JP2001238667A - 血栓溶解酵素及び粘質物を多量に生産する納豆菌株、その取得方法及びそれを用いて製造した納豆 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 納豆臭が少なく、かつ血栓溶解酵素活性が
高く、賞味期間中もこの活性をほぼ維持するとともに、
粘質物生産量が高くて旨味のある且つ糸引きが強い納豆
と、これを製造する納豆菌株およびその製造方法の提
供。 【解決手段】自然界に存在する稲藁で作った納豆を、生
埋食塩水に懸濁し、適宜希釈液を作製し、希釈液をバル
ビタール−アガロース−フィブリゲル平板培地に塗抹
し、平板に生育したコロニーの中から、コロニー周辺部
のフィブリンゲルを大きく溶解し透明域を形成している
コロニーを血栓溶解酵素高生産株として一次スクリーニ
ングする。次に、選出菌株を粘質物生産培地に塗抹し、
平板に形成されたコロニーの中から、粘質物を多量に生
産する株を血栓溶解酵素・粘質物高生産株として二次ス
クリーニングする。この工程により得られた納豆菌株Ｋ
Ａ−１４５で納豆を製造する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、血栓溶解酵素及び
粘質物を多量に生産する納豆菌株、その取得方法並びに
前記納豆菌株を用いて製造した納豆に関するものであ
る。

【０００２】

【従来の技術】蒸煮大豆に納豆菌を噴霧、醗酵させてで
きる納豆は、豊富で良質なたんぱく質やビタミン、ミネ
ラルなどの成分を含み、納豆の製造に使用する各種の納
豆菌が、特開平２−６５７７７号公報、特開平６−２６
１７４４号公報、特開平８−８０１８９号公報、特開平
８−２７５７７２号公報等で提案されている。そのう
ち、特開平６−２６１７４４号公報には、納豆菌の産生
する血栓溶解酵素（ナットウキナーゼ）が血栓症予防に
役立っているということが記載され、納豆の機能性も注
目をされている。従来から、納豆菌の特性である血栓溶
解酵素を多量に産生する納豆株を育種しようとする試み
がなされており、例えば、ヤマダフーズ社製の「おはよ
うキナーゼ納豆（商標）」やパンタス食品社製の「ナッ
トウキナーゼ六倍健康志向」などである。このような安
価で美味しい納豆は日本人にとって欠かせない健康食品
の一つといえる。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】納豆は、納豆菌が作り
出す血栓溶解酵素によって血栓症予防に効果があるが、
納豆によって血栓溶解酵素活性が異なるのは、納豆の酵
素生産能力の違いに負うところが大きいと考えられる。
このことから、従来の市販納豆菌を使用すると、同程度
の血栓溶解酵素を含む納豆しか生産されないことにな
る。

【０００４】また、従来の納豆菌株の育種は、菌株の維
持管理に厳しい温度管理が必要であったり、低温で長時
間醗酵を必要とするなど製造上の問題点があるだけでな
く、納豆製品の賞味期間中に血栓溶解酵素活性値が低下
したり、独特の納豆臭を呈するなどの課題も残されてい
る。

【０００５】また、納豆が有する特徴の一つに、高い粘
性と強い糸引きがあげられる。納豆菌は、大豆たんぱく
質を分解し、分解物を材料にポリ−γ−グルタミン酸を
合成し、この粘質物により、納豆中の旨味成分が引き出
され、また糸引きが充分な納豆らしい納豆を得ることが
できる。そのため、粘質物生産量の高い納豆菌株が必要
である。

【０００６】そこで、本発明は、従来の納豆とその製造
方法の問題点を解消するため、納豆臭が少なく、かつ血
栓溶解酵素活性が高く、賞味期間（１０日間）中もこの
活性をほぼ維持するとともに、粘質物生産量が高くて旨
味のあるかつ糸引きが強い納豆と、これを製造する納豆
菌株及びその製造方法を提供するものである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明の納豆菌株は、自
然界に存在する稲藁で作製した納豆からバチルス・ズブ
チリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に属
し、血栓溶解酵素を多量に生産するとともに、粘質物を
多量に生産する納豆菌株ＫＡ−１４５株を特徴とする。

【０００８】また、本発明の納豆菌株の取得方法は、平
板に生育した多数のコロニーの中から、血栓溶解酵素を
多量に生産するコロニーを一目で判定できる平板を利用
して前記納豆菌株を取得することを特徴とする。さら
に、本発明の納豆は、前記納豆菌株で製造し、血栓溶解
酵素生産量が高く、糸引きも充分で、低温で保蔵しても
血栓溶解酵素活性の低下が少なく、納豆臭の発生も少な
いことを特徴とする。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明による納豆菌株ＫＡ−１４
５株は、ＦＥＲＭＰ−１７６５９（１１生寄文第１６０
２号）として工業技術院生命工学工業技術院研究所に寄
託されている。

【００１０】また、本発明による納豆菌株の取得方法
は、バルビタールーアガロースーフィブリンゲル平板培
地の開発により、一段階でフィブリンゲル溶解酵素生産
力の高い菌をスクリーニングすることが可能となった。
この平板に生育した菌は、酵素生産能力に応じてコロニ
ー周辺のフィブリンゲルを溶解し、大きさの異なる透明
域を形成する。試料を同平板に塗抹し、大きな透明域を
形成したコロニーを選抜するだけで、酵素生産能の高い
コロニーを見いだすことができる。

【００１１】本発明の納豆菌の取得方法は、（１）自然
界より納豆菌の分離、（２）血栓溶解酵素高生産株のス
クリーニング、（３）粘質物高生産株のスクリーニング
の手順により酵素及び粘質物高生産株を選抜する。

【００１２】前記手順により選抜した酵素及び粘質物高
生産株により納豆を製造し、フィブリン寒天平板法及び
マイクロプレート法の二つの異なる方法で酵素活性を測
定した。また、粘質物の流下量により簡易粘度を測定し
た。

【００１３】さらに、遺伝学的手法（ＲＡＰＤ法）によ
り納豆菌株を分類同定した。

【００１４】また、パネラーにより納豆の官能検査を実
施した。

【００１５】

【実施例】（１）自然界より納豆菌の分離 熊本県阿蘇郡より得た稲藁で作製した藁苞に蒸煮大豆を
約１００ｇ包み、３７℃で３０時間醗酵後、４℃にて４
日間熟成した。

【００１６】（２）血栓溶解酵素高生産株のスクリーニ
ング 上記藁苞納豆１５粒を滅菌生埋食塩水１００ｍｌに懸濁
させ、懸濁液を適宜に希釈する。次に示すバルビタール
−アガロース−フィブリンゲル（Ｂａｒｂｉｔａｌ−Ａ
ｇａｒｏｓｅ−Ｆｉｂｒｉｎ ｇｅｌ）平板培地に滅菌
コンラージ棒で塗抹する。平板を３７℃で２０時間イン
キュベートし、平板に生育したコロニー周辺部のフィブ
リンゲル溶解面積を測定した。

【００１７】バルビタール−アガロース−フィブリンゲ
ル平板培地の組成は表１に示すとおりである。

【００１８】

【表１】 調整方法は、高圧滅菌した表１のＡ液とＢ液とを同量混
合し、これに加温溶解したアガロース溶液を１．２質量
％とフィブリノーゲン溶液を０．３質量％（いずれも最
終濃度）となるように添加する。あらかじめトロンビン
溶液（１２．５Ｕ／ｍｌ）０．５３ｍｌを入れた滅菌シ
ャーレに上記混合液を１３．２ｍｌ加え、アガロースが
ゲル化する前に時計方向、逆方向に動かして撹拌、静置
して平板とした。

【００１９】上記方法により、平板に生育したコロニー
の中からフィブリンゲルを溶解し、大きな透明域を形成
しているコロニー５８個を取得した。

【００２０】（３）粘質物高生産株のスクリーニング 糸引きの高い納豆を製造するために、選抜した株を次に
示す粘質物生産培地に、適宜希釈液を滅菌コンラージ棒
で塗抹する。平板を３７℃で１８時間インキュベート
し、コロニーを形成させた。粘質物生産培地の組成は表
２のとおりである。

【００２１】

【表２】 上記平板に生育したコロニーの中から、コロニー内に粘
質物を蓄積し不定形に隆起したコロニーを選抜した。コ
ロニー内に蓄積した粘質物をパスツールピペットで吸い
出し、その重量から粘質物生産量を簡易的に比較した。
従来から使用している宮城野株より１．８倍以上粘質物
を生産する新規分離株１０株を、酵素及び粘質物高生産
株として得た。

【００２２】次に本発明の納豆菌による納豆の製造方法
について説明する。

【００２３】中国産大豆１ｋｇを水で洗浄した後、約１
５℃の水道水に１５時間浸漬し水切り後、１．２ｋｇ／
ｃｍ^２で７０分間蒸煮した。これに、選抜した納豆菌の
胞子懸濁液（１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を蒸煮大豆
に対して１質量％噴霧し、よく混合した後、納豆製造用
容器（ポリスチレン製、５０ｇ用）に５０ｇずつ計量し
た。小孔を有するポリエチレン製フィルムで被覆し蓋を
閉め、４０℃で１８時間醗酵させ、その後４℃で２４時
間熟成させた。得られた試料納豆と、市販納豆Ｍ社（当
社従来品）、Ｐ社、Ｔ社、Ａ社の各市販納豆の血栓溶解
酵素活性を測定し比較した。

【００２４】納豆の血栓溶解酵素活性は、フィブリン寒
天平板法とマイクロプレート法の二種類の方法で測定し
た。なお、フィブリン寒天平板法は、太田らの方法にし
たがった｛太田、三浦、戸沢、「臨床血液」、１３
（５），７９３〜７９９（１９７２）参照｝。納豆の血
栓溶解酵素活性の測定方法を以下に示す。なお、二種類
の方法に供する納豆からの粗酵素溶液の取得は、納豆３
ｇに７倍容の生理食塩水を添加し、３０℃で３０分間回
転振とうし、酵素を抽出した。抽出液をガーゼで濾過
し、１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄みを
粗酵素溶液として活性測定に用いた。

【００２５】（１）フィブリン寒天平板法による測定 １）平板の作製 アガロース２ｇを０．１ｍｏｌバルビタール−ＨＣｌ緩
衝液（ｐＨ７．８）１００ｍｌに懸濁後、１２１℃で５
分間加熱して溶解する。一方、フィブリノーゲン１１２
ｍｇを０．１ｍｏｌバルビタール−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ
７．８）４２ｍｌに溶解させた後、ガーゼで濾過した。

【００２６】５０℃に保温しておいたアガロース溶液８
ｍｌとフィブリノーゲン溶液３ｍｌを滅菌シャーレに加
え、気泡が生じないように撹拌し、静置した。

【００２７】平板が固まったら、トロンビン溶液（５Ｕ
／１．５ｍｌ）１．５ｍｌを流し込み、表面を均一に浸
らせた。次に、気泡が入り込まないように滅菌円形濾紙
をのせ、４℃の冷蔵庫に入れて５時間以上水平に保持し
た平板を活性測定に使用した。

【００２８】２）酵素活性の測定 濾紙を取り除いた平板にピペットを用いて外径２ｍｍの
孔をあけ、試料溶液を２μｌ入れた後、ふたをして３７
℃で１８時間インキュベートした。

【００２９】平板を取り出し、図１に示すフィブリンゲ
ルが丸く透明に溶解している部分の直径を測定する。径
の２乗値をフィブリンゲル溶解面積とし、酵素活性値と
した。フィブリン平板は半透明であるため、溶解部分と
の境界線が分かり難いので、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｒ
ｉｌｌｉａｎｔ ｂｌｕｅ色素溶液で平板を染色し、判
定しやすくした（図１参照）。また、あらかじめフィブ
リンゲル溶解面積（Ｃｌｅａｒ ｚｏｎｅ）とプラスミ
ン（Ｐｌａｓｍｉｎ（Ｕ／ｍｌ））から作成した検量線
に基づいてプラスミン単位に換算して表示できるように
した（図２及び図３参照）。

【００３０】上記測定方法に従って測定した結果、当社
従来品に対して血栓溶解酵素活性が２倍高い納豆菌株Ｋ
Ａ−１４５を得た。この納豆菌で製造した納豆は５℃で
１０日間保蔵していても、８０％の残存活性を示し、当
社従来品及び他社製品の５０ないし６０％に比べると、
高い残存率であった。各納豆のフィブリンゲル溶解面積
を表３に示す。

【００３１】

【表３】 （２）マイクロプレート法による測定 １）フィブリンゲルマイクロプレートの作製 ９６穴マイクロプレートの各穴にトロンビン（１２．５
Ｕ／ｍｌ）１０μｌと０．４％フィブリノーゲン溶液２
００μｌを加え、フィブリンゲルを作製する。８０℃で
３０分間保持し、フィブリンゲル中に混在するプラスミ
ンを失活させた後、一夜室温で放置したものを活性測定
に使用した。

【００３２】２）酵素活性の測定 マイクロプレートリーダー（ＩＷＡＫＩ ＷＥＬＬＲＥ
ＡＤＥＲ ＳＭＥ３４００）を吸光度６３０ｎｍ、３７
℃にセットした。５分間プレインキュベーションした
後、フィブリンゲル上に試料溶液を１００μｌ滴下して
酵素反応を開始し、５分毎に６０分までの吸光度を経時
的に測定した。横軸に反応時間、縦軸に吸光度をとり、
吸光度が直線的に減少している１０分から６０分の間の
吸光度の変化を酵素活性値とした。図４は時間と６３０
ｎｍにおける吸光度をグラフ化したもので、図５は蛋白
量（Ｐｒｏｔｅｉｎ）と５０分間の吸光度減少量（ΔＡ
６３０ｎｍ）を示すグラフである。

【００３３】この測定方法を用いても、本発明のＫＡ−
１４５株は、当社従来品に対してフィブリン平板法の測
定と同様に２倍高い酵素活性を示した。また、５℃で１
０日間保蔵しても８０％の残存活性を示した。結果を表
４に示す。

【００３４】

【表４】 次に納豆中の粘度測定について説明する。

【００３５】納豆をよくかき混ぜ粘りを出した後、ビー
カーに入れ、１０倍希釈になるように脱イオン水を加
え、納豆表面の粘質物が完全に取れるまで約１０分間ス
ターラーで撹拌した。これを濾し機で濾し、粘質物懸濁
液とした。次に２０ｍｌピペットで脱イオン水を計り、
１５秒間で流下した液量を測った。同様の操作を４回繰
り返し、平均値を求めた。粘質物懸濁液についても同様
の操作を行った。（脱イオン水の流下量／粘質物懸濁液
の流下量）×１００で求めた値を簡易粘度値とし、値に
応じて評価した。測定値の判定は表５のとおりである。

【００３６】

【表５】 上記方法を用いて粘度を測定した結果、本発明の納豆菌
株ＫＡ−１４５株を用いて製造した納豆の測定値は２５
８．７、宮城野株で製造した納豆（当社従来品）の１７
６．１に比べて高い粘性を示した。

【００３７】本発明のＫＡ−１４５株の菌学的性質につ
いて説明する。

【００３８】本発明のＫＡ−１４５株の生理・生化学的
性状を表６に示す。

【００３９】

【表６】 ＫＡ−１４５株は、グラム陽性、好気性、芽胞形成、運
動性を有する桿菌であった。オキシダーゼ、カタラー
ゼ、β−ガラクトシダーゼ活性が陽性で、クエン酸を利
用し、アセトインを産生し、ゼラチンを液化した。最小
培地では生育にビオチンを要求し、粘質物生産培地では
粘質物を生産した。ＫＡ−１４５株の性状は、対照とし
て用いた市販納豆菌（宮城野株、弥生株、高橋株、成瀬
株）の性状とはよく一致したが、枯草菌の基準株（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ^ＴＭａｒｂｕｒｇ）と
は、硝酸塩の還元、ビオチン要求性、粘質物生産が異な
っていた。これらの結果から、ＫＡ−１４５株は納豆菌
であると同定した。

【００４０】また、ＫＡ−１４５株は市販納豆菌４株と
炭水化物からの酸生成パターンがよく一致したが、枯草
菌とはアミグダリン、サリシン、セロビオース、βゲン
チオビオースが異なっていた。

【００４１】遺伝学的手法による納豆菌株の分類表６に
示したように、従来の生理・生化学的手法で納豆菌を
「株」レベルで分類することはむずかしい。しかし、遺
伝学的手法（ＲＡＰＤ法）を用いると、納豆菌を「株」
レベルで分類できる。

【００４２】ＲＡＰＤ法は、各種納豆菌から調製したＤ
ＮＡを鋳型とし、ＯＰＥＲＯＮ社の１０−ｍｅｒＫｉｔ
ｓをプライマーとしてＰＣＲ反応を行った後、増幅産物
を電気泳動することによりＤＮＡ断片の確認を行うもの
である。

【００４３】血栓溶解酵素を多量に生産するＫＡ−１４
５株は、市販納豆菌（宮城野株、弥生株、高橋株、成瀬
株）のいずれとも異なる泳動パターンを示し、市販納豆
菌とは遺伝的に異なる株であることが証明できた。図６
及び図７は泳動パターンを示し、オペロン社のプライマ
ーＡ−５及びプライマーＡ−８のＲＡＰＤパターンを示
す図である。

【００４４】また、これまでにも血栓溶解酵素産生能の
高い納豆菌株を用いた納豆が市販されている。そこで、
血栓溶解酵素産生能の高い納豆菌株を用いたヤマダフー
ズ社とパンタス食品社の納豆、旭松食品社の低臭化納豆
菌株を用いた納豆、フジッコ社の二段熟成製法納豆から
納豆菌を単離し、同様の方法でＤＮＡ断片の確認を行っ
たところ、それぞれ異なる泳動パターンを示した（図７
参照）。この結果から、ＫＡ−１４５株は遺伝的にも異
なる新規分離株であるといえる。

【００４５】納豆の官能評価 ＫＡ−１４５株を用いて作製した納豆を４℃、４８時間
冷蔵後、専門パネラー１０名により表７に示す項目につ
いて、 １．優良 ２．良 ３．普通 ４．やや悪い ５．悪い の５段階評価で官能評価を行った。また、比較例として
宮城野株を上記実施例と同様にして納豆を製造し、評価
を行った。評価値は各パネラーの平均で示した。

【００４６】

【表７】 官能検査の結果、同じ工程で納豆を製造したにもかかわ
らず、ＫＡ−１４５株で製造した納豆は、宮城野株で製
造した納豆よりも旨味が著しく増し、粘度も高く、くせ
のないあっさりとした納豆に仕上がった。また、５℃で
１０日間保蔵しても、納豆特有の納豆臭が少なく、旨味
のある納豆で、対象として宮城野株で製造した納豆に比
べると優れていた。また、総合評価では、１０名のパネ
ラーのうち、８名がＫＡ−１４５株で作製した納豆が官
能的に優れていると答えた。

【００４７】

【発明の効果】本発明の納豆菌株は、本出願人が従来か
ら使用していた宮城野株と比べて、血栓溶解酵素生産力
が２倍、粘質物生産力も１．８倍高かった。

【００４８】この新規納豆菌株を用いて製造した納豆
は、当社従来品よりも血栓溶解酵素活性が２倍高く、粘
度も１．５倍高かった。さらに官能的にも高い評価を示
したため、従来の納豆製造方法と同じやり方でも、本発
明の納豆菌株を用いることにより優れた品質の納豆を提
供することが可能となった。

【００４９】血栓症予防に効果があるといわれている量
の血栓溶解酵素を摂取するためには、従来の納豆では１
日１００ｇの納豆を食べる必要があるが、多様な食生活
を営む現代では、納豆だけで１００ｇ食べることは現実
的でない。しかし、本発明の新規納豆株で製造した納豆
では、Ｉ日５０ｇ食べるだけで同じ効果が得られる。納
豆１パックの重さが５０ｇであることから、１食のメニ
ューに加えるだけで、血栓症予防に効果があるといわれ
ている量の血栓溶解酵素を容易に摂取することが可能と
なる。

【図面の簡単な説明】

【図１】フィブリン寒天平板法による酵素活性を示す図
である。

【図２】プラスミン標準溶液によるフィブリンゲルの溶
解を示す図である。

【図３】プラスミン標準溶液によるフィブリンゲル溶解
面積の相関を示すグラフである。

【図４】マイクロプレート法による６３０ｎｍにおける
吸光度の減少を示すグラフである。

【図５】マイクロプレート法による検量線を示すグラフ
である。

【図６】オペロン社のプライマーＡー５のＲＡＰＤパタ
ーンを示す図である。

【図７】オペロン社のプライマーＡー８のＲＡＰＤパタ
ーンを示す図である。

【符号の説明】

１：平板 ２：孔 ３：フィブリンゲル溶解部分（透明域）

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B020 LB14 LC05 LK17 LP18 LY04 4B065 AA19X AC14 BA23 CA24 CA33 CA42

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕ
   ｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に属する納豆菌であって、血栓
   溶解酵素生産量及び粘質物生産量が高い納豆菌株ＫＡ−
   １４５株（ＦＥＲＭ Ｐ−１７６５９）。
2. 【請求項２】 高圧滅菌した下記のＡ液とＢ液とを同量
   混合し、これに加温溶解したアガロース溶液を１．２質
   量％とフィブリノーゲン溶液を０．３質量％（いずれも
   最終濃度）となるように添加し、あらかじめトロンビン
   溶液（１２．５Ｕ／ｍｌ）０．５３ｍｌを入れた滅菌シ
   ャーレに上記混合液を１３．２ｍｌ加え、アガロースが
   ゲル化する前に撹拌、静置して平板とし、該平板に生育
   したコロニー周辺部のフィブリンゲル溶解面積を測定し
   て、大きな透明域を形成しているコロニーを取得し、選
   抜した株を粘質物生産培地に移植し、コロニーの中か
   ら、コロニー内に粘質物を著量蓄積し不定形に隆起した
   コロニーを選抜することを特徴とする請求項１記載の納
   豆菌株ＫＡ−１４５株（ＦＥＲＭ Ｐ−１７６５９）の
   取得方法。 Ａ液 ０．２ｍｏｌ／ｌバルビタールナトリウム ５０ｍｌ ０．１ｍｏｌ／ｌＨＣｌ １３５ｍｌ ｐＨ ７．８ Ｂ液 ポリペプトン １．８ｇ 酵母エキス ０．３６ｇ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．１８ｇ 大豆抽出液 ３６ｍｌ 蒸留水 １４４ｍｌ ｐＨ ７．０
3. 【請求項３】 請求項１記載の納豆菌株ＫＡ−１４５株
   （ＦＥＲＭ Ｐ−１７６５９）を用いて製造された納
   豆。