CN104928208A - 一种植物乳杆菌Lp90及其筛选方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种植物乳杆菌Lp90及其筛选方法和应用，特别涉及一种具有抑制脂肪积累功效的植物乳杆菌。所述植物乳杆菌，名称为Lp90，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10453。在线虫体外筛选模型获得，该植物乳杆菌能降低线虫的脂肪积累60％，具有防止肥胖的潜在功效，可作为益生菌添加到食品、保健品或药品中。同时，本发明提供了筛选方法，即线虫培养模型，能够定性和定量地检测线虫脂肪积累数据，从而可以方便快速的筛选出具有抑制脂肪积累功效的菌种，准确率高，且经济成本较低。

Description

一种植物乳杆菌Lp90及其筛选方法和应用

技术领域

本发明涉及一种植物乳杆菌及其筛选方法和应用，特别涉及一种具有抑制线虫脂肪积累功效的植物乳杆菌。属于微生物领域。

背景技术

随着我国国民经济的发展，人民生活水平普遍提高，处于“亚健康”状态以及患有“文明病”的人也日益增多，肥胖、三高等“富贵病”的发病率不断上升。这些病症很难通过药物根治，只有建立起健康的生活方式，特别是遵循健康饮食标准，才能达到预防和减轻的效果。因此，通过针对性地补充富含益生菌的食品来调节人体内环境平衡与生理节律十分必要。

益生菌是一类能对人体健康起到促进作用的细菌，常见的益生菌包括乳杆菌、双歧杆菌和链球菌等。这些益生菌产生的有机酸、多糖、过氧化氢、细菌素和特殊酶系等对人体有调节肠胃菌群平衡、提高免疫力、延缓衰老、改善便秘、腹泻和过敏症状等功效。

然而，如何从大量的微生物中筛选出我们所需要的有特定功能的益生菌是现在益生菌研究面临的主要问题之一。体外模型筛选虽然方便快捷，但是与体内环境差异大，而动物模型个体差异较大，成本昂贵，所耗的人力、物力较大。因此，从研究成本、技术可行性和应用前景考虑，结构简单，繁殖时间短，遗传信息清楚，免疫防御系统高度保守的线虫是一种较好的动物模型，已经成为研究最为清晰的体外细胞实验模式生物之一。本发明探讨的就是利用线虫模型筛选出具有特殊功效的植物乳杆菌。

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)是一种常用于酸奶及发酵乳制品生产的乳酸菌，安全，被列入卫生部公布的《可用于食品的菌种名单》(卫办监督发[2010]65号)。一些植物乳杆菌菌株在发酵过程中可产生胞外多糖，其作为一种大分子聚合物具有一定的粘性和持水性，是一种免疫因子。以植物乳杆菌作为基础进行筛选，是一种安全有效的方式。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能抑制线虫脂肪积累的植物乳杆菌。

本发明的技术方案如下：

一种植物乳杆菌，名称为Lp90，属于植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.10453，保藏日期为2015年1月27日。

本发明同时提供了上述植物乳杆菌作为食品添加剂的用途。

本发明还提供了一种含上述植物乳杆菌的组合物，其包含所述植物乳杆菌的冻干菌粉。

本发明还提供了一种筛选具有抑制脂肪堆积功效的益生菌筛选方法，通过线虫培养，获得线虫脂肪染色值评价抑制脂肪堆积功效进行筛选。

进一步，具体包括如下步骤：

a、设置成分相同的实验组和空白组的线虫培养基；

b、在所述实验组的线虫培养基中加入待筛选益生菌菌株；

c、将所述实验组和所述空白组的线虫培养基在相同环境下各培养12～15天，分别获得实验组线虫和空白组线虫；

d、将所述实验组线虫和所述空白组线虫分别进行脂肪染色，并计算出各自的脂肪染色比值；

e、若所述实验组线虫的脂肪染色比值比所述空白组线虫低，则步骤b中所述的待筛选益生菌菌株为具有抑制脂肪堆积功效；反之则待筛选益生菌菌株不具有抑制脂肪堆积功效。

进一步，所述益生菌菌株为植物乳杆菌。

进一步，所述待筛选益生菌菌株是经过活化接种培养的，其接种量为体积百分比1％～3％，其培养条件为温度30～50℃，时间1～48小时。

更进一步，培养条件为温度37～45℃，时间4～24小时。

进一步，所述步骤b中，线虫培养基中加入益生菌菌株的菌悬液浓度为10⁷-10⁸个/ml。

进一步，所述步骤a中所述的线虫培养基含有大肠杆菌Op50。

进一步，所述步骤a中所述的线虫培养基包括：3g/L氯化钠、2.5g/L蛋白胨、17g/L琼脂、25ml/L缓冲液、1ml/L胆固醇溶液、1ml/L硫酸镁水溶液和1ml/L氯化钙水溶液，其中缓冲液为浓度为1mol/L的K₂HPO₄-KH₂PO₄配置的pH6.0的水溶液，所述硫酸镁水溶液的浓度为1mol/L，所述氯化钙水溶液的浓度为1mol/L。

根据本发明筛选获得的植物乳杆菌Lp90具有抑制脂肪积累，防止肥胖的潜在功效，可作为益生菌添加到食品、保健品或药品中。同时，本发明提供的筛选方法，即线虫培养模型，能够定性和定量地检测线虫的脂肪积累数据，从而方便快速的筛选出所需菌株，准确率高，且成本较低。

附图说明

图1为实施例2中空白组的线虫脂肪染色对比图；

图2为实施例2中实验组1的线虫脂肪染色对比图。

具体实施方式

本发明的原理是通过线虫模型对植物乳杆菌进行筛选，从而获得能抑制线虫脂肪积累，即具有防止肥胖的潜在功效的益生菌Lp90。

线虫在生长过程中会积累脂肪。本发明利用添加了待筛选植物乳杆菌的培养基对线虫进行培养，并对获得的线虫进行脂肪染色。若该菌株具备抑制线虫脂肪积累的功效，则所育线虫的脂肪染色比值将小于未加入菌株直接培养的线虫。

合适的线虫培养基通常含有Na+、K+、Mg2+、Ca2+离子，蛋白胨，胆固醇等。也可由葡萄糖、蔗糖、乳糖等糖类，各种来源的蛋白胨、酵母浸粉/提取物、氨基酸等氮源物质，磷酸盐(磷酸氢钾、磷酸氢钠等)、有机酸盐(柠檬酸钠、乙酸钠等)、镁盐(硫酸镁等)、锰盐(硫酸锰等)等营养成分配制而成。其中可加入大肠杆菌Op50作为线虫食物，所述大肠杆菌Op50为市购商品。

下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

实施例1：待筛选植物乳杆菌的培养和分离

植物乳杆菌分离自然发酵泡菜汁样本，用无菌吸管取样稀释加入到55℃左右的含2％碳酸钙和MRS培养基中，在厌氧条件下，37℃培养72小时，挑选溶钙圈大活力强的菌落进行划线纯化培养，纯化菌株继续经过初筛：45℃不生长，15℃生长，pH3.0不生长，获得待筛选菌株共计85株低温保藏。

其中MRS培养基：麦芽糖5.0g，蛋白胨10.0g，牛肉膏8.0g，酵母膏4.0g，葡萄糖20.0g，磷酸氢二钾2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，柠檬酸三铵2.0g，吐温801.0g，琼脂20.0g，碳酸钙2.0g，pH6.0～6.5之间，加蒸馏水至1000mL，121℃灭菌20min。

实施例2：通过线虫模型进行菌株筛选和鉴定：

低温保藏的菌株可通过如下步骤活化和扩大培养：将初筛菌株经MRS液体培养基活化，再将活化后的菌株以1％～3％体积比接种到10％(W/V)固形物的牛乳中，在43℃下静置培养6小时，离心分离获得待测菌株。

本实施例选择的线虫培养基为Op50-NGM培养基。培养2周(14天)。

每1000ml的Op50-NGM培养基中含：3g NaCl，2.5g蛋白胨，17g琼脂，1mol/L K₂HPO₄-KH₂PO₄(pH6.0)缓冲液25ml，1ml胆固醇溶液，1mol/L MgSO₄1ml，1mol/L CaCl 1ml。

每株待选菌株同时设置加入和未加入待筛选菌株的实验组和空白组线虫培养基。其中，实验组包括实验组1和实验组2，分别含有不同浓度的待筛选菌株，实验组1的菌悬液浓度为10⁸个/ml，实验组2的菌悬液浓度为10⁷个/ml。

脂肪染色：通过Nile red和Sudan Black B染色。观察Nile red后染色的亮度，以及Sudan Black B染色后的染色深浅度，用Olympus显微镜拍摄线虫图像，用Image J软件进行分析。

每次分析至少30条线虫，并且用至少2个视野的图像进行分析。分析时，先把图像的背景和图像的荧光(或可见光)区分开，设好自动的阈值，这样以后的图像分析都采用统一的阈值分析。通过软件自动统计红色荧光的强度，来进行每个数据的分析，计算每条线虫的脂肪的相对含量，并通过软件扫描计算出染色强度值，从而对脂肪染色比值进行定量分析。

将其中一株命名为Lp90，Lp90的脂肪染色结果见附图1，左图为空白组，右图为实验组1。图中可直观看出，实验组1的脂肪染色比值远远低于对照组。

Nile red染色后，通过软件扫描计算出的染色强度值比较见下表：

	染色强度值
		空白组	100±5.2
实验组1	40±4.2
		实验组2	80±9.3

菌悬液浓度及其它培养因素都会对脂肪抑制效果产生影响，如实验组2，浓度降低一个数量级，则脂肪抑制能力降低，脂肪染色强度仅下降20％。

本专利提供的筛选方法，以菌悬液浓度10⁸个/ml作为标准，在该浓度下培养的线虫脂肪染色强度降低60％则为合格。选择该标准主要是因为染色强度差距较大，对比悬殊，误差较小。

Lp90在显微镜下呈短杆状，较粗胖，排列较规则，单个或短链状，代谢葡萄糖、蔗糖等，终产物中85％以上是乳酸，接触酶和氧化酶皆阴性，化能异养菌，生长需要营养丰富的培养基，需要泛酸钙和烟酸，最适生长温度为35～39℃。

通过形态特征、生理生化特性，初步鉴定Lp90菌株为植物乳杆菌。

将该菌株的16S rDNA序列进行对比分析，鉴定为植物乳杆菌，命名植物乳杆菌Lp90(Lactobacillus plantarum Lp90)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10453，保藏日期为2015年1月27日。

实施例3：对照实验

市购光明乳业生产的植物乳杆菌ST-III具有改善肥胖体质、降低体脂肪及减少胆固醇之用途。

选择的线虫培养基为OP50-NGM培养基，培养2周(14天)。

设置加入和未加入植物乳杆菌ST-III对照组和空白组线虫培养基。

植物乳杆菌ST-III液浓度为10⁸个/ml。

脂肪染色：通过Nile red和Sudan Black B染色。观察Nile red后染色的亮度，以及Sudan Black B染色后的染色深浅度，用Olympus显微镜拍摄线虫图像，用Image J软件进行分析。

Nile red染色后，通过软件扫描计算出的染色强度值比较见下表：

	染色强度值
		空白组	100±3.5
对照组	36±6.3

进一步说明，筛选出的植物乳杆菌Lp90具有与植物乳杆菌ST-III的抑制脂肪堆积的功效，并且证实线虫筛选模型可以简便快捷的筛选出具有抑制脂肪堆积益生菌的筛选方法。

实施例4：制备含植物乳杆菌Lp90的食品添加剂

将实施例2筛选获得的植物乳杆菌Lp90进行发酵、离心和冻干，得到冻干菌粉。按照如下配方((w/w))配置食品添加剂，即可加入各种食品中，或用于人体试验。

食品添加剂配方：Lp90冻干菌粉：10％；麦芽糊精：80％；和

可溶性膳食纤维：10％。

Claims (10)

1.一种植物乳杆菌，其特征在于，名称为Lp90，属于植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10453，保藏日期为2015年1月27日。

2.一种具有抑制脂肪堆积功效的食品添加剂，其特征在于，其为权利要求1所述植物乳杆菌的冻干菌粉。

3.一种组合物，其特征在于，包含所述植物乳杆菌的冻干菌粉。

4.一种筛选具有抑制脂肪堆积功效的益生菌筛选方法，其特征在于，通过线虫培养，获得线虫脂肪染色值评价抑制脂肪堆积功效进行筛选。

5.根据权利要求4所述筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：

a、设置成分相同的实验组和空白组的线虫培养基；

b、在所述实验组的线虫培养基中加入待筛选益生菌菌株；

c、将所述实验组和所述空白组的线虫培养基在相同环境下各培养12～15天，分别获得实验组线虫和空白组线虫；

d、将所述实验组线虫和所述空白组线虫分别进行脂肪染色，并计算出各自的脂肪染色比值；

e、若所述实验组线虫的脂肪染色比值比所述空白组线虫低，则步骤b中所述的待筛选益生菌菌株为具有抑制脂肪堆积功效；反之则待筛选益生菌菌株不具有抑制脂肪堆积功效。

6.根据权利要求5所述筛选方法，其特征在于，所述益生菌菌株为植物乳杆菌。

7.根据权利要求6所述筛选方法，其特征在于，所述待筛选益生菌菌株是经过活化接种培养的，其接种量为体积百分比1％～3％，其培养条件为温度30～50℃，时间1～48小时。

8.根据权利要求7所述筛选方法，其特征在于，所述培养条件为温度37～45℃，时间4～24小时。

9.根据权利要求5所述筛选方法，其特征在于，所述步骤b中，线虫培养基中加入益生菌菌株的菌悬液浓度为10⁷-10⁸个/ml。

10.根据权利要求5所述筛选方法，其特征在于，所述步骤a中所述的线虫培养基含有大肠杆菌Op50。