CN107692200A - 一种改善睡眠的纳豆激酶褪黑素组合物及其制备方法 - Google Patents

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CN107692200A CN201710830143.9A CN201710830143A CN107692200A CN 107692200 A CN107692200 A CN 107692200A CN 201710830143 A CN201710830143 A CN 201710830143A CN 107692200 A CN107692200 A CN 107692200A
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龚爱华
严永敏
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王艺凡
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唐宇
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Abstract

本发明公开了一种改善睡眠的纳豆激酶褪黑素组合物及其制备方法，属于保健食品领域。该组合物包括纳豆激酶和褪黑素；每g组合物中纳豆激酶的纤溶活性为500‑1000IU，褪黑素含量为0.1mg/g。其制备方法包括：(1)利用高产纳豆激酶的枯草芽孢杆菌制备纳豆激酶发酵液，离心后取上清液超滤浓缩，真空干燥得纳豆激酶冻干粉；(2)将纳豆激酶冻干粉与褪黑素粉混合，添加辅料即得。本发明以纳豆激酶、褪黑素为原料，这两种组分对睡眠发挥协同增效的作用。实验证明，本发明的纳豆激酶褪黑素组合物能够显著延长戊巴比妥钠睡眠时间、缩短巴比妥钠睡眠潜伏期，具有增强改善睡眠的功能。

Description

一种改善睡眠的纳豆激酶褪黑素组合物及其制备方法
技术领域
本发明属于保健食品领域，具体涉及一种纳豆激酶和褪黑素组合物及其制备方法。
背景技术
觉醒—睡眠节律是人体基本的生命现象，正常人每24小时有一次觉醒与睡眠的节律性交替。睡眠是维持人体生命的极其重要的生理功能，与人体健康息息相关。睡眠可分为正相睡眠期(非快速眼动睡眠期NREM)和异相睡眠期(快速眼动睡眠期REM)，健康人睡眠开始于正相睡眠期，维持70～100分钟后转入异相睡眠期，再维持20～30分钟后又转入正相睡眠期，每晚如此重复约4～6次。睡眠量常依年龄不同而异，新生儿需睡18～20小时，儿童12～14小时，成人7～9小时，老年人一般只需5～7小时。临床资料显示，很多人都患有睡眠方面的障碍或者和睡眠相关的疾病。据2002年国际睡眠流行病学调查显示，我国普通成年人出现睡眠障碍的比例高达45.4％。长期失眠会导致大脑功能紊乱，对身体各系统造成多种危害，从而影响身心健康和生活质量。
褪黑素(melatonin，MT)主要是由松果体分泌的一种吲哚类神经内分泌激素，具有调节昼夜节律、清除自由基抗氧化、抑制肿瘤细胞生长、改善骨质疏松、提高记忆和延缓衰老等多种生理功能。在睡眠方面，褪黑素能缩短睡前觉醒时间和入睡时间，减少睡眠中觉醒次数，缩短浅睡眠，延长深睡眠，降低次日早晨唤醒阈值，明显改善睡眠质量，并且有较强的调整时差功能。
纳豆激酶(Nattokinase，NK)是1987年由日本生理学教授须见洋行博士首先发现并命名的一种丝氨酸蛋白酶，是在纳豆发酵过程中由纳豆枯草杆菌产生的，具有溶解血栓、降低血粘度，改善血液循环，软化和增加血管弹性等作用。在此之后的相关研究表明，纳豆激酶能够有效清除人体血液内的血栓，是目前溶栓活力最高的蛋白酶，而且对高血压、衰老、中风、肌肉痉挛、心脑血管疾病、改善睡眠也有很好的疗效。
临床上常用化学合成类镇静催眠药治疗失眠及其他疾病引起的睡眠障碍。此类药物在延长睡眠时间的同时，都会出现不同程度的副作用如头晕、乏力、困倦、注意力不集中，甚至暂时性健忘和宿醉现象，并未真正起到改善睡眠质量的作用。因此，有必要提供一种药效显著、安全、副作用小的改善睡眠作用的功能食品。本发明首次将褪黑素与纳豆激酶组合在一起，以期在改善睡眠方面取得了较好的疗效。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种纳豆激酶褪黑素组合物及其制备方法。
本发明公开了一株纳豆激酶高产菌株UJS-1，现保藏于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.14434，保藏日期为2017年07月17日，建议的分类命名为：枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis.
本发明提供的技术方案是纳豆激酶组合物，该组合物由纳豆激酶、褪黑素组成，每g组合物中纳豆激酶的纤溶活性为500～1000国际单位(IU)，褪黑素在该组合物中含量为0.1mg/g。
上述纳豆激酶可以是由高产纳豆激酶的枯草芽孢杆菌的发酵液，也可以是纳豆激酶冻干粉。
本发明提供了上述纳豆激酶褪黑素组合物的制备方法，按照下述步骤进行：
(1)利用枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis制备纳豆激酶发酵液，离心，取上清液超滤浓缩，得到纳豆激酶粗品浓缩液；
(2)将褪黑素与纳豆激酶粗品浓缩液混合。
本发明还提供了上述纳豆激酶褪黑素组合物的制备方法，具体按照下述步骤进行：
(1)选用纳豆激酶高产菌株UJS-1枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，直接在平板上进行分离筛选，分离平板优选LB-琼脂糖-纤维蛋白平板：LB培养基配制时用0.0lmol磷酸盐缓冲液(pH7.4)溶解，制作平板时，将纤维蛋白原和凝血酶溶解于其中，其制作方法同琼脂糖-纤维蛋白平板。
其中所述的LB-琼脂糖-纤维蛋白平板组成如下：PBS缓冲液25ml，琼脂糖溶液0.25g，0.5％纤维蛋白原溶液200ul，20U/ml凝血酶溶液60ul。
(2)本发明选用一种优化的高产纳豆激酶的液态发酵培养基，使用枯草芽孢杆菌UJS-1进行发酵制备种子液，发酵至OD值为0.8～1.0时，以体积比0.5～3.0％左右的接种量进行液体发酵，发酵温度为36～38℃，pH为7.0～7.4，发酵周期为24～28小时。
(3)利用高产纳豆激酶的枯草芽孢杆菌UJS-1制备纳豆激酶发酵液，以5000～10000rpm离心，取上清液超滤浓缩，超滤膜的截留分子量为10000～30000，截留率>90％，得到纳豆激酶粗品浓缩液；
(4)将褪黑素粉末与纳豆激酶浓缩液按1:1000混合。
其中步骤(2)选用高产纳豆激酶的液态发酵培养基，按质量比计：黄豆粉4～6％，葡萄糖2～4％，NaCl 0.5～1％，K2HPO4 0.1～0.2％，KH2PO4 0.1～0.2％，CaCl2 0.01～0.025％，MgSO4.7H2O 0.05～0.075％。
为了除去发酵液中的大部分菌体和杂质，纳豆激酶发酵液离心转速优选5000～10000rpm。由于纳豆激酶对热比较敏感，超滤浓缩一般选用常温超滤浓缩，超滤膜的截留分子量为10000～30000，截留率>90％。
纳豆激酶褪黑素组合物的制备方法还可以是：
(1)利用高产纳豆激酶的枯草芽孢杆菌制备纳豆激酶发酵液，以5000～10000rpm离心，取上清液浓缩，真空冷冻干燥，得到纳豆激酶冻干粉；
(2)将褪黑素粉末与纳豆激酶冻干粉混合。
本发明的组合物可以包括药学可接受的辅料，按常规的制剂工艺制成胶囊剂、片剂、颗粒剂、凝胶剂、缓释剂等。药学可接受的辅料包括填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂选自淀粉、糊精、乳糖、可压性淀粉、微晶纤维素中的一种或两种以上的混合。粘合剂选自轻丙基甲基纤维素、淀粉浆、交联聚维酮、竣甲基纤维素钠中的一种或两种以上的混合。崩解剂选自干淀粉、竣甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮中的一种或两种以上的混合。润滑剂选自滑石粉、硬脂酸镁、微粉硅胶中的一种或两种以上的混合。
本发明所述的纳豆激酶褪黑素组合物的日服用量为1～3g，其中1g组合物中褪黑素为0.1mg，纳豆激酶的纤溶活性为500～1000IU，远低于常规用量，可大大节约成本，减轻患者的经济压力。
本发明具有安全无毒、口感良好、服用量少和无依赖性的特点。褪黑素具有直接促进睡眠的作用，纳豆激酶通过改善血液循环从而间接促进睡眠，实验研究证明这两种物质组合在一起发挥协同增效的作用，能够显著延长戊巴比妥钠睡眠时间、协同戊巴比妥钠阈下剂量催眠作用和缩短巴比妥钠睡眠潜伏期，具有显著改善睡眠的功能。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本发明公开了一株纳豆激酶高产菌株UJS-1，现保藏于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.14434，保藏日期为2017年07月17日，建议的分类命名为：枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis.
本发明枯草芽孢杆菌亚种Bacillus subtilis subsp.UJS-1的形态和特征为：Bacillus subtilis subsp.UJS-1菌株在LB平板上生长良好，菌落灰白色，呈不规则圆形，表面粗糙并形成褶皱，中央形成乳头状突起，边缘不整齐，无光泽，不透明。在奶粉平板上生长18h后可见明显水解溶圈；该菌株为革兰氏阴性菌，杆状、两端钝圆，能产生芽抱，芽孢圆形或椭圆形，中生。
利用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取UJS-1菌株基因组DNA，用TE缓冲液稀释到200ng/μl，作为PCR扩增模板。配制以下反应体系：2×PCR mix 10μl，基因组DNA 2μl，上游引物(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3')1μl，下游引物(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')1μl，纯水6μl。按以下程序进行扩增：94℃预变性3min，35个循环(94℃预变性20s，55℃退火20s，延伸1min)，72℃延伸5min，4℃保存。PCR扩增结束后取3μl反应液进行1.5％琼脂糖电泳检测。紫外检测表明扩增16S rRNA条带大小约为1500bp。确认是枯草芽孢杆菌亚种。
以下实施例中所述纳豆激酶发酵液均按下述方法制得：
选用纳豆激酶高产菌株UJS-1，直接在平板上进行分离筛选，分离平板优选LB-琼脂糖-纤维蛋白平板：LB培养基配制时用0.0lM磷酸盐缓冲液(pH7.4)溶解，制作平板时，将纤维蛋白原和凝血酶溶解于其中，其制作方法同琼脂糖-纤维蛋白平板。其中所述的LB-琼脂糖-纤维蛋白平板组成如下：PBS缓冲液25ml，琼脂糖溶液0.25g，0.5％纤维蛋白原溶液200ul，20U/ml凝血酶溶液60ul。
(1)本发明选用一种优化的高产纳豆激酶的液态发酵培养基，包括：红芸豆粉5g，葡萄糖2g，NaCl 0.5g，K2HPO4 0.1g，KH2PO4 0.1g，1mol CaCl2 40μl，1mol MgSO4.7H2O 80μl。
(2)根据本发明优选的方法，使用枯草芽孢杆菌进行发酵制备种子液，发酵至OD值为0.8～1.0时，以0.5～3.0％左右的接种量进行液体发酵，发酵温度为36～38℃，pH为7.0～7.4，发酵周期为24～28小时，到纳豆激酶发酵液。
实施例1纳豆激酶褪黑素组合物A
该组合物由纳豆激酶、褪黑素组成，其中纳豆激酶的用量以纳豆激酶纤溶活性计算，该组合物中纳豆激酶的纤溶活性为500IU/g，褪黑素的含量为0.1mg/g。
该组合物的制备方法为：
(1)将纳豆激酶发酵液以5000rpm离心，将上清液常温超滤浓缩，得到纳豆激酶浓缩液，真空冷冻干燥，得到纳豆激酶粗品冻干粉；
(2)将纳豆激酶粗品冻干粉与褪黑素粉按比例进行混合，添加辅料，以确保组合物中纳豆激酶的纤溶活性为500IU/g，褪黑素的含量为0.1mg/g。
实施例2纳豆激酶褪黑素组合物B
该组合物由纳豆激酶、褪黑素组成，其中纳豆激酶的用量以纳豆激酶纤溶活性计算，该组合物中纳豆激酶的纤溶活性为750IU/g，褪黑素的含量为0.1mg/g。
该组合物的制备方法为：
(1)将纳豆激酶发酵液以8000rpm离心，将上清液常温超滤浓缩，得到纳豆激酶浓缩液，真空冷冻干燥，得到纳豆激酶粗品冻干粉；
(2)将纳豆激酶粗品冻干粉与褪黑素粉按比例进行混合，添加辅料，以确保组合物中纳豆激酶的纤溶活性为750IU/g，褪黑素的含量为0.1mg/g。
实施例3纳豆激酶褪黑素组合物C
该组合物由纳豆激酶、褪黑素组成，其中纳豆激酶的用量以纳豆激酶纤溶活性计算，该组合物中纳豆激酶的纤溶活性为1000IU/g，褪黑素的含量为0.1mg/g。
该组合物的制备方法为：
(1)将纳豆激酶发酵液以10000rpm离心，将上清液常温超滤浓缩，得到纳豆激酶浓缩液，真空冷冻干燥，得到纳豆激酶冻干粉；
(2)将纳豆激酶粗品冻干粉与褪黑素粉按比例进行混合，添加辅料，以确保组合物中纳豆激酶的纤溶活性为1000IU/g，褪黑素的含量为0.1mg/g。
实施例4纳豆激酶褪黑素制剂毒理学安全性评价试验
按卫生部《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)评价方法，对本发明的实施例1～实施例3的改善睡眠的纳豆激酶褪黑素组合物进行毒理学安全性评价试验，结果如下：
(1)急性经口毒性试验：以最大给药量(剂量30g/kg.BW)给予纳豆激酶褪黑素组合物30天后，未见小鼠有中毒症状，无动物死亡，试验结束解剖动物，大体观察未见异常，属无毒物。
(2)三项遗传毒性试验结果：Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠精子畸形试验结果均为阴性；
(3)30天喂养试验结果：以167、334、668mg/kg.BW(分别相当于人体推荐用量25、50、100倍)3个剂量的改善睡眠的纳豆激酶褪黑素组合物连续给小鼠灌胃30天，实验期间小鼠生长情况良好，血液学检查，生化学检查，主要脏体比及组织学检查结果与对照组相比，均无显著差异(P>0.05)。
安全性毒理学试验结果显示本发明所述的纳豆激酶褪黑素组合物安全无毒。
实施例5纳豆激酶褪黑素制剂改善睡眠功能试验
取昆明小鼠50只，体重在18～22g，雌雄各半，将其随机分为5组，每组10只，分别为实验组1、2、3、4和对照组(等体积的生理盐水代替)。实验组1给予褪黑素(0.1mg/Kg)，给药剂量为1g/kg；实验组2、3、4分别给药实施例1、2、3的组合物A、B、C，给药剂量为lg/kg，对照组给予生理盐水。每日经口灌胃，灌胃体积为0.05mL/10g.BW，连续30天后，测试改善睡眠功能的各项指标。
(1)直接睡眠实验
在给末次样品后观察小鼠的睡眠情况，以动物的翻正反射消失超过60秒判为进入睡眠，翻正反射恢复即为动物觉醒。结果用卡方检验进行统计分析。如实验组入睡动物数及睡眠时间增加并与空白对照组有显著性差异(P<0.05)，即判定该项实验结果为阳性。
(2)巴比妥钠睡眠潜伏期实验
各组动物在给末次样品后20分钟经腹腔注射戊巴比妥钠250mg/kg.BW，注射量为0.05mL/10g.BW。以翻正反射消失为指标，观察改善睡眠的纳豆激酶褪黑素组合物能否缩短巴比妥钠睡眠潜伏期。结果用方差分析进行统计分析。如实验组小鼠的睡眠潜伏期比对照组缩短并有统计学意义(P<0.05)，即判定该项试验结果为阳性。
(3)戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验
在给末次样品20分钟后，各组动物经腹腔注射戊巴比妥钠35mg/kg.BW。观察30分钟内小鼠的睡眠情况，以翻正反射消失60秒以上者为入睡，记录各组的入睡动物数，计算入睡动物发生率。结果用卡方检验分析，如实验组入睡动物发生率高于对照组并有统计学意义(P<0.05)，即判定该项实验结果为阳性。
(4)延长戊巴比妥钠睡眠时间实验
在给末次样品20分钟后，各组动物经腹腔注射戊巴比妥钠45mg/kg.BW，注射量为0.1mL/10g BW。以动物的翻正反射消失为指标，观察改善睡眠的纳豆激酶褪黑素组合物能否延长戊巴比妥钠睡眠时间。结果用方差分析进行统计分析。如实验组小鼠的睡眠时间比对照组延长并有统计学意义(P<0.05)，即判定该项实验结果为阳性。
若延长戊巴比妥钠睡眠时间实验、戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验、戊巴比妥钠睡眠潜伏期实验三项实验中二项阳性，且无明显直接睡眠作用，可判定该纳豆激酶褪黑素组合物具有改善睡眠的功效。
(5)实验结果
1)改善睡眠的纳豆激酶褪黑素组合物对小鼠体重的影响
表1纳豆激酶褪黑素组合物改善睡眠功能实验小鼠体重(X±S)
注：P值表示实验1～4组初始和末期的小鼠体重及增重与对照组比较，差异均无显著性。
由表1中可见，实验1～4组初始和末期的小鼠体重及增重与对照组比较，小鼠体重增长差异均无显著性(P>0.05)，表明该组合物A、B、C及褪黑素对小鼠的体重增长无明显影响。
2)改善睡眠的纳豆激酶褪黑素组合物的直接睡眠作用
表2纳豆激酶褪黑素组合物小鼠直接睡眠试验结果
组别 例数(只) 入睡动物数(只) 入睡率(％)
对照组 10 0 0
实验组1 10 0 0
实验组2 10 0 0
实验组3 10 0 0
实验组4 10 0 0
从表2可见，经口服给予小鼠不同剂量组合物A、B、C及褪黑素30天，各组均没有动物出现翻正反射消失，即全部动物均没有进入睡眠状态，提示该组合物A、B、C和低剂量褪黑素没有直接诱导小鼠睡眠的作用。
3)改善睡眠的纳豆激酶褪黑素组合物对巴比妥钠催眠潜伏期的影响
表3纳豆激酶褪黑素组合物巴比妥钠睡眠潜伏期试验结果(X±S)
组别 例数(只) 睡眠潜伏期(min) P值 缩短率(％)
对照组 10 25.54±5.53 ～～ 0
实验组1 10 4.67±0.11 0.0014 81.7
实验组2 10 6.79±0.48 0.0028 73.4
实验组3 10 9.56±1.12 0.03 62.6
实验组4 10 13.34±2.05 0.084 47.8
从表3可见，经口服给予小鼠不同剂量组合物A、B、C及褪黑素30天，实验组1-3的睡眠潜伏期均比对照组缩短，差异具有显著性(P<0.05)，提示该组合物A、B和褪黑素具有缩短巴比妥钠睡睡眠潜伏期的作用。
4)改善睡眠的纳豆激酶褪黑素组合物对戊巴比妥钠阈下剂量催眠作用的影响
表4纳豆激酶褪黑素组合物戊巴比妥钠阈下剂量催眠试验结果
组别 例数(只) 入睡动物数(只) 入睡率(％) P值
对照组 10 0 0 ～～
实验组1 10 1 10 >0.05
实验组2 10 2 20 >0.05
实验组3 10 2 20 >0.05
实验组4 10 1 10 >0.05
从表4可见，经口服给予小鼠不同剂量组合物A、B、C及褪黑素30天，实验组1-4小鼠入睡率均高于对照组，但差异无显著性(P>0.05)，提示该组合物A、B、C及褪黑素组与阈下剂量的戊巴比妥钠没有协同催眠的作用。实验组2、3小鼠的入睡率高于实验组1，说明纳豆激酶褪黑素组合物A、B的效果优于单用褪黑素组。
5)改善睡眠的纳豆激酶褪黑素组合物对戊巴比妥钠睡眠时间的影响
表5纳豆激酶褪黑素组合物延长戊巴比妥钠睡眠时间试验结果(X±S)
组别 例数(只) 睡眠时间(min) P值 延长率(％)
对照组 10 49.1±7.66 0 0
实验组1 10 83.74±3.74 0.0019 70.5
实验组2 10 126.1±5.11 0.0002 156.8
实验组3 10 68.6±3.85 0.0306 39.7
实验组4 10 67.96±4.20 0.0464 38.4
从表5可见，经口服给予小鼠不同剂量组合物A、B、C及褪黑素30天，实验组1-3小鼠的睡眠时间与对照组比较，睡眠时间明显延长，差异具有显著性(P<0.05)，提示该组合物A、B及褪黑素组具有延长戊巴比妥钠睡眠时间的作用。其中实验组2小鼠的睡眠延长时间明显优于实验组1，说明纳豆激酶褪黑素组合物A在睡眠延长时间的效果优于单独使用褪黑素组，
6)结果判定
纳豆激酶褪黑素组合物A、B和褪黑素组连续给小鼠灌胃30天，能延长戊巴比妥钠睡眠时间、缩短巴比妥钠睡眠潜伏期，无直接睡眠作用，对小鼠的体重无影响，其中在延长戊巴比妥钠睡眠时间和戊巴比妥钠阈下剂量催眠试验中，组合物A、B效果优于单用褪黑素组，提示该组合物A、B具有增强改善睡眠的功能。

Claims (6)

1.一株纳豆激酶高产菌株UJS-1，其特征在于保藏编号为CGMCC No.14434，建议的分类命名为：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis.。
2.利用权利要求1所述纳豆激酶高产菌株生产的纳豆激酶组合物，其特征在于该组合物由纳豆激酶、褪黑素组成，每g组合物中纳豆激酶的纤溶活性为500～1000国际单位(IU)，褪黑素在该组合物中含量为0.1mg/g。
3.权利要求2所述纳豆激酶褪黑素组合物的制备方法，其特征在于按照下述步骤进行：
(1)利用枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis制备纳豆激酶发酵液，离心，取上清液超滤浓缩，得到纳豆激酶粗品浓缩液；
(2)将褪黑素与纳豆激酶粗品浓缩液混合，即得。
4.权利要求2所述纳豆激酶褪黑素组合物的制备方法，其特征在于具体按照下述步骤进行：
(1)选用纳豆激酶高产菌株UJS-1枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，直接在平板上进行分离筛选，分离平板优选LB-琼脂糖-纤维蛋白平板：LB培养基配制时用0.0lmol磷酸盐缓冲液(pH7.4)溶解，制作平板时，将纤维蛋白原和凝血酶溶解于其中，其制作方法同琼脂糖-纤维蛋白平板；其中所述的LB-琼脂糖-纤维蛋白平板组成如下：PBS缓冲液25ml，琼脂糖溶液0.25g，0.5％纤维蛋白原溶液200ul，20U/ml凝血酶溶液60ul。
(2)使用枯草芽孢杆菌UJS-1进行发酵制备种子液，发酵至OD值为0.8～1.0时，以体积比0.5～3.0％左右的接种量进行液体发酵，发酵温度为36～38℃，pH为7.0～7.4，发酵周期为24～28小时；
(3)利用高产纳豆激酶的枯草芽孢杆菌UJS-1制备纳豆激酶发酵液，以5000～10000rpm离心，取上清液超滤浓缩，超滤膜的截留分子量为5000～20000，截留率>90％，得到纳豆激酶粗品浓缩液；
(4)将褪黑素粉末与纳豆激酶浓缩液按1：1000混合，添加辅料即得。
5.权利要求4所述纳豆激酶褪黑素组合物的制备方法，其特征在于其中步骤(2)选用高产纳豆激酶的液态发酵培养基，以质量比计：黄豆粉4～6％，葡萄糖2～4％，NaCl 0.5～1％，K2HPO4 0.1～0.2％，KH2PO4 0.1～0.2％，CaCl2 0.01～0.025％，MgSO4.7H2O 0.05～0.075％。
6.权利要求2所述纳豆激酶褪黑素组合物的制备方法，其特征在于纳豆激酶褪黑素组合物的制备方法还可以是：
(1)利用高产纳豆激酶的枯草芽孢杆菌制备纳豆激酶发酵液，以5000～10000rpm离心，取上清液浓缩，真空冷冻干燥，得到纳豆激酶冻干粉；
(2)将褪黑素粉末与纳豆激酶冻干粉混合，添加辅料即得。
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