CN113403214B - 一种枯草芽孢杆菌纳豆菌亚种菌株、纳豆发酵饮品及其制备方法 - Google Patents

一种枯草芽孢杆菌纳豆菌亚种菌株、纳豆发酵饮品及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种纳豆杆菌BNA‑128/001/B128为具有较高的纳豆激酶产率，且气味低，可以用于纳豆发酵饮品的制备。而本发明还提供了纳豆发酵饮品及其制备方法，包括以下步骤：黄豆泥制备、酶解、单细胞溶液制备；首次发酵、调味、二次发酵。本发明采用黄豆单细胞与纳豆杆菌的种子液进行发酵，增大了纳豆菌与黄豆细胞的接触面积，提高了发酵利用率。发酵产生了高浓度纳豆激酶以及其他的营养物质(维生素K、异黄酮以及氨基酸)，同时也保留了纳豆的风味。

Description

一种枯草芽孢杆菌纳豆菌亚种菌株、纳豆发酵饮品及其制备 方法
技术领域
本发明涉及生物食品领域，特别涉及一种枯草芽孢杆菌纳豆菌亚种菌株、纳豆发酵饮品及其制备方法。
背景技术
纳豆以其独特的味道和众多的保健功能(溶血栓、降血脂、清除体内致癌物质、调节肠道菌群润肠通便等)被大众所熟知。例如中国专利申请200810228955.7公开了一种产生纳豆激酶的枯草芽孢杆菌纳豆亚种及其应用；中国专利申请201510588951.X公开了一株耐微波枯草芽孢杆菌及其在纳豆激酶制备中的应用。但传统纳豆是气味浓郁的固体食品。现有的纳豆产品有三种：传统纳豆、纳豆复合饮料和纳豆激酶保健品。传统纳豆在日本较为受欢迎，但因气味过大所以餐饮店很少提供；现有三种纳豆产品分别具有以下缺点：
传统的纳豆气味过大，在公共场合食用会影响他人，所以在餐饮店里基本不会出售纳豆，想要食用只能在家中。纳豆激酶保健品在市场上主打的产品是纳豆胶囊，是将纳豆菌进行发酵浓缩干燥后制成胶囊，售价昂贵，味道不佳。而纳豆复合饮料是将冻干纳豆磨浆进行复配调味，这种方式会造成纳豆的营养大幅度流失，失去纳豆风味；同时，机械磨浆方式使纳豆枯草芽孢杆菌的活菌流失大半，纳豆激酶含量相对减少。例如中国专利申请201510452976.7公开了一种含纳豆激酶的保健调和奶饮品，所述保健调和奶饮品由豆浆、牛奶和纳豆枯草芽孢杆菌种子液制备而成，纳豆激酶含量较低。
发明内容
为此，需要提供一种可以让气味温和、口感柔和，含高纳豆激酶的饮品，可供大众日常饮用。
为了实现本发明的目的，本发明第一方面提供了一株纳豆杆菌,为枯草芽孢杆菌纳豆菌亚种BNA-128/001/B128(菌株名称/株号/符号)菌株，拉丁分类名为：Bacillussubtilis natto，所述菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学；保藏编号为CCTCC NO.M 2020479；保藏日期为2020年9月9日。
所述枯草芽孢杆菌纳豆菌亚种BNA-128/001/B128菌株，其分泌的纳豆激酶酶活达到1500U/ml，具有高活性、低气味的特点。
本发明第二方面提供了一种纳豆发酵饮品的制备方法，包括以下步骤：黄豆泥制备：将泡发后的黄豆进行熟制、粉碎，加水搅拌均匀，得到黄豆泥；所述黄豆与水的质量比为1:1-1:20；
酶解：在黄豆泥中加入复合酶，20-50℃酶解，得到酶解复合物；所述复合酶为黄豆泥质量的0.1-5wt％；所述复合酶包括果胶酶、中性蛋白酶和纤维素酶；单细胞溶液制备：将所述酶解复合物加水稀释后，得到黄豆单细胞溶液；首次发酵：将枯草芽孢杆菌纳豆菌亚种菌株种子液接种入黄豆单细胞溶液，在有氧环境中进行首次发酵，得到首次发酵混合物；发酵温度为20-45℃，发酵时间2-8天，控制发酵过程pH 5.5-8.5；
调味：将首次发酵混合物加入调味剂进行调味，得到调味混合物；
二次发酵：将调味混合物在无氧环境中进行二次发酵得到纳豆发酵饮品，发酵温度为4-20℃，发酵时间为2-8天，控制发酵过程pH 5.5-8.5。
发明人在研究中发现，黄豆细胞间隙之间富含果胶，其是一种广泛存在于高等植物中的复杂多糖，在植物组织中通常与木质素、纤维素、半纤维素等结合，形成植物组织不同的质构和形态。而酶解步骤，就是采用复合酶来酶解果胶，可以打破黄豆细胞间的连接，得到不相互粘结的黄豆单细胞。同时，多糖的分解，也有利于在首次发酵步骤中，纳豆杆菌自身的大量利用，快速繁殖。
首次发酵步骤中，在20-45℃、有氧的发酵环境中，纳豆杆菌自身大量繁殖。而二次发酵步骤中，无氧环境中，纳豆杆菌进入菌种稳定期，低温无氧下菌株生长减缓，菌株更偏向于产生发酵产物，包括纳豆激酶、维生素K、异黄酮以及氨基酸等，使口感更加醇厚；同时，低温抑制菌种进一步繁殖，纳豆发酵气味掩盖良好，适宜日常饮用。
本发明采用黄豆单细胞，纳豆杆菌(枯草芽孢杆菌纳豆菌亚种菌株)的种子液进行发酵，增大了纳豆杆菌与黄豆细胞的接触面积，提高了发酵利用率。发酵产生了纳豆激酶以及其他的营养物质(维生素K、异黄酮以及氨基酸)，同时也保留了纳豆的风味。
进一步地，纳豆杆菌的种子液，采用摇菌培养纳豆杆菌菌株至对数生长期；提高首次发酵的效率。
进一步地，所述黄豆泥的制备步骤中，黄豆泡发时间为1-4天，采用高压蒸煮的方式进行熟制。
进一步地，所述酶解步骤中，酶解过程进行搅拌，搅拌速度100-150r/min；所述复合酶中果胶酶的含量为1-10wt％、中性蛋白酶的含量为1-5wt％、纤维素酶的含量为1-5wt％。
进一步地，所述酶解步骤中，果胶酶的酶活5×105u/g、中性蛋白酶的酶活为10×105u/g而纤维素酶的酶活为10×105u/g。
进一步地，所述单细胞溶液制备步骤中，将所述酶解液加水稀释至黄豆泥质量后，100-130℃灭菌，得到黄豆单细胞溶液。
进一步地，所述首次发酵步骤中，所述枯草芽孢杆菌纳豆菌亚种菌株为枯草芽孢杆菌纳豆菌亚种BNA-128/001/B128菌株，所述菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.M 2020479。
进一步地，所述首次发酵步骤中，种子液中含菌量为5×108cfu/ml，而种子液的接种量为2-7wt％黄豆单细胞溶液。
进一步地，所述首次发酵步骤中，发酵过程中进行搅拌，搅拌转数为 100-800rpm,发酵中通气量1-4L/min。
进一步地，所述调味剂包括糖。糖的加入，除了调节口感，也可提供C 源，抑制纳豆杆菌的繁殖，使其转向分泌发酵产物。
进一步地，调味剂包括白砂糖、甜蜜素、香精和苯甲酸钠。
本发明第三方面提供了一种纳豆发酵饮品，所述纳豆发酵饮品采用本发明第二方面所述的制备方法进行制备。
区别于现有技术，上述技术方案至少包括以下有益效果：纳豆杆菌BNA-128/001/B128具有较高的纳豆激酶产率，且气味低，可以用于纳豆发酵饮品的制备。而本发明采用黄豆单细胞与纳豆杆菌的种子液进行发酵，增大了纳豆菌与黄豆细胞的接触面积，采用液态发酵过程，提高了发酵利用率。发酵产生了纳豆激酶以及其他的营养物质(维生素K、异黄酮以及氨基酸)，同时也保留了纳豆的风味。
附图说明
图1为酶解复合物上清液中黄豆细胞的显微图片a；
图2为酶解复合物上清液中黄豆细胞的显微图片b。
具体实施方式
为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。
实施例1纳豆杆菌(枯草芽孢杆菌纳豆菌亚种BNA-128菌株)的筛选 1、培养基配制
(1)初筛培养基：蛋白胨1-5％、氯化钠0.1-1％、牛肉膏0.3-1％、干酪素1-5％、固态加入琼脂1-4％。
(2)复筛培养基：白糖0.1-0.5％，细菌学蛋白胨0.1-0.5％，pH7.2
(3)纤维蛋白平板
(4)斜面培养基：蛋白胨0.5-2.5％、牛肉膏粉0.2-2％、氯化钠0.5-2.5％、琼脂1-5％、pH7.3
2.操作
(1)初筛：采用农家发酵的1-2g黄豆豆豉，用少量无菌生理盐水浸泡并震荡30-60min，按10倍梯度法对浸泡液进行稀释，将上述稀释液分别取 0.1-1ml涂布于初筛培养基中，30-37℃培养24-48h后观察结果。挑取5个圆形、边缘叶状、表面皱褶并且具有较大水解圈的单菌落，划线培养直至纯种。
(2)复筛：得到的初筛固态培养的菌按1-5％接种率接到复筛培养基， 30-37℃、100-200r/min摇瓶发酵培养24-48h，离心取上清液为粗酶液，采用纤维蛋白平板法比较其酶活大小，五株菌酶活大小在100-1500U/ml之间, 选取酶活最高的1500U/ml为纳豆激酶高产菌株，命名为BNA-128。
(3)斜面培养保藏：将选取的纳豆激酶高产菌株对应的初筛固态培养基中挑取一环接种至固态斜面培养基，30-37℃，培养24-48h即得到高产菌株，枯草芽孢杆菌纳豆菌亚种BNA-128菌株。
实施例2纳豆发酵饮品的制备
包括以下步骤：
黄豆泥制备：黄豆泡发时间为1-4天，采用高压蒸煮的方式进行熟制、粉碎，加水搅拌均匀，得到黄豆泥；所述黄豆与水的质量比为1:1-1:20；
酶解：在黄豆泥中加入复合酶，20-50℃、100-150r/min搅拌2-8h后，得到酶解复合物；所述复合酶为黄豆泥质量的0.1-5wt％；所述复合酶中果胶酶的含量为1-10wt％、酶活5×105u/g，中性蛋白酶的含量为1-5wt％，酶活为10 ×105u/g、纤维素酶的含量为1-5wt％，酶活为10×105u/g。
单细胞溶液制备：将所述酶解复合物加水稀释至黄豆泥质量后，100-130℃灭菌10-60min，得到黄豆单细胞溶液；
其中，酶解复合物上清液中黄豆细胞的显微图片a、b如图1、2所示，由图中可以看出，细胞间的果胶酶被酶解，黄豆细胞基本分离，没有彼此粘结。首次发酵：将枯草芽孢杆菌纳豆菌亚种菌株(BNA-128/001/B128，保藏编号为CCTCC NO.M 2020479)培养至对数生长期的种子液接种入黄豆单细胞溶液，种子液中含菌量为5×108cfu/ml；在有氧环境中进行首次发酵，得到首次发酵混合物；发酵温度为20-45℃，发酵时间2-8天，控制发酵过程pH 5.5-8.5；发酵过程中进行搅拌，搅拌转数为100-800rpm,发酵中通气量1-4L/min。调味：将首次发酵混合物加入调味剂进行调味，得到调味混合物；调味剂中，白砂糖含量为1-4wt％，甜蜜素为0.01-0.07wt％，香精(奶味、玫瑰味、葡萄味等)为0.01-0.1wt％，苯甲酸钠为0.01-0.05wt％。
二次发酵：将调味混合物在无氧环境中进行二次发酵得到纳豆发酵饮品，发酵温度为4-20℃，发酵时间为2-8天，控制发酵过程pH 5.5-8.5。
将实施例2中所制备的纳豆发酵饮品进行营养物质检测。经过测试可知，实施例2制备的发酵饮品中，纳豆激酶的酶活均值为1500U/ml，含菌量为 1.5x109cfu/ml；异黄酮含量为0.2％-0.8％，维生素K的含量为2.1×103g/ml.
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者终端设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者终端设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”或“包含……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者终端设备中还存在另外的要素。此外，在本文中，“大于”、“小于”、“超过”等理解为不包括本数；“以上”、“以下”、“以内”等理解为包括本数。
需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。

Claims (9)

1.一株枯草芽孢杆菌纳豆菌亚种BNA-128/001/B128菌株，所述菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.M 2020479；其分泌的纳豆激酶酶活达到1500U/ml。
2.一种纳豆发酵饮品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
黄豆泥制备：将泡发后的黄豆进行熟制、粉碎，加水搅拌均匀，得到黄豆泥；所述黄豆与水的质量比为1:1-1:20；
酶解：在黄豆泥中加入复合酶，20-50℃酶解，得到酶解复合物；所述复合酶为黄豆泥质量的0.1-5wt%；所述复合酶包括果胶酶、中性蛋白酶和纤维素酶；
单细胞溶液制备：将所述酶解复合物加水稀释后，得到黄豆单细胞溶液；
首次发酵：将权利要求1所述枯草芽孢杆菌纳豆菌亚种BNA-128/001/B128菌株的种子液接种入黄豆单细胞溶液，在有氧环境中进行首次发酵，得到首次发酵混合物；发酵温度为20-45℃，发酵时间2-8天，控制发酵过程pH 5.5-8.5；
调味：将首次发酵混合物加入调味剂进行调味，得到调味混合物；
二次发酵：将调味混合物在无氧环境中进行二次发酵得到纳豆发酵饮品，发酵温度为4-20℃，发酵时间为2-8 天，控制发酵过程pH 5.5-8.5。
3.根据权利要求2所述的纳豆发酵饮品的制备方法，其特征在于，所述黄豆泥的制备步骤中，黄豆泡发时间为1-4天，采用高压蒸煮的方式进行熟制。
4.根据权利要求2所述的纳豆发酵饮品的制备方法，其特征在于，所述酶解步骤中，酶解过程进行搅拌，搅拌速度为100-150r/min；所述复合酶中果胶酶的含量为1-10wt%、中性蛋白酶的含量为1-5wt%、纤维素酶的含量为1-5wt%。
5.根据权利要求4所述的纳豆发酵饮品的制备方法，其特征在于，所述酶解步骤中，果胶酶的酶活5×105u/g、中性蛋白酶的酶活为10×105u/g而纤维素酶的酶活为10×105u/g。
6.根据权利要求2所述的纳豆发酵饮品的制备方法，其特征在于，所述首次发酵步骤中，所述枯草芽孢杆菌纳豆菌亚种菌株为分泌纳豆激酶的枯草芽孢杆菌纳豆菌亚种BNA-128/001/B128菌株，所述菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.M2020479。
7.根据权利要求2所述的纳豆发酵饮品的制备方法，其特征在于，所述首次发酵步骤中，种子液中含菌量为5×108cfu/ml，而种子液的接种量为2-7wt%黄豆单细胞溶液。
8.根据权利要求2所述的纳豆发酵饮品的制备方法，其特征在于，所述首次发酵步骤中，发酵过程中进行搅拌，搅拌转数为100-800 rpm,发酵中通气量1-4 L/min。
9.根据权利要求2所述的纳豆发酵饮品的制备方法，其特征在于，所述调味剂包括糖。
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