CN106754558B - 一株产低温活性β-半乳糖苷酶的极地来源的细长赖氨酸芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体是一株极地土壤来源的细长赖氨酸芽孢杆菌S‑14‑65，和利用该菌株生产具有低温活性的β‑半乳糖苷酶的方法，及利用该菌株生产的具有低温活性的β‑半乳糖苷酶在制备低乳糖牛奶中的应用。本发明菌株所产生的β‑半乳糖苷酶水解乳糖的最适温度为30℃，其在10℃时能达到最适温度下活力的50％，而在4℃时则能达到最适温度下活力的20％，4℃时对牛奶中乳糖的水解率可达到75％以上。由于乳制品的运输及保藏多在低温下进行，能够在低温条件下水解乳糖的β‑半乳糖苷酶在食品工业中有非常重要的应用。

Description

一株产低温活性β-半乳糖苷酶的极地来源的细长赖氨酸芽孢 杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体地说，是一株极地土壤来源的细长赖氨酸芽孢杆菌S-14-65，和利用该菌株生产具有低温活性的β-半乳糖苷酶的方法，及利用该菌株生产的具有低温活性的β-半乳糖苷酶在制备低乳糖牛奶中的应用。

背景技术

β-半乳糖苷酶(β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，EC 3.2.1.23)是能够将乳糖水解为D-半乳糖和D-葡萄糖的酶。该酶在自然界分布非常广泛。从细菌、酵母、真菌、植物和哺乳动物均可产生β-半乳糖苷酶。动物体内的β-半乳糖苷酶主要存在与小肠表面，它可将乳糖水解为半乳糖和葡萄糖以供生物体利用。

牛乳是一种具有很高的营养价值的天然食品。然而某些人在饮用牛乳后会产生包括腹鸣、腹泻、呕吐等症状，这些症状称为乳糖不耐症。产生这些症状的原因是由于这些人由于各种原因(包括种族、年龄、遗传、疾病等因素)在体内缺乏β-半乳糖苷酶，从而对于牛乳中的天然成分——乳糖消化不良引起的。解决乳糖不耐症的主要方法是在乳制品中加入外源性的β-半乳糖苷酶，通过将牛奶中的乳糖水解，产生低乳糖的牛奶。

目前，在牛奶加工过程中所用的β-半乳糖苷酶主要是来自酵母和霉菌，这些酶的最适温度较高，而在低温条件相对活力很低。例如荷兰DSM公司的乳酸克鲁维酵母菌所产的乳糖酶最适温度为45℃，其低温活力不显著。因此，采用这些酶对牛奶加工往往需要比较高的温度，然而，高温处理不仅会影响牛奶的品质(例如会产生褐变现象)，同时也使能耗增加。由于牛奶的存储和运输多在低温下进行。在低温下具有较高活力的β-半乳糖苷酶在乳制品加工行业中具有很高的应用价值。

目前已有一些低温β-半乳糖苷酶的文献报道。例如来自于Carnobacteriumpiscicola的β-半乳糖苷酶在0-10℃时可达到最适温度下的24％，来自Arthrobactersp.SB的β-半乳糖苷酶在0-20℃时可达到最大活力的50％。而来自Arthrobacterpsychrolactophilus在0-20℃时可达到最大活力的75％。然而这些酶均未获得市场应用，导致这些酶未获得市场应用主要有以下一些因素：一、酶的产量偏低。例如大部分酶在天然菌株中产量很低，而通过大肠杆菌埃希氏菌重组表达产生的酶又多以包涵体的形式存在。二、酶学性质不理想。例如有些酶受到Ca²⁺和Na⁺的抑制作用很强，而有些酶的动力学参数不理想。例如K_m值偏大而k_cat值偏小，导致酶的整体催化效率不高。还有的酶受到产物半乳糖的抑制作用很强，导致其在水解乳糖中转化率很低。因此，开发新型的在低温下具有较高活力的β-半乳糖苷酶具有极高的应用价值。目前，世界各个发达国家都在积极开发能生产具有优良性状的β-半乳糖苷酶的新型专利菌株。在这方面我国还处于起步阶段，开发具有我国自主知识产权的β-半乳糖苷酶专利菌株对提升我国乳制品行业具有重要的意义。

极地具有独特的地理环境和气候特征。极低的温度、特殊的光照条件、变化极大的光照辐射造就了极低微生物独特的生物学特征。因此，极地被认为是一个重要的、潜在的微生物资源库。此外，极地常年具有非常低的温度，因此，在极地的低温微生物相比其它生境分布更加广泛、种类数量更多、而这些低温微生物所产生酶就可能具有在低温下高活性的特征，因此，通过对极地微生物的筛选有望得到具有优良性状的新型低温β-半乳糖苷酶。

发明内容

本发明的目的在于提供一株高产具有低温活性的β-半乳糖苷酶(以下也称低温β-半乳糖苷酶)的细长赖氨酸芽孢杆菌S-14-65。用该菌株生产的β-半乳糖苷酶可在低温下用于牛奶中乳糖的水解。

本发明的第一方面，提供一株产低温β-半乳糖苷酶的菌株S-14-65，所述的产低温β-半乳糖苷酶的菌株S-14-65经鉴定为细长赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusmacroides)。S-14-65菌株是从北极土壤中分离得到的，该菌株已保藏，保藏编号为CCTCCNO：M2016745，保藏日期2016年12月12日，保藏单位为中国典型微生物保藏中心(CCTCC)，地址：中国湖北省武汉市武汉大学。

所述的菌株S-14-65菌落形态特征如下：菌落颜色呈淡黄色、形态呈圆形、表面光滑湿润、突起于琼脂表面。经过革兰氏染色鉴定，该菌株为革兰氏阳性菌。

经过16S rRNA基因序列测定，所述的菌株S-14-65的16S rDNA全长为1423bp，如SEQ ID NO.1所示，该序列提交至细菌鉴定与分类专业网站EzTaxon网站进行BLAST比对，发现与之序列相似度最高的为长杆状赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus macroides stainDSM 54的16S rRNA基因(Genbank No：LGCI01000008.1)(序列一致性达到99％)。

本发明的第二方面，提供上述的细长赖氨酸芽孢杆菌S-14-65在制备具有低温活性的β-半乳糖苷酶中的应用。

本发明的第三方面，提供利用上述的细长赖氨酸芽孢杆菌S-14-65制备具有低温活性的β-半乳糖苷酶的方法，是将S-14-65菌株接种于种子培养基，培养2-3天后接入含乳糖的发酵培养基中继续培养3-7天(优选4-5天)，通过离心收菌及细胞破碎，收集上清，即可获得含有低温β-半乳糖苷酶的细胞裂解液。所述的培养温度为20-30℃。

较优的，所述的制备具有低温活性的β-半乳糖苷酶的方法是将斜面S-14-65菌接入种子培养基，25℃，180rpm下生长2-3天，随后，按照1：10的比例接种于发酵培养基，25℃，180rpm继续培养4-5天。通过离心收菌及细胞破碎，即可获得含有低温β-半乳糖苷酶的细胞裂解液。

所述的种子培养基为改良的R2A培养基：酵母粉5g，蛋白胨5g，酪蛋白水解物0.5g，葡萄糖0.5g，可溶性淀粉0.5g，磷酸氢二钾0.3g，无水硫酸镁0.024g，丙酮酸钠0.3g，溶于1000ml蒸馏水(调节pH至7.2)。

所述的发酵培养基是在种子培养基中加入质量分数1％-3％(优选3％)的乳糖。

本发明的第四方面，提供一种具有低温活性的β-半乳糖苷酶，所述的具有低温活性的β-半乳糖苷酶采用上述的方法制备得到。

根据上述方法获得的含有低温β-半乳糖苷酶的细胞裂解液，在乳糖水解实验中可水解乳糖。具体方法是在100μl的总反应体系中加入1μl的细胞裂解液和99μl的底物反应液(含5％乳糖，20mM磷酸氢二钾/磷酸二氢钾缓冲液，pH 7.2)，在0-35℃等不同温度条件下反应30min，通过测定葡萄糖的含量可以计算乳糖的转化率。葡萄糖含量的测定的方法是采用葡萄糖氧化酶试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司，货号：E1010)。

通过测定该细胞裂解液在0-35℃不同温度条件下的乳糖转化能力发现：S-14-65菌细胞裂解液所含的低温β-半乳糖苷酶最适反应温度为30℃，其在10℃能保持其在最适温度条件下50％以上的酶活力，而在4℃条件下能保持20％以上的酶活力，具体方法见实施例3。

此外，通过在反应体系中加入金属离子的实验表明，Na⁺和Ca²⁺对含有低温β-半乳糖苷酶的细胞裂解液在乳糖水解反应过程中抑制率很低。其中1mM的Na⁺和Ca²⁺对低温β-半乳糖苷酶没有抑制作用，而10mM的Na⁺对该酶活性抑制率为5％，10mM的Ca²⁺对该酶活性抑制率只有7％，具体方法见实施例4。

本发明的第五方面，提供上述的细长赖氨酸芽孢杆菌在制备低乳糖牛奶中的应用。

本发明的第六方面，提供上述的具有低温活性的β-半乳糖苷酶在制备低乳糖牛奶中的应用。

所述的低乳糖牛奶的制备方法是将上述S-14-65所产生的细胞裂解液10μl加入到10ml牛奶中，于4℃冰箱放置12h。经测定，通过该方法可水解牛奶中的约75％乳糖。

本发明优点在于：

本发明提供了一株能够产生具有低温活性β-半乳糖苷酶的极地来源的细长赖氨酸芽孢杆菌，本发明提供的细长赖氨酸芽孢杆菌来源于北极土壤，该菌株所产生的β-半乳糖苷酶水解乳糖的最适温度为30℃，其在10℃时能达到最适温度下活力的50％，而在4℃时则能达到最适温度下活力的20％，4℃时对牛奶中乳糖的水解率可达到75％以上。由于乳制品的运输及保藏多在低温下进行，能够在低温条件下水解乳糖的β-半乳糖苷酶在食品工业中有非常重要的应用。

生物材料样品的保藏信息：

保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)

地址：中国湖北省武汉市武汉大学

保藏日期：2016年12月12日

保藏编号：CCTCC NO：M2016745

分类命名：细长赖氨酸芽孢杆菌S-14-65(Lysinibacillus macroides S-14-65)

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1：菌株S-14-65的培养

菌株S-14-65的培养基为改良的R2A培养基(每升蒸馏水含酵母粉5g，蛋白胨5g，酪蛋白水解物0.5g，葡萄糖0.5g，可溶性淀粉0.5g，磷酸氢二钾0.3g，无水硫酸镁0.024g，丙酮酸钠0.3g，调节pH至7.2)，培养条件为180rpm，25℃2-3d。

实施例2：菌株S-14-65细胞裂解液的制备

首先，将斜面保藏的S-14-65菌株接种与种子培养基进行活化(每升蒸馏水含酵母粉5g，蛋白胨5g，酪蛋白水解物0.5g，葡萄糖0.5g，可溶性淀粉0.5g，磷酸氢二钾0.3g，无水硫酸镁0.024g，丙酮酸钠0.3g，调节pH至7.2)，25℃培养2-3d，随后，按照1：10的比例接种于发酵培养基(在种子培养基中加入3％的乳糖)，25℃下继续培养4-5d。离心收集菌体，按照每克湿菌加入3ml细胞裂解液(20mM磷酸氢二钾/磷酸二氢钾pH 7.2、50mM NaCl、5％甘油)制备成菌悬液。采用高压细胞破碎仪进行破碎(压力800-1000bar，破碎3次)，22000g，离心30min，收集上清，即得细胞裂解液。

实施例3：菌株S-14-65细胞裂解液所含β-半乳糖苷酶水解乳糖最适温度的测定

将在100μl的总反应体系中加入1μl的细胞裂解液和99μl的底物反应液(含5％乳糖，20mM磷酸氢二钾/磷酸二氢钾缓冲液，pH 7.2)，在0℃、4℃、10℃、20℃、30℃、35℃等不同温度条件下反应30min。随后，用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法测定葡萄糖的浓度(葡萄糖测定试剂盒，北京普利莱基因技术有限公司E1010)，通过葡萄糖的生成量计算乳糖的转化率。通过计算S-14-65菌株细胞裂解液所含β-半乳糖苷酶最适温度为30℃，其在10℃下可保持最大活力的50％，而在4℃时可达到最大活力的20％。

实施例4：金属离子对菌株S-14-65细胞裂解液所含β-半乳糖苷酶水解乳糖的影响

将在100μl的总反应体系中加入1μl的细胞裂解液和89μl的底物反应液(含5％乳糖，20mM磷酸氢二钾/磷酸二氢钾缓冲液，pH 7.2)，另加入10μl金属离子存储液(Na⁺、Ca²⁺等)使其在反应体系的终浓度达到1mmol/L或10mmol/L，以加入10μl双蒸水的反应体系作为对照，在30℃下反应30min，通过计算葡萄糖的含量计算乳糖的转化率。

实施例5：S-14-65细胞裂解液水解牛奶中乳糖的应用方法。

采用市售的光明乳业的优倍全脂全家福牛奶。将10μl上述S-14-65细胞裂解液加入到100ml牛奶中，于4℃放置12小时以上。采用葡萄糖氧化酶试剂盒测定生成的葡萄糖含量，以此计算乳糖的转化率。经测定，通过该方法对该品种牛奶中乳糖的水解率达到75％以上。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国人民解放军第二军医大学

<120> 一株产低温活性β-半乳糖苷酶的极地来源的细长赖氨酸芽孢杆菌及其应用

<130> /

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1423

<212> DNA

<213> 细长赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus macroides）

<400> 1

tgcagtcgag cgaacagaaa aggagcttgc tcctttgacg ttagcggcgg acgggtgagt 60

aacacgtggg caacctaccc tatagtttgg gataactccg ggaaaccggg gctaataccg 120

aataatctct tttgcttcat ggtaaaagac tgaaagacgg tttcggctgt cgctatagga 180

tgggcccgcg gcgcattagc tagttggtga ggtaacggct caccaaggcg acgatgcgta 240

gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg 300

aggcagcagt agggaatctt ccacaatggg cgaaagcctg atggagcaac gccgcgtgag 360

tgaagaaggt tttcggatcg taaaactctg ttgtaaggga agaacaagta cagtagtaac 420

tggctgtacc ttgacggtac cttattagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc 480

ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg cgtaaagcgc gcgcaggcgg 540

tcctttaagt ctgatgtgaa agcccacggc tcaaccgtgg agggtcattg gaaactgggg 600

gacttgagtg cagaagagga aagtggaatt ccaagtgtag cggtgaaatg cgtagagatt 660

tggaggaaca ccagtggcga aggcgacttt ctggtctgta actgacgctg aggcgcgaaa 720

gcgtggggag caaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgagtgcta 780

agtgttaggg ggtttccgcc ccttagtgct gcagctaacg cattaagcac tccgcctggg 840

gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag 900

catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat cccgttgacc 960

actgtagaga tatagtttcc ccttcggggg caacggtgac aggtggtgca tggttgtcgt 1020

cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tgatcttagt 1080

tgccatcatt tagttgggca ctctaaggtg actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg 1140

gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga cctgggctac acacgtgcta caatggacga 1200

tacaaacggt tgccaactcg cgagagggag ctaatccgat aaagtcgttc tcagttcgga 1260

ttgtaggctg caactcgcct acatgaagcc ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgc 1320

cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccacga gagtttgtaa 1380

cacccgaagt cggtgaggta acctttggag ccagccgccg aag 1423

Claims (6)

1.细长赖氨酸芽孢杆菌，其特征在于，所述的细长赖氨酸芽孢杆菌的分类命名为细长赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus macroides）S-14-65，保藏编号为CCTCC NO：M2016745。

2.一种如权利要求1所述的细长赖氨酸芽孢杆菌在制备具有低温活性的β-半乳糖苷酶中的应用。

3.一种利用如权利要求1所述的细长赖氨酸芽孢杆菌制备具有低温活性的β-半乳糖苷酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：将所述的细长赖氨酸芽孢杆菌菌株接种于种子培养基，培养2-3天后接入含乳糖的发酵培养基中继续培养3-7天，培养温度为20-30℃，通过离心收菌及细胞破碎，收集上清，即可获得含有具有低温活性的β-半乳糖苷酶的细胞裂解液。

4.根据权利要求3所述的制备具有低温活性的β-半乳糖苷酶的方法，其特征在于，所述的种子培养基为改良的R2A培养基：酵母粉5g，蛋白胨5g，酪蛋白水解物0.5g，葡萄糖0.5g，可溶性淀粉0.5g，磷酸氢二钾0.3g，无水硫酸镁0.024g，丙酮酸钠0.3g，溶于1000ml蒸馏水；所述的发酵培养基是在种子培养基中加入质量分数1%-3%的乳糖。

5.一种如权利要求1所述的细长赖氨酸芽孢杆菌在制备低乳糖牛奶中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的低乳糖牛奶的制备方法是将权利要求3的方法中所产生的含有具有低温活性的β-半乳糖苷酶的细胞裂解液10μl加入到10ml牛奶中，于4℃冰箱放置12h。