CN101560478A - 一种产生纳豆激酶的枯草芽孢杆菌纳豆亚种及其应用 - Google Patents
一种产生纳豆激酶的枯草芽孢杆菌纳豆亚种及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种产生纳豆激酶的枯草芽孢杆菌纳豆亚种及其应用。枯草芽孢杆菌纳豆亚种(Bacillus subtilis subsp.natto LNUB236)，CCTCC NO：M 208156。该枯草芽孢杆菌纳豆亚种经菌种活化、制备种子液和发酵液，提取纳豆激酶。利用纳豆激酶在制备预防与治疗脑血栓保健品上的应用。保健品中，组分按重量配比为：纳豆冻干粉∶纳豆激酶∶月见草油＝1∶2.0～3.0∶1.0～1.5。本发明的枯草芽孢杆菌纳豆亚种LNUB236产纳豆激酶量高，在30升发酵罐中发酵生产酶活最高可达到431.455IU/ml，制备的含纳豆激酶保健品，具有酶活高、效果明显、无副作用的特点。
Description
技术领域：
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种能高产纳豆激酶的枯草芽孢杆菌纳豆亚种及其应用。
本发明所称的一种产生纳豆激酶的枯草芽孢杆菌纳豆亚种命名为：枯草芽孢杆菌纳豆亚种(Bacillus subtilis subsp.nattoLNUB236)，已于2008年10月14日在中国典型培养物保藏中心保藏，编号为CCTCC NO：M 208156。
背景技术：
血栓栓塞性疾病是引起死亡的主要原因之一，是现今仅次于癌症的第二大病症。目前，溶解血栓是治疗这一类疾病的重要手段，当今用于临床治疗的药物包括链激酶、尿激酶、组织型纤溶酶原激活剂、单链尿激酶型血纤溶酶原活剂、化学修饰的血纤溶酶-链激酶激活剂复合物等。这些药物均为激活血液中的血纤溶酶原，从而降解纤维蛋白而间接地起作用。临床应用方法是注射或滴注，有可能引起患者全身性内出血，而且在血液中的半衰期很短(3～20分钟)，因此在使用这些药物时必须长时间的滴注用药，很不方便，且来源紧缺、造价高。因此，开发新型溶血栓药物已成为当前重要研究课题之一。
到目前为止工业上还没有进行大规模生产纳豆激酶，原因一是还没有找到适合大规模发酵高产纳豆激酶的菌种，达到工业化生产的标准；二是大规模发酵生产纳豆激酶的成本比较高，开发出纳豆激酶临床标准药品的费用昂贵，而开发出相应的保健产品成本相应低。
所以找到高产纳豆激酶的菌种就格外重要，以实现纳豆激酶的工业化生产，并进一步开发出纳豆保健产品。
发明内容：
为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种高产纳豆激酶的枯草芽孢杆菌纳豆亚种(Bacillus subtilis subsp.natto LNUB236)，在武汉中国典型培养物保藏中心保藏，编号为CCTCC NO：M 208156，以下简称枯草芽孢杆菌纳豆亚种LNUB236。
本发明的另一目的是利用枯草芽孢杆菌纳豆亚种LNUB236产生的纳豆激酶在制备预防与治疗脑血栓保健品上的应用。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种产生纳豆激酶的枯草芽孢杆菌纳豆亚种，其特征在于枯草芽孢杆菌纳豆亚种(Bacillus subtilis subsp.natto LNUB236)，在武汉中国典型培养物保藏中心保藏，编号为CCTCC NO：M 208156。
本发明提供的枯草芽孢杆菌纳豆亚种LNUB236的筛选方法为：
取5克豆豉样品于50毫升无菌水中浸泡1小时，震荡后静置取上清液，涂布BPY培养基，分离单菌落，观察用牙签挑起的单菌落能否拉出丝来，选择能拉丝的革兰氏阳性芽孢菌落，参照《伯杰细菌鉴定手册》第八版、《微生物分类学》等对所选菌株进行鉴定，经鉴定为枯草芽孢杆菌的菌株作进一步发酵试验。从豆豉样品中共筛选到48株产拉丝粘质的革兰氏阳性芽孢菌株，再从中挑选出17株长势良好的菌株，其中的6株在纤维蛋白平板上表现出明显的纤溶活性，将其依次编号为LNUB235--LNUB240。将筛选出来的6个菌种进行液体发酵，培养基为：麦芽糖3％、大豆胰蛋白0.7％、酵母提取物0.15％、磷酸二氢钾0.1％、磷酸氢二钾0.25％、硫酸镁0.05％、氯化钙0.02％、pH7.0，37℃，发酵72小时，然后测量发酵液的酶活。
参照Astrup等方法制备标准纤维蛋白平板，1小时以后用尿激酶标准品点样10、20、40、80、160、320IU/ml，37℃培养，18小时后测溶圈垂直直径，以垂直直径乘积为横坐标，酶活为纵坐标，在双对数坐标纸上绘制标准曲线。将待测样品分别点样于纤维蛋白平板上，培养18小时、测溶圈垂直直径并在标准曲线上查出酶活。
筛选出的6株纳豆枯草芽孢杆菌发酵液溶圈直径积(cm2)及酶活
(IU/ml)
| 菌株号 | LNUB235 | LNUB236 | LNUB237 | LNUB238 | LNUB239 | LNUB240 |
| 溶圈直径积 | 4.028 | 5.928 | 3.085 | 4.401 | 2.296 | 2.033 |
| 酶活 | 169.825 | 431.455 | 89.324 | 210.354 | 78.563 | 32.665 |
筛选出酶活值最高的LNUB236，进一步分离纯化，得到一株纯种菌。
菌株LNUB236的鉴定如下：
A.菌株LNUB236的形态与特征：
LNUB236菌株在营养平板上生长良好，菌落灰白色，不规则，表面粗糙，有褶皱，边缘不整齐，无光泽，不透明；营养肉汤上生长不混浊，表面产生一层有褶皱的菌膜；在标准纤维蛋白平板上生长18小时能形成蛋白水解透明圈；LNUB236菌株为革兰氏阳性，杆状、两端钝圆；能产生芽孢，芽孢圆形或椭圆形、中生，生长温度范围在15～50℃；在含70克/升的氯化钠培养液中能生长；半固体培养基作穿刺培养显示出运动性。
B.菌株LNUB236的生理生化特性：
与《伯氏手册》中有关枯草芽孢杆菌的描述相比较(Sneath et al.，1986；Buchanan and Gibbens，1974)，结论见下表：
LNUB236菌株的生理生化性质
| 生理生化特性 | 葡萄糖产酸 | 葡萄糖产气 | 严格好氧菌 | 过氧化氢酶反应阳性 | VP反应阳性 | 水解淀粉和酪蛋白 | 明胶液化 | 硝酸盐还原 | 柠檬酸利用 | 果聚糖产生 |
| LNUB236腊状芽胞杆菌地衣芽胞杆菌枯草芽孢杆菌对照 | ++++ | ---- | +--+ | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ | +-++ |
注：+表阳性，-表阴性。
可见菌株LNUB236为严格好氧菌，葡萄糖产酸不产气，过氧化氢酶和VP反应阳性；能水解淀粉和酪蛋白；明胶液化、硝酸盐还原及柠檬酸利用和果聚糖产生等均为阳性。我们鉴定该菌是枯草芽孢杆菌中的一个菌，其重要特性是能产生纤溶酶、γ-PGA及果聚糖等大分子物质。
C.菌株LNUB236的16S rDNA的测序及进化树的制作：
菌株LNUB236基因组DNA的提取：1.5毫升对数生长期细菌细胞，12000转/分钟离心2分钟，弃上清液。加100微升TE buffer悬浮细胞，按5毫克/毫升量加入溶菌酶，37℃温育2小时。按2％的量加入10％SDS，37℃温育10分钟。此时溶液为澄清、粘稠或有较明显的拉丝现象。等体积酚：氯仿抽提，12000转/分钟离心5分钟，取上清，重复一次。用等体积氯仿抽提上清液一次，12000转/分钟离心5分钟，取上清，加1/10体积的乙酸钠，轻轻振荡、摇匀。加2-2.5倍体积的-20℃无水乙醇，冰上放置5分钟，12000转/分钟离心2分钟，弃上清。80％无水乙醇洗两次，-20℃，12000转/分钟离心2分钟，滤纸洗干并于37℃以下烘干。加50-100微升TE buffer重新溶解DNA，待用。菌株LNUB236的16SrDNA基因的PCR扩增以所提取的基因组为模板，建立如下反应体系：无菌水17.5微升，PCR buffer 2.5微升，dNTP 2微升，模版DNA 1.5微升，上游引物序列为5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’0.5微升，下游引物序列为5’-GGTACCTTGTTACGACTT-3’0.5微升，Taq酶0.5微升。其中引物浓度为50皮摩尔，Taq酶浓度为0.5U/微升。PCR扩增程序如下：95℃预变性8分钟→30循环(94℃变性30秒→45℃退火1分30秒→72℃延伸1分钟)→72℃延伸8分钟。PCR反应结束后取5微升PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，紫外检测仪下检测结果。
利用凝胶成像Dolphin-DOC系统软件，再利用Marker进行比对。对经过凝胶电泳的基因组进行分析得出其基因组大小约为8211.204bp，对经过凝胶电泳的基因组进行分析得出其16S rDNA大小为1430bp。
菌株LNUB236基因的测序结果如下：
TTCGGCGGCTGGCTCCTAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTACCGCCCTATTCGAACGGTACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCCACCTTTTATGTTTGAACCATGCGGTTCAAACAACCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACATCAGGGAGCAAGCTCCCATCTGTCCGCTCGACTTGCATGTATAGCA
以上为PCR扩增后产物的测序结果，其全长为1430个bp。
D.菌株LNUB236系统进化树分析：见图1。
将测得的16S rDNA基因序列与GenBank中保存的基因序列进行比对，得到序列相似性图谱，并做系统进化树如图1，实验分离出的高产纳豆激酶菌株在整个枯草芽孢杆菌属中的位置从树状图看到，LNUB236与Bacillus subtilis subsp.natto有很高的相似性，从分子角度来说其属于枯草芽孢杆菌属。
F.结论：从豆豉中分离出具有高产溶栓活性的优势菌种，通过生理生化反应，并利用PCR反应扩增该菌株的16S rDNA，经过测序鉴定，利用生物软件MegAlign制作进化树进行同源性分析及进化分析，确定菌株LNUB236为枯草芽孢杆菌，我们命名为枯草芽孢杆菌纳豆亚种(Bacillus subtilis subsp.natto LNUB236)，2008年10月14日送中国典型培养物保藏中心保藏，其编号为CCTCC NO：M 208156。
利用枯草芽孢杆菌纳豆亚种LNUB236液体发酵产生纳豆激酶，其制备方法如下：
1)菌种活化：将枯草芽孢杆菌纳豆亚种LNUB236接到LB斜面培养基上，在37℃恒温箱里培养24小时；
2)种子液制备：将活化的菌种，用接种环挑接到含有200毫升LB液体培养基的500毫升三角瓶中，在37℃，200转/分钟下培养18小时；
3)发酵液的制备：以2％种子液接种量接到发酵罐液体综合培养基中，发酵温度为37℃，发酵时间为72小时，pH为7.0，通气量为0.5-1.0立方米/小时，转速为400转/分钟，罐压为0.1-0.2兆帕；
4)提取纳豆激酶：把发酵液在4℃，3000转/分钟条件下离心30分钟，弃去沉淀，收集上清液，往上清液中加入研磨的硫酸铵粉末，使其饱和度达到35％，在4℃下盐析12小时，在6000转/分钟条件下离心30分钟，弃去沉淀，收集上清液；往上清液中加入硫酸铵粉末使其饱和度达到75％，4℃下盐析12小时后，6000转/分钟离心30分钟，弃上清液，收集沉淀，沉淀用0.04摩尔/升，pH 7.8的磷酸盐缓冲液溶解。将得到的溶液过滤、层析、冻干。
利用上述制备的纳豆激酶在制备预防与治疗脑血栓保健品上的应用。保健品中，组分包括纳豆冻干粉、纳豆激酶和月见草油。重量配比为，纳豆冻干粉∶纳豆激酶∶月见草油＝1∶2.0～3.0∶1.0～1.5。用纯纳豆激酶、纳豆冻干粉、月见草油混合制备保健品，在国内尚属首次。纳豆冻干粉含有高酶活的纳豆激酶，所以与纯纳豆激酶混合增加了软胶囊中纳豆激酶的酶活，使每粒软胶囊酶活达到500U；另外月见草油有美容，抗衰老，能抑制癌细胞生长，也具有防心血管阻塞、降低胆固醇的特性。
纳豆激酶是一种安全性最高的高效血栓溶解酶，有很强的溶血栓能力，跟传统的一些溶栓剂相比，具有安全性好、成本低、口服有效等优点。纳豆激酶具有纤溶活性和溶栓能力，可治疗和预防血栓病；纳豆激酶还具有降低血液黏度、降血脂、降胆固醇，改善血液循环状况，维持血细胞的正常形态和功能等作用。
本发明的有益效果是：本发明的枯草芽孢杆菌纳豆亚种LNUB236产纳豆激酶量高，在30升发酵罐中发酵生产酶活最高可达到431.455IU/ml，为工业化纳豆激酶生产提供了可行性。利用枯草芽孢杆菌纳豆亚种LNUB236产生的纳豆激酶为主要成分，以纳豆冻干粉、月见草油为辅料制备纳豆激酶软胶囊，具有酶活高、效果明显、无副作用的特点。
附图说明：
图1是利用MegAlign软件制作的枯草芽孢杆菌纳豆亚种LNUB236的进化树。
具体实施方式：
实施例1
利用枯草芽孢杆菌纳豆亚种LNUB236制备纳豆激酶，其方法如下：
1)菌种活化：将枯草芽孢杆菌纳豆亚种(Bacillus subtilissubsp.natto LNUB236)接到LB斜面培养基上，在37℃恒温箱里培养24小时；
LB斜面培养基组成为：胰蛋白胨1克、氯化钠1克、酵母提取物0.5g、琼脂1.5g、去离子水100毫升、pH为7.0；
2)种子液制备：将活化的菌种，用接种环挑接到2个含有200毫升LB液体培养基的500毫升三角瓶中，在37℃，200转/分钟条件下培养18小时；
LB液体培养基：胰蛋白胨4克、氯化钠4克、酵母提取物2克、去离子水400毫升、pH为7.0；
3)发酵液的制备：以2％种子液接种量接到发酵罐液体综合培养基中，发酵温度为37℃，发酵时间为72小时，pH为7.0，通气量为0.5-1.0立方米/小时，转速400转/分钟，罐压为0.1-0.2兆帕；
发酵罐液体综合培养基组成为：麦芽糖3％、大豆胰蛋白0.7％、酵母提取物0.15％、磷酸二氢钾0.1％、磷酸氢二钾0.25％、硫酸镁0.05％、氯化钙0.02％；
4)提取纳豆激酶：把发酵液在4℃，3000转/分钟条件下离心30分钟，弃去沉淀，收集上清液，往上清液中加入研磨的硫酸铵粉末，使其饱和度达到35％，在4℃下盐析12小时，在6000转/分钟条件下离心30分钟，弃去沉淀，收集上清液，加入研磨的硫酸铵使其饱和度达到75％，4℃下盐析12小时，6000转/分钟离心30分钟，弃上清液，收集沉淀，沉淀用0.04摩尔/升，pH 7.8磷酸盐缓冲液溶解；
5).纯化纳豆激酶：把上述溶液过SephadexG-75凝胶柱，得到活性部分，超浓缩，经过Penpyl-Sepharose Cl-4B疏水层析柱得到高纯度纳豆激酶；
6).冻干：把高纯度纳豆激酶溶液放入-80℃的冰箱中过夜，然后用冷冻干燥机进行冻干，得到高纯度纳豆激酶粉末。
实施例2
一种利用纳豆激酶制备的保健品。保健品按重量配比，纳豆冻干粉∶纳豆激酶∶月见草油＝1∶2.5∶1.5。
其中，纳豆激酶为实施例1制备的纳豆激酶。
制备方法：
(1)制备纳豆冻干粉：大豆在流水中浸泡18小时后，在高压锅上蒸煮，121℃，90分钟。待冷却后，接种，接种量为40％，置于37℃环境中培养1天，再放入4℃环境中培养1天，即为成熟纳豆，然后成熟纳豆加少量蒸馏水用组织捣碎机破碎，再经真空冷冻干燥，得到纳豆冻干粉。
(2)将15克月见草油加热除去其中的氧气并冷却到室温；
(3)在无菌条件下，将10克纳豆冻干粉、月见草油与25克纳豆激酶在组织匀浆机的搅拌下均匀混合，然后用胶囊制备机制成软胶囊，每颗软胶囊中纳豆冻干粉、纳豆激酶和月见草油的总量为0.5克。
实施例3
一种利用纳豆激酶制备的保健品。保健品按重量配比，纳豆冻干粉∶纳豆激酶∶月见草油＝1∶2.0∶1.0。
其中，纳豆激酶为实施例1制备的纳豆激酶。
制备方法：
(1)制备纳豆冻干粉：大豆在流水中浸泡18小时后，在高压锅上蒸煮，121℃，90分钟。待冷却后，接种，接种量为40％，置于37℃环境中培养1天，再放入4℃环境中培养1天，即为成熟纳豆，然后成熟纳豆加少量蒸馏水用组织捣碎机破碎，再经真空冷冻干燥，得到纳豆冻干粉；
(2)将10克月见草油加热除去其中的氧气并冷却到室温；
(3)在无菌条件下，将10克纳豆冻干粉、月见草油与20克纳豆激酶在组织匀浆机的搅拌下均匀混合，然后用胶囊制备机制成软胶囊，每颗软胶囊中纳豆冻干粉、纳豆激酶和月见草油的总量为0.5克。
实施例4
一种利用纳豆激酶制备的保健品。保健品按重量配比，纳豆冻干粉∶纳豆激酶∶月见草油＝1∶3.0∶2.0。
制备方法：
(1)制备纳豆冻干粉：
(2)将20克月见草油加热除去其中的氧气并冷却到室温；
(3)在无菌条件下，将10克纳豆冻干粉、月见草油与30克纳豆激酶在组织匀浆机的搅拌下均匀混合，然后用胶囊制备机制成软胶囊，每颗软胶囊中纳豆冻干粉、纳豆激酶和月见草油的总量为0.5克。
Claims (4)
1、一种产生纳豆激酶的枯草芽孢杆菌纳豆亚种，其特征在于：枯草芽孢杆菌纳豆亚种(Bacillus subtilis subsp.natto LNUB236)，在武汉中国典型培养物保藏中心保藏，编号为CCTCC NO：M 208156。
2、一种纳豆激酶，其特征在于制备方法如下：
1)菌种活化：将权利要求1所述的枯草芽孢杆菌纳豆亚种(Bacillus subtilis subsp.natto LNUB236)，接到LB斜面培养基上，在37℃恒温箱里培养24小时；
2)种子液制备：将活化的菌种，用接种环挑接到含有200毫升LB液体培养基的500毫升三角瓶中，在37℃，200转/分钟条件下培养18小时；
3)发酵液制备：种子液以发酵液体积2％的接种量接到发酵罐液体综合培养基中，发酵温度为37℃，发酵时间为72小时，pH为7.0，通气量为0.5-1.0立方米/小时，转速为400转/分钟，罐压为0.1-0.2兆帕；
4)提取纳豆激酶：把发酵液在4℃，3000转/分钟条件下离心30分钟，弃去沉淀，收集上清液，往上清液中加入研磨的硫酸铵粉末，使其饱和度达到35％，在4℃下盐析12小时，在6000转/分钟条件下离心30分钟，弃去沉淀，收集上清液；往上清液中加入硫酸铵粉末使其饱和度达到75％，4℃下盐析12小时后，6000转/分钟离心30分钟，弃上清液，收集沉淀，沉淀用0.04摩尔/升，pH 7.8的磷酸盐缓冲液溶解，将得到的溶液进行层析、冻干。
3、权利要求2所述的纳豆激酶在制备治疗与预防脑血栓保健品的应用。
4、按照权利要求3所述的纳豆激酶在制备治疗与预防脑血栓保健品的应用，其特征在于所述的保健品包括以下原料按重量配比组成：纳豆冻干粉∶纳豆激酶∶月见草油＝1∶2.0～3.0∶1.0～1.5；
其制备方法如下：
(1)制备纳豆冻干粉；：
(2)加热月见草油除去其中的氧气并冷却到室温；
(3)在无菌条件下，按上述重量配比将纳豆冻干粉、月见草油、纳豆激酶均匀混合，制成软胶囊。
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