CN102174439B - 一株产低温β-半乳糖苷酶的海洋盐单胞菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及海洋微生物技术领域。由于牛奶的运输、保藏多数是在低温下进行的，因此能在低温下分解乳糖，是工业应用β-半乳糖苷酶所必须具备的条件之一。本发明的海洋盐单胞菌菌株P6006-1，是从东海海域的海水中培养分离得到的，已于2011年1月7日保藏于中国武汉典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号为CCTCC No：M2011001。本发明还提供了利用该海洋盐单胞菌生产低温β-半乳糖苷酶的方法。利用该海洋盐单胞菌生产出的低温β-半乳糖苷酶可以用来分解牛乳中的乳糖，最适反应温度为30℃。
Description
技术领域
本发明涉及海洋微生物技术领域，具体涉及一株海洋盐单胞菌菌株P6009-1，及其利用该海洋盐单胞菌生产低温β-半乳糖苷酶的方法，及其在制备低乳糖牛奶中的应用。
背景技术
β-半乳糖苷酶(E.C.3.2.1.23)全称是β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，它广泛分布在动植物以及微生物中，动物体内的β-半乳糖苷酶主要存在于小肠表面，其作用是将乳糖分解为葡萄糖和半乳糖，以供生物体利用。同时它还可以通过转糖基作用将半乳糖转移至乳糖上，生成低聚糖。
乳糖是由D-半乳糖和D-葡萄糖通过β-1，4糖苷键连接形成的二糖，它主要存在于哺乳动物的乳汁中，在人乳中约含7％，牛乳中约含5％。牛乳是一种重要的营养品，但某些人群在喝牛奶时会产生腹鸣、腹泻、呕吐等症状，其主要原因是由于人体内β-半乳糖苷酶的含量或活性随年龄、人种及肠道疾病的影响而降低，导致牛乳中的乳糖不能很好地被分解而产生的一种不适，称为乳糖不耐症或乳糖消化不良。乳糖不耐症的主要原因是乳糖不耐症严重影响了牛奶中营养物质的吸收。目前为解决乳糖不耐症患者的牛奶饮用问题，多采用在牛奶中添加外源性β-半乳糖苷酶的方法生产低乳糖牛奶，使牛奶中的乳糖在进入人体之前就被降解，避免了乳糖吸收的问题。
食品工业最主要的β-半乳糖苷酶的来源是从微生物中提取纯化的β-半乳糖苷酶。但是，由于牛奶的运输、保藏多数是在低温下进行的，因此能在低温下分解乳糖，是工业应用β-半乳糖苷酶所必须具备的条件之一。鉴于此原因，目前报道的最适作用温度低于50℃的β-半乳糖苷酶不多，而能在低温(0～20℃)下保持高活性的β-半乳糖苷酶就更少。比较优良的有来自于Arthrobacterpsychrolactophilus F2的β-半乳糖苷酶，在0～20℃时可保持活性75％以上，以及来自于Arthrobacter sp.SB中的β-半乳糖苷酶，在0～20℃时可保持活性50％以上。而目前能应用于食品工业的符合美国FDA的GRAS级(generally regard assafe)的只有荷兰帝斯曼集团改造的乳酸克鲁维酵母菌(Kluyveromyces lactis)中提取的β-半乳糖苷酶，该酶最适温度在40℃左右，但它在低温下活性很低，因此，目前没有真正意义上的低温β-半乳糖苷酶应用于食品工业中，急需发现新型低温β-半乳糖苷酶。
海洋是一个十分独特的生态环境，复杂的生态环境，不仅使海洋微生物产生了特殊的生物活性物质，也使海洋生物代谢过程中的酶类在性质、功能上与陆地生物有很多不同，比如作用温度，海洋微生物酶类普遍具有低温酶的相关性质。因此，从海洋微生物中寻找低温下具有高活性的β-半乳糖苷酶是一种很好的选择。
本发明的目的在于从海洋微生物中寻找到一株能够高产低温β-半乳糖苷酶的海洋盐单胞菌，并利用它生产低温β-半乳糖苷酶。
本发明提供了一株海洋盐单胞菌菌株P6009-1。
本发明的海洋盐单胞菌(Halomonas sp.)菌株P6009-1，是从东海海域的海水中培养分离得到的，是一株盐单胞菌属未知种菌株，该盐单胞菌属未知种菌株P6009-1，已于2011年1月5日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号为CCTCC No：M2011001。
本发明提供的海洋盐单胞菌菌株P6009-1(简称菌株P6009-1)形态特征如下：菌落颜色呈黄色，菌落形态为圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，突起于琼脂表面。对菌株进行革兰氏染色，为革兰氏阴性杆菌。
经DNA序列测定，菌株P6009-1的16S rDNA序列全长为1447bp。将该16S rDNA序列递交GenBank进行Blast同源系列比对，结果发现，P6009-1与Halomonas sp.MZ0306A1(EU124745.1)相似度最高，为99％。
菌株P6009-1的16S rDNA全序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明还提供了利用该海洋盐单胞菌生产低温β-半乳糖苷酶的方法。该方法是将上述海洋盐单胞菌在含乳糖的培养基中进行发酵，培养温度为25-37℃，培养3-7天，pH值为7.2-7.8。
较优的方法是，将上述海洋盐单胞菌接种于Zobell 2216E液体培养基(蛋白胨5g，酵母膏1g，磷酸铁0.1g，NaCl 60g，1000ml蒸馏水，pH7.6)，28℃，培养2天；然后转入发酵液体培养基(乳糖20g，蛋白胨5g，酵母膏1g，磷酸铁0.1g)中培养，28℃，培养3天。
本发明还提供了利用该海洋盐单胞菌生产出的低温β-半乳糖苷酶在制备低乳糖牛奶中的应用。
采用乳糖诱导培养菌株P6009-1，细胞裂解液与乳糖在30℃左右水浴反应10min，即可将乳糖分解生成葡萄糖和半乳糖。本发明菌株P6009-1具有能分解乳糖的能力，可以用来分解牛乳中的乳糖。利用该海洋盐单胞菌生产出的低温β-半乳糖苷酶，最适反应温度为30℃，以30℃时ONP的吸光度值为100％，算得该粗酶在4℃时的酶活力可保持在15％～20％之间，8℃时的酶活力为最适温度下的35％。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细描述。但下列实施例不应看作对本发明范围的限制。
实施例1：菌株P6009-1的培养
菌株P6009-1的培养基为：蛋白胨5g，酵母膏1g，磷酸铁0.1g，人工海水(或陈海水)1000ml，pH 7.6。人工海水配方：NaCl 25.0g，Na2SO4 4.0g，KCl 0.7g，NaHCO3 0.20g，KBr 0.10g，H3BO3 0.03g，NaF 0.003g，53mL 1.0mol/LMgCl2溶液，10mL 1.0mol/l CaCl2溶液，0.90ml 0.1mol/L SrCl2溶液，蒸馏水1000ml，pH调为6.5。按常规将菌株P6009-1接种于培养基，在28℃下培养。
实施例2：菌株P6009-1的粗酶液制取
采用乳糖诱导培养，将P6009-1菌株接种于Zobell 2216E液体培养基(蛋白胨5g，酵母膏1g，磷酸铁0.1g，NaCl 60g，1000ml蒸馏水，pH7.6)，28℃，130r/min摇床培养2天，活化菌株，然后转入发酵液体培养基(乳糖20g，蛋白胨5g，酵母膏1g，磷酸铁0.1g)中培养，28℃，130r/min摇床培养3天，发酵液离心，5000r/min×15min×4℃，弃上清。用0.05mol/L pH7.2的磷酸缓冲液将沉淀重悬，转移至离心管中，并用磷酸缓冲液洗涤菌体两次，并离心，5000r/min×15min×4℃，弃上清。将菌体重悬于0.05mol/L pH7.2的磷酸缓冲液中。冰浴条件下用超声波粉碎机破碎细胞：每次超声1s，间隔1s再超声，共5min。破菌后的菌液离心12000r/min×40min×4℃，取上清即为粗酶液。
实施例3：金属离子对粗酶活性的影响
取粗酶液10μL，加入87μL 20g/L的乳糖，再分别加入3μL的0.2M的MnCl2、FeCl2、FeCl3、MgCl2、ZnCl2、LiCl、CoCl2、BaCl2、SrCl2、CuCl2、NaCl、CaCl2溶液，放置在不同温度下孵育，通过薄层层析方法检测乳糖是否被分解生成半乳糖和葡萄糖，具体操作为：取5μL反应液用毛细管点样于硅胶薄层板上，以正丁醇∶吡啶∶水(5∶4∶1)为展开剂进行展开，待溶剂前沿达到离薄层板上沿约1cm 时，取出薄层板，挥干溶剂后喷上20％硫酸-甲醇溶液，115℃烘烤显色。以0.2％乳糖，0.2％半乳糖，0.2％葡萄糖为标准对照品，观察反应液中是否出现于标准品Rf值相同的斑点。
结果发现，加入ZnCl2、CuCl2、NaCl溶液的反应管中葡萄糖、半乳糖斑点亮度明显减弱甚至消失，而加入其他上述离子的反应管中的葡萄糖和半乳糖的生成亮无明显变化，因此，Zn2+、Cu2+、Na+对该菌株产低温β-半乳糖苷酶的活性具有较显著抑制作用，而Mn2+、Fe2+、Fe3+、Mg2+、Li+、Co2+、Ba2+、Sr2+、Ca2+对该酶的活性无抑制作用。
实施例4：粗酶分解乳糖的定性实验
取粗酶液20μL，加入10μL 2g/L的乳糖，分别于4℃，8℃，15℃，30℃，40℃，60℃反应30min，加热煮沸10min以终止反应。各取反应液5μl用毛细管点于硅胶G薄层板上，以0.2％乳糖，0.2％半乳糖，0.2％葡萄糖标准品为阳性对照，以正丁醇∶吡啶∶水(5∶4∶1)为展开剂，进行展开，以20％硫酸甲醇为显色剂，发现在4℃，8℃，15℃，30℃，40℃温度下反应，均能出现葡萄糖、半乳糖阳性斑点，与对照品的Rf值相同；而60℃反应，无阳性斑点产生。
实施例5：粗酶在低温下的活力
取粗酶液10μL，加入10μL 40mM的ONPG溶液，补充体积至100μL，分别在4℃，8℃，15℃，30℃，40℃，60℃下反应一定时间，用1M的Na2CO3溶液终止反应，在OD405nm处测量吸光度值，发现该酶的最适反应温度为30℃，以30℃时ONP的吸光度值为100％，算得该粗酶在4℃时的酶活力可保持在15％～20％之间，8℃时的酶活力为最适温度下的35％。
Claims (5)
1.海洋盐单胞菌(Halomonas sp.)，保藏号为CCTCC No：M2011001。
2.一种利用如权利要求1所述的海洋盐单胞菌生产低温β-半乳糖苷酶的方法，其特征在于该方法是将海洋盐单胞菌在含乳糖的培养基中进行发酵，培养温度为25-37℃，培养3-7天，pH7.2-7.8。
3.根据权利要求2所述的生产低温β-半乳糖苷酶的方法，其特征在于该方法是将海洋盐单胞菌接种于Zobell 2216E液体培养基：蛋白胨5g、酵母膏1g、磷酸铁0.1g、NaCl 60g和1000ml蒸馏水，pH7.6，28℃，培养2天；然后转入发酵液体培养基：乳糖20g、蛋白胨5g、酵母膏1g和磷酸铁0.1g，28℃，培养3天。
4.一种如权利要求1所述的海洋盐单胞菌在制备低乳糖牛奶中的应用。
5.一种利用如权利要求1所述的海洋盐单胞菌生产低温β-半乳糖苷酶的方法在制备低乳糖牛奶中的应用。
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