CN103695359A - 一种产纳豆激酶枯草芽孢杆菌菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种产纳豆激酶枯草芽孢杆菌菌株及其应用，通过从汉江流域的豆酱中分离、纯化，采用脱脂牛奶初筛、黄豆固体发酵复筛、整合纳豆激酶基因PCR筛选法同纤维活性相结合的方法高效快速筛选到一株纳豆激酶生产菌株，最后通过16SrRNA分子鉴定为枯草芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌BN-05 CCTCC NO：M 2013530，该菌株在35℃固体黄豆发酵培养24h，纳豆拉丝较长，口感较好，产纳豆激酶的含量高，可作为食品发酵研究的基础。这将有利于人们通过饮食提高体内纳豆激酶含量，预防和缓解血栓疾病的发病率。

Description

一种产纳豆激酶枯草芽孢杆菌菌株及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种纳豆激酶生产菌株，还涉及一种纳豆激酶生产菌株菌株在制备纳豆中的应用，本发明所述的枯草芽孢杆菌具备高产纳豆的激酶酶的能力，可用于纳豆的生产。

背景技术

血栓性疾病可导致心肌梗塞、脑血栓中风、急性肺原性心脏病等相关性疾病，因其发病率高，复病率高，而且难以根治，已成为威胁人类健康的主要疾病。因此，近几年来就如何有效的治愈血栓性疾病，引起了医学界、科技界高度重视。纳豆激酶（nattokinase，NK）已被证明具有高效的溶栓作用，它不仅可以直接降低纤维蛋白原，而且可以促进催化血纤维蛋白溶酶原转化为血纤维蛋白溶酶，增加体内血栓溶解因子的合成。相比临床上的溶栓药物（尿激酶(UK)、链激酶（SK）和组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)），纳豆激酶具有高效的溶纤活性、安全性好、生产成本低、无毒副作用、半衰期长、在胃肠的稳定性好等优点。然而目前国内的纳豆激酶产品活性普遍比较低，筛选具有高活力纳豆激酶生产能力的菌株，具有重要意义。

纳豆食品虽具有很好的营养和保健功能，但纳豆特有的风味并不易被我国人民所接受，这不利于人们通过饮食提高体内纳豆激酶含量，不利于降低血栓疾病发病率。传统发酵食品中微生物种类丰富，具有良好的食品安全性，并已形成了人们适应的感官风味，是纳豆激酶生产菌株的重要来源，中国豆酱富含芽胞杆菌，如B.subtilis、B.amyloliquefaciens和Bacillus licheniformis，然而还未见从中国豆酱中分离纳豆激酶产生菌的报道。因此从中国的豆酱中筛选出一株高活力的纳豆激酶生产菌株，来提高纳豆食品中纳豆激酶的含量，这将会更好的预防和缓解心脑血栓疾病。

发明内容

本发明的目的是提供了一种枯草芽孢杆菌BN-05，该菌株具备高产纳豆激酶的特点，可用于纳豆激酶保健品的生产，该菌株已于2013年11月3日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BN-05，保藏编号：CCTCC NO：M2013530，地址：中国武汉武汉大学。

本发明还有一个目的在于提供了一种枯草芽孢杆菌BN-05在制备纳豆中的应用，利用该菌株发酵黄豆，提高了纳豆产品中纳豆激酶的含量，并改善了纳豆的口感。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种枯草芽孢杆菌BN-05，其筛选过程如下：

1）利用初筛培养基分离豆酱和豆豉里面的枯草芽孢杆菌，经形态学鉴定，初步确定为

枯草芽孢杆菌。

初筛培养基：5g.L^-1脱脂奶粉，1g.L^-1葡糖糖，1g.L^-1酵母膏，1g.L^-1K₂HPO₄，0.5g.L^-1KH₂PO₄，0.1g.L^-1MgSO₄，20g.L^-1琼脂，pH7.0～7.2。

2）再次利用固体发酵复筛，进行感官鉴评和测定纤溶活力，选择感官鉴评优和纤溶活力高的菌株。

复筛培养基：固体培养基为黄豆洗净，与水以m：v=1:5常温下浸泡6-8h，沥干于115℃灭菌15min。

3）最后应用纳豆激酶的PCR扩增，高效快速筛选到一株纳豆激酶生产菌株BN-05，并对该菌株进行了生理生化鉴定和16S rRNA的分子鉴定。该菌株已于2013年11月3日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：枯草芽孢杆菌B.subtilis BN-05，保藏编号：CCTCC NO：M2013530。

枯草芽孢杆菌BN-05的形态特征：BN-05在LB平板培养基上的菌落特征与模式菌株G1M1.286菌株相比较，结果如表1所示。从表1可以看出BN-05在菌落形态上和纳豆枯草芽孢杆菌G1M1.286相似。挑取单菌落革兰氏染色后镜检，镜下细胞形态为杆状，革兰氏染色呈阳性，产芽孢，芽孢椭圆形，中生或近中生。

表1 BN-05的菌落特征

BN-05的生理生化特征：见表2

表2 BN-05的生理生化试验

注：“+”表示生化反应（或革兰氏染色）为阳性；“-”表示生化反应（革兰氏染色）阴性。

一种枯草芽孢杆菌菌株在制备纳豆中的应用，其应用步骤为

将筛选得到的枯草芽孢菌菌株转接到LB斜面培养基上35℃活化24h，用接种环挑选2-3环的菌苔接种到液体种子培养基中（装液量50mL/250mL），于35℃，180r/min的条件下培养12h处于对数生长期，然后以4%的接种量接种到灭菌的黄豆培养基上，在35℃培养36h，后熟24h，测得纳豆激酶的活力达到7980IU/g（湿黄豆）。

所述的液体种子培养基：10g.L^-1葡糖糖，5g.L^-1酵母提取物，10g.L^-1牛肉膏，5g.L^-1NaCl，pH7.4～7.6。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1)本发的枯草芽孢杆菌BN-05来源于豆酱，菌株的安全性高；

2）本发明的枯草芽孢杆菌BN-05，获得的纳豆产品口感优良；

3）本发明枯草芽孢杆菌BN-05产纳豆激酶的活力较高，是研究和开发纳豆激酶产品的首要条件。因此该枯草芽孢杆菌在改善食品口感，提高发酵活性，并丰富纳豆保健品的功效上有很好的应用前景。

附图说明

图1为一种枯草芽孢杆菌BN-05在初筛培养基上的菌落形态示意图。

图2为一种枯草芽孢杆菌BN-05在LB培养基上的形态示意图。

图3为一种枯草芽孢杆菌BN-05在琼脂糖-纤维蛋白原上的活力示意图。

图4为一种枯草芽孢杆菌BN-05菌体电子扫描电镜照片（×10.0k）示意图。

图5为MEGA5.05用邻近法基于16S rRNA基因序列构建的系统进化树。

显示分离株属于Bacillus subtilis属。Bootstrap为1000，表示经过1000次数值分析；

图下标尺表示每100个碱基序列中有一个碱基替换。

图6为尿激酶活力的对数值与溶解圈面积呈线性关系示意图。

具体实施方式

实施例1：

一种枯草芽孢杆菌BN-05，其筛选过程如下：

1）初筛

从湖北省的黄陂腐乳、荆州豆瓣酱、应城的黄豆酱、宜昌腊八豆、山乡的豆瓣酱、公关热酱、武汉市市售的黄豆酱、蚕豆酱和豆豉中等地的11种样品各取2g置于100mL的已灭菌的具塞三角瓶中，加无菌生理盐水稀释10倍，振荡30s后，于37℃，180r/min的条件下培养24h。将菌悬液置于80～85℃的水浴锅中加热10min，冷却后的菌悬液分别做梯度稀释，各取0.1mL涂布于脱脂牛奶平板上，37℃倒置培养24h，挑取水解圈与菌落直径比值（C/H的值）较大的菌落进行革兰氏染色及镜检，参照常见细菌系统手册中关于芽孢杆菌属的形态描述进行镜检初筛，并接种到LB平板上进行划线分离纯化，将获得的单一菌株接种到LB斜面培养上，37℃培养24h，于4℃冰箱保存备用。经初筛培养基初筛，筛选出16株疑是产纳豆激酶高活性的菌株。

初筛培养基为5g.L^-1脱脂奶粉，1g.L^-1葡糖糖，1g.L^-1酵母膏，1g.L^-1K₂HPO₄，0.5g.L^-1KH₂PO₄，0.1g.L^-1MgSO₄，20g.L^-1琼脂，pH7.0～7.2。

2）复筛

通过黄豆固体发酵复筛和纤溶活性的分析，筛选出5株活性较高的菌株。

复筛培养基：固体培养基为黄豆洗净，与水以m：v=1:5常温下浸泡6-8h，沥干于115℃灭菌15min。

3）纳豆激酶的PCR扩增法

将菌株BN-05活化，转接于LB液体培养基中，200r/min、37℃震荡培养8h后，用细菌DNA试剂盒（中国北京天恩泽基因科技有限公司）提取菌株的基因组。aprN基因扩增引物为aprNF(CCGTGAGAAGCAAAAAATTGTGGATCA)和aprNR(ATTTATTGTGCAGCTGCTTGTACGTTG)，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，扩增产物为SEQ ID NO.1所示。

PCR反应程序

94℃预变性5min；

94℃变性1min，52℃退火45s，72℃延伸1.5min，30个循环；

72℃延伸10min。

克隆测序及序列分析

扩增所得的基因片段经过分离纯化后，连接pUC19载体，转化Escherichia coli DH5α进行克隆测序，测序引物为通用测序引物M13F和M13R。对测序结果进行Blast相似性分析（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）并提交至Genebank数据库。通过Bioedit软件进行基因序列的翻译，并进行氨基酸序列同源性比对。

整合纳豆激酶基因扩增筛选法，筛选出一株产纳豆激酶的高活性菌株BN-05，见图5。4）16S rRNA分子鉴定

16S rRNA序列为SEQ ID NO.2所示。通过MEGA5.05软件进行系统进化树的构建，结果得到了如图5所示的系统发育树状图。系统发育学分析结果表明，该系统树以Paenibacillus borealis(AJ011322)作为一个单独的外群种，其中BN-05菌株与Bacillus subtillis属菌株在同一分支，结合前面的形态学和生理生化鉴定结果，初步鉴定BN-05为枯草芽孢杆菌属。该菌株已于2013年11月3日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:M2013530，地址：中国武汉武汉大学。

实施例2：

纤溶活力（纳豆激酶活力）的测定：采用琼脂糖—纤维蛋白原平板法，琼脂糖平板的制作步骤如下：

首先将1%的琼脂糖溶于0.05mol/L的Tris-HCl（pH7.8）缓冲溶液中，加热至完全溶解后，取出10mL置于大试管中，待其冷却至50℃左右，迅速倒入10mL1.5mg/L牛血纤维蛋白原溶液，不断震荡，使其完全混合均匀，注入直径9cm的培养皿中，再迅速加入300μL20IU/mL的凝血酶溶液，不断晃动平皿使三者混合均匀，防止气泡的产生，静置1h后，用直径为2mm的无菌胶头吸管在平板上打孔。

尿激酶标准曲线的制作:配制不同的尿激酶标准品（200、400、800、1000、1200、1400、1600、1800、2000和2400IU/ml），各10μL点样于新配制的纤维蛋白原平板上，放置10min，37℃培养16h后取出，测定溶解圈的直径，计算各溶解圈面积，得出尿激酶活力的对数值与溶解圈面积呈线性关系，y=0.0051x，R²=0.9984。

样品的测定:

粗酶液的制备：称取2g纳豆溶于4mL无菌的生理盐水中，4℃下浸提24h后过滤，取滤液12000r/min，离心10min，取上清液10μL分别点样在纤维蛋白原平板上，培养16h，测定溶圈的直径，计算出溶圈的面积，通过尿激酶标准曲线，计算出酶活。通过此方法测定纳豆激酶的简便易行，可行度高，可同时测定多个样品，节约实验成本。

实施例3：

一种枯草芽孢杆菌BN-05在制备纳豆的中的应用，其步骤如下：

将枯草芽孢杆菌BN-05菌株转接到LB斜面培养基上37℃活化24h，用接种环挑选2-3环的菌苔接种到液体种子培养基中（装液量50mL/250mL），于35℃，180r/min的条件下培养12h至对数生长期，然后按4%（v/w）的接种量接种到灭菌的黄豆培养上，在37℃培养36h，每12h搅拌一次。发酵的纳豆颜色为土黄色，豆粒酥软，拨动黄豆有长长拉丝的现象，带有淡淡的香味物质，纳豆激酶激酶的活力为7980IU/g（湿黄豆）。

所述的液体种子培养基：10g.L-1葡糖糖，5g.L-1酵母提取物，10g.L-1牛肉膏，5g.L-1NaCl，pH7.4～7.6。

实施例4：

一种枯草芽孢杆菌BN-05在制备纳豆的中的应用，其步骤如下：

1）选取优质的小黄豆，去除无胚粒、未成熟颗粒及杂质。将精选后的小黄豆放入加工装置的容器内并用水清洗三遍，用1:5（w/w）的水浸泡小黄豆，室温浸泡6h。浸泡完成后，排出浸泡水，保持通风的条件，23℃发芽，每隔2h喷洒适量的水以保持大豆的湿度，每隔8h用纯净水冲洗大豆以免被霉菌污染，整个发芽过程，湿度控制在80-95%，发芽时间为28h，芽长为1-2mm，得到发芽小黄豆固体培养基，沥水，称重。

2）将含水量为45-50%的发芽小黄豆于115℃下，灭菌20min，待其冷却后，将实施例3中制备的生长处于对数生长期的BN-05的种子液按6%（v/w）的接种量接种到已灭菌的发芽小黄豆中，35℃发酵36h，每隔12h，搅拌一次，发酵结束后，于4℃的冰箱里后熟24h。发酵的产品颜色为黄色，豆粒酥软，拨动豆子有长长拉丝的现象，带有淡淡的香味物质，无氨臭味。取样检测分析，纳豆激酶的活力为9263IU/g(湿黄豆)，γ-氨基丁酸的含量为23.87mg/100g。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  湖北工业大学

 

<120>  一种产纳豆激酶枯草芽孢杆菌菌株及其应用

 

<130>  一种产纳豆激酶枯草芽孢杆菌菌株及其应用

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.1

 

<210>  1

<211>  1146

<212>  DNA

<213>  枯草芽孢杆菌

 

<400>  1

gtgagaagca aaaaattgtg gatcagcttg ttgtttgcgt taacgttaat ctttacgatg     60

 

gcgttcagca acatgtctgc gcaggctgcc ggaaaaagca gtacagaaaa gaaatacatt    120

 

gtcggattta agcagacaat gagtgccatg agttccgcca agaaaaagga tgttatttct    180

 

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ctttctaagc acccgacttg gacaaacgcg caagtccgtg atcgtttaga aagcactgca   1080

 

acatatcttg gaaactcttt ctactatgga aaagggttaa tcaacgtaca agcagctgca   1140

 

caataa                                                              1146

 

 

<210>  2

<211>  1211

<212>  DNA

<213>  枯草芽孢杆菌

 

<400>  2

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taagtggtag ccgaagccac cttttatgtt tgaaccatgc ggttcaaaca accatccggt   1200

 

attagccccg g                                                        1211

 

 

Claims (3)

1.一种产纳豆激酶的枯草芽孢杆菌菌株， 其特征在于：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtillis） BN-05 CCTCC NO：M2013530。

2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在制备纳豆中的应用。

3.一种分离的纳豆激酶基因，其序列为SEQ ID NO.1所示。

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