CN106497982A - 一种α‑葡萄糖苷酶抑制剂及其制备方法 - Google Patents
一种α‑葡萄糖苷酶抑制剂及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106497982A CN106497982A CN201610976308.9A CN201610976308A CN106497982A CN 106497982 A CN106497982 A CN 106497982A CN 201610976308 A CN201610976308 A CN 201610976308A CN 106497982 A CN106497982 A CN 106497982A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- alpha
- preparation
- glucosidase inhibitor
- fermentation
- milk
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
- C12P1/04—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/0102—Alpha-glucosidase (3.2.1.20)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明具体公开了一种α‑葡萄糖苷酶抑制剂的制备方法,包括以下步骤:(a)将牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis)CGMCC No.8333接种于脱脂乳中进行发酵,得到发酵乳;(b)将步骤(a)得到的发酵乳冷冻干燥得到发酵乳冻干粉,在发酵乳冻干粉中加入甲醇浸提,离心取上清,除去甲醇,得到α‑葡萄糖苷酶抑制剂。上述技术方案中的制备方法,首次采用牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis)CGMCC No.8333,以脱脂乳作为培养基进行发酵,并经过冷冻干燥,甲醇浸提,离心,除甲醇,制备得到α‑葡萄糖苷酶抑制剂,披露了牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333具有发酵脱脂乳生成α‑葡萄糖苷酶抑制剂的新用途,拓宽了α‑葡萄糖苷酶抑制剂的来源。同时,上述制备方法操作简单,成本更低,所制备的α‑葡萄糖苷酶抑制剂活性强烈,稳定性更好。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备方法。此外,本发明还涉及一种α-葡萄糖苷酶抑制剂。
背景技术
近年来,糖尿病在全世界广泛流行,目前已成为继肿瘤、心血管疾病之后第三大类严重危害人类健康的慢性疾病。随着我国经济、社会的迅速发展,膳食结构和生活方式的改变,人口老龄化速度的加快,糖尿病的患病率也呈现快速增加的趋势。在糖尿病患病率快速上升的同时,我国糖尿病的知晓率、治疗率及控制率明显偏低。糖尿病已成为一个严重危害我国人群健康的公共卫生问题,对经济社会发展产生越来越严重的影响。
根据发病机制不同,糖尿病分为I型糖尿病(胰岛素依赖型)和II型糖尿病(非胰岛素依赖型),后者约占糖尿病总数的85%以上。迄今为止,治疗II型糖尿病的药物根据治疗机制不同主要分为:(1)促胰岛素分泌剂;(2)胰岛素增敏剂;(3)α-葡萄糖苷酶抑制剂(α-GI)。由于α-GI具有作用温和持久、毒副作用小甚至无毒的优点,因此得到越来越多国内外研究者的青睐。
研究表明,α-葡萄糖苷酶抑制剂(α-GI)可有效地降低糖尿病人的餐后高血糖,作为口服降糖药的一种,其发生作用的场所位于小肠,作用方式是抑制小肠体内的α-葡萄糖苷酶活性,从而达到降低餐后高血糖的目的。如果使用者饮食中碳水化合物占50%以上,则降糖效果更为明显,因此其适用于以碳水化合物为主食的人群,尤其是中老年糖尿病患者。
目前所发现的α-GI虽能克服传统降糖药的一些缺点,但其来源相对狭窄,主要集中于放线菌,导致α-葡萄糖苷酶抑制剂来源不足,这是本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
基于上述技术问题,本发明提供了一种α-葡萄糖苷酶抑制剂制备的新方法,以牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333为发酵菌株,以脱脂乳作为培养基,发酵制得α-葡萄糖苷酶抑制剂,具有强烈的抑制活性。
具体的,一方面,提供了一种α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备方法,包括以下步骤:(a)将牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis)CGMCC No.8333接种于脱脂乳中进行发酵,得到发酵乳;(b)将步骤(a)得到的发酵乳冷冻干燥得到发酵乳冻干粉,在发酵乳冻干粉中加入甲醇浸提,离心取上清,除去甲醇,得到α-葡萄糖苷酶抑制剂。
进一步地,上述步骤(b)中,发酵乳冻干粉中甲醇的添加量为5~15mL/g。
进一步地,上述步骤(b)中,浸提的时间为1~5h。
进一步地,上述步骤(a)中,牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333的接种量为1.25x106~1x107cfu/mL。
进一步地,上述步骤(a)中,脱脂乳包括脱脂乳粉和水,脱脂乳粉占脱脂乳的质量百分比为6~12%。
进一步地,上述步骤(a)中,发酵为振荡培养,振荡速度为100~300rpm。
进一步地,上述步骤(a)中,发酵的温度为20℃~35℃。
进一步地,上述步骤(a)中,发酵的时间为3~12h。
另一方面,还提供了一种α-葡萄糖苷酶抑制剂,由上述任一种制备方法制得。
进一步地,上述α-葡萄糖苷酶抑制剂对α-葡萄糖苷酶的半抑制率浓度IC50≤30mg/mL。
上述技术方案中的制备方法,首次采用牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis)CGMCC No.8333,以脱脂乳作为培养基进行发酵,并经过冷冻干燥,甲醇浸提,离心,除甲醇,制备得到α-葡萄糖苷酶抑制剂,披露了牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333具有发酵脱脂乳生成α-葡萄糖苷酶抑制剂的新用途,拓宽了α-葡萄糖苷酶抑制剂的来源。同时,上述制备方法与超滤等方法相比,操作更加简单,成本更低,适用于工业化生产,并且牛类芽孢杆菌CGMCCNo.8333发酵脱脂乳所制备的α-葡萄糖苷酶抑制剂的活性强烈,稳定性更好。
具体实施方式
为更清楚的对本发明技术方案予以阐述,下面将结合具体实施方式对本发明的技术方案进行进一步阐述:
在一个具体的实施方式中,提供了一种α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备方法,包括以下步骤:(a)将牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis)CGMCC No.8333接种于脱脂乳中进行发酵,得到发酵乳;(b)将步骤(a)得到的发酵乳冷冻干燥得到发酵乳冻干粉,在发酵乳冻干粉中加入甲醇浸提,离心取上清,除去甲醇,得到α-葡萄糖苷酶抑制剂。
上述技术方案中的制备方法,首次采用牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333,以脱脂乳作为培养基进行发酵,并经过冷冻干燥,甲醇浸提,离心,除甲醇,制备得到α-葡萄糖苷酶抑制剂,披露了牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333具有发酵脱脂乳生成α-葡萄糖苷酶抑制剂的新用途,拓宽了α-葡萄糖苷酶抑制剂的来源。同时,牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333发酵脱脂乳所制备的α-葡萄糖苷酶抑制剂的活性强烈,稳定性好。
此外,上述技术方案中的制备方法极大简化了生产步骤,仅需发酵、冻干、浸提、离心、去除甲醇五步,大大减少了传统复杂工艺可能带来的污染问题;其次,整个制备过程不涉及任何有机溶剂,因此从根本上杜绝了有机溶剂残留的问题。制备所采用的发酵培养基来源广泛、成本低廉、天然安全,避免使用化学合成培养基;加上发酵菌种采用牛类芽孢杆菌这一种单一菌种,上述的原料、菌种的组合,有利于产品品质的标准化与工业大规模生产的成本控制。
进一步地,上述步骤(b)中,发酵乳冻干粉中甲醇的添加量为5~15mL/g;较佳为8~13mL/g,更佳为10mL/g。
进一步地,上述步骤(b)中,浸提的时间为1~5h;较佳为2~4h,更佳为3h。
结合实施例亦可知,在优选的甲醇添加量和浸提时间的范围之外时,得到的α-葡萄糖苷酶抑制剂的抑制效果明显下降。
此外,进一步地,上述步骤(b)中,浸提次数为1~5次;较佳为2~4次,更佳为3次。
上述步骤(b)中,上述的冷冻干燥较佳为真空冷冻干燥,真空冷冻干燥条件较佳地为:板层极限温度≤-60℃,冷阱极限温度-70℃,板层装料厚度0.5~2.0mm,真空度10~30Pa。
上述步骤(b)中,上述离心的速度为8,000~12,000g;更佳地为10000~11000g。离心的时间较佳地为5~10分钟,更佳地为6~8分钟。
上述步骤(b)中,除去甲醇可以采用减压蒸发的方法,如旋转蒸发,平行蒸发等。
进一步地,步骤(a)中,牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333的接种量为1.25x106~1x107cfu/mL;较佳地为2.5x106~7.5x106cfu/mL,更佳地为5x106cfu/mL。
进一步地,上述步骤(a)中,脱脂乳可以是新鲜的脱脂乳,也可以是配制而成的脱脂乳。优选的为配制的脱脂乳,配制的脱脂乳包括脱脂乳粉和水,脱脂乳粉占脱脂乳的质量百分比为6~12%。制备方法可以包括以下步骤:在蒸馏水中加入脱脂乳粉,混匀充分溶解后,95~125℃灭菌5~20分钟,冷却即得。
进一步地,上述步骤(a)中,优选的发酵温度为20℃~35℃;较佳地为25℃~35℃;更佳地为30℃。
进一步地,上述步骤(a)中,优选的发酵时间为3~12h;较佳地为6~12小时;更佳地为6小时。
进一步地,上述步骤(a)中,优选的发酵方式为振荡培养,振荡速度为100~300rpm;较佳地为150~250rpm;更佳地为200rpm。
结合实施例亦可知,在优选发酵参数的范围之外时,牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333发酵脱脂乳,再经过冷冻干燥,甲醇浸提,离心,除甲醇后得到的α-葡萄糖苷酶抑制剂的抑制效果明显下降。例如,在接种量过少时,菌种繁殖速度慢,使得最终获得的α-葡萄糖苷酶抑制剂的活性低于优选的接种量范围;当接种量过多时,一定时间后菌种个体因生存空间及营养的限制而死亡或停滞生长,不利于代谢物的积累,也使得最终获得的α-葡萄糖苷酶抑制剂的活性低于优选的接种量范围。又例如,当发酵温度低于优选范围值时,菌种代谢缓慢,会导致α-葡萄糖苷酶抑制剂的活性有所降低。还例如,发酵的振荡速度低于优选范围时,菌种发酵的溶氧量不够,生产和代谢受到限制,导致α-葡萄糖苷酶抑制剂的活性降低。
在另一个具体的实施方式中,提供了一种α-葡萄糖苷酶抑制剂,由上述的任一种制备方法制得。
上述制备方法具备上述有益效果,因此,由上述制备方法所制得的α-葡萄糖苷酶抑制剂也具备相应的有益效果,此处不再赘述。
进一步的,上述α-葡萄糖苷酶抑制剂对α-葡萄糖苷酶的半抑制率浓度IC50≤30mg/mL。结合实施例亦可知,上述α-葡萄糖苷酶抑制剂的抑制活性显著高于其他常规脱脂乳发酵菌株。
下面通过实施例进一步说明上述具体实施方式,但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,按照常规方法和条件,或按照商品说明书选择。实施例中所使用的试剂若未加说明,均为分析纯试剂,购买自国药集团。其他试验仪器、试剂、菌种,如未做特别说明,均可通过商业途径直接购得。
实施例1
1、材料与方法
(a)种子(发酵菌种)的制备:将牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333(该菌株的来源请参见公开号为CN 103740618A的中国专利)的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解,用接种环取一环划线于TYC固体培养基(购买自OXOID Co.,英国),30℃好氧培养48h取出,用接种环挑取单菌落放入10mL TYC液体培养基(购买自OXOID Co.,英国),运用涡旋振荡器将菌落均匀分散于液体培养基内,30℃、180rpm振荡培养24h取出,以2%(v/v)接种量接种于TYC液体培养基(购买自OXOID Co.,英国),30℃、180rpm振荡培养24h后,培养物15,000rpm离心10分钟,弃去上清,菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后,用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮,得到发酵用的种子,种子液的菌浓度为2.5x108cfu/mL。
(b)脱脂乳的制备:将质量百分比为10%的脱脂乳粉与蒸馏水混匀,充分溶解后,在125℃下灭菌5min,冷却至室温,即得所需浓度的脱脂乳。
(c)待测样品制备:将α-葡萄糖苷酶抑制剂溶解于无菌水中,pH调节至6.80,再4℃、10,000rpm离心10min,取上清,pH调节至6.80,再次4℃、10,000rpm离心10min,取得的上清即可用于α-葡萄糖苷酶抑制活性的检测。
α-葡萄糖苷酶抑制活性的检测:取100μL待测样品于1.5mL EP(Eppendorf)管,接着加入50μLα-葡萄糖苷酶(100mU/mL,sigma,美国),混匀,37℃温育15min,然后加入80μL2mM的PNPG(sigma,美国),混匀,37℃反应15min,最后加入80μL 0.2M的Na2CO3终止反应,再4℃、10,000rpm离心2min,取200μL上清于96孔微孔板(Greinerbio-one,德国),在405nm波长下用Spectra Max M5多功能酶标仪(MolecularDevices,美国)测定吸光度值。待测样品对α-葡萄糖苷酶的抑制活性如以下公式所示:
其中:阴性对照组为空白脱脂乳替代待测样品;
阴性空白组为0.1M、pH=6.8的磷酸盐缓冲液(PBS)替代阴性对照组中的α-葡萄糖苷酶;
样品空白组为PBS替代待测样品组中的α-葡萄糖苷酶。
α-葡萄糖苷酶半抑制率浓度IC50的测定:以倍半稀释的方法将待测样品溶液进行稀释,获得不同浓度的待测样品组,利用上述检测方法测定不同浓度的待测样品对α-葡萄糖苷酶的抑制率,根据浓度与α-葡萄糖苷酶抑制率构成的线性关系计算得出样品对α-葡萄糖苷酶的半抑制率浓度(IC50)。
2、α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备
将牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333种子以接种量2%(v/v)无菌接种于10%(w/w)脱脂乳,30℃、200rpm培养6小时得发酵乳。
将发酵乳冷冻干燥,以10mL/g冻干粉的添加量加入甲醇混匀,浸提3h,浸提3次,再8,000g离心10min取上清,旋转蒸发除去甲醇,得α-葡萄糖苷酶抑制剂产品A。
3、α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定
将α-葡萄糖苷酶抑制剂产品A以上述方法制备为待测样品后测定其对α-葡萄糖苷酶抑制活性,结果表明该产品A对α-葡萄糖苷酶的半抑制率浓度IC50=22mg/mL。
实施例2
1、材料与方法
(a)种子(发酵菌种)的制备:同实施例1。
(b)脱脂乳的制备:将质量百分比为12%的脱脂乳粉与蒸馏水混匀,充分溶解后,在95℃下灭菌20min,冷却至室温,即得所需浓度的脱脂乳。
(c)待测样品制备:同实施例1。
2、α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备
将牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333种子以接种量0.5%(v/v)无菌接种于12%(w/w)脱脂乳,35℃、100rpm培养12小时得发酵乳。
将发酵乳冷冻干燥,以5mL/g冻干粉的添加量加入甲醇混匀,浸提1h,浸提5次,再10,000g离心8min取上清,旋转蒸发除去甲醇,得α-葡萄糖苷酶抑制剂产品B。
3、α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定
将α-葡萄糖苷酶抑制剂产品B以上述方法制备为待测样品后测定其对α-葡萄糖苷酶抑制活性,结果表明该产品B对α-葡萄糖苷酶的半抑制率浓度IC50=29mg/mL。
实施例3
1、材料与方法
(a)种子(发酵菌种)的制备:同实施例1。
(b)脱脂乳的制备:将质量百分比为6%的脱脂乳粉与蒸馏水混匀,充分溶解后,在100℃下灭菌15min,冷却至室温,即得所需浓度的脱脂乳。
(c)待测样品制备:同实施例1。
2、α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备
将牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333种子以接种量4%(v/v)无菌接种于6%(w/w)脱脂乳,20℃、300rpm培养3小时得发酵乳。
将发酵乳冷冻干燥,以15mL/g冻干粉的添加量加入甲醇混匀,浸提5h,浸提1次,再12,000g离心5min取上清,平行蒸发除去甲醇,得α-葡萄糖苷酶抑制剂产品C。
3、α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定
将α-葡萄糖苷酶抑制剂产品C以上述方法制备为待测样品后测定其对α-葡萄糖苷酶抑制活性,结果表明该产品C对α-葡萄糖苷酶的半抑制率浓度IC50=25mg/mL。
实施例4
1、材料与方法
(a)种子(发酵菌种)的制备:同实施例1。
(b)脱脂乳的制备:将质量百分比为8%的脱脂乳粉与蒸馏水混匀,充分溶解后,在120℃下灭菌10min,冷却至室温,即得所需浓度的脱脂乳。
(c)待测样品制备:同实施例1。
2、α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备
将牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333种子以接种量3%(v/v)无菌接种于8%(w/w)脱脂乳,25℃、250rpm培养5小时得发酵乳。
将发酵乳冷冻干燥,以8mL/g冻干粉的添加量加入甲醇混匀,浸提2h,浸提4次,再10,000g离心6min取上清,平行蒸发除去甲醇,得α-葡萄糖苷酶抑制剂产品D。
3、α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定
将α-葡萄糖苷酶抑制剂产品D以上述方法制备为待测样品后测定其对α-葡萄糖苷酶抑制活性,结果表明该产品D对α-葡萄糖苷酶的半抑制率浓度IC50=26mg/mL。
实施例5
1、材料与方法
(a)种子(发酵菌种)的制备:同实施例1。
(b)脱脂乳的制备:将质量百分比为9%的脱脂乳粉与蒸馏水混匀,充分溶解后,在115℃下灭菌12min,冷却至室温,即得所需浓度的脱脂乳。
(c)待测样品制备:同实施例1。
2、α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备
将牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333种子以接种量1%(v/v)无菌接种于9%(w/w)脱脂乳,28℃、150rpm培养9小时得发酵乳。
将发酵乳冷冻干燥,以12mL/g冻干粉的添加量加入甲醇混匀,浸提4h,浸提2次,再11,000g离心8min取上清,旋转蒸发除去甲醇,得α-葡萄糖苷酶抑制剂产品E。
3、α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定
将α-葡萄糖苷酶抑制剂产品E以上述方法制备为待测样品后测定其对α-葡萄糖苷酶抑制活性,结果表明该产品E对α-葡萄糖苷酶的半抑制率浓度IC50=30mg/mL。
效果实施例1冷藏条件下α-葡萄糖苷酶抑制剂抑制效果的稳定性
将实施例1-5制备的产品A、B、C、D和E分别装入密封袋后,置于冷藏条件(8℃)保存0、10、20和30天后取出,分别测定各样品对α-葡萄糖苷酶的半抑制率浓度IC50值,结果如表1所示。
表1冷藏条件下α-葡萄糖苷酶抑制剂产品抑制效果的稳定性
由表1可知,所有测试的α-葡萄糖苷酶抑制剂产品在冷藏(8℃)保存30天后,对α-葡萄糖苷酶抑制活性稳定保持在同一水平,稳定性较好。
对比例1
将实施例1中的接种量,脱脂乳浓度,培养温度,发酵时间、发酵振荡的速度、甲醇添加量以及浸提时间逐一进行调整,获得了以下一组不同方法制备的α-葡萄糖苷酶抑制剂产品,各组所得α-葡萄糖苷酶抑制剂对α-葡萄糖苷酶的抑制效果如表2所示。
表2不同方法制备所得α-葡萄糖苷酶抑制剂的抑制效果
从表2所示的结果中可以得出,将所述α-葡萄糖苷酶抑制剂产品的制备方法中接种量,脱脂乳浓度,培养温度,发酵时间、发酵振荡的速度、甲醇添加量以及浸提时间调整到优选范围之外的时候,牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333依然可以发酵脱脂乳产生α-葡萄糖苷酶抑制剂,但是产物的α-葡萄糖苷酶抑制效果明显下降。
对比例2
参考实施例1所述方法,比较由牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333、干酪乳杆菌(L.casei)ATCC 393(购买自ATCC)、保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)LB340(由丹尼斯科公司提供)、嗜热链球菌(S.thermophilus)ST-BODY-3(由科.汉森公司提供)制备的α-葡萄糖苷酶抑制剂对α-葡萄糖苷酶的抑制效果,具体操作如下:
1、材料与方法
(a)种子(发酵菌种)的制备:
干酪乳杆菌和保加利亚乳杆菌种子的制备:将干酪乳杆菌ATCC 393和保加利亚乳杆菌LB340的冻干粉分别用少量无菌蒸馏水溶解,各自用接种环取一环划线于MRS固体培养基(购买自Merck Co.德国)上,37℃厌氧培养24h取出,用接种环挑取单菌落放入1mL MRS液体(购买自Merck Co.德国),运用涡旋震荡器将菌落均匀分散于液体培养基内,37℃厌氧培养24h取出,以2%(v/v)接种量接种于50mL MRS液体,37℃培养24h后,培养物9,000rpm离心10分钟,弃去上清,菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后,用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮,得到相应的发酵用的种子。
嗜热链球菌种子的制备:将嗜热链球菌ST-BODY-3的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解,用接种环取一环划线于M17固体培养基(购买自Merck Co.德国)上,40℃厌氧培养24h取出,用接种环挑取单菌落放入1mL M17液体(购买自Merck Co.德国),运用涡旋震荡器将菌落均匀分散于液体培养基内,40℃厌氧培养24h取出,以2%(v/v)接种量接种于50mL M17液体,40℃培养24h后,培养物9,000rpm离心10分钟,弃去上清,菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后,用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮,得到发酵用的种子。
(b)脱脂乳的制备:同实施例1。
(c)待测样品制备:同实施例1。
2、α-葡萄糖苷酶抑制剂产品的制备
将各菌株以2%(v/v)接种量无菌接种于10%(w/w)脱脂乳,分别培养(保加利亚乳杆菌和干酪乳杆菌37℃厌氧培养,嗜热链球菌40℃厌氧培养,牛类芽孢杆菌30℃、200rpm振荡培养)6h,获得相应的发酵乳。
将上述发酵乳按照实施例1中所述方法进行灭菌,离心,超滤,冷冻干燥,制备得到α-葡萄糖苷酶抑制剂。
3、α-葡萄糖苷酶抑制剂活性的测定
上述不同菌株制备的α-葡萄糖苷酶抑制剂的抑制效果如表3所示:
表3不同菌株制备的α-葡萄糖苷酶抑制剂的抑制效果
由表3可知,其他常规发酵菌株不具有发酵脱脂乳产生α-葡萄糖苷酶抑制剂的能力,而牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333可以发酵脱脂乳,最后得到α-葡萄糖苷酶抑制剂,对α-葡萄糖苷酶的抑制活性非常显著。
以上对本发明所提供的α-葡萄糖苷酶抑制剂及其制备方法进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述,以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (10)
1.一种α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(a)将牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis)CGMCC No.8333接种于脱脂乳中进行发酵,得到发酵乳;
(b)将步骤(a)得到的发酵乳冷冻干燥得到发酵乳冻干粉,在发酵乳冻干粉中加入甲醇浸提,离心取上清,除去甲醇,得到α-葡萄糖苷酶抑制剂。
2.根据权利要求1所述的α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备方法,其特征在于,步骤(b)中,发酵乳冻干粉中甲醇的添加量为5~15mL/g。
3.根据权利要求1所述的α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备方法,其特征在于,步骤(b)中,浸提的时间为1~5h。
4.根据权利要求1-3任一项所述的α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备方法,其特征在于,步骤(a)中,所述牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333的接种量为1.25x106~1x107cfu/mL。
5.根据权利要求4所述的α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备方法,其特征在于,步骤(a)中,所述脱脂乳包括脱脂乳粉和水,脱脂乳粉占脱脂乳的质量百分比为6~12%。
6.根据权利要求4所述的α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备方法,其特征在于,步骤(a)中,所述发酵为振荡培养,振荡速度为100~300rpm。
7.根据权利要求4所述的α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备方法,其特征在于,步骤(a)中,所述发酵的温度为20℃~35℃。
8.根据权利要求4所述的α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备方法,其特征在于,步骤(a)中,所述发酵的时间为3~12h。
9.一种α-葡萄糖苷酶抑制剂,其特征在于,由权利要求1~8任一项所述的制备方法制得。
10.根据权利要求9所述的α-葡萄糖苷酶抑制剂,其特征在于,α-葡萄糖苷酶抑制剂对α-葡萄糖苷酶的半抑制率浓度IC50≤30mg/mL。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201610976308.9A CN106497982B (zh) | 2016-11-07 | 2016-11-07 | 一种α-葡萄糖苷酶抑制剂及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201610976308.9A CN106497982B (zh) | 2016-11-07 | 2016-11-07 | 一种α-葡萄糖苷酶抑制剂及其制备方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN106497982A true CN106497982A (zh) | 2017-03-15 |
CN106497982B CN106497982B (zh) | 2019-08-23 |
Family
ID=58323249
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201610976308.9A Active CN106497982B (zh) | 2016-11-07 | 2016-11-07 | 一种α-葡萄糖苷酶抑制剂及其制备方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN106497982B (zh) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106978457A (zh) * | 2017-04-24 | 2017-07-25 | 光明乳业股份有限公司 | 一种抗生素FusaricidinA的制备方法 |
CN107760724A (zh) * | 2017-10-31 | 2018-03-06 | 光明乳业股份有限公司 | 一种利用多粘类芽孢杆菌制备α‑葡萄糖苷酶抑制剂的方法及该α‑葡萄糖苷酶抑制剂 |
CN107788119A (zh) * | 2017-10-31 | 2018-03-13 | 光明乳业股份有限公司 | 一种利用多粘类芽孢杆菌制备发酵乳的方法及该多粘类芽孢杆菌的应用 |
CN111763647A (zh) * | 2020-07-28 | 2020-10-13 | 盐城康林达生物科技有限公司 | 枯草芽孢杆菌mk15及其发酵方法与用途 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104673773A (zh) * | 2015-03-30 | 2015-06-03 | 光明乳业股份有限公司 | 一种直投式凝乳酶制剂的制备方法及其产物和应用 |
-
2016
- 2016-11-07 CN CN201610976308.9A patent/CN106497982B/zh active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104673773A (zh) * | 2015-03-30 | 2015-06-03 | 光明乳业股份有限公司 | 一种直投式凝乳酶制剂的制备方法及其产物和应用 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
MIN-GU KANG,ET AL.: "Production and Characterization of a New α-Glucosidase Inhibitory Peptide from Aspergillus oryzae N159-1", 《MYCOBIOLOGY》 * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106978457A (zh) * | 2017-04-24 | 2017-07-25 | 光明乳业股份有限公司 | 一种抗生素FusaricidinA的制备方法 |
CN106978457B (zh) * | 2017-04-24 | 2021-06-25 | 光明乳业股份有限公司 | 一种抗生素FusaricidinA的制备方法 |
CN107760724A (zh) * | 2017-10-31 | 2018-03-06 | 光明乳业股份有限公司 | 一种利用多粘类芽孢杆菌制备α‑葡萄糖苷酶抑制剂的方法及该α‑葡萄糖苷酶抑制剂 |
CN107788119A (zh) * | 2017-10-31 | 2018-03-13 | 光明乳业股份有限公司 | 一种利用多粘类芽孢杆菌制备发酵乳的方法及该多粘类芽孢杆菌的应用 |
CN111763647A (zh) * | 2020-07-28 | 2020-10-13 | 盐城康林达生物科技有限公司 | 枯草芽孢杆菌mk15及其发酵方法与用途 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN106497982B (zh) | 2019-08-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN101338283B (zh) | 一种干酪乳杆菌及其在固态发酵中的应用 | |
CN106578805A (zh) | 功能性果蔬酵素饮料 | |
CN106509105A (zh) | 一种发酵乳、其制备方法以及发酵乳粉 | |
CN106497982B (zh) | 一种α-葡萄糖苷酶抑制剂及其制备方法 | |
CN106509101A (zh) | 一种发酵乳饮料及其制备方法 | |
CN110607255B (zh) | 一种德氏乳杆菌及直投式德氏乳杆菌发酵剂的制备方法和应用 | |
CN107494731A (zh) | 一种富硒益生菌发酵乳及其制备方法 | |
CN104928208A (zh) | 一种植物乳杆菌Lp90及其筛选方法和应用 | |
WO2012016445A1 (zh) | 一种枯草芽孢杆菌及其应用 | |
CN106520608B (zh) | 一种α-葡萄糖苷酶抑制剂及其制备方法 | |
CN102851259B (zh) | 抗氧化剂的制造方法 | |
CN100448982C (zh) | 低温β-半乳糖苷酶菌株、低温β-半乳糖苷酶及其生产工艺 | |
CN109234215A (zh) | 一种鼠李糖乳杆菌低盐培养基及培养方法 | |
CN107760724A (zh) | 一种利用多粘类芽孢杆菌制备α‑葡萄糖苷酶抑制剂的方法及该α‑葡萄糖苷酶抑制剂 | |
CN105821086B (zh) | 一种规模化生产普伐他汀的工艺 | |
CN106538915A (zh) | 益生菌发酵果蔬汁提高相关酶活的方法 | |
CN102533868A (zh) | 干酪乳杆菌LC2W在制备Alpha-糖苷酶抑制剂中的用途 | |
CN109315693A (zh) | 一种发酵沙棘布丁及其制备方法 | |
CN112592854B (zh) | 高密度保加利亚乳杆菌的发酵培养基及发酵方法和应用 | |
CN108741087A (zh) | 一种通过益生菌发酵植物细胞果粒或器官制作酵素的方法 | |
CN105982035B (zh) | 一种提高纳豆水提取物对α-葡萄糖苷酶抑制率的纳豆制备方法 | |
CN104711208B (zh) | 一种具有高的淀粉分解能力的乳酸菌 | |
CN107788119A (zh) | 一种利用多粘类芽孢杆菌制备发酵乳的方法及该多粘类芽孢杆菌的应用 | |
CN103103062A (zh) | 复合益生菌制备桑葚营养饮料方法 | |
CN106434786A (zh) | 一种由干酪乳杆菌发酵制备胞外多糖的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |