CN101731706A - 纳豆饮料及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种纳豆饮料及其制备方法，该纳豆饮料含有豆类经纳豆芽孢杆菌液体深层发酵获得的发酵产物，所使用的纳豆芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌纳豆亚种ODK-BN1菌株，保藏编号为CCTCC No.M207055；其制备方法是先采用纳豆芽孢杆菌液体深层发酵豆类获得液态发酵产物，再将液态发酵产物与食用辅料按常规方法制成饮料；本发明使用耐缺氧、耐高温并高产纳豆激酶的纳豆芽孢杆菌菌株，采用液体深层发酵法制备纳豆饮料，方法简单，成本低，产品富含多种有益生理活性成分，外观和气味佳，安全无毒，稳定性好，保质期长，易于被消费者接受，市场前景广阔。

Description

纳豆饮料及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种饮料，特别涉及一种纳豆饮料，还涉及该纳豆饮料的制备方法。

背景技术

纳豆(Natto)由大豆经纳豆芽孢杆菌发酵而成，是日本传统大豆发酵食品。据统计，约89.4％的日本国民有常年进食纳豆的习惯。有学者认为，日本民族之所以成为世界上最长寿的民族，纳豆功不可没。

纳豆是纳豆芽孢杆菌、优质小分子蛋白质和多种活性物质的有机复合活体。研究表明，纳豆不但是优良的蛋白质来源，而且含有几十种对人体健康有益的生理活性因子，包括19种氨基酸、22种微量元素、多种维生素以及纳豆菌、纳豆激酶、超氧化物歧化酶(SOD)、吡啶二羧酸、磷脂、皂甙、膳食纤维、低聚糖、异黄酮、蛋白酶抑制剂等。其主要生理功能包括：有效预防和改善骨质疏松症；迅速溶解血栓，改善微循环障碍(纳豆是世界230多种普通食品中唯一能直接溶解血栓的食品)；降低血脂、胆固醇、低密度脂蛋白，防治高血压、动脉硬化、脂肪肝等；有强大的调整胃肠作用，可提高消化功能，促进有益菌的增殖，抑制有害菌，预防痢疾和便秘，润肠通便；保护肝脏、大脑，从而能够解酒、醒酒；减肥和降低餐后血糖，预防糖尿病；可杀灭艾滋病毒、疱疹病毒等，并能够清除多种致癌因子，预防癌症；提高记忆力，缓解疲劳；养颜美容，改善妇女的更年期综合症；全面提升免疫力，延缓衰老，预防老年痴呆症；改善代谢障碍，防治代谢和内分泌性疾病；提高身体整体机能，增强体质等。

由于具有上述众多的保健功能，纳豆不但在日本成为大众保健食品(已由日本厚生省规定为幼儿园、学校和养老院营养餐的必备食品)，而且受到世界范围的关注，特别在发达国家应用日渐广泛，成为21世纪的保健新宠。而在我国，纳豆的基础和应用研究才刚刚起步，且由于宣传力度和口味习惯等原因，食用者非常有限，这与我国亟需增强国民体质的需求以及豆类主要生产大国的地位极不相称。因此，在我国开发和推广纳豆食品，使其能够为我国广大人民群众的健康服务，是健康产业工作者义不容辞的责任。

目前，纳豆的制备方法以固体发酵法为主，但该方法存在如下缺陷：(1)纳豆芽孢杆菌的生物量难以提高(一般为10^6-7cfu/mg)且在发酵过程中分布不均匀，造成大豆发酵程度不均一，产品质量难以控制；(2)产品的外观和气味不佳(布满菌斑和粘丝并有浓重的氨臭味)，特别是后者不符合中国人的饮食习惯，是目前纳豆食品在中国难以推广的主要原因之一；(3)产品储存期短(一般为7天)，需冷冻保藏，不便携带；(4)制备周期长，成本高。

鉴于上述情况，亟需开发制备方法更先进、产品特性更符合市场需求和大众习惯的纳豆食品，使其能够更好地为大众健康服务。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种制备方法更先进、产品特性更符合市场需求和大众习惯的纳豆饮料；目的之二在于提供所述纳豆饮料的制备方法。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

1、纳豆饮料，含有豆类经纳豆芽孢杆菌液体深层发酵获得的发酵产物；所述纳豆芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌纳豆亚种(Bacillus subtilis var.natto)ODK-BN1菌株，保藏编号为CCTCC No.M207055。

2、所述纳豆饮料的制备方法，包括以下步骤：

a、以豆类为氮源制备液体发酵培养基；

b、在发酵罐中加入步骤a所得液体发酵培养基，再接入纳豆芽孢杆菌培养菌液，进行液体深层发酵，得液态发酵产物；

c、将步骤b所得液态发酵产物与食用辅料按常规方法制成饮料。

进一步，步骤c是将液态发酵产物离心去除菌体，用絮凝剂沉淀不溶性成分，分级过滤除渣，滤液减压浓缩，再加入稳定剂和调味剂，灌装，消毒，包装，即得纳豆液体饮料；

进一步，步骤c是将液态发酵产物冷冻干燥制成冻干粉，再以该冻干粉为芯材，将其包埋在壁材中制成微胶囊，包装，即得纳豆固体饮料；

进一步，步骤a所述液体发酵培养基按质量体积百分浓度即g/mL计由以下组分组成：4％的黄豆浆，3％的玉米糖浆，1％的猪肝浸粉，余量为水；

进一步，步骤b所述液体深层发酵温度为37℃，发酵pH为7.5，发酵时间为4天；

进一步，步骤b所述纳豆芽孢杆菌的种龄为18小时，接入菌液的体积为液体发酵培养基与菌液体积之和的2％；

进一步，步骤b所述发酵罐装液总体积为发酵罐容积的50％；

进一步，步骤c所述絮凝剂为单宁，稳定剂为可溶性壳聚糖，调味剂为蛋白糖和柠檬酸；

进一步，步骤c所述芯材为冻干粉和环糊精，所述壁材为海藻酸钠和低甲基果胶。

本发明的有益效果在于：①本发明将纳豆制成饮料食用，可按市场需求灵活调节饮料口味和包装形态及规格，市场适应性强，前景好；②本发明使用的纳豆芽孢杆菌为自行驯化的耐缺氧、耐高温并高产纳豆激酶的优良菌株；③本发明采用液体深层发酵法发酵豆类，发酵产物中纳豆芽孢杆菌的生物量提高至10^9-10cfu/mL，且在发酵过程中分布均匀，豆类发酵程度均一，产品质量好；④采用液体深层发酵法所得发酵产物在形态和气味等方面发生显著改变，从而使终端产品纳豆饮料的外观和气味大大改善，易于被消费者接受；⑤根据终端产品的功能定位，本发明的纳豆饮料可以去除发酵产物中与产品功能无关的纳豆芽孢杆菌菌体以及其它不溶性成分，主要保留与产品功能有关的可溶性成分，从而大大提高产品的稳定性，延长产品保质期；此外，本发明的纳豆饮料也可以制成固体饮料，以便于携带和运输；⑥本发明以纳豆芽孢杆菌生物量和纳豆激酶产量为评判指标，对液体发酵培养基的氮源浓度、碳源种类和浓度等进行了优化，不仅大大减少了氮源用量，并且通过更换碳源种类，降低了制备成本，提高了技术经济性；此外，采用猪肝浸粉替代传统培养基中的无机盐作为促生长剂，避免了非食用成分的摄取，消除了健康安全隐患；⑦本发明以纳豆芽孢杆菌生物量和纳豆激酶产量为评判指标，对液体深层发酵的条件如发酵温度、发酵pH、发酵时间、菌种种龄、菌种接种量和发酵罐装液量等进行了系统优化，大大提高了单位发酵产物的纳豆芽孢杆菌生物量和纳豆激酶产量，并能够产生和转化出更多的有益生理活性物质，从而极大地提高了产品质量。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1显示了不同碳源种类的培养基对纳豆激酶产量的影响；

图2显示了不同氮源浓度的培养基对纳豆激酶产量的影响。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。在优选实施例中，所述质量体积百分浓度的单位均为g/mL。

1、枯草芽孢杆菌纳豆亚种ODK-BN1菌株的获得

本发明从日本小杉食品株式会社生产的小粒有机纳豆食品中分离出纳豆芽孢杆菌，将所得菌株进行纯化、复壮、紫外光梯次照射诱变(紫外光波长范围为220～280nm，照射时间为6～9分钟)，再以液体发酵培养基(按质量体积百分浓度计由以下组分组成：2～8％的黄豆浆，1～3％的玉米糖浆，0.5～1％的猪肝浸液，余量为水)渐次驯化其存活适应性，当传代至第25代时，得到耐缺氧、耐高温并高产纳豆激酶的菌株，命名为ODK-BN1，深低温冷冻保存，于2007年4月24日送中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，简称CCTCC，地址为武汉市武昌珞珈山)鉴定并保藏，鉴定为枯草芽孢杆菌纳豆亚种(Bacillus subtilis var.natto)，保藏编号为CCTCC NO.M207055。

枯草芽孢杆菌纳豆亚种ODK-BN1菌株具有如下生物学特性：①一般特性：革兰氏阳性，染色均匀，芽孢椭圆形或柱状，中生或偏中生，有鞭毛，能运动，可耐受100℃、40分钟的杀菌条件；成熟菌体杆状，约0.7～0.8μm，能够分泌各种胞外酶，包括蛋白酶、淀粉酶、谷氨酸转肽酶(GTP)、脂肪酶、果聚糖蔗糖酶和植酸酶；在胃酸环境中稳定，在肠道中不增殖，迅速发育成具有新陈代谢作用的营养型细胞；②特殊性能：耐高温：菌体生长温度最高达80℃，最低为10℃；耐缺氧：平均氧溶解度(DO值)可低至0.76mmol/L；高产纳豆激酶：纳豆激酶产量最高可达8000IU/g。

2、液体深层发酵制备纳豆的培养基和发酵条件优化

目前用于固体发酵制备纳豆的基础培养基按质量体积百分浓度计由以下组分组成：50％的黄豆(氮源)，3％的果糖(碳源)，0.2％的磷酸二氢钾、0.4％的磷酸氢二钾、0.05％的硫酸镁和0.02％的氯化钙(无机盐)。本发明对此培养基进行了改良，以纳豆芽孢杆菌生物量和纳豆激酶产量为评判指标，优化了氮源浓度、碳源种类和浓度，并用猪肝浸粉取代无机盐作为促生长剂。同时，本发明对液体深层发酵条件如发酵温度、发酵pH、发酵时间、菌种种龄、菌种接种量和发酵罐装液量等进行了系统优化。

(1)液体发酵培养基碳源种类的优化

以质量体积百分浓度为2％的葡萄糖、果糖、可溶性淀粉、蔗糖或玉米糖浆为碳源，质量体积百分浓度为5％的黄豆浆(将黄豆用55℃的温水浸泡24小时后去皮，用匀浆机打成浆，即得)为氮源，质量体积百分浓度为1％的猪肝浸粉为促生长剂，制备液体发酵培养基；在发酵罐中加入液体发酵培养基，再按接种量「即菌液体积/(液体发酵培养基体积+菌液体积)×100％]为2％接入种龄为24小时的枯草芽孢杆菌纳豆亚种ODK-BN1菌株培养菌液，发酵罐装液量(即发酵罐装液总体积/发酵罐容积×100％)为40％，在温度为37℃、pH为7.5的条件下发酵4天；发酵终止后，用细菌活菌定量计数法计数不同碳源培养基发酵产物中的活菌数，即纳豆芽孢杆菌生物量；用纤维蛋白平板法测定不同碳源培养基发酵产物中的纳豆激酶产量(用溶解圈面积表示)。结果见表1和图1。

表1不同碳源种类对纳豆芽孢杆菌生物量和纳豆激酶产量的影响

由表可知，不同碳源种类中，纳豆芽孢杆菌生物量和纳豆激酶产量最高者为果糖，玉米糖浆次之，葡萄糖、蔗糖和淀粉较差；鉴于果糖价格昂贵，而玉米糖浆的价格仅为果糖的约1/80，从技术经济性考虑，本发明选择玉米糖浆为液体发酵培养基的最佳碳源。

2、液体发酵培养基氮源浓度的优化

豆类既是液体深层发酵制备纳豆的发酵对象，又是液体发酵培养基的唯一氮源。以质量体积百分浓度为2％、4％、6％或8％的黄豆浆为氮源，质量体积百分浓度为2％的玉米糖浆为碳源，质量体积百分浓度为1％的猪肝浸粉为促生长剂，制备液体发酵培养基；在发酵罐中加入液体发酵培养基，再按接种量为2％接入种龄为24小时的枯草芽孢杆菌纳豆亚种ODK-BN1菌株培养菌液，发酵罐装液量为40％，在温度为37℃、pH为7.5的条件下发酵4天；发酵终止后，用细菌活菌定量计数法计数不同碳源培养基发酵产物中的活菌数，即纳豆芽孢杆菌生物量；用纤维蛋白平板法测定不同碳源培养基发酵产物中的纳豆激酶产量(用溶解圈面积表示)。结果见表2和图2。

表2不同氮源浓度对纳豆芽孢杆菌生物量和纳豆激酶产量的影响

由表可知，不同氮源浓度中，纳豆芽孢杆菌生物量和纳豆激酶产量最高者为4％，6％次之，2％和8％较差，因此，本发明选择4％为液体发酵培养基的最佳氮源浓度。

3、液体发酵培养基的氮源浓度、碳源浓度以及发酵温度、发酵时间的优化

根据上述单因素实验结果，综合考虑液体发酵培养基的氮源浓度、碳源浓度以及发酵温度、发酵时间对纳豆芽孢杆菌生物量和纳豆激酶产量的影响，采用L9(34)正交表设计如下正交试验：以质量体积百分浓度为4％、5％或6％的黄豆浆为氮源，质量体积百分浓度为1％、2％或3％的玉米糖浆为碳源，质量体积百分浓度为1％的猪肝浸粉为促生长剂，制备液体发酵培养基；在发酵罐中加入液体发酵培养基，再按接种量为2％接入种龄为24小时的枯草芽孢杆菌纳豆亚种ODK-BN1菌株培养菌液，发酵罐装液量为40％，在温度为30℃、35℃或37℃，pH为7.5的条件下发酵2天、3天或4天；发酵终止后，用细菌活菌定量计数法计数不同碳源培养基发酵产物中的活菌数，即纳豆芽孢杆菌生物量；用纤维蛋白平板法测定不同碳源培养基发酵产物中的纳豆激酶产量(用溶解圈面积表示)。结果见表3。

表3氮源浓度、碳源浓度、发酵温度和发酵时间四因素正交试验结果

由表可知，各因素的影响权重顺序为B＞A＞D＞C，最佳组合为A₁B₃C₃D₃，即最佳氮源浓度为4％，最佳碳源浓度为3％，最佳发酵温度为37℃，最佳发酵时间为4天。

4、发酵酸碱度、菌种接种量、菌种种龄和发酵罐装液量的优化

根据上述单因素实验结果及正交试验结果，综合考虑发酵酸碱度、菌种接种量、菌种种龄和发酵罐装液量对纳豆芽孢杆菌生物量和纳豆激酶产量的影响，采用L⁹(3⁴)正交表设计如下正交试验：以质量体积百分浓度为4％的黄豆浆为氮源，质量体积百分浓度为3％的玉米糖浆为碳源，质量体积百分浓度为1％的猪肝浸粉为促生长剂，制备液体发酵培养基；在发酵罐中加入液体发酵培养基，再按接种量为1％、2％或3％接入种龄为18小时、24小时或30小时的枯草芽孢杆菌纳豆亚种ODK-BN1菌株培养菌液，发酵罐装液量为30％、40％或50％，在温度为37℃，pH为6.5、7.0或7.5的条件下发酵4天；发酵终止后，用细菌活菌定量计数法计数不同碳源培养基发酵产物中的活菌数，即纳豆芽孢杆菌生物量；用纤维蛋白平板法测定不同碳源培养基发酵产物中的纳豆激酶产量(用溶解圈面积表示)。结果见表4。

表4发酵酸碱度、菌种接种量、菌种种龄、发酵罐装液量四因素正交试验结果

由表可知，各因素的影响权重顺序为A＞C＞B＞D，最佳组合为A₃B₂C₁D₃，即最佳发酵pH为7.5，最佳菌种接种量为2％，最佳菌种种龄为18小时，最佳发酵罐装液量为50％。

实施例1女性保健用纳豆液体饮料的制备

a、枯草芽孢杆菌纳豆亚种ODK-BN1菌株的复壮和增菌培养：取深低温冷冻保存的枯草芽孢杆菌纳豆亚种ODK-BN1菌株菌种管1支，加入菌粉干重2倍量(w/v，g/mL)的生理盐水溶解菌粉，再涂布于营养琼脂平板(按质量体积百分浓度计由下述组分组成：2％的葡萄糖、0.5％的牛肉膏、1％的蛋白胨、0.5％的NaCl、2％的琼脂糖、余量为水)，在温度36℃条件下培养24小时进行复壮；挑取营养琼脂平板上的单一菌落，接种于种子培养基(按质量体积百分浓度计由下述组分组成：2％的葡萄糖、1％的酵母膏、1％的蛋白胨、0.5％的氯化钠、0.2％的磷酸二氢钾、0.4％的磷酸氢二钾、0.05％的硫酸镁和0.02％的氯化钙、余量为水，pH为7.0～7.2)，在温度为37℃、振摇速度为150r/min的条件下增菌培养18小时，收集培养菌液，备用；

b、液体发酵培养基的制备：按质量体积百分浓度计由以下组分组成：4％的黄豆浆，3％的玉米糖浆，1％的猪肝浸粉，余量为水；

c、液体深层发酵：在容积为100L的发酵罐中，加入步骤b所得液体发酵培养基49L，高温消毒，降温至37℃，再加入步骤a所得培养菌液1L，在温度为37℃，pH为7.5，搅拌速度为30r/min的条件下发酵4天，测得纳豆芽孢杆菌生物量大于1.0×10⁹cfu/mL，纳豆激酶产量大于900IU/mL，终止发酵，得液态发酵产物；

d、纳豆饮料的制备：将步骤c所得液态发酵产物离心去除纳豆芽孢杆菌菌体，收集离心上清液，加入质量体积百分浓度为0.5％的单宁沉淀不溶性成分，分级过滤除渣，将滤液在温度为40℃条件下减压浓缩至原体积的1/2，再加入质量体积百分浓度为1％的可溶性壳聚糖、质量体积百分浓度为0.5％的蛋白糖和质量体积百分浓度为1％的柠檬酸，混合均匀，灌装，辐照消毒，包装，即得纳豆饮料。

本实施例的纳豆饮料主要定位于女性保健食用，根据产品定位，饮料中主要保留了可溶性的抗氧化、抗衰老等活性成分包括异黄酮、总皂甙、谷胱甘肽、小分子活性肽等，去除了发酵产物中的纳豆芽孢杆菌菌体以及与产品功能无关的不溶性成分，从而大大提高了产品的稳定性，延长了产品保质期。

实施例2溶栓降脂纳豆固体饮料的制备

a、枯草芽孢杆菌纳豆亚种ODK-BN1菌株的复壮和增菌培养：与实施例1所述方法相同；

b、液体发酵培养基的制备：与实施例1所述方法相同；

c、液体深层发酵：与实施例1所述方法相同；

d、纳豆饮料的制备：将步骤c所得液态发酵产物进行冷冻干燥，得冻干粉，冷冻干燥条件为：冷冻温度-50℃～-70℃、升华温度30℃、干燥时间72小时；取该冻干粉5000g，与等量环糊精混匀后作为芯材，混悬于熔点为40～60℃的大豆硬化油中制得芯材溶液；同时，配制由质量体积百分浓度为2％的海藻酸钠和质量体积百分浓度为1％的低甲基果胶组成的壁材溶液；采用挤压法将芯材包被到壁材中，再通过凝固浴固化制得微胶囊，包装，即得纳豆固体饮料。

本实施例的纳豆饮料主要定位于具有溶栓和降脂功能，根据产品定位，饮料中保留了纳豆芽孢杆菌、纳豆激酶、SOD、大豆纤维素等具有明显溶栓和降脂功能的活性物质；此外，本实施例将液态发酵产物和食用辅料制成微胶囊形式的固体饮料，携带和运输方便。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

Claims (10)

1.纳豆饮料，其特征在于：含有豆类经纳豆芽孢杆菌液体深层发酵获得的发酵产物；所述纳豆芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌纳豆亚种(Bacillus subtilis var.natto)ODK-BN1菌株，保藏编号为CCTCC No.M207055。

2.权利要求1所述纳豆饮料的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

a、以豆类为氮源制备液体发酵培养基；

b、在发酵罐中加入步骤a所得液体发酵培养基，再接入纳豆芽孢杆菌培养菌液，进行液体深层发酵，得液态发酵产物；

c、将步骤b所得液态发酵产物与食用辅料按常规方法制成饮料。

3.根据权利要求2所述纳豆饮料的制备方法，其特征在于：步骤c是将液态发酵产物离心去除菌体，用絮凝剂沉淀不溶性成分，分级过滤除渣，滤液减压浓缩，再加入稳定剂和调味剂，灌装，消毒，包装，即得纳豆液体饮料。

4.根据权利要求2所述纳豆饮料的制备方法，其特征在于：步骤c是将液态发酵产物冷冻干燥制成冻干粉，再以该冻干粉为芯材，将其包埋在壁材中制成微胶囊，包装，即得纳豆固体饮料。

5.根据权利要求2至4任一项所述纳豆饮料的制备方法，其特征在于：步骤a所述液体发酵培养基按质量体积百分浓度即g/mL计由以下组分组成：4％的黄豆浆，3％的玉米糖浆，1％的猪肝浸粉，余量为水。

6.根据权利要求2至4任一项所述纳豆饮料的制备方法，其特征在于：步骤b所述液体深层发酵温度为37℃，发酵pH为7.5，发酵时间为4天。

7.根据权利要求2至4任一项所述纳豆饮料的制备方法，其特征在于：步骤b所述纳豆芽孢杆菌的种龄为18小时，接入菌液的体积为液体发酵培养基与菌液体积之和的2％。

8.根据权利要求2至4任一项所述纳豆饮料的制备方法，其特征在于：步骤b所述发酵罐装液总体积为发酵罐容积的50％。

9.根据权利要求3所述纳豆饮料的制备方法，其特征在于：步骤c所述絮凝剂为单宁，稳定剂为可溶性壳聚糖，调味剂为蛋白糖和柠檬酸。

10.根据权利要求4所述纳豆饮料的制备方法，其特征在于：步骤c所述芯材为冻干粉和环糊精，所述壁材为海藻酸钠和低甲基果胶。