CN105238720B - 一种产纤溶酶枯草芽孢杆菌及发酵方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种产纤溶酶枯草芽孢杆菌及发酵方法和应用，所述枯草芽孢杆菌分离、筛选自中国重庆的传统发酵食品豆豉中，所述的枯草芽孢杆菌DC27保藏在中国典型培养物保藏中心，CCTCC NO：M 2015573，本发明进一步提供了该菌株的液体发酵方法，所得发酵液中的纤溶酶活力可达4506IU/mL。该菌株来源于食品且能分泌高活性的纤溶酶，安全无毒，可应用于预防或缓解血栓性疾病的功能性食品或药品的开发中，应用前景广阔。

Description

一种产纤溶酶枯草芽孢杆菌及发酵方法和应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种产纤溶酶枯草芽孢杆菌及发酵方法和应用，本发明所述的枯草芽孢杆菌分离筛选至豆豉，具有高产豆豉纤溶酶的能力，可用于预防或缓解血栓性疾病的功能性食品或药品的开发中。

背景技术

心血管疾病(cardiovascular disease，CVDs)，如急性心肌梗死、缺血性心脏病和高血压是世界上人类死亡的主要原因之一。据2001年世界卫生组织报告，每年约有1700万人死于CVDs，到2020年，因CVDs而导致的每年死亡人数将增至2500万。在不同类型的CVDs中，血栓性疾病已成为威胁人类健康的最主要的病因之一。因此，如何有效地预防和治疗血栓性疾病，已引起国内外医学界和科技界的高度重视。

治疗血栓性疾病的方法主要有外科手术、保守疗法和溶栓疗法三种，其中溶栓疗法以纤溶酶作为溶栓剂，使血管再通，治疗费用较低，是目前治疗血栓性疾病最为有效和可靠的手段。相比临床上使用的组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)、尿激酶(UK)和链激酶(SK)等溶栓药物，食品来源的纤溶酶，如纳豆激酶和豆豉纤溶酶不仅血栓溶解能力强，而且具有安全无毒、不引起内出血、生产成本低、在胃肠里的稳定性好以及在体内的半衰期长等优点。豆豉是我国传统的大豆发酵食品，有上千年的历史，制作方式比日本的纳豆复杂。据中国药典记载：豆豉具有开胃增食，消积化滞，祛风散寒以及预防心血管疾病等功效，经研究发现，豆豉中的纤溶酶活性比纳豆来源的纳豆激酶活性更高。近年来，科研工作者相继从中国的豆豉、日本的纳豆、韩国的豆酱和印尼的天培等传统发酵食品中发现并获得产纤溶酶的菌株。然而，目前国内的纤溶酶产品活性普遍偏低。因此，从传统的发酵食品中分离筛选高活性的纤溶酶菌株，并对其发酵方法进行研究，可为预防或治疗血栓性疾病功能性食品或药品的开发奠定良好的基础，具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种枯草芽孢杆菌DC27，该菌株具有高产豆豉纤溶酶的特性，安全无毒，可用于预防或治疗血栓性疾病功能性食品或药品的开发，该菌株已于2015年9月23日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)DC27，保藏编号：CCTCC NO：M 2015573，地址：中国武汉武汉大学。

本发明还有一个目的在于提供了一种枯草芽孢杆菌的液体发酵方法，方法简单，易行，利用本发明提供的发酵方法，采用50L发酵罐所得发酵液中的纤溶酶活力可达4506IU/mL。

本发明的最后一个目的在于提供了枯草芽孢杆菌DC27在制备纤溶酶中的应用，所述的应用包括利用该菌株生产的纤溶酶制备各种目前市场上流通的含有纤溶酶的产品。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种枯草芽孢杆菌DC27，其筛选过程如下：

1)利用初筛培养基分离和筛选传统发酵豆豉中的芽孢菌，根据平板上的透明圈和菌落大小的直径的比值来确定酶活较高的菌株。

初筛培养基：酪蛋白0.4％，NaCl 0.5％，琼脂2％。

2)利用复筛培养基将初筛获得的菌株进行复筛，通过纤溶酶活性测定和在血琼脂培养基上的溶血性试验选择纤溶活力高且安全的菌株。

复筛培养基：葡萄糖1％，大豆蛋白胨1％，Na₂HPO₄ 0.2％，NaH₂PO₄ 0.1％，CaCl₂0.02％，MgSO₄ 0.05％，pH7.0，115℃灭菌15min。

血琼脂培养基：蛋白胨1％，酵母膏0.3％，NaCl 5％，Na₂HPO₄ 0.5％，甘露醇1％，新鲜的人血5％～10％，琼脂1.5％，结晶紫10ppm，pH8.0。

3)最后筛选到一株纤溶酶酶活力较高且安全的菌株DC27，通过形态学、生理生化鉴定和16SrRNA的分子鉴定初步确定为枯草芽孢杆菌，再根据特异PCR进一步确定为枯草芽孢杆菌。该菌株已于2015年9月23日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DC27，保藏编号：CCTCC NO：M 2015573。

枯草芽孢杆菌DC27的形态特征：DC27在LB平板培养基上的菌落形态与芽孢杆菌相似，为圆形，边缘整齐，表面有褶皱，呈乳白色，半透明，有粘性。挑取单菌落经革兰氏染色镜检，光学显微镜镜下细胞形态为杆状，革兰氏染色为阳性，产芽孢，芽孢椭圆形，中生或近中生。

DC27的生理生化特征：见表1。

表1.DC27的生理生化特征

注：“+”表示生理生化反应(或革兰氏染色)阳性；“-”表示表示生理生化反应(或革兰氏染色)阴性；“d”表示11％-89％菌株为阳性；“ND”表示未测定。

特异PCR：

采用枯草芽孢杆菌的特异引物(上游引物为5’-CAGGCTCACACTTTGTCTTG-3’，下游引物为5’-TGAACACAGTCCTGGGTTAG-3’)，以枯草芽孢杆菌为阳性对照，进行菌落PCR，PCR程序为：94℃预变性10min，94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环，72℃延伸10min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。

枯草芽孢杆菌DC27在摇瓶中的液体发酵方法包括：

将处于对数生长期的枯草芽孢杆菌DC27种子液以2％(体积比)的接种量接种到液体发酵培养基(已灭菌)中，转速170r/min，装液量40mL/250mL，在37℃培养72h，发酵液上清酶活可达到3185IU/mL。

所述的液体发酵培养基：玉米淀粉3％、大豆蛋白胨2％、Na₂HPO₄ 0.2％、NaH₂PO₄0.1％、CaCl₂ 0.02％、MgSO₄ 0.05％，pH8.0，115℃灭菌20min。

枯草芽孢杆菌DC27在50L发酵罐中的液体发酵方法包括：

将处于对数生长期的枯草芽孢杆菌DC27种子液以2％(体积比)的接种量接种到液体发酵培养基(已灭菌)中，发酵罐进气口压力0.25MPa，出气口压力0.05MPa，搅拌速率200r/min，装液量30L/50L，在37℃培养36h，发酵液上清酶活可达到4506IU/mL。

所述的液体发酵培养基：玉米淀粉3％、大豆蛋白胨2％、Na₂HPO₄ 0.2％、NaH₂PO₄0.1％、CaCl₂ 0.02％、MgSO₄ 0.05％，pH8.0，115℃灭菌20min。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1)本发明的枯草芽孢杆菌DC27来源于豆豉中，菌株的安全性高；

2)本发明的初筛培养基选用酪蛋白培养基，配方简单，结果展示明显，缩短筛选时间；

3)本发明筛选的枯草芽孢杆菌DC27菌株的初始酶活与现有菌株相比酶活较高，安全无毒，利于改造为更为优良的菌株；

4)本发明筛选的枯草芽孢杆菌DC27产酶量大，采用摇瓶发酵纤溶酶活力可达3185IU/mL，采用50L发酵罐可达4506IU/mL，是目前已知的豆豉纤溶酶酶活最高的菌株，而且培养中所用原料廉价，大型发酵周期短(36h)，利于企业的大规模生产，在预防或治疗血栓性疾病的功能性食品或药品开发方面具有很好的应用前景。

附图说明

图1为豆豉中的产蛋白酶菌株在酪蛋白平板上的活力示意图。

图2为一种枯草芽孢杆菌DC27在LB平板上的菌落形态示意图。

图3为一种枯草芽孢杆菌DC27在纤维蛋白平板上的活力示意图。

图4为一种枯草芽孢杆菌DC27菌体在光学显微镜下的革兰氏染色照片示意图(1000×)。图5为尿激酶酶活与透明圈面积呈线性关系示意图。

具体实施方式

实施例1：

一种枯草芽孢杆菌DC27的获得：

1)初筛

从重庆市市售的5个豆豉样品中各取1g豆豉，加入到盛有4～6颗玻璃珠的100mL无菌生理盐水的三角瓶中，150r/min，37℃的摇床上振荡20min，然后于80℃水浴10min后，4000r/min离心5min。收集上清液，取1mL处理液加入9mL无菌蒸馏水分别稀释5个梯度(10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5)，分别吸取0.1mL涂布于酪蛋白初筛培养基平板上，37℃倒置培养18h后取出，观察平板，挑取初筛平板上透明圈直径与菌落直径比值较大的菌株，转接到LB平板上进行划线纯培养，将得到的纯培养菌株接种到LB斜面培养基上培养，37℃培养24h，于4℃冰箱保存备用。经初筛培养基初筛，筛选出36株疑是产豆豉纤溶酶高活性的菌株。

初筛培养基：酪蛋白0.4％，NaCl 0.5％，琼脂2％。

2)复筛

将初筛后保存于斜面上的菌株取一环接种到种子液，培养12h后转接到装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，接种量为2％，在180r/min，37℃的摇床上培养72h，将发酵液于4000r/min离心10min。采用纤维蛋白平板法进行豆豉纤溶酶酶活的测定。将纤维平板置于37℃的培养箱中培养18h后观察溶菌圈的大小，用游标卡尺测量溶解圈的直径和菌落的直径，通过计算并比较溶解圈的面积与菌落的面积的比值比较酶活高低。通过复筛培养基的筛选，筛选出2株活性较高的菌株。在血琼脂培养基上的溶血性试验选择纤溶活力高且安全的菌株DC27。

复筛培养基：葡萄糖1％，大豆蛋白胨1％，Na₂HPO₄ 0.2％，NaH₂PO₄ 0.1％,CaCl₂0.02％，MgSO₄ 0.05％，pH7.0，115℃灭菌15min。

血琼脂培养基：蛋白胨1％，酵母膏0.3％，NaCl 5％，Na₂HPO₄ 0.5％，甘露醇1％，新鲜的人血5％～10％，琼脂1.5％，结晶紫10ppm，pH8.0。

3)菌种的生理生化和分子生物学鉴定

将筛选到的菌株DC27根据伯杰氏细菌学鉴定手册以及常见细菌系统鉴定手册(东秀珠&蔡妙英，1999)进行生理生化鉴定。

将菌株DC27活化，转接于LB平板上用于菌落PCR扩增。PCR上游引物为27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物为1492R:5′-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3′。引物由上海英骏公司合成。菌落PCR配制体系(50μL)：10×PCR buffer(含Mg²⁺)5μL，Taq酶0.5μL，dNTP(25mmol/L)4μL，27F(50pmol/L)1μL，1492R(50pmol/L)1μL，DNA 1μL，ddH₂O 37.5μL。在配制好的体系中加入用枪头挑取的少量菌体，混匀，设置PCR程序为：94℃预变性10min，94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环，72℃延伸10min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，并送至英潍捷基(上海)公司进行测序。将所测得的序列与GenBank中16SrDNA序列进行blast相似性分析比对。根据形态学、生理生化鉴定、16sRNA初步确定为枯草芽孢杆菌。

再通过特异PCR扩增出枯草芽孢杆菌DC27的纤溶酶基因，确定DC27为枯草芽孢杆菌。该菌株已于2015年9月23日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DC27，保藏编号：CCTCC NO：M 2015573，地址：中国武汉大学。

实施例2：

纤溶酶活力的测定，采用纤维蛋白平板法，步骤如下：

1)制作纤维蛋白平板

参照Astrup法(Astrup，1952)稍加修改。称取琼脂糖0.150g溶于10mL0.06mol/L的PBS磷酸缓冲液中，沸水浴溶解，溶解过程中不断的摇匀，使琼脂糖能完全溶解，溶解液呈现透明状为最佳，称取0.015g纤维蛋白原溶于10mL 0.06mol/L的PBS磷酸缓冲液中，将溶解后的琼脂糖和纤维蛋白原以及凝血酶分别放于50℃水浴锅中预热5min，然后将1mL的凝血酶加入到琼脂糖中用手轻轻的晃动，将其完全混匀后迅速倒入纤维蛋白原溶液中，混合均匀后将液体缓慢倒入干净的直径为9cm的平板中。平板在自然温度下凝固5min后放入37℃培养箱中凝固30min，再放入80℃的烘箱中30min，将平板缓慢的取出防止平板晃动造成平板凹凸不平影响实验效果，冷却到室温后放入4℃冰箱中备用，现配现用时间不宜过长。用直径为2mn的杜氏小管(用前用紫外线杀菌15min)在纤维蛋白平板上打孔，用微量注射器将打孔部分的凝固物取出，同时将孔内的水分吸出。

2)制作尿激酶标准曲线

将尿激酶标准品(60000IU/mg)用灭菌的生理盐水梯度稀释为6000，3000，1000，800，400，200和100IU/mL，以100IU/mL为原液再配制浓度分别为10，20，40，60和80IU/mL的尿激酶标准品。取标准品10μL加入到小孔内，盖好盖子放于37℃的培养箱中培养18h后，用游标卡尺测量透明圈的直径，以透明圈的面积为横坐标，以尿激酶的酶活为纵坐标作尿激酶的标准曲线。

3)样品的制备与酶活测定

将活化的DC27菌株的斜面接种到种子培养基中，培养12h转接至发酵培养基中，发酵72h后得到DC27菌株的发酵液。发酵液于4℃，8000rpm离心10min得到上清液。取上清液10μL加入小孔内，盖好盖子放于37℃的培养箱中培养18h，用游标卡尺测量透明圈的直径，再根据尿激酶标准曲线计算样品的纤溶酶活力。

实施例3：

菌株的保藏

采用甘油冷冻保藏法。首先用火焰灭菌的接种环取1环斜面菌种，在平皿上划线分离单菌落，平皿倒置于37℃恒温培养箱，培养24～48h，至单菌落的大小为3mm左右，挑取一个单菌落，接种于装有50mL LB培养基的三角瓶中，37℃振荡培养10～15h，至菌密度OD₆₀₀为1.0～1.5。然后用火焰灭菌的接种环取少量种子液，涂片后，作革兰氏染色，在显微镜下观察菌体的形态，及是否有杂菌。最后按1:1(v/v)的比例在菌液中加入30％甘油(已灭菌)，混合后分装至灭菌的菌种保存管中，1～2mL/管，于-80℃或液氮保存。

实施例4：

枯草芽孢杆菌DC27在采用摇瓶制备纤溶酶中的应用，应用过程包括：

1)将筛选得到的枯草芽孢菌菌株DC27转接到LB斜面培养基上，37℃活化24h。用接种环挑选1环的菌苔接种到液体种子培养基中(装液量50mL/250mL)，于37℃，150r/min的条件下培养12h。

液体种子培养基配方包括：蛋白胨1％，牛肉膏0.5％，NaCl 0.5％，以上百分比为质量体积比，pH 7.2～7.4，其余为水。

2)将处于对数生长期的种子液以2％(体积比)的接种量接种到液体发酵培养基(已灭菌)中，转速170r/min，装液量40mL/250mL，在37℃培养72h，发酵液上清酶活为到3185IU/mL。

所述的液体发酵培养基包括：玉米淀粉3％、大豆蛋白胨2％、Na₂HPO₄ 0.2％、NaH₂PO₄ 0.1％、CaCl₂ 0.02％、MgSO₄ 0.05％，pH8.0，115℃灭菌20min，以上百分比为质量体积比，其余为水。

实施例5：

枯草芽孢杆菌DC27在采用50L发酵罐制备纤溶酶中的应用，应用过程包括：

1)将筛选得到的枯草芽孢菌菌株DC27转接到LB斜面培养基上，37℃活化24h。用接种环挑选1环的菌苔接种到液体种子培养基中(装液量50mL/250mL)，于37℃，150r/min的条件下培养12h。

液体种子培养基配方包括：蛋白胨1％，牛肉膏0.5％，NaCl 0.5％，以上百分比为质量体积比，pH 7.2～7.4，其余为水。

2)将处于对数生长期的种子液以2％(体积比)的接种量接种到液体发酵培养基(已灭菌)中，发酵罐进气口压力0.25MPa，出气口压力0.05MPa，搅拌速率200r/min，装液量30L/50L，在37℃培养36h，发酵液上清酶活为4506IU/mL。

所述的液体发酵培养基包括：玉米淀粉3％、大豆蛋白胨2％、Na₂HPO₄ 0.2％、NaH₂PO₄ 0.1％、CaCl₂ 0.02％、MgSO₄ 0.05％，pH8.0，115℃灭菌20min，以上百分比为质量体积比，其余为水。

Claims (2)

1.一种枯草芽孢杆菌发酵生产纤溶酶的方法，包括：将处于对数生长期的枯草芽孢杆菌DC27种子液以2％的接种量接种到液体发酵培养基中，发酵罐进气口压力0.25MPa，出气口压力0.05MPa，搅拌速率200r/min，装液量30L/50L，在37℃培养36h；

所述的液体发酵培养基配方包括：玉米淀粉3％、大豆蛋白胨2％、Na₂HPO₄ 0.2％、NaH₂PO₄ 0.1％、CaCl₂ 0.02％、MgSO₄ 0.05％，pH8.0，115℃灭菌20min，其余为水；

所述的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DC27，保藏编号为：CCTCCNO：M2015573。

2.权利要求1所述方法制备的纤溶酶在制备含有纤溶酶药物中的应用。