CN105368736A - 一株醋酸杆菌及其在咖啡果皮肉发酵醋中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株醋酸杆菌及其在咖啡果皮肉发酵醋中的应用。具体而言，本发明提供一株新的巴氏醋杆菌菌株及其在醋酸发酵中的应用，菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2015年6月23日，保藏编号为CGMCC？No.11014。本发明还提供利用本发明分离鉴定的巴氏醋杆菌菌株发酵咖啡果皮肉生产咖啡果醋的方法，包括咖啡果皮肉汁液的制备、纤维素酶处理、糖度调整、杀菌、酒精发酵、醋酸发酵等步骤。利用本发明的巴氏醋杆菌菌株发酵咖啡果皮肉制得的咖啡果醋澄清透明，理化指标和微生物指标完全符合酿造食醋的国家标准。

Description

一株醋酸杆菌及其在咖啡果皮肉发酵醋中的应用

技术领域

本发明属于微生物发酵和食品领域，具体属于醋酸菌发酵食品领域。

背景技术

咖啡是目前世界上消费量最大的一种饮料，其与茶、可可并称为世界三大饮料。咖啡树属于茜草科咖啡属的常绿小乔木或灌木，是重要热带经济作物。成熟的咖啡果实为红色浆果，包括外果皮、果肉、内果皮(又称“羊皮”或“纸皮”)、银皮和种子。我们通常喝的咖啡就是由咖啡果的种子烘焙后经过研磨、冲泡等步骤制作成的。在咖啡加工时，需将咖啡果皮、果肉去掉，取中间的咖啡豆来使用。咖啡种子(咖啡豆)以外的部分，通常被当作废物丢弃。每加工1吨鲜咖啡果，就有43～50％的果皮果肉副产品，这些咖啡果皮肉通常被当成垃圾废弃物处理。虽然国内外已有将咖啡果皮肉加工成饲料的报道，但其售价低廉，且未实现规模化生产。随着咖啡种植业的增长和咖啡加工业的迅速发展，每年都有大量的咖啡果皮肉资源被浪费。由于咖啡果皮肉容易腐败变质，如果处理不及时易造成环境污染，并且将咖啡果皮肉当作废弃物处理还增加了企业负担，严重阻碍了咖啡产业的发展。因此，针对咖啡加工过程中废弃的咖啡果皮肉进行综合开发应用，充分利用其潜在价值，具有很好的经济价值和社会效益。

现代研究表明，每天喝咖啡可以预防酒精中毒、肝硬化、肥胖、胆结石、痛风、Ⅱ型糖尿病和保护心血管系统等。咖啡之所以有此类保健功效，主要源自其中的生物活性成分多酚类化合物和生物碱类物质。作为咖啡果实的一部分，咖啡果皮肉也含有多酚类化合物和生物碱类物质，且经过卫生学、营养学和安全毒理学检验，证明咖啡果肉安全无毒。

目前对于咖啡果皮肉发酵果醋的研究极少。中国专利申请第200510037441.X公开了一种以咖啡果皮与粘液制造咖啡酒与咖啡醋的方法，其在酒精发酵后，添加的是种醋，不是纯的醋酸菌菌种。由于醋酸菌菌种是决定果醋产量和质量的主要因素之一，不同醋酸菌菌种的特性不相同，其繁殖能力和产酸能力不相同，发酵后形成的果醋品质和风味也存在很大差异。因此，在果醋发酵过程中，选择适宜的醋酸菌及对菌种进行驯化，是果醋风味物质形成的关键。目前尚没有发酵性能较好的咖啡果醋的专用醋酸菌。因此，筛选和开发适合于发酵果醋尤其是利用咖啡果皮果肉发酵咖啡果醋的专用醋酸菌以及研究咖啡果醋的发酵工艺是目前亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的之一是解决本领域存在的上述问题。为实现该目的，本发明第一方面提供一株巴氏醋杆菌(Acetobacterpasteurianus)菌株，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2015年6月23日，保藏编号为CGMCCNo.11014。

本发明第二方面提供根据本发明的巴氏醋杆菌菌株在醋酸发酵中的应用。在一个优选实施方式中，所述醋酸发酵的产物是食醋，优选果醋，更优选用咖啡果皮肉或石榴制备的咖啡果醋或石榴果醋。

本发明第三方面提供一种用咖啡加工过程中废弃的咖啡果皮肉发酵生产果醋的方法，包括以下步骤：

(1)咖啡果皮肉汁液的制备：对果皮肉进行破碎和均质化处理，以获得咖啡果皮肉汁液；

(2)纤维素酶处理咖啡果皮肉汁液：将步骤(1)得到的咖啡果皮肉汁液加纤维素酶酶解；

(3)糖度调整：将步骤(2)酶解过的咖啡果皮肉汁加入糖调整其发酵的初始糖度；

(4)杀菌处理：对步骤(3)获得的咖啡果皮肉汁液进行杀菌处理；

(5)酒精发酵：向经步骤(4)杀菌处理的咖啡果皮肉汁液中加入酵母进行酒精发酵，得到咖啡果酒；

(6)醋酸发酵：用本发明的巴氏醋杆菌菌株对步骤(5)获得的咖啡果酒进行醋酸发酵，以获得咖啡果醋。

一个优选实施方式中，步骤(2)的纤维素酶处理步骤中，纤维素酶：咖啡果皮肉汁：水的重量比为1:2～50:20～300，酶解温度25～42℃，酶解时间1～5h。

一个优选实施方式中，步骤(3)糖分调整所述糖为蔗糖、葡萄糖、果糖、果葡糖浆中的一种或一种以上混合物，调整糖度为10～20％Brix。

一个优选实施方式中，步骤(4)的杀菌方式是煮沸或巴氏杀菌(例如65～80℃加热20～30min)。

另一个优选实施方式中，步骤(5)的酒精发酵工艺参数为：酵母添加量为体积百分比4～12％，酵母菌种子培养液浓度不低于1.0×108个/ml，发酵温度20～40℃，发酵时间为2～7d。

另一个优选实施方式中，步骤(6)的醋酸发酵中，醋酸菌接种量为5～15％，醋酸菌种子培养液浓度不低于1.0×108个/ml，发酵温度为25～40℃，发酵初始酒精度为4～12％，至发酵液中酸度不再上升时停止发酵，优选发酵时间为3～10d。

另一个优选实施方式中，步骤(6)的醋酸发酵之后还包括使获得的咖啡果醋澄清、杀菌和陈酿的步骤。

本发明第四方面提供一种用石榴发酵生产果醋的方法，包括以下步骤：

(1)石榴汁的制备：石榴去除外种皮和内种皮，取籽粒加入水榨汁，均质，得到石榴汁备用；

(2)糖度调整：向步骤(1)的石榴汁中加入糖，使其糖度为12～15％Brix；

(3)杀菌处理：将步骤(2)获得的石榴汁进行杀菌处理；

(4)酒精发酵：用酵母对步骤(3)获得的石榴汁进行酒精发酵，获得石榴果酒；

(5)醋酸发酵：用本发明的巴氏醋杆菌菌株对步骤(4)获得的石榴果酒进行醋酸发酵，以获得石榴果醋。

本发明的优点及益处包括但不限于：

本发明提供的巴氏醋杆菌菌株易在酸性且含酒精的环境中生长，是一株产酸能力强、发酵性能优良且传代稳定性较好的醋酸菌。在实验过程中，利用该菌在接种量为9％，30℃发酵，可使咖啡果醋酸度达7.2g/100ml，具有较好的耐酸能力。该菌株在初始酒精度为10％的条件下进行醋酸发酵，咖啡果醋总酸含量仍能达到5.1g/100ml，具有良好的耐酒精能力。

利用该菌株发酵制得的咖啡果醋具有咖啡果的特殊香气，且含有咖啡中的天然咖啡因成分和多酚类物质，使其具有与咖啡类似的保健功效。

保藏信息

本发明分离鉴定的巴氏醋杆菌(Acetobacterpasteurianus)菌株，命名为CFAc10，已于2015年6月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCCNo.11014。

附图说明

图1显示了从咖啡果皮肉酿制的咖啡果酒中分离得到的31株醋酸菌的产酸量。

图2是根据CFAc10菌株16SrDNA序列构建的NJ树。

具体实施方式

下面通过参考附图和具体实施方式对本发明作进一步的详细阐述，但这些阐述并不对本发明做任何形式的限定。除非另有说明，否则本文所用的所有科学和技术术语，例如，醋、食醋、果醋等，具有本发明所属和相关技术领域的一般技术人员通常理解的含义。除非另有说明，否则所用比例是重量比，份数是重量份。

咖啡树产生的果实通常称为咖啡浆果，其成熟采摘时变为鲜红色。咖啡浆果包括红色表皮即外果皮、果肉、内果皮(羊皮状覆盖物)、银皮(膜状，又称种皮)和种子。咖啡浆果不能直接食用，通常喝的咖啡是由咖啡果的种子即咖啡豆经烘焙等步骤而制成的，在加工过程中，需要去除咖啡豆以外的所有各层。在本发明中，术语“咖啡果皮肉”、“咖啡果皮和果肉”和“咖啡加工过程中废弃的咖啡果皮肉”可以互换使用，指包括咖啡浆果的外果皮和/或果肉，这些外果皮和/或果肉通常在咖啡制作过程中被当作废弃物丢弃；某些情况下，也可能包括内果皮和银皮，但这些不是必须的。

咖啡果醋及其醋饮料的研发是综合利用咖啡果皮果肉的有效途径之一。咖啡果皮肉营养成分较为丰富，含糖量适中，具有咖啡果实独特的香气，适合加工成果醋产品，其含有的天然咖啡因成分、多酚类物质能够较好地保留在果醋中，使其具有一定的保健功效。因此，以咖啡果皮肉为原料开发果醋产品，前景十分广阔，不仅能够实现咖啡加工废弃物的充分利用、避免有限资源的浪费，提高咖啡加工附加值，促进咖啡产业行业的发展，还能为果醋行业的产品开发提供新思路。

本发明提供一株新的巴氏醋杆菌(Acetobacterpasteurianus)菌株，命名为CFAc10，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏日期为2015年6月23日，保藏编号为CGMCCNo.11014。

本发明的醋酸菌菌株CFAc10(或在本文中简称为本发明的醋酸菌菌株、本发明的菌株、或根据本发明的菌株等)是发明人从利用咖啡果皮肉酿制的咖啡果酒中分离得到的。在筛选到的31个醋酸菌菌株中，CFAc10菌株的产酸量最高(参见，图1)，且传代性能稳定(参见下表1)。

根据常规的菌种鉴定方法对筛选到的醋酸菌菌株CFAc10从培养特征、形态特征、生理生化特征等方面进行观察和鉴定。经鉴定，醋酸菌菌株CFAc10的培养特征为：在含CaCO₃的固体培养基上，菌落形态为圆形，表面光滑，菌落周围有明显的碳酸钙溶解圈；在含乙醇的液体培养基中培养，培养基变浑浊，有明显的醋酸味。在含30％的葡萄糖培养基上不生长。形态特征为：革兰氏阴性菌；细胞为短杆状，0.8～1.2μm×1.4～2.5μm，单生或偶尔成短链，不产芽孢。生理生化特征：能氧化乙酸，氧化乙醇，接触酶阳性，甲基红试验阳性，生酮试验阴性，葡萄糖产酸试验阳性，不能利用柠檬酸盐，不能水解淀粉，不能液化明胶。在以上结果的基础上，根据《伯杰氏细菌鉴定手册》(第8版)和《常见细菌系统鉴定手册》，初步将CFAc10菌株鉴定为巴氏醋杆菌(Acetobacterpasteurianus)。

继而分析了CFAc10菌株的16SrDNA序列。系统发育分析(参见，图2)表明，在系统发育树上CFAc10菌株与巴氏醋杆菌非常接近，基因序列相似性为99％。因此，结合该CFAc10菌株的形态学特征、生理生化特征、16SrDNA测序结果，将其鉴定为巴氏醋杆菌(Acetobacterpasteurianus)。

本发明还提供根据本发明的巴氏醋杆菌菌株在醋酸发酵中的应用。在一个优选实施方式中，所述醋酸发酵的产物是食醋，即根据本发明的巴氏醋杆菌菌株在发酵生产食醋中的应用。在一个特别优选的实施方式中，所述食醋是果醋。在一个尤其优选的实施方式中，所述果醋为用咖啡果皮肉制备的咖啡果醋。也就是说，本发明还提供根据本发明的巴氏醋杆菌菌株在利用咖啡果皮肉发酵生产咖啡果醋中的应用。

虽然本发明的巴氏醋杆菌菌株尤其适合用于发酵咖啡果皮肉来生产咖啡果醋，但由于该醋酸菌菌株本身具有发酵性能优异、产酸能力强、传代性能稳定等优良的特性，预期也能够发酵其他常规用于发酵产醋的原料来生产醋，例如发酵各种粮食类、水果类等等。在实施本发明时，可从头开始以各种粮食类或水果类等等为原料经酒精发酵和醋酸发酵等步骤来生产醋；或者，也可以将本发明的巴氏醋杆菌菌株加到已经经过酒精发酵的材料中直接进行醋酸发酵。例如，可从商业途径购得各种含酒精且不含防腐剂的材料，例如咖啡果酒等等，然后用这些含有酒精的物质为原料加入本发明的巴氏醋杆菌菌株来发酵产醋。

本发明还提供一种用咖啡果皮肉发酵生产果醋的方法，即以咖啡果皮和/或果肉为原料生产醋，所述方法包括以下步骤：

(1)咖啡果皮肉汁液的制备：对果皮肉进行破碎和均质化处理，以获得咖啡果皮肉汁液；

(2)纤维素酶处理咖啡果皮肉汁液：将步骤(1)得到的咖啡果皮肉汁液加纤维素酶酶解；

(3)糖度调整：将步骤(2)酶解后的咖啡果皮肉汁加入糖调整其发酵的初始糖度；

(4)杀菌处理：对步骤(3)获得的咖啡果皮肉汁液进行杀菌处理；

(5)酒精发酵：向经步骤(4)杀菌处理的咖啡果皮肉汁液中加入酵母进行酒精发酵；

(6)醋酸发酵：用本发明的巴氏醋杆菌菌株CFAc10对步骤(5)经酒精发酵的咖啡果皮肉汁液进行醋酸发酵。

步骤(1)中，可用打浆机等常规设备对咖啡浆果进行破碎和均质化处理，目的是获得咖啡果皮肉的汁液，以进行后续处理。

一个优选实施方式中，步骤(2)的纤维素酶处理中，纤维素酶：咖啡果皮肉汁：水的重量比为1:2～50:20～300，优选1:5～25:50～200，更优选1:8～20:80～150，最优选1:10:100，例如10份咖啡果皮肉汁，加水100份，加纤维素酶1份。酶解温度25～42℃，优选30～40℃，更优选33～38℃，最优选35℃。酶解时间1～5h，优选2～4h，最优选2.5～3.5h。

本发明测定了新鲜咖啡果皮肉中的基本化学成分，其中咖啡果皮肉约占咖啡果实的46.5％。咖啡果皮肉中含有碳水化合物(24.7％)、总糖(6.82％)、维生素C(8.58mg/100g)等多种丰富的营养物质，可被微生物发酵利用，是酿制果醋的理想原料。但新鲜咖啡果皮肉中也含有较高的粗纤维(3.58％)，会影响咖啡果皮肉的出汁率。因此在发酵咖啡果醋前对咖啡果皮肉汁液进行适当的处理是有利的。因此本发明的方法中优选在发酵咖啡果皮肉之前先用纤维素酶处理，以提高咖啡果皮肉的出汁率。纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，主要由外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等组成，其作用于纤维素以及从纤维素衍生出来的产物。

一个优选实施方式中，步骤(3)的糖分调整为10～20％Brix，优选11～16％Brix，更优选12～14％Brix。所述糖为蔗糖、葡萄糖、果糖、果葡糖浆中的一种或一种以上的混合物。

咖啡果皮肉汁液在处理过程中存在大量微生物，如不进行处理，将影响后续的酒精发酵和醋酸发酵。因此在酒精发酵前最好进行杀菌处理。一个优选实施方式中，上述方法中步骤(4)的杀菌方式是煮沸，优选煮沸7～12min，更优选8～10min。除煮沸之外，本发明的咖啡果皮肉汁液也可采用巴氏杀菌的方式或其他常规灭菌方式灭菌。

另一个优选实施方式中，步骤(5)的酒精发酵工艺参数为：酵母添加量为体积比4～12％(酵母菌种子培养液浓度不低于1.0×108个/ml)，优选6～8％；发酵温度20～40℃，优选27～36℃，更优选30～33℃；发酵时间为2～7d。

本发明方法的酒精发酵步骤中所用酵母优选葡萄酒果酒专用酵母，例如市售的安琪葡萄酒果酒专用酵母。也可以采用其他合适的酵母。

在步骤(6)的醋酸发酵中，向经酒精发酵的咖啡果皮肉中加入本发明的巴氏醋杆菌菌株CFAc10，以发酵产生醋酸。该步骤中，醋酸菌接种量优选为体积比5～15％(醋酸菌种子培养液浓度不低于1.0×108个/ml)，优选8～11％，更优选9～10％。发酵温度25～40℃，优选27～36℃，更优选30～33℃；发酵初始酒精度为4～12％，优选5～10％，更优选8～9％。至发酵液中酸度不再上升时停止发酵，一般为3～10d。

步骤(6)的醋酸发酵之后还优选包括使获得的咖啡果醋澄清、杀菌和陈酿的步骤。例如，醋酸发酵之后，可将制得的咖啡果醋离心分离，得到澄清的果醋。然后可对咖啡果醋进行杀菌处理，例如巴氏杀菌，70～75℃，杀菌5min。杀菌后的咖啡果醋可进行陈酿，例如，在贮藏罐中陈酿至少1个月。

本发明还提供一种用石榴发酵生产果醋的方法，包括以下步骤：

(1)石榴汁的制备：石榴去除外种皮和内种皮，取籽粒加入水榨汁，均质，得到石榴汁备用；

(2)糖度调整：向步骤(1)的石榴汁中加入糖，使其糖度为12～15％Brix；

(3)杀菌处理：将步骤(2)获得的石榴汁进行杀菌处理；

(4)酒精发酵：用酵母对步骤(3)获得的石榴汁进行酒精发酵，获得石榴果酒；

(5)醋酸发酵：用本发明的巴氏醋杆菌菌株对步骤(4)获得的石榴果酒进行醋酸发酵，以获得石榴果醋。

在用石榴发酵生产果醋的上述方法中，糖度调整、杀菌处理、酒精发酵和醋酸发酵等程序可适当地与用咖啡果皮肉发酵生产果醋的方法中所用程序相同或类似。醋酸发酵之后还可包括使获得的石榴果醋澄清、杀菌和陈酿的步骤。

下面将结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不以任何方式限制本发明的范围。本发明的范围仅由所附的权利要求书限定。本领域技术人员在阅读了本公开内容之后，可在不脱离本发明精神和范围的情况下对本发明做出多种改动和变化，这些改动和变化都应认为是本发明实施方式的等同形式而落在本发明的范围内。另外，本申请书中(包括以上说明书和下文的实施例以及权利要求书)阐述的本发明的各个特征可以互相组合而形成新的特征，限于篇幅，本文不再赘述，但需要指出，这些新的特征也在本发明涵盖的范围内。

如无特别说明，本文中所用术语和缩写具有本领域技术人员通常理解的含义，例如，“h”代表小时，“min”代表分钟，“d”代表天，等等。

实施例

实施例1醋酸菌的分离鉴定

醋酸菌的分离鉴定步骤为：

样品(咖啡果酒)→醋酸菌的富集培养→稀释涂布分离→醋酸菌定性试验→醋酸菌的产酸量→筛选优良菌株→传代稳定性试验→生理生化鉴定→分子生物学方法鉴定

样品：该醋酸菌是从发明人利用咖啡果皮肉自酿的咖啡果酒中分离，酿制咖啡果酒的方法参见本文上述制备咖啡果醋方法中的步骤(1)、(2)、(3)、(5)，即不经过杀菌处理。咖啡果采摘自云南省普洱市思茅区种植的咖啡树。

醋酸菌的富集培养：取10ml上述咖啡果酒，加入装有90ml液体培养基(葡萄糖1％、酵母浸粉1％、无水乙醇3％vo1，其余为水，pH值自然)的三角瓶中，30℃、150r/min振荡培养48h后，选择有醋酸味的富集培养液供平板分离。

稀释涂布分离：取醋酸菌富集培养液25ml加入装有225ml生理盐水的三角瓶中，依次稀释至10-2～10-7，分别取10-5～10-7三个稀释度的200μl稀释液涂布在醋酸菌分离培养基(葡萄糖1％，酵母浸粉1％，琼脂粉2％，CaCO₃2％，无水乙醇3％vol，其余为水，pH值自然)平板上，每个稀释度涂布3个平板。30℃培养3～5d，部分菌落周围产生透明溶钙圈，挑取溶钙圈较大的单菌落进行斜面培养3d后，保存于4℃冰箱中备用。

醋酸菌定性试验：将筛选出的菌株分别接种于醋酸菌液体培养基(葡萄糖1％、酵母浸粉1％、无水乙醇3％vo1，其余为水，pH值自然)中，于30℃恒温培养3d后，培养液以4000r/min离心20min以除去菌体等沉淀，吸取5mL上清液，以0.1mol/L氢氧化钠中和至pH值为7.0，将中和的溶液煮沸，加入质量浓度为8％氯化铁溶液数滴，形成红褐色沉淀者为醋酸菌。一共获得31株醋酸菌，分别命名为CFAc1，CFAc2，……，CFAc31。其试管斜面分别于4℃冰箱中保存。

实施例2醋酸菌菌株的产酸量测试

将筛选出的醋酸菌各取1环菌分别接种于100ml醋酸菌液体培养基中，30℃条件下，150r/min振荡培养3d后，采用碱式滴定法测定其产酸量。从中筛选产酸量高的菌株进行复筛。

取上述培养液2ml，加入50ml蒸馏水，再加2～3滴1％的酚酞试剂，用0.1mol/L的NaOH滴定至粉红色30s不褪色为终点。由所耗的NaOH的量来计算样品中的含酸量(以醋酸计)。同法平行操作3次。

产酸量(g/L)＝(V-V₀)×C_NaOH×60/V_样

式中：v为发酵液样品滴定耗用的NaOH的体积数(ml)；

V₀为以空白培养基为对照滴定耗用的NaOH的体积数(ml)；

C_NaOH为NaOH溶液的浓度(mol/L)；

60为醋酸的分子量；

V_样为所取培养液的体积。

结果总结于图1。由图1可知，醋酸菌CFAc10菌株的产酸量最高，其次是CFAc9。

实施例3醋酸菌菌株的传代稳定性试验

对产酸能力较强的CFAc10和CFAc9菌株进行传代培养试验，连续传5次，测定每一代菌株发酵培养后的产酸量。从中筛选出产酸量高且稳定性较好的菌株。

结果总结于下表1。由表1可知，CFAc10菌株的产酸量高且传代性能稳定。

表1CFAc9和CFAc10菌株传代培养的产酸量(g/L)

实施例4醋酸菌菌株CFAc10的分类鉴定

培养特征观察：观察菌株在固体培养基上菌落特征及在含30％的葡萄糖培养基上生长情况。

该菌株在含CaCO₃的固体培养基上，菌落形态为圆形，表面光滑，菌落周围有明显的碳酸钙溶解圈；在含乙醇的液体培养基中培养，培养基变浑浊，有明显的醋酸味。在含30％的葡萄糖培养基上不生长。

形态特征观察：挑取菌落涂片，进行革兰氏染色，在光学显微镜下观察细胞的基本形态、大小、排列特征。

该菌株为革兰氏阴性菌。细胞为短杆状，0.8～1.2μm×1.4～2.5μm，单生或偶尔成短链，不产芽孢。

生理生化特征：分别对该菌株进行乙酸和乙醇的氧化试验、接触酶试验、甲基红试验、生酮试验、利用葡萄糖产酸试验、利用柠檬酸盐试验、淀粉水解和明胶液化试验。

试验结果表明CFAc10菌株能氧化乙酸，氧化乙醇，接触酶阳性，甲基红试验阳性，生酮试验阴性，葡萄糖产酸试验阳性，不能利用柠檬酸盐，不能水解淀粉，不能液化明胶。

在以上生理生化试验的基础上，根据《伯杰氏细菌鉴定手册》(第8版)和《常见细菌系统鉴定手册》，初步将CFAc10菌株鉴定为巴氏醋杆菌。

DNA序列分析：采用细菌DNA提取试剂盒提取该菌株的总DNA，利用引物对27F/1394R扩增菌株的16SrDNA序列，PCR产物回收后送至赛音生物技术(上海)有限公司进行DNA测序。得到的DNA序列在NCBI数据库中进行Blast检索，选择与之同源性较高的序列以及一些已知醋酸菌种类作为参考序列，利用Mega4.1软件构建系统发育树，确定菌株的分类地位。

系统发育分析(图2)表明，在系统发育树上CFAc10菌株属于巴氏醋杆菌非常接近，基因序列相似性为99％。

结合该CFAc10菌株的形态学特征、生理生化特征、16SrDNA测序结果，将其鉴定为巴氏醋杆菌(Acetobacterpasteurianus)。

实施例5

利用巴氏醋杆菌CFAc10发酵咖啡果皮肉酿制咖啡果醋

本实施例中利用巴氏醋杆菌CFAc10发酵咖啡果皮肉酿制咖啡果醋，具体包括以下步骤：咖啡果皮肉汁的制备→纤维素酶处理→糖度调整→杀菌处理→加入酵母菌进行酒精发酵→加入CFAc10菌株进行醋酸发酵→离心分离→杀菌→陈酿→成品

咖啡果皮肉汁液的制备：选择咖啡加工中的丢弃物咖啡果皮肉为原料，用打浆机对果皮肉进行破碎处理，均质，得到咖啡果皮肉汁液备用。

纤维素酶处理咖啡果皮肉汁液：新鲜咖啡果皮肉中含有较高的粗纤维，会影响咖啡果皮肉的出汁率，因此在发酵咖啡果醋前对咖啡果皮肉汁液进行纤维素酶处理。

纤维素酶用量的单因素试验：取10g榨好的咖啡果肉汁数份，加水量均为100ml，分别加入纤维素酶0.5g、1g、1.5g、2g，酶解温度为35℃，酶解时间均为3h，测量可溶性固形物的变化。每个加酶量做三个平行试验。

酶解温度的单因素试验：取10g榨好的咖啡果肉数份，加水量均为100ml，加入纤维素酶1g，分别在25℃、30℃、35℃、40℃条件下，酶解时间均为3h，测量可溶性固形物的变化。每个温度做三个平行试验。

酶解时间的单因素试验：10g榨好的咖啡果肉数份，加水量均为100ml，分别加入纤维素酶1g，酶解温度35℃，酶解时间分别为2.0h、2.5h、3.0h、3.5h，测量可溶性固形物的变化。每个酶解时间做三个平行试验。

单因素试验结果表明，采用10份咖啡果皮肉汁，加水100份，加纤维素酶1～1.5份，酶解温度35℃，酶解时间2.5～3.5h。在上述条件下纤维素酶水解咖啡果皮肉汁可获得较高的可溶性固形物含量。

纤维素酶水解咖啡果皮肉汁的最佳工艺条件：以上述单因素试验所得到的各试验参数的基本范围为依据，采用L9(3³)正交试验确定酶解咖啡果肉的最佳工艺条件。即以纤维素酶用量(分别为0.5g、1g、1.5g)、酶解时间(分别为2.5h、3h、3.5h)、酶解温度(分别为30℃、35℃、40℃)进行了三因素三水平的正交试验。

正交试验结果证明(表2)，纤维素酶水解咖啡果皮肉的过程中，对水解效果的影响因素为酶解时间＞酶解温度＞酶的添加量。纤维素酶处理咖啡果皮肉汁的最佳条件为纤维素酶添加量：咖啡果肉：水＝1：10：100，酶解温度35℃，酶解时间3h。

表2纤维素酶水解咖啡果皮肉的正交试验结果

糖度调整：用蔗糖或葡萄糖调整咖啡果皮肉汁液的初始糖度为10％、12％、14％、16％Brix，调整pH至酸性，杀菌后加入酵母菌进行酒精发酵，测定溶液中酒精的生成量。结果表明糖度为12～14％Brix时酒精发酵效果较好。

杀菌处理：咖啡果皮肉汁液在处理过程中存在大量微生物，如不进行处理，将影响后续的酒精发酵和醋酸发酵。因此在酒精发酵前进行杀菌处理。本发明可采用煮沸8～10min的方式进行杀菌处理，也可采用巴氏杀菌或灭菌的方式处理。经此条件下处理的咖啡果皮肉汁，分别用孟加拉红培养基和营养琼脂培养基检测，均未检测到真菌和细菌。

酒精发酵：采用市售的安琪葡萄酒果酒专用酵母进行咖啡果皮肉汁的酒精发酵。

酵母菌活化：在无菌条件下，按1∶20的比例将酵母加到装有无菌水的三角瓶中，在恒温水浴锅中35～38℃复水活化30～60min。将活化好的酵母液接入麦芽汁斜面培养基中，28℃培养24h，备用。

酵母菌一级扩大培养：在试管中装入咖啡果皮肉汁5mL，115℃灭菌15min，冷却后取2～3环酵母菌接入试管中，放置恒温培养箱中28～30℃培养24h。

酵母菌二级扩大培养：在三角瓶中装入灭菌后的咖啡果皮肉汁100mL，按3％接入一级扩大培养的酵母菌，放置恒温培养箱中28℃培养24h。

酵母接种量对酵母菌酒精发酵影响的单因素试验：将上述二级扩大培养的酵母培养液加入调整后糖度为12％Brix的咖啡果皮肉汁液中，调整pH至酸性，酵母加入量选择4％、6％、8％、10％，在33℃发酵72h，测定发酵液中酒精的生成量。

发酵温度对酵母菌酒精发酵影响的单因素试验：对咖啡果皮肉汁液调整糖度至12％后，调整pH至酸性，选择酶母添加量为8％，发酵温度分别为27℃、30℃、33℃、36℃，发酵72h，测定发酵液中酒精的生成量。

单因素试验结果表明，酵母接种量为6～8％，发酵温度为30～33℃。在上述条件下发酵获得的咖啡果酒酒精度较高，风味和口感也较好。

咖啡果皮肉汁的酒精发酵条件优化：依据响应面中心旋转组合试验设计，考察三因素三水平对咖啡果皮肉汁酒精发酵的影响。根据上述单因素试验所得到的各参数的基本范围，确定酒精发酵的条件和因素水平为：初始糖度分别为10％、12％、14％；酵母添加量分别为6％、8％、10％；发酵温度分别为30℃、33℃、36℃。

根据Box-Behnken设计模型分析得知，咖啡果皮肉酒精发酵的优化工艺参数为：初始糖度12.2％，酵母添加量7.48％，发酵温度30.09℃。在此条件下，酒精度的预测值为6.3731％。为验证该模型的可靠性，根据实际操作，将发酵工艺参数修正为初始糖度12％，酵母添加量7.5％，发酵温度30℃；采用该模型最优化分析所得出的方案进行3次酒精发酵试验，实际测得的酒精度为6.3％±0.2％。在显著性水平p＜0.05的前提下，预测值与实际值无显著性差异。因此，采用响应面分析法优化得到的酒精发酵条件参数准确可靠，具有实用价值。

醋酸发酵：采用本发明分离获得的巴氏醋酸菌CFAc10菌株进行咖啡果皮肉的醋酸发酵。

一级扩大培养：在试管中装入咖啡果皮肉汁5mL，115℃灭菌15min，灭菌后加入无水乙醇3％，冷却后从醋酸菌斜面培养基上取2～3环醋酸菌接入试管中，于30℃，150r/min振荡培养48h。

二级扩大培养:在三角瓶中装入灭菌后的咖啡果皮肉汁100mL，同时加入无水乙醇3％，冷却后按3％的接种量接入一级扩大培养的醋酸菌，于30℃，150r/min振荡培养48h。

接种量对咖啡果醋发酵影响的单因素试验：将上述酿制的咖啡果酒调整酒精度为8％，加入事先培养好的醋酸菌培养液，接种量分别为7％、8％、9％、10％，30℃静置发酵，发酵5d后进行酸度的测定。

发酵温度对咖啡果醋发酵影响的单因素试验：将酿制的咖啡果酒调整酒精度为8％，加入事先培养好的醋酸菌培养液，接种量为8％，分别在27℃、30℃、33℃、36℃恒温条件下静置发酵，发酵5d后进行酸度的测定。

初始酒精度对咖啡果醋发酵影响的单因素试验：将酿制的咖啡果酒调整酒精度为7％，8％，9％，10％加入事先培养好的醋酸菌培养液，接种量为8％，30℃静置发酵，发酵5d后进行酸度的测定。

单因素试验结果表明，醋酸菌接种量为9～10％，发酵温度为30～33℃，发酵初始酒精度为8～9％。在上述条件下发酵获得的咖啡果醋的总酸含量较高。

咖啡果醋的醋酸发酵条件优化：按照响应面中心旋转组合试验设计，考察三因素三水平对咖啡果醋的醋酸发酵的影响。根据上述单因素试验所得到的各参数的基本范围，确定酒精发酵的条件和因素水平为：醋酸菌添加量分别为8％、9％、10％；发酵温度分别为27℃、30℃、33℃；初始酒精度分别为7％、8％、9％。

根据Box-Behnken设计模型分析得知，咖啡果醋的醋酸发酵优化工艺参数为：醋酸菌接种量9.03％，发酵温度30.18℃，初始酒精度8.14％。在此条件下，总酸含量预测值为7.1758g/100ml。为验证该模型的可靠性，根据实际操作，将发酵工艺参数修正为醋酸菌接种量9％，发酵温度30℃，初始酒精度8％；采用该模型最优化分析所得出的方案进行3次醋酸发酵试验，实际测得的总酸含量为7.2g/100ml。在显著性水平p＜0.05前提下，预测值与实际值无显著性差异。因此，采用响应面分析法优化得到的咖啡果醋的醋酸发酵条件参数基本准确可靠，具有一定的实用价值。

离心分离：将发酵制得的咖啡果醋4000r/min离心10min，得到的果醋澄清度很好。

咖啡果醋杀菌：将发酵得到的咖啡果醋进行巴氏杀菌，70～75℃，杀菌5min。

陈酿：杀菌后的咖啡果醋在贮藏罐中陈酿至少1个月。

咖啡果醋成品检验

本发明利用咖啡果皮肉发酵制得的咖啡果醋的感官评价为：在色泽方面，呈深琥珀色；在香味方面，具有浓郁的醋香和咖啡果实特有的芳香气，气味柔和；在口味方面，其酸味柔和爽口，无异味，滋味纯正；在状态方面，其澄清透明，组织细腻，无沉淀，无肉眼可见外来杂质。

制得的咖啡果醋中总酸含量(以乙酸计)为6.7～7.2g/100ml，可溶性固形物为2.0～2.2％，pH值为3.2～3.4。咖啡因含量为11～13mg/L，总酚酸含量为0.9～1.2mg/ml，其理化指标和微生物指标完全符合酿造食醋的国家标准。

实施例6利用巴氏醋杆菌CFAc10发酵石榴酿制果醋

(1)石榴汁的制备：选择产自云南省蒙自县的新鲜甜石榴为原料，去除外种皮和内种皮，取籽粒加入一定量的水(重量比1:1)榨汁，均质，得到石榴汁备用。

(2)糖度调整：向步骤(1)的石榴汁中加入蔗糖，使其糖度为12～15％Brix。

(3)杀菌处理：将步骤(2)获得的石榴汁进行杀菌处理。采用煮沸8～10min的方式进行。

(4)酒精发酵：采用市售的安琪葡萄酒果酒专用酵母进行石榴汁的酒精发酵。先将酵母菌进行活化，按10％的接种量接入步骤(3)获得的石榴汁中进行扩大培养。将经扩大培养的酵母菌液作为种子培养液，按10％的接种量接种到步骤(3)获得的石榴汁中进行酒精发酵。发酵温度为28℃，发酵时间5d。获得石榴果酒。

(5)醋酸发酵：采用本发明分离获得的巴氏醋酸菌CFAc10菌株按10％的接种量对步骤(4)获得的石榴果酒进行醋酸发酵。发酵温度为30℃，发酵时间为5～10d，至发酵液中酸度不再上升时停止发酵。

(6)离心分离：将发酵制得的石榴果醋4000r/min离心10min，得到的果醋澄清度很好。

(7)杀菌：将发酵得到的石榴果醋进行巴氏杀菌，70～75℃，杀菌5min。

(8)陈酿：杀菌后的石榴果醋在贮藏罐中陈酿至少1个月。

利用本发明的巴氏醋杆菌菌株发酵制得的石榴果醋色泽红亮，具有浓郁的醋香和石榴特有的果香，其酸味柔和爽口，且不添加任何防腐剂。

Claims (10)

1.一株巴氏醋杆菌(Acetobacterpasteurianus)菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2015年6月23日，保藏编号为CGMCCNo.11014。

2.如权利要求1所述的巴氏醋杆菌菌株在醋酸发酵中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，醋酸发酵的产物是食醋。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述食醋为用咖啡果皮肉制备的咖啡果醋。

5.一种用咖啡加工过程中废弃的咖啡果皮肉发酵生产果醋的方法，包括以下步骤：

(1)咖啡果皮肉汁液的制备：对果皮肉进行破碎和均质化处理，以获得咖啡果皮肉汁液；

(2)纤维素酶处理咖啡果皮肉汁液：将步骤(1)得到的咖啡果皮肉汁液加纤维素酶酶解；

(3)糖度调整：将步骤(2)酶解过的咖啡果皮肉汁加入糖调整其发酵的初始糖度；

(4)杀菌处理：对步骤(3)获得的咖啡果皮肉汁液进行杀菌处理；

(5)酒精发酵：向经步骤(4)杀菌处理的咖啡果皮肉汁液中加入酵母进行酒精发酵，得到咖啡果酒；

(6)醋酸发酵：用如权利要求1所述的巴氏醋杆菌菌株对步骤(5)获得的咖啡果酒进行醋酸发酵，以获得咖啡果醋。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)的纤维素酶处理步骤中，纤维素酶：咖啡果皮肉汁：水的重量比为1:2～50:20～300，酶解温度为25～42℃，酶解时间为1～5h。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)糖分调整所用糖为蔗糖、葡萄糖、果糖、果葡糖浆中的一种或一种以上的混合物，调整糖度为10～20％Brix。

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(5)的酒精发酵工艺参数为：酵母添加量为体积百分比4～12％，酵母菌种子培养液浓度不低于1.0×108个/ml，发酵温度20～40℃，发酵时间为2～7d。

9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(6)的醋酸发酵中，醋酸菌接种量为体积百分比5～15％，醋酸菌种子培养液浓度不低于1.0×108个/ml，发酵温度为25～40℃，发酵初始酒精度为4～12％，至发酵液中酸度不再上升时停止发酵。

10.一种用石榴发酵生产果醋的方法，包括以下步骤：

(1)石榴汁的制备：石榴去除外种皮和内种皮，取籽粒加入水榨汁，均质，得到石榴汁备用；

(2)糖度调整：向步骤(1)的石榴汁中加入糖，使其糖度为12～15％Brix；

(3)杀菌处理：将步骤(2)获得的石榴汁进行杀菌处理；

(4)酒精发酵：用酵母对步骤(3)获得的石榴汁进行酒精发酵，获得石榴果酒；

(5)醋酸发酵：用如权利要求1所述的巴氏醋杆菌菌株对步骤(4)获得的石榴果酒进行醋酸发酵，以获得石榴果醋。