CN113736684B - 一种利用西洋参内生菌发酵制备溶栓酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明从西洋参中分离出一株产溶栓酶的菌株——枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis sp.)CG1(保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072，保藏日期为2020年6月19日，保藏编号为CCTCC NO：M2020225)。菌株CG1的最佳产酶发酵条件为：温度32℃、时间37h、转速187r/min，在此发酵条件下，溶栓酶活力最大可达917.35IU/mL。纯化后的溶栓酶在3‑12pH范围内均具有活性，30‑45℃温度范围内稳定性良好，最适温度在40‑45℃，最适pH在7.5左右；Mn2+、Mg2+对酶活性具有显著的激活作用，是一种金属丝氨酸蛋白酶。该酶活性高，作用方式为直接溶解纤维蛋白，不能激活溶栓酶原间接溶解纤维蛋白，可有效避免由溶栓酶原激活剂引起的出血和溶栓亢进等副作用，为溶栓物质的开发提供了新的微生物资源和药源物质，并为西洋参内生菌功能开发开辟了新途径。
Description
技术领域
本发明涉及溶栓酶发酵领域，尤其是一种利用西洋参内生菌——枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis sp.)CG1发酵制备溶栓酶的方法。
背景技术
血栓性疾病是因为血液中纤维蛋白的不断堆积所造成的血管腔狭窄与闭塞，使体内出现缺血和梗塞而引发的功能障碍疾病，具有多发性，隐匿性，其致死率及其复发率极高。近年来，微生物源溶栓酶因其在血栓治疗中的潜在应用而受到广泛关注。
植物内生菌是一类特殊而重要的微生物，可产生大量具有多种生物学功能的代谢产物，可作为抗菌、降糖、抗癌和免疫抑制药物的良好来源，具有潜在的药用价值。西洋参(Panax quinquefolius L.)是名贵中药材，具有广泛的药理作用，涉及抗肿瘤、抗血糖、抗血栓、免疫调节、调节神经、抗氧化、抗疲劳等方面，其内生菌资源丰富，定植在健康西洋参组织中，但目前研究较少，且有关西洋参内生菌来源的溶栓酶研究未见报道。
本发明从西洋参中分离出一株高产溶栓酶的菌株，通过对其进行菌种鉴定，发酵工艺优化，并对其所产溶栓酶进行分离纯化和酶学性质研究，发现该菌株发酵所产溶栓酶活力高，对酸、碱、热稳定性好，最适温度和pH与人体的生理条件接近，可以适应人体的温度环境和胃酸环境，适合开发成口服溶栓药物；Mn2+、Mg2+对酶活性具有显著的激活作用，是一种金属丝氨酸蛋白酶。该酶的作用方式为直接溶解纤维蛋白，不能激活溶栓酶原间接溶解纤维蛋白，可有效避免由溶栓酶原激活剂引起的出血和溶栓亢进等副作用，这是该酶相对于临床上使用的溶栓酶原激活剂的一个特殊优势，有作为功能性食品或临床溶栓剂开发的潜力。
发明内容
本发明的目的是从西洋参中分离出一株产溶栓酶的菌株——枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis sp.)CG1及其在溶栓酶发酵中的应用。
本发明所采用的技术方案是：
枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis sp.)CG1，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072，保藏日期为2020年6月19日，保藏编号为CCTCC NO：M2020225；该菌株的主要生物学特征为：CG1接种在NA平板培养24h后，菌落呈白色，圆形，菌落不透明，边缘整齐，表面褶皱，菌落中央有突起；菌株呈单个菌体，直杆状且两端钝圆；革兰氏染色阳性；溶菌酶试验阴性、过氧化氢酶试验阳性；MR试验阴性，VP试验阳性；可利用葡萄糖、麦芽糖、木糖、甘露醇和山梨醇，不能利用乳糖、棉子糖和鼠李糖；能水解七叶苷、淀粉、尿素、果胶和明胶；能利用丙二酸盐和西蒙氏盐，并能还原硝酸盐。CG1可高效产溶栓酶，在温度32℃、时间37h、转速187r/min的产酶发酵条件下酶活力可达917.35IU/mL，纯化后的溶栓酶在3-12pH范围内均具有活性，30-45℃温度范围内稳定性良好，最适温度在40-45℃左右，最适pH在7.5左右；Mn2+、Mg2+对酶活性具有显著的激活作用，是一种金属丝氨酸蛋白酶。该酶的活性高，作用方式为直接溶解纤维蛋白，不能激活溶栓酶原间接溶解纤维蛋白，可有效避免由溶栓酶原激活剂引起的出血和溶栓亢进等副作用。该菌株经16S rDNA序列分析鉴定为Bacillussubtilis属，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis sp.)CG1，Genbank登陆号为MK208685.1。
所述菌株CG1的分离方法按如下步骤操作：
(1)菌株分离：取西洋参鲜根，去除须根，自来水冲洗5min，用滤纸吸干水分后，用75％乙醇浸泡1min，后用2％NaClO浸泡4min，再用50％乙醇冲洗30s，然后用无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸干根部表面水分，用无菌剪刀去除表皮及边缘组织后，剪成0.3cm×0.3cm的小块，等间距接入NA、PDA培养基中，分别于37℃、28℃恒温培养箱中倒置培养；
(2)菌株纯化和保藏：待根块边缘长出菌落后，挑取单菌落或孢子，接种于新的平板上培养，如此重复6次，得到单一菌落的内生菌平板；将分离纯化得到的内生菌接种至对应的斜面培养基中，待菌落完全长出后，保存于4℃冰箱；
(3)菌株筛选
初筛：将西洋参内生菌点在初筛平板上，28℃培养2-4天，选取产生透明圈的菌株用于复筛；所述初筛平板为脱脂奶粉50.0g/L溶于蒸馏水中，115℃灭菌15min；琼脂粉15.0g/L溶于蒸馏水中，121℃灭菌20min，冷却后混合均匀，取20mL倒入平板凝固而成；
复筛：将初筛选出的菌株用接种环挑取单菌落接种至装有50mL种子培养基的150mL三角瓶中，30℃、180r/min恒温震荡培养12h，制备种子液；取2％(v/v)种子液接种至装有50mL发酵培养基的150mL三角瓶中，30℃恒温震荡培养48h，发酵液在4℃、10000r/min条件下离心10min，取上清液备用；用直径3mm的打孔器打孔纤维蛋白平板，取10uL上清液注入孔中，以无菌生理盐水做对照，将纤维蛋白平板置于37℃恒温培养箱孵育18h后取出观察是否有透明圈产生，根据透明圈直径计算发酵液溶栓酶活力，筛选获得产溶栓酶的菌株。
利用所述菌株CG1发酵制备溶栓酶按如下步骤操作：
(1)斜面培养：将菌株CG1接种于牛肉膏蛋白胨(NA)培养基中，于37℃恒温培养24-48h，待菌落完全长出后，获得菌体斜面；
(2)种子培养：从步骤(1)菌体斜面上挑取菌体接种至种子培养基中恒温震荡培养12-18h，制得CG1种子液；
(3)发酵产酶：将步骤(2)获得的种子液接入发酵培养基中；于28-38℃，150-200r/min的条件下，震荡发酵培养32-42h，获得CG1溶栓酶粗酶液。
作为优选，利用所述菌株CG1发酵制备溶栓酶按如下步骤操作：
(1)斜面培养：将菌株CG1接种于牛肉膏蛋白胨(NA)培养基中，于37℃恒温培养37h，待菌落完全长出后，获得菌体斜面；
(2)种子培养：从步骤(1)菌体斜面上挑取菌体接种至种子培养基中恒温震荡培养15h，制得CG1种子液；
(3)发酵产酶：将步骤(2)获得种子液接入发酵培养基中，于32℃，187r/min的条件下，震荡培养37h，获得CG1溶栓酶粗酶液。
所述溶栓酶的分离纯化工艺按如下步骤操作：
(1)硫酸盐沉淀：取100mL粗酶液缓缓添加硫酸铵固体至终饱和度为30％，在冰浴条件下用磁力搅拌器低速搅拌，待硫酸铵固体充分溶解后取出，于4℃冰箱静置12h，以4℃、12000r/min条件离心20min，取上清液；上清液添加硫酸铵固体至终饱和度为70％，在冰浴条件下用磁力搅拌器低速搅拌直至固体溶解，4℃冰箱静置12h后于相同条件离心，弃上清液,将沉淀溶解于适量Tris-HCl中，保存于4℃冰箱待用；
(2)透析脱盐：将步骤(1)所述溶栓酶沉淀溶解于适量20mmol/L pH7.8的Tris-HCl缓冲液中；取1mL盐析样品注入透析袋，放入装有500mL透析液(20mmol/L pH7.8的Tris-HCl缓冲液)的烧杯中，磁力搅拌器缓慢搅拌；冰浴中持续8-14h，期间更换3-4次透析液；当用氯化钡溶液检测不到白色沉淀时，结束透析；
(3)离子交换层析
①装柱：设置报警压为0.5Mpa，系统流速为1mL/min，以滴对滴的方式将层析柱接入系统，以1mL/min流速平衡柱子，待电导、紫外的读数稳定后，调节UV基线为零；
②上样：选用1mL的上样环连接系统，透析液注入上样环，待层析柱充分平衡后，样品从上样环缓慢流入层析柱中，收集穿透峰，完成后关闭上样阀；
③洗脱：采用梯度洗脱法，设置B液终浓度为100％，时间为15min，开始洗脱；
④收集：选择按体积收集，每管收集1mL，收集洗脱锋；
(4)凝胶过滤层析：将20g Sephadex G-75凝胶悬浮于500mL加热过的20mmol/LpH7.8 Tris-HCl中，溶胀后一次性装入层析柱中，接入AKTA pure蛋白纯化系统，用20mmol/L pH7.8的Tris-HCl缓冲液平衡层析柱；基线稳定后，取2mL样品上样，上样流速为0.2mL/min；然后用pH7.8，含有0.3mol/L NaCl的20mmol/L pH7.8的Tris-HCl缓冲液以0.2mL/min的流速开始洗脱，收集洗脱锋。
所述溶栓酶，在3-12pH范围内均具有活性，30-45℃温度范围内稳定性良好，最适温度40-45℃，最适pH在7.5左右；Mn2+、Mg2+对酶活性具有显著的激活作用，是一种金属丝氨酸蛋白酶；该酶的活性高，作用方式为直接溶解纤维蛋白，不能激活溶栓酶原间接溶解纤维蛋白，可有效避免由溶栓酶原激活剂引起的出血和溶栓亢进副作用。
本发明与现有技术相比，有益效果主要体现在：本发明从西洋参中分离出一株产溶栓酶的菌株——枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis sp.)CG1，该菌发酵所产溶栓酶活力高，对酸、碱、热稳定性好，最适温度和pH与人体的生理条件接近，可以适应人体的温度环境和胃酸环境，适合开发成口服溶栓药物；Mn2+、Mg2+对酶活性具有显著的激活作用，是一种金属丝氨酸蛋白酶。该酶的作用方式为直接溶解纤维蛋白，不能激活溶栓酶原间接溶解纤维蛋白，可有效避免由溶栓酶原激活剂引起的出血和溶栓亢进等副作用，这是该酶相对于临床上使用的溶栓酶原激活剂的一个特殊优势，有作为功能性食品或临床溶栓剂开发的潜力。
附图说明
图1为本发明枯草芽孢杆菌CG1的菌落形态图；
图2为本发明枯草芽孢杆菌CG1基于16S rRNA基因序列的系统发育树图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：菌株的筛选与鉴定
(1)培养基
营养琼脂培养基(Nutrient Agar，NA)：蛋白胨10.0g/L，牛肉浸出粉3.0g/L，氯化钠5.0g/L，琼脂15.0g/L，溶解于蒸馏水中，121℃灭菌20min，每个平板倒入20mL，凝固后4℃保存备用；
马铃薯葡萄糖琼脂培养基(Potato Dextrose Agar，PDA)：马铃薯浸粉3.0g/L，葡萄糖20.0g/L，琼脂15.0g/L，溶解于蒸馏水中，121℃灭菌20min，每个平板倒入20mL，凝固后4℃保存备用；
初筛培养基：脱脂奶粉50.0g/L溶于蒸馏水中，115℃灭菌15min；琼脂粉15.0g/L溶于蒸馏水中，121℃灭菌20min，冷却后混合均匀，每个平板倒入20mL，凝固后4℃保存备用；
种子培养基(Luria-Bertani，LB)：NaCl 10.0g/L，胰蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，溶解于蒸馏水中，121℃高压灭菌20min，4℃保存备用；
发酵培养基：葡萄糖20.0g/L，蛋白胨20.0g/L，NaH2PO46.0g/L，Na2HPO42.0g/L，NaCl 10.0g/L，溶解于蒸馏水中，调pH为7.0，121℃灭菌20min；
溶栓酶活力测定相关溶液的配制：
0.04mol/L巴比妥钠-HCl缓冲液：8.24g巴比妥钠粉末溶于1000mL蒸馏水中，加入114.7mL0.2mol/LHCl混合均匀，调节pH至7.8，灭菌后使用；
2％琼脂糖溶液：2g琼脂糖粉末溶于100mL巴比妥钠-HCl缓冲液中，灭菌后使用；
3mg/mL纤维蛋白原溶液：150mg纤维蛋白原粉末溶于50mL灭菌后巴比妥钠-HCl缓冲液中，使用时应现用现配；
纤维蛋白原平板：取5mL保温在50℃的纤维蛋白原溶液，加入10mL50℃左右的琼脂糖溶液，接着加入100uL凝血酶溶液混合均匀，迅速倒入培养皿中，待凝固后放入4℃冰箱保存；
(2)菌株的分离
取西洋参鲜根，去除须根，自来水冲洗5min，用滤纸吸干水分后，用75％乙醇浸泡1min，后用2％NaClO浸泡4min，再用50％乙醇冲洗30s，然后用无菌水冲洗5次，并保留最后一次冲洗液涂布在培养基上，检验组织块表面是否无菌；用无菌滤纸吸干根部表面水分，用无菌剪刀去除表皮及边缘等组织后，剪成0.3cm×0.3cm的小块，等间距接入NA、PDA培养基中，分别于37℃、28℃恒温培养箱中倒置培养；
(3)菌株纯化和保藏：待根块边缘长出菌落后，挑取单菌落或孢子，接种于新的平板上培养，如此重复6次，得到单一菌落的内生菌平板；将分离纯化得到的内生菌接种至对应的斜面培养基中，待菌落完全长出后，保存于4℃冰箱；
(4)菌株筛选
初筛：将西洋参内生菌点在初筛平板上，每个试验做三个平行，28℃培养2-4天，选取产生透明圈的菌株用于复筛；所述初筛平板为脱脂奶粉50.0g/L溶于蒸馏水中，115℃灭菌15min；琼脂粉15.0g/L溶于蒸馏水中，121℃灭菌20min，冷却后混合均匀，取20mL倒入平板凝固而成；
复筛：将初筛选出的菌株用接种环挑取单菌落接种至装有50mL种子培养基的150mL三角瓶中，30℃、180r/min恒温震荡培养12h，制备种子液；取2％(v/v)种子液接种至装有50mL发酵培养基的150mL三角瓶中，30℃恒温震荡培养48h，发酵液在4℃、10000r/min条件下离心10min，取上清液备用；用直径3mm的打孔器打孔纤维蛋白平板，取10uL上清液注入孔中，以无菌生理盐水做对照，将纤维蛋白平板置于37℃恒温培养箱孵育18h后取出观察是否有透明圈产生，根据透明圈直径计算发酵液溶栓酶活力，筛选获得产溶栓酶的菌株；
(5)溶栓酶活力的测定
用灭过菌的0.04mol/L巴比妥钠-HCl缓冲液将标准尿激酶分别稀释至1000IU/mL、500U/mL、250IU/mL、125IU/mL、62IU/mL，分别在纤维蛋白原上点样10uL，每个浓度做3个平行，37℃恒温培养18h，用游标卡尺测量透明圈直径，计算透明圈直径乘积(A)，以透明圈直径乘积的对数(lgA)为横坐标，相应浓度的对数(lgC)为纵坐标，绘制尿激酶活力标准曲线；发酵液离心获得的粗酶液按照步骤(4)的方法测得透明圈直径，根据标准曲线计算发酵液溶栓酶活力，筛选获得产溶栓酶的菌株；
(6)目标菌株的鉴定
形态学鉴定：将纯化后的菌株接种在培养基上培养24h后取出，观察菌株的形态，该菌株的菌落形态如图1所示：
生理生化鉴定：根据蔡妙英所著常见细菌系统鉴定手册对目标菌株进行生理生化鉴定；
16S rRNA基因序列同源性分析：目标菌株DNA提取，PCR扩增及测序由生工生物工程(上海)股份有限公司进行；用BLAST工具将测序结果与GenBank基因库中的已知序列进行比对，选择同源性较高的序列用MAGA软件构建系统发育树，进行系统发育分析，系统发育树如图2所示：
CG1菌株的主要生物学特征为：CG1接种在NA平板培养24h后，菌落呈白色，圆形，菌落不透明，边缘整齐，表面褶皱，菌落中央有突起；菌株呈单个菌体，直杆状且两端钝圆；革兰氏染色阳性；溶菌酶试验阴性、过氧化氢酶试验阳性；MR试验阴性，VP试验阳性；可利用葡萄糖、麦芽糖、木糖、甘露醇和山梨醇，不能利用乳糖、棉子糖和鼠李糖；能利用丙二酸盐和西蒙氏盐，并能还原硝酸盐。CG1可高效产纤溶酶，酶活力最大可达917.35IU/mL，纯化后的纤溶酶在3-12pH范围内均具有活性，30-45℃温度范围内稳定性良好，最适温度在40-45℃左右，最适pH在7.5左右；Mn2+、Mg2+对酶活性具有显著的激活作用，是一种金属丝氨酸蛋白酶；该酶的作用方式为直接溶解纤维蛋白，不能激活纤溶酶原间接溶解纤维蛋白，可有效避免由溶栓酶原激活剂引起的出血和溶栓亢进等副作用。该菌株经16S rDNA序列分析鉴定为Bacillussubtilis属，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis sp.)CG1。该菌株的Genbank登陆号为MK208685.1，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072，保藏日期为2020年6月19日，保藏编号为CCTCC NO：M2020225。
实施例2：枯草芽孢杆菌CG1在发酵制备溶栓酶中的应用
(1)斜面培养：将菌株CG1接种于牛肉膏蛋白胨(NA)培养基中，于37℃恒温培养37h，待菌落完全长出后，获得菌体斜面；
(2)种子培养：从步骤(1)菌体斜面上挑取菌体接种至种子培养基中恒温震荡培养15h，制得CG1种子液；
(3)发酵产酶：将步骤(2)获得种子液接入发酵培养基中，于32℃，187r/min的条件下，震荡培养37h，获得CG1溶栓酶粗酶液。
实施例3：枯草芽孢杆菌CG1产溶栓酶的分离纯化及酶学性质分析
(1)硫酸盐沉淀：取100mL粗酶液缓缓添加硫酸铵固体至终饱和度为30％，在冰浴条件下用磁力搅拌器低速搅拌，待硫酸铵固体充分溶解后取出，于4℃冰箱静置12h，以4℃、12000r/min条件离心20min，取上清液；上清液添加硫酸铵固体至终饱和度为70％，在冰浴条件下用磁力搅拌器低速搅拌直至固体溶解，4℃冰箱静置12h后于相同条件离心，弃上清液，将沉淀溶解于适量Tris-HCl中，保存于4℃冰箱待用；
(2)透析脱盐：将步骤(1)所述溶栓酶沉淀溶解于适量20mmol/L pH7.8的Tris-HCl缓冲液中；取1mL盐析样品注入透析袋，放入装有500mL透析液(20mmol/L pH7.8的Tris-HCl缓冲液)的烧杯中，磁力搅拌器缓慢搅拌；冰浴中持续8-14h，期间更换3-4次透析液；当用氯化钡溶液检测不到白色沉淀时，结束透析；
(3)离子交换层析
①装柱：设置报警压为0.5Mpa，系统流速为1mL/min，以滴对滴的方式将层析柱接入系统，以1mL/min流速平衡柱子，待电导、紫外的读数稳定后，调节UV基线为零；
②上样：选用1mL的上样环连接系统，透析液注入上样环，待层析柱充分平衡后，样品从上样环缓慢流入层析柱中，收集穿透峰，完成后关闭上样阀；
③洗脱：采用梯度洗脱法，设置B液终浓度为100％，时间为15min，开始洗脱；
④收集：选择按体积收集，每管收集1mL，收集洗脱锋；
(4)凝胶过滤层析：将20gSephadex G-75凝胶悬浮于500mL加热过的20mmol/LpH7.8 Tris-HCl中，溶胀后一次性装入层析柱中，接入AKTA pure蛋白纯化系统，用20mmol/L pH7.8的Tris-HCl缓冲液平衡层析柱；基线稳定后，取2mL样品上样，上样流速为0.2mL/min；然后用pH7.8，含有0.3mol/L NaCl的20mmol/L pH7.8的Tris-HCl缓冲液以0.2mL/min的流速开始洗脱，收集洗脱锋；
(5)SDS-PAGE检测蛋白纯度：分离胶浓度为12％，浓缩胶浓度为5％，凝胶使用考马斯亮蓝R250染色；SDS-PAGE电泳检测为单一条带，纯化酶达到电泳纯，分子量约为27Kda。整个分离过程中，溶栓酶产率为25.75％，比活力为2754.69IU/mg，纯化倍数为27.85倍。
经酶稳定性测试试验表明，该酶在3-12pH范围内均具有活性，30-45℃温度范围内稳定性良好，最适温度在40-45℃左右，最适pH在7.5左右,与人体的生理条件较为接近，可以适应人体的温度环境和胃酸环境，具有开发成口服溶栓药物的潜能；Mn2+、Mg2+对酶活性具有显著的激活作用，是一种金属丝氨酸蛋白酶。该酶的作用方式为直接溶解纤维蛋白，不能激活溶栓酶原间接溶解纤维蛋白，可有效避免由溶栓酶原激活剂引起的出血和溶栓亢进等副作用，这是该酶相对于临床上使用的溶栓酶原激活剂的一个特殊优势，有作为功能性食品或临床溶栓剂开发的潜力。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未脱离本发明原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应视为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis sp.)CG1，其特征在于,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2020225。
2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis sp.)CG1在发酵制备溶栓酶中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的应用按如下步骤操作：
(1)斜面培养：将菌株CG1接种于牛肉膏蛋白胨(NA)培养基中，于37℃恒温培养24-48h，待菌落完全长出后，获得菌体斜面；
(2)种子培养：从步骤(1)菌体斜面上挑取菌体接种至种子培养基中恒温震荡培养12-18h，制得CG1种子液；
(3)发酵产酶：将步骤(2)获得的种子液接入发酵培养基中，于28-38℃，150-200r/min的条件下，震荡发酵培养32-42h，获得CG1溶栓酶粗酶液。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的应用按如下步骤操作：
(1)斜面培养：将菌株CG1接种于牛肉膏蛋白胨(NA)培养基中，于37℃恒温培养37h，待菌落完全长出后，获得菌体斜面；
(2)种子培养：从步骤(1)菌体斜面上挑取菌体接种至种子培养基中恒温震荡培养15h，制得CG1种子液；
(3)发酵产酶：将步骤(2)获得种子液接入发酵培养基中，于32℃，187r/min的条件下，震荡培养37h，获得CG1溶栓酶粗酶液。
5.如权利要求3或4所述的应用,其特征在于，CG1溶栓酶的分离纯化工艺按如下步骤操作：
(1)硫酸盐沉淀：取100mL粗酶液缓缓添加硫酸铵固体至终饱和度为30％，在冰浴条件下用磁力搅拌器低速搅拌，待硫酸铵固体充分溶解后取出，于4℃冰箱静置12h，以4℃、12000r/min条件离心20min，取上清液；上清液添加硫酸铵固体至终饱和度为70％，在冰浴条件下用磁力搅拌器低速搅拌直至固体溶解，4℃冰箱静置12h后于相同条件离心，弃上清液,将沉淀溶解于适量Tris-HCl中，保存于4℃冰箱待用；
(2)透析脱盐：将步骤(1)所述溶栓酶沉淀溶解于适量20mmol/LpH7.8的Tris-HCl缓冲液中；取1mL盐析样品注入透析袋，放入装有500mL透析液的烧杯中，透析液为20mmol/L、pH7.8的Tris-HCl缓冲液,磁力搅拌器缓慢搅拌；冰浴中持续8-14h，期间更换3-4次透析液；当用氯化钡溶液检测不到白色沉淀时，结束透析；
(3)离子交换层析
①装柱：设置报警压为0.5Mpa，系统流速为1mL/min，以滴对滴的方式将层析柱接入系统，以1mL/min流速平衡柱子，待电导、紫外的读数稳定后，调节UV基线为零；
②上样：选用1mL的上样环连接系统，透析液注入上样环，待层析柱充分平衡后，样品从上样环缓慢流入层析柱中，收集穿透峰，完成后关闭上样阀；
③洗脱：采用梯度洗脱法，设置B液终浓度为100％，时间为15min，开始洗脱；
④收集：选择按体积收集，每管收集1mL，收集洗脱峰；
(4)凝胶过滤层析：将20g Sephadex G-75凝胶悬浮于500mL加热过的20mmol/L、pH7.8的Tris-HCl中，溶胀后一次性装入层析柱中，接入AKTA pure蛋白纯化系统，用20mmol/L、pH7.8的Tris-HCl缓冲液平衡层析柱；基线稳定后，取2mL样品上样，上样流速为0.2mL/min；然后用pH7.8，含有0.3mol/L NaCl的20mmol/L、pH7.8的Tris-HCl缓冲液以0.2mL/min的流速开始洗脱，收集洗脱峰；
(5)SDS-PAGE检测酶蛋白纯度：分离胶浓度为12％，浓缩胶浓度为5％，凝胶使用考马斯亮蓝R250染色；SDS-PAGE电泳检测为单一条带，纯化酶达到电泳纯，分子量为27Kda。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述溶栓酶在pH 3-12范围内均具有活性，30-45℃温度范围内稳定性良好，最适温度40-45℃，最适pH在7.5；Mn2+、Mg2+对酶活性具有显著的激活作用，是一种金属丝氨酸蛋白酶；所述溶栓酶作用方式为直接溶解纤维蛋白，不能激活溶栓酶原间接溶解纤维蛋白。
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