
16 87 90 89
17 94 84 87
18 92 83 84
19 88 91 82
20 91 87 83
平均分 89.75 85.8 84.4
由表8可知，本申请实施例二制备的葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品平均分为89.7分，现有技术1平均分为85.8分，现有技术2平均分为84.4分，说明本申请制备葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品风味口感更佳，色泽纯正、性状稳定、具有葡萄籽与鹰嘴豆固有的色泽和香气，无苦涩感，口感偏甜，酸度适中，协调性适中，口感丰满，具有良好的均衡性。综上所述，本申请所选用的乳杆菌WTMX-2适合于发酵葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品，本申请提供的一种发酵制备葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品的方法在提升葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品的口感与风味方面做出了突出贡献。
实施例七：葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品抗氧化性试验
1.葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品总酚含量的测定
总酚的提取采用超声辅助法，取发酵前葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品、葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品各1mL与30mL无水乙醇混合，在250W，50℃超声条件下，提取30min后，以转速4000rpm离心10min，将上清液定容至100mL容量瓶内备用。含量的测定参照福林酚法，取1mL提取液，加入1mL稀释10倍的福林酚试剂，5mL蒸馏水，3mL碳酸钠(12.5％)混匀，在30℃条件下水浴1h，以蒸馏水为空白对照，在760nm波长处测定吸光度，使用没食子酸绘制标准曲线，测定样液中总酚含量。
测定结果，葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品在发酵之前的总酚含量为22.875±1.23g/L，发酵后总酚含量为43.65±1.54g/L。发酵后的总酚含量较发酵前提高了95.4％。表明，葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品的总酚含量通过乳杆菌(Lactobacillus sp.)WTMX-2CGMCCNo.14605发酵后，得到了明显的提高。有大量研究显示，通过微生物的发酵，产品的多酚含量会有较大幅度的增长。
2.待测液的配置
试验设葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品样品组和0.5mg/mL的谷胱甘肽(GSH)、0.5mg/mL的抗环血酸2个阳性对照组。通过预实验，将5组液体分别稀释至原浓度的0.5％、2％、4％、6％、8％、10％，以此作为待测液进行后续试验。
3.葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品DPPH自由基清除率的测定
准确称取0.01g DPPH溶解在无水乙醇中，定容至250mL棕色容量瓶中，放入冰箱4℃冷藏备用。取2mL待测液与2mL DPPH醇溶液迅速混匀后避光反应30min，在517nm波长处测定吸光度值(A1)；同时取2mL无水乙醇与2mL DPPH醇溶液按上述方法测定吸光度值(A2)；再取2mL无水乙醇与2mL待测液按上述方法测定吸光度值(A3)，按照公式(1)对待测液的DPPH自由基的清除率进行计算。
DPPH自由基的清除率(％)＝[1-(A1-A3)/A2]*100％ 式1
由附图20可看出，在样品浓度2.0％时，发酵前样品的DPPH自由基清除率为67.23±2.13％，发酵后样品的DPPH自由基清除率为75.31±1.14％，VC的DPPH自由基清除率为33.48±1.44％，GSH的DPPH自由基清除率为35.11±1.21％，发酵前样品的DPPH自由基清除率是VC组的约2倍，是GSH组的1.9倍。发酵后样品的DPPH自由基清除率是VC组的约2.25倍，是GSH组的2.14倍。当样液浓度达到10％时，发酵后的样品比发酵前的样品DPPH自由基清除率提高了9.85％，并且发酵前、后两组样液的DPPH自由基清除率均明显高于阳性对照GSH组，分别高出30.94％和40.79％。从附图20中可以看出总体情况，随着样品浓度的增加，葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品在发酵前、后，均对DPPH自由基的清除率有所提高，两组阳性对照组也出现相同情况，并随着样品浓度的增加，清除率的提高幅度变小，最终趋于平稳。发酵后的葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品在相同浓度的情况下，DPPH自由基清除率均高于发酵前，且二者均较大程度上高于两个阳性对照组。
4.葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品羟基自由基清除率的测定
取2mL蒸馏水加入2mL 6mmol/L硫酸铁溶液、2mL 6mmol/L双氧水和2m L 6mmol/L水杨酸混匀后，37℃水浴15min，冷却后于510nm测定吸光值(A0)；取2mL待测液替换蒸馏水，其余条件不变，测定吸光值(A1)，按照公式(2)计算待测液的羟基自由基清除率。
羟基自由基清除率(％)＝(A0-A1)/A0×100％ 式2
由附图21可看出，发酵前的待测液浓度为2％时的羟基自由基清除率为38.74±1.25％，待测液浓度为0.5％时的羟基自由基清除率为31.21±1.37％，羟基自由基清除能力提高了7.53％。发酵后的待测液浓度为0.5％时的羟基自由基清除率为38.55±0.93％，浓度为2％时的羟基自由基清除率是56.52±2.06％，随着样品浓度的提高，羟基自由基清除能力提高了17.97％。由此表明，随着样品浓度的增大，发酵前、后葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品的羟基自由基清除能力均随着样品浓度的升高而明显增强，并且发酵后的葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品的羟基自由基清除能力的升高幅度高于发酵前的羟基自由基清除能力的升高幅度。从附图21中还可以看出，在样品浓度均为10％的情况下，发酵前葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品的羟基自由基清除能力是GSH羟基清除能力的约2.5倍，是VC羟基清除能力的约2.25倍；发酵后的葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品的羟基自由基清除能力是GSH羟基自由基清除能力的约2.86倍，是VC羟基清除能力的约2.55倍。发酵前、后的葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品的羟基自由基清除能力均远远高于同等浓度下的两个阳性对照组的羟基自由基清除能力，体现出了葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品具有明显的清除羟基自由基的能力。
5.葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品超氧阴离子自由基清除率的测定
取0.5mL待测液，加入3mL蒸馏水和4.5mL三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液，混合均匀，置于25℃恒温培养10min后，加入0.1mL的邻苯三酚(0.6mol/L)摇匀，静置3min后加入1mL的浓盐酸(10mol/L)，测定325nm波长处的吸光值A1，用蒸馏水代替待测液作为空白对照，测定325nm波长处的吸光值A0。按照公式(4-3)计算待测液的超氧阴离子自由基清除率。
超氧阴离子自由基清除率＝[(A0-A1)/A0]×100％ 式3
由附图22可看出，在相同浓度下，葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品在发酵前、后超氧阴离子自由基清除能力均高于GSH、VC两个阳性对照组。当样品浓度为10％时，发酵前的葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品的超氧阴离子自由基清除能力是GSH超氧阴离子自由基清除能力的3.9倍，是VC超氧阴离子自由基清除能力的约2.38倍；发酵后的葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品的超氧阴离子清除能力是GSH超氧阴离子自由基清除能力的约4.6倍，是VC超氧阴离子自由基清除能力的约2.81倍。并从附图22中得出，发酵前、后葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品的超氧阴离子自由基清除率均随着样品浓度的增加而增加。在浓度0.5-6％阶段，发酵前的葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品的超氧阴离子自由基清除率从21.21±1.11％增长为30.34±2.23％，提高了9.13％；发酵后的葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品的超氧阴离子自由基清除率从31.55±0.88％增长为43.21±1.52％，提高了11.66％，增长均较为缓慢；在浓度6-10％阶段，发酵前的葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品的超氧阴离子自由基清除率从30.34±2.23％增长为69.88±1.21％，提高了39.54％，发酵后的葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品超氧阴离子自由基清除率从43.21±1.52％增长到82.56±1.62％，提高了39.35％，超氧阴离子自由基清除能力均迅速增强。可能是由于葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品在较高浓度的情况下，有效抑制了自氧化的反应。
6.葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品总还原力的测定
取2.5mL待测液，加入2.5mL 1％铁氰化钾溶液混匀，置于50℃水浴反应20min。取出后加入2.5mL 10％三氯乙酸混匀，以8000rpm离心10min。取上清液2.5mL，加蒸馏水2.5mL、0.1％氯化铁0.5mL，混合均匀，静置10min后，测定700nm波长处的吸光值A700。
由附图23可看出，发酵前、后的葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品的总还原能力均高于相同浓度的GSH、VC两个阳性对照。在浓度为10％时，发酵前的葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品的总还原力是GSH的总还原力的约3.6倍，是VC的总还原力的约2.37倍；发酵后的葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品的总还原力是GSH总还原力的约4.13倍，是VC总还原力的约2.71倍。同时得出，发酵前、后的葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品和GSH、VC阳性对照组的总还原力均随着浓度的增加而提高。浓度在0.5-6％时，发酵前的葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品的总还原力从0.234±0.027增长到0.795±0.036，增长了0.561；发酵后的葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品的总还原力从0.638±0.024增长到1.154±0.022，增长了0.516，总还原力明显提高；浓度在6-10％时，发酵前的葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品的总还原力从0.795±0.036增长到1.068±0.025，提高了0.273；发酵后的葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品的总还原力从1.154±0.022增长到1.223±0.028，增长了0.069，总还原力的增长较缓慢。
综上结果表明：试验通过测定本发明提供的葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品发酵前、后及0.5mg/mL的GSH、0.5mg/mL的VC为阳性对照组的DPPH自由基清除率、羟基自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率和总还原力，对葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品的抗氧化性进行评价。比较葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品发酵前、后自由基清除能力及总还原力，结果表明，葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品在发酵前具有较高的抗氧化性，并在发酵后抗氧化性有所提高，发酵前、后其自由基清除率和总还原力均高于0.5mg/mL的GSH、0.5mg/mL的VC两个阳性对照组，并且在样品浓度相同的条件下，发酵后的葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品的各项自由基的清除率和总还原力＞发酵前的葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品＞0.5mg/mL的VC溶液＞0.5mg/mL的GSH溶液。说明葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品具有较好的抗氧化性，并且通过乳杆菌混合发酵后，抗氧化能力得到有效的提高。
经体外抗氧化性试验，测定总酚含量、自由基清除率，结果显示，本发明提供的葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品的总酚含量经发酵后增高，自由基清除率也随着样品浓度的增大而增强，并且高于阳性对照组。表明葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品具有良好的抗氧化性。
如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。
序列表
<110> 新疆农业大学
<120> 一种乳杆菌WTMX-2及其在发酵复合饮品中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1440
<212> DNA
<213> 乳杆菌(Lactobacillus sp.)
<400> 1
ccttagcggc tggttcctaa aggttacccc accgactttg ggtgttacaa actctcatgg 60
tgtgacgggc ggtgtgtaca aggcccggga acgtattcac cgcggcatgc tgatccgcga 120
ttactagcga ttccgacttc atgtaggcga gttgcagcct acaatccgaa ctgagaatgg 180
ctttaagaga ttagcttact ctcgcgagtt cgcaactcgt tgtaccatcc attgtagcac 240
gtgtgtagcc caggtcataa ggggcatgat gatttgacgt catccccacc ttcctccggt 300
ttgtcaccgg cagtctcacc agagtgccca acttaatgct ggcaactgat aataagggtt 360
gcgctcgttg cgggacttaa cccaacatct cacgacacga gctgacgaca accatgcacc 420
acctgtatcc atgtccccga agggaacgtc taatctctta gatttgcata gtatgtcaag 480
acctggtaag gttcttcgcg tagcttcgaa ttaaaccaca tgctccaccg cttgtgcggg 540
cccccgtcaa ttcctttgag tttcagcctt gcggccgtac tccccaggcg gaatgcttaa 600
tgcgttagct gcagcactga agggcggaaa ccctccaaca cttagcattc atcgtttacg 660
gtatggacta ccagggtatc taatcctgtt tgctacccat actttcgagc ctcagcgtca 720
gttacagacc agacagccgc cttcgccact ggtgttcttc catatatcta cgcatttcac 780
cgctacacat ggagttccac tgtcctcttc tgcactcaag tttcccagtt tccgatgcac 840
ttcttcggtt gagccgaagg ctttcacatc agacttaaaa aaccgcctgc gctcgcttta 900
cgcccaataa atccggacaa cgcttgccac ctacgtatta ccgcggctgc tggcacgtag 960
ttagccgtgg ctttctggtt aaataccgtc aatacctgaa cagttactct cagatatgtt 1020
cttctttaac aacagagttt tacgagccga aacccttctt cactcacgcg gcgttgctcc 1080
atcagacttt cgtccattgt ggaagattcc ctactgctgc ctcccgtagg agtttgggcc 1140
gtgtctcagt cccaatgtgg ccgattaccc tctcaggtcg gctacgtatc attgccatgg 1200
tgagccgtta ccccaccatc tagctaatac gccgcgggac catccaaaag tgatagccga 1260
agccatcttt caaactcgga ccatgcggtc caagttgtta tgcggtatta gcatctgttt 1320
ccaggtgtta tcccccgctt ctgggcaggt ttcccacgtg ttactcacca gttcgccact 1380
cactcaaatg taaatcatga tgcaagcacc aatcaatacc agagttcgtc gactgcatgt 1440

Claims (4)

1.一种适用于发酵葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品的乳杆菌(Lactobacillus sp.)WTMX-2，其特征在于，所述的乳杆菌(Lactobacillus sp.)WTMX-2保藏编号为CGMCC No.14605，基因序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种由乳杆菌(Lactobacillus sp.)WTMX-2CGMCC No.14605制备的葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品，其特征在于，通过如下制备方法获得：
(1)菌种的活化：将4℃下保存的乳杆菌(Lactobacillus sp.)WTMX-2CGMCC No.14605在无菌环境下接种于MRS培养基，置于37℃培养24h，恒温保藏备用；
(2)葡萄籽预处理：筛选颗粒完整，无虫蛀的优质葡萄籽，清洗干燥后的放入600W烘焙环境1-2min后，室温下贮藏备用；
(3)鹰嘴豆预处理：选用颗粒饱满，无霉变的鹰嘴豆，使用质量浓度为0.3％碳酸氢钠溶液浸泡12h，使组织充分软化，利于打浆；清水将原料进行清洗，清洗3-5次，剥去外皮；室温下贮藏备用；
(4)葡萄籽鹰嘴豆汁混合液的制备：按质量百分比计，分别将5.8％的步骤(2)获得的葡萄籽与步骤(3)获得的鹰嘴豆混合均匀，加入纯净水打浆，过滤后室温下保存备用；
(5)母发酵液的制备：按体积百分比计，将10％的步骤(4)得到的葡萄籽鹰嘴豆汁混合液均分装于发酵容器中，在无菌条件下，将按步骤(1)活化的乳杆菌(Lactobacillus sp.)WTMX-2CGMCC No.14605按3％接种比例接入发酵容器中，培养条件为37℃培养24h、恒温保藏备用；
(6)发酵：将步骤(5)制备的乳杆菌(Lactobacillus sp.)WTMX-2CGMCC No.14605发酵液加入步骤(4)制备的剩余90％葡萄籽鹰嘴豆汁混合液中，在37℃下培养24h-72h，发酵终点设定为：测定总酸达到33.10°T，p H值达到3.30；
(7)后处理：待产品至发酵终点后，闪蒸杀菌，发酵复合饮品冷却后进行无菌灌装制备获得葡萄籽鹰嘴豆复合发酵饮品。
3.如权利要求1所述乳杆菌(Lactobacillus sp.)WTMX-2制备的葡萄籽鹰嘴豆发酵复合饮品。
4.如权利要求1所述乳杆菌(Lactobacillus sp.)WTMX-2在制备的葡萄籽鹰嘴豆饮料的应用。
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