背景技术
β-半乳糖苷酶(EC.3.2.1.和葡23),又称乳糖酶,既能将乳糖水解为易吸收和甜味品质好的半乳糖与葡萄糖,又能在水解糖过程中还会发生转糖苷反应,生成具有多种生理功能的低聚半乳糖。该糖是双歧杆菌增值因子,难以被人体消化,它可用于生产低乳糖食品,改善乳制品的风味和营养,解除乳糖不耐受患者因食用乳制品而引起的腹泻、腹胀等多种不良反应。它还能改善便秘、降低血糖、促进钙的吸收、抗龋齿等,另外,在冷冻制品中乳糖会结晶,影响食品的加工性能。乳糖也是牛乳加工副产物----乳清的主要成分,目前乳清利用率不到50%,余下的被排放到环境中造成污染,因此如何将乳糖转化为对人体有益的物质,变废为宝,对发展乳制品工业,提高人民健康水平具有重要意义。
β-半乳糖苷酶主要来源于动物、植物、细菌、酵母、真菌或霉菌。国外已经商品化的β-半乳糖苷酶主要来源于大肠杆菌、黑曲霉、米曲霉、酵母、乳酸杆菌等。低温下催化反应可防止污染(同源的低温酶不活泼),经过温和的热处理即可使它的活力丧失,而低温或适温处理不会影响产品的品质等。而低温半乳糖苷酶可在兼备高乳糖水解水平的同时缩短水解时间,还可减少细菌污染的风险。因此,人们更重视低温β-半乳糖苷酶的研究。目前,国外的研究集中在产低温酶菌株的筛选鉴定及对低温β-D-半乳糖苷酶学性质研究及其基因的分析,纯β-半乳糖苷酶制剂已从大肠杆菌、酵母菌和真菌中提取得到,由酵母菌(Saccharomyces)制取的β-半乳糖苷酶在生产中应用最为广泛。而我国在此领域内研究尚属空白,目前使用的常温乳糖酶全部依赖进口,国内还未见有关此低温β-半乳糖苷酶的研究报道。
低温β-半乳糖苷酶可广泛应用于食品、医药、免疫、环境检测等各个领域。在食品工业,它能够解决目前奶业加工处理及储存中乳糖含量偏高的问题,所生成的低聚半乳糖具有良好的保湿性,可用于发酵乳、饮料、冰淇淋、糖果、奶粉、口服液等。利用β-半乳糖苷酶的糖苷转移作用人工合成糖苷化合物,对药品和其它生理活性物质的合成有潜在意义。免疫学方面,将β-半乳糖苷酶与人体胞外淀粉状蛋白前体融合形成融合蛋白,可作为Alzheimer病的免疫源,并进一步制备其单克隆抗体。在环境检测方面,通过β-半乳糖苷酶活性检测,可快速分析浴场和渔场地区海水水体受排泄污染程度。
由于乳糖是牛乳中主要的糖成分,其含量约为5%(w/v)左右,它没有甜味,溶解度较低,在肠道内不能被直接吸收。许多成人(因人种而异,亚洲、非洲占的比例较大)饮用牛奶后,乳糖到了肠道里,被肠道细菌分解发酵,产生大量二氧化碳气体,使肠道膨胀,收缩加强,造成肠鸣、腹胀、腹泻等,这种现象称作乳糖不耐受症,使相当一部分人无法充分消化吸收牛乳这一天然、具有良好平衡型的食品中的营养成份,成为阻碍我国乳品工业发展的主要障碍之一,而低乳糖牛奶和低乳糖乳制品是解决这一问题的最有效的方法。
利用β-半乳糖苷水解酶(β-D-galactoside galatohydrolase)(EC 3.2.1.23)处理加工牛乳及乳清,可生产低乳糖牛奶和低乳糖乳制品,它能将乳糖水解成为半乳糖和葡萄糖,使其甜度达到蔗糖的80%,溶解度提高3~4倍,易被肠道吸收。鲜乳冷藏保鲜加工、生产低乳糖牛奶及低乳糖乳制品需要的是高活性低温β-半乳糖苷酶,但目前生产所用的β-半乳糖苷酶在低温下酶活都很低,难以满足市场及生产所需。由于利用低温乳糖酶进行鲜乳冷藏保鲜加工时,可最大限度地保留其营养及风味物质,真正达到了绿色有机食品的要求,因此低温β-半乳糖苷酶的研究是当今乳品业发展的迫切需要。
发明内容
针对常温乳糖酶反应温度高,低温酶活低的缺点,本发明根据生物与环境相适应的原理,在冷库与冷冻土壤中分离出一批耐低温的微生物菌株,通过进一步选育、驯化,获得稳定表达的菌株,利用符合本菌株的特性,设计出一套发酵生产工艺技术,获得能适应反应温度低,低温酶活高的乳糖酶。
本发明提供的一株产低温半乳糖苷酶的菌株,通过在冷库与冷冻土壤中分离出一批耐低温的微生物菌株,从中筛选出一株编号为L2004的菌株,从而提供了一种低温乳糖酶菌株,其具有生产低温乳糖酶的优良特性,经微生物学鉴定,定为短芽孢杆菌(Brevibacillussp.)。
本发明在获得的短芽孢杆菌的基础上,提供了一种低温乳糖酶的生产工艺。
同时,本发明还提供了一种低温乳糖酶,通过利用本发明的菌株经过本发明确定的具体发酵工艺而获得。
本发明提供了一种低温乳糖酶菌株,命名为L2004,其能够以高产率产生低温乳糖酶。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位:中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址:北京市海淀区中关村北一条13号,中国科学院微生物研究所,邮编:100080。保藏日期是2005年7月25日,保藏号是CGMCC.No.1424。经微生物学鉴定为短芽孢杆菌属(LacfococcusSchleifer et al,1984),细胞杆状,0.7-0.9um×3-5um,革蓝氏阴性(-),以周生鞭毛运动,在膨大孢子内含椭圆形芽孢,菌落平整、光滑,黄灰色,无可容性色素。该菌严格好氧,接触酶阴性;能利用葡萄糖产酸,也能利用L-阿拉伯糖,D-甘露糖,D-木糖,水解淀粉,液化明胶,分解酪素,能利用柠檬酸盐生长,不产生吲哚,并能在6%氯化钠盐度下生长。可在较大温度范围4℃-37℃内生长,最适生长温度为20℃,生长pH范围为5-8,最适生长范围为6-8。依照伯杰氏系统细菌学手册第二卷,L2004菌为芽孢杆菌属中的成员,定为短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.)。本发明进一步建立菌种保藏、复壮及选育的系统工艺流程技术。
一、菌种保藏:菌种在矿物油和真空冷冻条件下进行了保藏试验。
其效果如表1所述:
表1不同保藏方法对菌株存活率的影响
处理方法 |
7天 |
1个月 |
6个月 |
矿物油 |
99% |
98% |
80% |
真空保藏 |
99% |
99% |
99% |
二、菌种活化:取保存菌株,用接种针刮取或挑取少量接于固体LB上,在适合菌株生长的温度下培养一定时间后,连续活化数次,并进行菌株产酶能力的测定。
三、菌种复壮:在中试中,确定了一套保持产酶特性稳定菌株筛选的流程。
依次在液体培养基STA和固体培养基ST中接种活化好的菌并进行培养,检测该菌特性,选取优良菌株接种于斜面培养基上培养,并将此菌株用摇瓶进行发酵实验,以检测其产酶能力。检测其产酶能力未发生退化后,此菌株可作为生产菌株使用。
本发明提供一种低温乳糖酶的生产工艺,其包括:
A:对短芽孢杆菌(CGMCC.No.1424)进行菌种活化培养步骤;
B:利用步骤A获得的活化菌种进行发酵步骤;
发酵过程中,以选择低温乳糖酶酶产量最高的条件为优选条件。接种量为1%-15%,优选发酵温度20℃,通气量1∶0.2-0.5vvm,搅拌速度为150-200rpm,发酵周期24-32小时。
在发酵罐发酵工艺上,采用单批发酵工艺,发酵酶活达78.2u/ml-83.4u/ml。
在发酵过程中,培养基是发酵工艺的基础。本发明在实验中,利用摇瓶发酵对发酵培养基进行筛选与优化,并对菌种活性进行检测。本着高产率、低成本的原则,在实验室的基础上进行了工业化中试研究的培养基筛选和优化。本发明的短芽孢杆菌(CGMCC.No.1424)对培养基的营养源并无特殊的规定,可使培养基中含有常规的用于微生物培养的碳源、氮源。例如,短芽孢杆菌(CGMCC.No.1424)菌株可以葡萄糖、乳糖、麦芽糖、玉米粉、淀粉等作碳源,生长并产酶。其中,以乳糖为碳源菌体生长最快。可利用胰蛋白胨、豆蛋白胨等可作为氮源使用,但胰蛋白胨为最佳氮源,其获取、使用容易,且可使生产菌株达最大的产酶量。
通过实验证明,金属离子对发酵有一定的作用,Cu离子、Al离子、Fe离子对产酶具有不同的抑制作用,Na、Zn离子对产酶无显著作用,而Mg离子对产酶具有促进作用,K离子可使菌体生长加快,有益于产酶。优选0.01%-1%的Mg和K离子。
同时实验表明,乳糖对该菌株产酶有一定影响,3%乳糖发酵浓度与12%乳糖浓度相比,酶活提高了7.31%。优选发酵乳糖浓度为3%。
在发酵过程中,物料灭菌与菌体代谢都会使发酵液pH发生较大的变化,因此,在发酵培养基中本发明使用磷酸盐调节发酵过程的pH变化,使用碳酸盐控制物料灭菌过程带来的pH变化。
本发明同时提供了利用短芽孢杆菌(CGMCC.No.1424)获得的低温乳糖酶,其不仅具有一般乳糖酶特性,而且克服了常温乳糖酶反应温度高,低温酶活低的缺点,提供了一种具有良好低温活性、酶活高的低温乳糖酶,可使乳糖酶的应用温度降低20℃,且本产品已具备规模工业化生产能力。本领域普通技术人员已知,低温乳糖酶指乳糖酶的反应温度较低,一般反应温度0-50℃。本发明的低温乳糖酶是生产菌株(CGMCC.No.1424)的代谢产物,通过对发酵培养基及发酵工艺参数的优化,在发酵醪液中富集低温乳糖酶分子,并利用酶分子的物化性质进行产物分离。本发明的低温乳糖酶反应温度0℃-40℃,与一般低温酶相比,本发明的低温酶具有反应温度范围较宽,酶活较高的优点。本低温酶最适反应温度为33℃,最适反应pH6.5;金属离子对酶的作用:Ca离子与Mg离子对酶分子有激活作用,而Cu离子、Fe离子、Al离子及Zn离子对酶分子的活性有不同程度的抑制作用;酶的半衰期:在20℃保温1小时,酶活力下降4%,在40℃下酶的半衰期30分钟。
通过实施本发明具体的技术指标,实现本发明内容,可以达到以下有益效果。
A、定向筛选到L2004低温乳糖酶高产菌株经鉴定为短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.)。利用本发明的菌株发酵获得的低温乳糖酶具有反应温度低,低温酶活高的特点。
B、通过本发明优选实施方案,通过确定培养基配方及发酵工艺条件的优化,确立了L2004生产菌株稳定的发酵工艺,发酵酶活达78.2u/ml-83.4u/ml。
以下是对本发明的整体方案的具体示例,并不以任何方式限定本发明。
具体实施方式
实施例1:菌株L2004的保藏与复壮
在乌鲁木齐肉联厂冷库分离得到了一株低温乳糖酶产生菌L2004,经鉴定为短芽孢杆菌,所产生的低温乳糖酶最适反应温度33℃,40℃下酶的半衰期约50分钟。
采用两种方法进行菌种保藏,即液体石蜡保藏法和真空冷冻干燥法。前者用于菌种短期保存(3-6个月),后者用于生产菌种的长期保藏(6个月-数年)。
保存菌种的活化:取保存菌株,用接种针挑取菌种接种装有2毫升无菌水的试管中,振荡10分钟。然后用无菌吸管取0.2毫升加到斜面培养基TSA(胰蛋白胨15g,豆蛋白胨5g,磷酸氢二钾2.5g,酵母浸膏3g,乳糖2.5g,氯化钠5g,琼脂15g,水,1000ml;pH:6.5-7.2)平板培养基上,再用玻璃刮铲涂匀,置13℃温箱中培养24小时后取出培养基平板。
高产菌株的筛选:将活化好的菌种接种于液体TS培养基中,于10℃、150rpm下培养24小时,将此菌株用摇瓶进行发酵实验,以检测其产酶能力及大小。检测其产酶能力未发生退化者可作为生产菌株使用。液体发酵,用500mL三角瓶装入100mL发酵培养基里,120℃20min,冷却后接入普通培养菌种2mL,15℃,150rpm培养,测定乳糖酶活性进行复筛;
取纯化的菌株,在TSA平板上20℃涂布倒置培养24h,用8.5%生理盐水5ml洗涤1次,将其接种于含60ml摇瓶培养基的500ml摇瓶中,200r/min,20℃摇床培养24h。
实施例2:菌株L2004低温乳糖酶活力检测方法
以ONPG为底物进行测定,取1ml酶液于试管中30℃水浴预热10min,加入已在30℃水浴预热的0.5mL pH6.5 0.1mol/L磷酸钠缓冲液(1mol/L NaH2PO4 70mL与1mol/L Na2HPO4 30mL缓冲液混合稀释10倍配制)及0.2mL ONPG溶液(pH6.5. 0.1mol/L磷酸钠配制)反应5min,加入0.8ml 5%Na2CO3溶液终止酶反应,测定OD420nm值。在上述条件下,每分钟水解ONPG生成1μmol邻硝基苯酚的酶量为1个ONPG酶活单位。
1.定义
1克固体酶粉(或1ml液体酶),在一定温度下和pH条件下,1分钟水解ONPG(邻硝基苯酚半乳糖苷)产生1umol酪氨酸为一个酶活力单位,以u/g(u/ml)表示。
2.比色法
2.1原理
L2004低温乳糖酶在30℃,pH6.5条件下,水解ONPG底物,产生含有酚基的ONP,在碱性条件下,ONPG显黄色,用分光光度计测定,计算其酶活力。
2.2试剂与溶液
2.2.1磷酸钠缓冲液的制备
分别取1mol/LNa2HPO4与1mol/LNaH2PO4缓冲液30ml与70ml混合于容量瓶中,定容至1000ml,即0.1mol/L磷酸钠缓冲液,贮于棕色瓶内。
2.2.2碳酸钠溶液c(Na2CO3)=0.5mol/L
称取无水碳酸钠(Na2CO3)50g,用水溶解并定溶至1000ml。
2.2.3 2.5g/L ONPG底物溶液
称取ONPG 0.250g,精确至0.001g,用70ml蒸馏水后,再加入适量的pH6.5的磷酸缓冲液约30ml,加热边搅拌,直至完全溶解,冷却后,转入25ml容量瓶中,用适量的pH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液于棕色试剂瓶中冰箱中保存,有效期为半年。
2.2.4 240umol/ml ONP标准溶液
2.2.4.1称取恒重的ONP3.3386g,精确至0.0002g,用蒸馏水70ml溶解后,再用30ml 0.1mol/L磷酸钠缓冲液定溶至100ml,即为240umol/ml ONP标准溶液。
2.2.4.2取240umol/ml ONP标准溶液10.00ml,用蒸馏水定溶至100ml,即得到24umol/ml。
2.3仪器和设备
2.3.1恒温水浴 30±0.2℃、40±0.2℃。
2.3.2分光光度计 应符合GB 9721的规定。
2.4.测定步骤
2.4.1标准曲线的绘制
2.4.1.1ONP标准溶液按下表配制
表2 ONP标准溶液配制
管号 |
ONP标准溶液浓度umol/ml |
取400umol/mlONP标准溶液体积ml |
取水的体积ml |
0 |
0 |
0 |
10 |
1 |
25 |
0.5 |
7.5 |
2 |
50 |
1 |
7 |
3 |
100 |
2 |
6 |
4 |
160 |
3.2 |
4.8 |
5 |
240 |
4.8 |
3.2 |
2.4.1.2.分别取上述溶注液各0.5ml磷酸钠缓冲液(须做平行试验),各加0.4mol/ml碳酸钠溶液0.80ml,置于30℃水浴中显色15分钟,取出用分光光度计于波长420nm,10mm比色皿,以不含ONP的0号管为空白,分别测定其吸光度。以吸光度A为纵坐标,酪氨酸的浓度c为横坐标,绘制标准曲线(此线应通过零点)。
根据作图或用回归方程,计算出当吸光度为1时的ONP的量(umol),即为吸光常数K值。其K值应在100左右。
2.4.2待测酶样的制备与测定
2.4.2.1粗酶液的制备
取5ml培养菌悬液于50ml离心管中,在冰水浴中用超声波仪(破壁)。在10强度下破壁5min,使酶从菌体中释放出来。
2.4.2.2.测定
吸取0.2ml的0.25%ONPG溶液加入试管中,加入0.5ml的磷酸钠缓冲液,水浴5min,加入1ml适当稀释的酶液,保温15min,加入0.8ml的5%碳酸钠溶液终止反应,再加入蒸馏水定容至8ml,于420nm波长处比色,测定OD420nm值。以煮沸失活的酶液同样处理为对照。
(*本实验的稀释倍数均为50倍)先将0.2ulONPG与0.5ml磷酸钠缓冲液放入30℃恒温水浴中,预热5分钟。并按如图1所述的程序操作:
2.4.2.3.计算
在此条件下,每分钟水解产生1umol邻硝基苯酚(ONP)的酶活力定义为1u单位。ONP浓度与OD420nm值之间存在线性关系,如图1,根据测得的OD420nm值,从图1中查出对应的ONP浓度,通过下式求得酶活力:
其中:C为[ONP],N为稀释倍数。本实验的稀释倍数均为50倍
式中:U-样品的酶活力,u/ml(u/g);
8-反应试剂的总体积,ml;
15-反应时间15分钟,以分钟计;
N-稀释倍数。
所测定的结果表示为整数。平行试验相对误差不超过3%。
实施例3:本发明菌株及其产酶的温度特性测定
培养基:胰蛋白胨15g,豆蛋白胨5g,氯化钠5g,乳糖2.5g,磷酸氢二钾2.5g,水1000ml,pH6.5。
分别于4℃、20℃、42℃、200转/分钟、60ml物料/瓶(500ml摇瓶)、加棉塞,培养时间分别6d、2d、1d,取5ml培养菌悬液于50ml离心管中,在冰水浴中用超声波仪(破壁)。在10强度下破壁5min,使酶从菌体中释放出来。取出用分光光度计于波长420nm,10mm比色皿,以不合ONP的管为空白,分别测定其吸光度。同时用分光光度计于波长620nm,10mm比色皿,以未接菌培养基的管为空白,分别测定其吸光度。
结果表明,温度分别为4℃、20℃、42℃,200转/分钟、60ml物料/瓶(500ml摇瓶)、加棉塞,培养6d、2d、1d的酶活分别为32.5u、39.4、8.2,发酵原液620nm的吸光值分别为1.20。0.804、0.021。由此可见,本发明菌株L2004(Breibacillus sp.)的生长温度范围4℃-42℃,最适生长温度20℃及最适产酶温度为20℃。
表3 发酵温度对菌株生长的影响
发酵温度(℃) |
菌株生长量(OD620) |
24h |
48h |
72h |
10 |
1.221 |
0.752 |
0.656 |
15 |
0.525 |
1.225 |
1.023 |
20 |
0.810 |
0.724 |
0.642 |
25 |
1.692 |
1.073 |
0.965 |
30 |
0.748 |
0.653 |
0.535 |
35 |
3.015 |
2.832 |
1.216 |
实施例4:本发明发酵培养基的筛选
培养基是发酵工艺技术的基础,本着高产酶率、低成本的原则,在实验室研究的基础上进行了工业化中试研究的培养基筛选和优化。碳源选择葡萄糖、乳糖,氮源为胰蛋白胨、豆蛋白胨,并加入一定量Na、K离子,促进菌体生产和产酶率的提高,并以磷酸盐调节培养基在发酵过程中pH的变化。
1.筛选培养基:胰蛋白胨15g,豆蛋白胨5g,氯化钠5g,琼脂15-20g,乳糖2.5g,磷酸氢二钾2.5g,X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳吡喃糖苷)0.1g,水800ml,pH6.5。
2.摇瓶检测培养基:胰蛋白胨15g,豆蛋白胨5g,氯化钠5g,乳糖2.5g,磷酸氢二钾2.5g,水1000ml,pH6.5。
于20℃、200转/分钟、60ml物料/瓶(500ml摇瓶)、加棉塞,培养48hr,取5ml培养菌悬液于50ml离心管中,在冰水浴中用超声波仪(破壁)。在10强度下破壁5min,使酶从菌体中释放出来。检测发酵液酶产量,当酶产量达50u/ml以上时,证明菌生产能力符合生产要求。
3.种子培养基和发酵培养基
3.1.种子培养基:胰蛋白胨7.5g,豆蛋白胨5g,氯化钠5g,酵母浸膏6g,琼脂17g,乳糖3g,磷酸氢二钾2.5g,水800ml,pH6.5。
以摇瓶检测培养基为水平1,设计正交方案为5水平,4重复进行筛选优化培养基如下。
3.2.摇瓶发酵优选培养基:胰蛋白胨7.5g,豆蛋白胨5g,酵母浸膏6g,氯化钠5g,乳糖3g,磷酸氢二钾2.5g,水1000ml,pH6.5。
实施例5:本发明的摇瓶发酵工艺研究
首先,在菌株筛选培养基上活化菌株L2004于20℃培养箱中12h,然后挑取一单菌落用无菌水稀释,吸取0.2mL涂于筛选培养基上,倒置于20℃培养箱中12h,加入5mL无菌水用接种环刮下菌苔接入发酵摇瓶培养基中(优选发酵培养基:胰蛋白胨7.5g,豆蛋白胨5g,酵母浸膏6g,磷酸氢二钾2.5g,乳糖3g,氯化钠5g,pH值6.5),于200rpm恒温摇床20℃培养36h在摇瓶,收集发酵液用于酶制剂的生产。试验中发现摇床温度和三角瓶装料量对该酶的产率有较大影响,在一定范围内降低摇床温度可使酶的产率提高(见表1);500ml三角瓶装60ml培养基较装100ml培养基的产酶率高(见表2)。因此,优化发酵工艺为:发酵温度20℃、通气量1∶8.2、搅拌速度为200rpm、发酵周期32h。实验表明,发酵培养基中乳糖浓度对菌株L2004产酶有一定影响,3%乳糖发酵浓度与12%乳糖浓度相比,酶活提高了7.31%。因此优选发酵乳糖浓度为3%(见图1、图2、图3)。
表4 发酵温度对产酶的影响
发酵温度(℃) |
酶活(u/mL) |
24h |
48h |
72h |
10 |
31.2 |
69.8 |
83.5 |
15 |
36.8 |
62.3 |
79.2 |
20 |
39.5 |
45.2 |
54.6 |
25 |
49.8 |
35.1 |
15.6 |
30 |
19.5 |
17.2 |
7.6 |
35 |
16.3 |
13.5 |
11.2 |
表5 发酵摇瓶装料量对该酶的产率的影响(20℃发酵)
装料量(mL) |
酶活(u/mL) |
24h |
48h |
72h |
30 |
42.6 |
48.2 |
60.1 |
60 |
39.4 |
44.6 |
55.2 |
90 |
32.2 |
39.8 |
46.1 |
150 |
21.1 |
32.6 |
39.9 |
以上说明L2004菌株的产酶率与溶氧量和温度在一定范围内成正相关;装料量决定发酵摇瓶发酵培养基的容氧量。
实施例6:本发明酶制剂的制备
液体酶制剂的制备过程简单,直接将发酵预处理液取5ml摇瓶培养菌悬液于50ml,在冰水浴中用超声波仪(破壁)。在10强度下破壁5min,使酶从菌体中释放出来。加入防腐剂低温密封即可。