CN102206591B - 谷氨酸棒杆菌及生产l-苹果酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了谷氨酸棒杆菌及生产L-苹果酸的方法，谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGMCC No.4351，用谷氨酸棒杆菌生产L-苹果酸或其盐的方法，是用所述谷氨酸棒杆菌与富马酸接触或与富马酸盐接触。本发明采用的微生物菌种具有安全性高，容易保存，反应的选择性高等优点，同时成品L-苹果酸的光学纯度和化学纯度高。
Description
技术领域
本发明属于生物化工技术领域，涉及一种谷氨酸棒杆菌及生产L-苹果酸的方法。
背景技术
L-苹果酸口感接近天然果汁并具有天然香味，与柠檬酸相比，酸度更大(酸味比柠檬酸强20％)，产生的热量更低、口味更柔和(具有较高的缓冲指数)、滞留时间更长，具特殊香味，不损害口腔与牙齿，代谢上有利于氨基酸吸收，不积累脂肪，是新一代的食品酸味剂，被生物界和营养界誉为“最理想的食品酸味剂”。作为食品酸味剂，L-苹果酸与柠檬酸配合使用，可以模拟天然果实的酸味特征，使口感更自然、协调、丰满。清凉饮料、粉末饮料、乳酸饮料、乳饮料、果汁饮料中均可添加L-苹果酸改善其口感和风味，L-苹果酸常与人工合成的二肽甜味剂阿斯巴甜(ASPARTME)配合使用，作为软饮料的风味固定剂添加。L-苹果酸具有抗疲劳和保护肝、肾、心脏的作用，可用于保健饮料。苹果酸能增进药物的稳定性，改善人体对药物的吸收。苹果酸配入复合氨基酸注射液中，直接进入生物体的主要代谢循环--三羧酸循环，可以减少氨基酸的代谢损失和弥补肝功能缺陷，可用于治疗尿毒症、高血压并可减轻抗癌药物对正常细胞的毒害作用。亦可用做皮肤的消毒剂、空气的清洁剂和除臭剂。
L-苹果酸，主要存在于不成熟的的山楂、苹果和葡萄果实的浆汁中。过去，生产的L-苹果酸是从山楂、苹果和葡萄果实的浆汁中分离提取，或者以葡糖糖为主要原料通过发酵法生产。而采用具有延胡索酸酶的微生物将富马酸水解生产L-苹果酸是目前L-苹果酸生产的发展方向。
目前报道的用于生产L-苹果酸的具有延胡索酸酶的微生物的有：产氨短杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)，变形杆菌(proteusbacillus vulgaris)，黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)，短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、大肠杆菌(Escherichiacoli)和温特曲霉(Aspergillus wentii)等。如中国专利CN1523115A采用温特曲霉，催化富马酸生产L-苹果酸，温特曲霉很容易产生致癌性物质；中国专利采用CN1093753A采用黄色短杆菌，催化延胡索酸生产L-苹果酸。但未见采用微生物菌株谷氨酸棒杆菌CGMCCNo.4351生产L-苹果酸的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种谷氨酸棒杆菌。
本发明的第二个目的是提供一种用谷氨酸棒杆菌生产L-苹果酸或其盐的方法。
本发明的第三个目的是提供一种生物催化剂。
本发明的技术方案概述如下：
谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGMCC No.4351。
用谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGMCC No.4351生产L-苹果酸或其盐的方法，是用谷氨酸棒杆菌与富马酸接触或与富马酸盐接触。
所述富马酸盐优选的是富马酸钠、富马酸铵或富马酸钙。
一种生物催化剂，包括谷氨酸棒杆菌或谷氨酸棒杆菌的发酵液。
本发明的优点：本发明采用的微生物菌种具有安全性高，容易保存，反应的选择性高等优点，同时成品L-苹果酸的光学纯度和化学纯度高。
具体实施方式
发明人经过长期和细致的研究，从土壤中分离获得了一种新的微生物菌株，根据形态特征和16S rDNA序列分析，该菌株属于棒杆菌属，并与谷氨酸棒杆菌非常接近，其培养特征和生理生化也与谷氨酸棒杆菌一致，故该菌株被定名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)。该菌株已经于2010年11月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号CGMCC No.4351。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
本发明所用的培养基的成分及其含量如下所述：
液体种子培养基(各成份为质量百分比)：
玉米浆1％，酵母膏0.5％，葡萄糖2％，硫酸铵0.5％，用氢氧化钠调pH＝7.0，121℃灭菌20分钟。
发酵产酶培养基(各成份为质量百分比)：
玉米浆5％，葡萄糖2％，硫酸铵1％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.05％，富马酸0.5％，用氢氧化钠调pH＝7.0，121℃灭菌20分钟。
合适的培养基可以从市场上购得，或者可以用本领域已知的方法制备。适用于本发明的培养基并不限于上面所述。在细菌培养箱培养，其条件可以按本领域常规的培养时间和温度进行。
本发明的菌株是经中国科学院微生物研究所检测鉴定，并出了《中国科学院微生物研究所检测鉴定报告》：
材料与方法：
参照《放线菌的分类和鉴定》和《伯杰氏细菌学手册》
1菌种来源：常茂生物化学工程股份有限公司
菌种编号：CM002
2形态特征：于牛肉膏蛋白胨琼脂上28℃培养48小时后，按常规方法观察菌落培养特征，并进行革蓝氏染色。
3培养特征：在牛肉膏蛋白胨培养基上28℃培养48小时后观察苗体的颜色及可溶性色素。
4生理生化：参照《伯杰氏细菌学手册》Vol.IV的内容对菌株进行生理生化鉴定。
516S rDNA序列分析：用溶菌酶法从新鲜菌体提取基因组DNA，采用通用引物进行16SrDNA扩增，PCR产物经纯化后直接用Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit测序，电泳及数据收集用Applied Biosystems DNA Sequencer(model 377)自动进行。将所测的I6SrDNA序列与GenBank数据库中相关种属的序列进行比对，以确定该菌株分类地位。
实验结果：
1形态特征：在牛肉啻蛋白胨琼脂上培养48小时后，菌株CM002在光学显微镜下呈直或弯的细杆，具有钝圆或棒状的末端，大小0.8-1.0×1.0-2.5哪，不分枝；细胞通常以单个、成对、V字形或几个平行细胞的栅状排列(见图1)。无鞭毛、不运动，不生孢子。革蓝氏染色阳性，不抗酸。
2培养特征：菌落圆形、菌落边缘整齐、微黄色、表面光滑，无可溶性色素产生。
3生理生化特征：见表1。
表1菌株CM002的生理生化特征
416S rDNA序列分析：菌株CM002的16S rDNA与GenBank中相关序列比较的结果表明菌株CM002属于棒杆菌属。与blast搜累到的最相近的菌株相比，CM002与多个谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的序列相似性均大于99.5％。
菌种鉴定结果：
根据形态特征和16S rDNA序列分析，菌株CM002属于棒杆菌属，并与谷氨酸棒杆菌非常相近，其培养特征和生理生化特征也与谷氨酸棒杆菌一致。故常菌株CM002定名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
用谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGMCC No.4351生产L-苹果酸的方法：
将培养48小时的谷氨酸棒杆菌CGMCC No.4351菌株的斜面接种于装有50mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，30℃振荡培养48小时，移取10mL上述种子液接种于装有100mL液体发酵产酶培养基的500mL三角瓶中，30℃振荡培养24小时，离心收集得到湿菌体4克。将4克湿菌体加到装有500mL质量浓度为10％的富马酸二钠水溶液的1000mL三角瓶中，37℃振荡反应24小时后，加入氯化钙水溶液钙化，过滤和水洗沉淀得到56克L-苹果酸钙，再经硫酸酸解，阴和阳离子交换柱除去杂质离子、浓缩、结晶、离心和烘干后得到L-苹果酸24克，经分析该L-苹果酸的含量为99.3％，光学纯度为99.9％。
实施例2
利用富马酸二钠和用卡拉胶包埋的本发明所述的CGMCC No.4351菌株细胞生产L-苹果酸
将培养48小时的谷氨酸棒杆菌CGMCC No.4351的斜面接种于装有50mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，30℃振荡培养48小时，移取10mL上述种子液接种于装有100mL液体发酵产酶培养基的500mL三角瓶中，30℃振荡培养24小时，离心收集得到湿菌体4克，用卡拉胶包埋得到固定化谷氨酸棒杆菌CGMCC No.4351菌株细胞20克。将该20克固定化谷氨酸棒杆菌CGMCC No.4351菌株细胞加到装有500mL质量浓度为10％富马酸二钠水溶液的1000mL三角瓶中，37℃振荡反应48小时后，过滤回收固定化CGMCC No.4351菌株细胞。过滤液加入氯化钙水溶液钙化，过滤和水洗沉淀得到52克L-苹果酸钙，再经硫酸酸解，阴和阳离子交换柱除去杂质离子、浓缩、结晶、离心和烘干后得到L-苹果酸21克，经分析该L-苹果酸的含量为99.4％，光学纯度为99.9％。
将该回收的固定化谷氨酸棒杆菌CGMCC No.4351菌株细胞加到装有500mL质量浓度为10％富马酸二钠水溶液的1000mL三角瓶中，37℃振荡反应48小时后，过滤回收固定化谷氨酸棒杆菌CGMCC No.4351菌株细胞。过滤液加入氯化钙水溶液钙化，过滤和水洗沉淀得到58克L-苹果酸钙，再经硫酸酸解，阴和阳离子交换柱除去杂质离子、浓缩、结晶、离心和烘干后得到L-苹果酸25克，经分析该L-苹果酸的含量为99.3％，光学纯度为99.9％。
该固定化谷氨酸棒杆菌CGMCC No.4351菌株细胞可以反复使用。
实施例3
利用富马酸钙和本发明所述的谷氨酸棒杆菌CGMCC No.4351菌株生产L-苹果酸
将培养48小时的上述CGMCC No.4351菌株的斜面接种于装有50mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，30℃振荡培养48小时，移取10mL上述种子液接种于装有100mL液体发酵产酶培养基的500mL三角瓶中，30℃振荡培养24小时，离心收集得到湿菌体4克。将4克湿菌体加到装有100克富马酸钙和400mL水的1000mL三角瓶中，37℃振荡反应24小时后，过滤和水洗沉淀得到162克L-苹果酸钙。经硫酸酸解，阴和阳离子交换柱除去杂质离子、浓缩、结晶、离心和烘干后得到L-苹果酸68克，经分析该L-苹果酸的含量为99.4％，光学纯度为99.9％。
实施例4
利用富马酸钙和本发明所述的谷氨酸棒杆菌CGMCC No.4351菌株的发酵液生产L-苹果酸
将培养48小时的谷氨酸棒杆菌CGMCC No.4351菌株的斜面接种于装有50mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，30℃振荡培养48小时，移取10mL上述种子液接种于装有100mL液体发酵产酶培养基的500mL三角瓶中，30℃振荡培养24小时后，将100mL发酵液加到装有100克富马酸钙和400mL水的1000mL三角瓶中，37℃振荡反应24小时后，过滤和水洗沉淀得到156克L-苹果酸钙。经硫酸酸解，阴和阳离子交换柱除去杂质离子、浓缩、结晶、离心和烘干后得到L-苹果酸65克，经分析该L-苹果酸的含量为99.2％，光学纯度为99.9％。
实施例5
利用富马酸二铵和本发明所述谷氨酸棒杆菌CGMCC No.4351菌株生产L-苹果酸
将培养48小时的上述谷氨酸棒杆菌CGMCC No.4351菌株的斜面接种于装有50mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，30℃振荡培养48小时，移取10mL上述种子液接种于装有100mL液体发酵产酶培养基的500mL三角瓶中，30℃振荡培养24小时，离心收集得到湿菌体4克。将4克湿菌体加到装有500mL质量浓度为12％富马酸二铵水溶液的1000mL三角瓶中，37℃振荡反应24小时后，加入氯化钙水溶液钙化，过滤和水洗沉淀得到64克L-苹果酸钙，再经硫酸酸解，阴和阳离子交换柱除去杂质离子、浓缩、结晶、离心和烘干后得到L-苹果酸28克，经分析该L-苹果酸的含量为99.2％，光学纯度为99.9％。
本发明所使用的培养基可以是本领域常规的培养基。所述的培养方式可以在本领域的常规或已知的条件下进行。例如，可以在实验室或工业发酵罐中，在包含碳源和氮源以及无机盐的适当的培养基中以适当的培养方式条件下，通过摇瓶培养、发酵罐培养(包括分批的、连续的、补料分批的)来培养细胞。
Claims (3)
1.一种谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum），其保藏号为CGMCC No.4351。
2.用权利要求1的谷氨酸棒杆菌生产L-苹果酸或其盐的方法，其特征是用所述谷氨酸棒杆菌与富马酸接触或与富马酸盐接触，所述富马酸盐为富马酸二钠、富马酸二铵或富马酸钙。
3.一种生物催化剂，其特征是包括权利要求1的谷氨酸棒杆菌或其发酵液。
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