JP5754009B1

JP5754009B1 - 糸引性低下納豆菌株及び該納豆菌株による納豆の製造方法と納豆

Info

Publication number: JP5754009B1
Application number: JP2014100932A
Authority: JP
Inventors: 雄司久保
Original assignee: IBARAKI PREFECTURAL GOVERNMENT
Current assignee: IBARAKI PREFECTURAL GOVERNMENT
Priority date: 2014-04-24
Filing date: 2014-04-24
Publication date: 2015-07-22
Anticipated expiration: 2034-04-24
Also published as: JP2015208319A; WO2015163120A1

Abstract

【課題】従来の納豆菌株では安定的に製造することが困難であった糸引きの弱い納豆を安定して製造できる糸引性低下納豆菌株及び該納豆菌株による納豆の製造方法と納豆を提供する。【解決手段】バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）に属する新規な微生物変異株であるバチルス・サブチリスＩＢＡＲＡＫＩｌｓｔ−１（受託番号：ＮＩＴＥＰ−０１８３６）である糸引性低下納豆菌株を用いることにより、味、食感及び風味は従来の納豆菌株と遜色なく、糸引きだけが弱い納豆が製造できる。【選択図】図１

Description

本発明は、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）に属する納豆菌株及びその用途に関する。特に、納豆菌の種菌メーカーが製造販売する従来の納豆菌よりも有意に糸引きが弱い納豆を製造することの出来る糸引性低下納豆菌株及び該納豆菌株による納豆の製造方法と納豆に関するものである。

納豆は、日本の伝統的な発酵食品で栄養価が高く食卓でも馴染み深い食品であり、蒸した大豆に納豆菌を植菌して発酵することで製造される。原料の一つである納豆菌は、大手メーカーが自社開発した物を除くと、全国で大きく３種類しか存在しない。その３種類の中で全国的に利用率が高いのは、有限会社宮城野納豆製造所が販売する宮城野菌である。納豆の最大の特徴に糸引きが挙げられる。しかしながら、介護の現場で納豆を給餌する際、粘りにより介護する側が食べさせにくいだけでなく嚥下困難者は誤嚥を引き起こす恐れがある。また、納豆をそのまま食べるだけはなく加工食材と見なした際も、粘りが邪魔になる。介護の現場や、加工食材として納豆を容易に利用する為には、納豆の糸が弱いことが求められる。

従来の納豆菌株を使用して納豆を製造すると、しっかりと糸を引く納豆が出来上がる。稀に糸引きの弱い納豆が出来たとしても、多くの場合は発酵中における温調の不具合による発酵不良などが原因である。したがって、糸引きの弱い納豆が安定して製造できれば、嚥下が容易になる為、介護食としての利用や、粘性が低くなり扱いが容易になることから加工食材として利用する需要が見込める。

糸引きの弱い納豆を製造する方法としては様々な方法が提案されている（例えば、特許文献１〜３を参照）。また、特許文献４には、バチルス・サブチリスＯＵＶ２３４８１株（ＦＥＲＭＢＰ−６６５９）型から薬剤変異法によって育種改良された納豆菌を用いて糸引性低下納豆を製造する方法が開示されている。

特開２０１１−９２０２７号公報特開７−２５５４０８号公報特開２００１−１２８号公報特許第４６４９２４４号公報

しかしながら、前記特許文献１に開示されている方法は、容器の工夫で糸引きの弱い納豆を製造するため、製造方法が通常の納豆と大きく異なる場合、納豆メーカーが既存設備で生産することが難しく、設備投資費用が問題になる。また、前記特許文献２に記載の方法も同様で、糊料の添加は製造の際の手間が増える問題点がある他、大豆と納豆菌以外の副原料を使用した納豆製品に対する消費者心理の問題も懸念される。前記特許文献３では原料に大豆ではなくおからを使用することで納豆の糸引きをなくす方法が開示されているが、この方法を用いると大豆の種子は原料に含まれない為、納豆の風味もなくなってしまう。特殊な設備投資を行わず糸引きの弱い納豆を製造する為には、糸引きが弱い納豆を作ることの出来る納豆菌が必要である。

一方、前記特許文献４には糸引きが弱い納豆を作ることの出来る納豆菌が開示されているが、この納豆菌は化学的な薬剤変異法によって育種改良されるものである。化学的な処理方法では処理条件によって変異する場所が変わったり、変異が親株の複数箇所で起こることがあり、育種改良後の納豆菌を用いて製造される納豆の糸引き性が安定しないという問題が発生する場合がある。

本発明は、従来技術の問題点を解決し、従来の納豆菌株では実現出来なかった糸引きの弱い納豆を安定して製造出来る新規の納豆菌株を提供するとともに、この新規な納豆菌株を用いて製造した納豆及びその製造方法を提供することを目的とする。

上記課題を解決するために、請求項１に記載の本発明は、バチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）に属する納豆菌変異株であって、粘性物質の生産量が少ない糸引性低下納豆菌株ＩＢＡＲＡＫＩ１ｓｔ−１株（ＮＩＴＥＰ−０１８３６）であることを特徴とする。

また、請求項２に記載の本発明は、糸引きが弱い納豆を製造しうることを特徴とする請求項１に記載の糸引性低下納豆菌株ＩＢＡＲＡＫＩ１ｓｔ−１株（ＮＩＴＥＰ−０１８３６）であることを特徴とする。

また、請求項３に記載の本発明は、請求項１又は２に記載の糸引性低下納豆菌株ＩＢＡＲＡＫＩ１ｓｔ−１株（ＮＩＴＥＰ−０１８３６）を用い、大豆を原料として納豆を製造することを特徴とする納豆の製造方法である。

また、請求項４に記載の本発明は、請求項３に記載の製造方法により得られる納豆であることを特徴とする。

本発明によれば、新規なバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）に属し、納豆の糸に当たるガンマポリグルタミン酸（γ−ＰＧＡ）を主体とする粘性物質の生産量が従来の納豆菌株よりも少ない糸引性低下納豆菌株（ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＩＢＡＲＡＫＩｌｓｔ−１）が提供される。該糸引性低下納豆菌株（ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＩＢＡＲＡＫＩｌｓｔ−１）は、納豆の製造に用いることができ、煮豆に植菌して発酵させることにより、粘りの少ない納豆を製造することが出来る。

本発明の糸引性低下納豆菌株（ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＩＢＡＲＡＫＩｌｓｔ−１）で製造した納豆をかき混ぜた状態の外観写真宮城野菌で製造した納豆をかき混ぜた状態の外観写真納豆の官能検査で用いた評価用紙を示す図

本発明の糸引性低下納豆菌株（ＩＢＡＲＡＫＩｌｓｔ−１）は、自然変異を利用して自然界から選抜するいわゆるスクリーニング法によって得ることができる。育種改良法としては、前記スクリーング法の他にも、薬剤変異法や紫外線等を用いる物理的変異処理法等が従来から知られているが、納豆菌株の物性又は特性の安定性が高いという点から、自然変異を利用して得られる本発明の納豆菌株が好適である。また、本発明の糸引性低下納豆菌株は、変異を起こさせるための処理が他の処理方法と比べて簡便であるという利点も有する。他方で、スクリーニング法は試行錯誤が多く、有効な特性を有する新規の納豆菌株を育種することが難しいという側面を持つ。しかしながら、本発明の糸引性低下納豆菌株（ＩＢＡＲＡＫＩｌｓｔ−１）は、以下に述べる分離及び培養の方法によって、粘性物質の生産量が従来の納豆菌株よりも少なくなる納豆菌変異株として新規に得られたものである。

以下に、本発明の糸引性低下納豆菌株（ＩＢＡＲＡＫＩｌｓｔ−１）の分離、培養及び用途について実施例によって詳しく説明する。

本発明の新規な納豆菌であるＩＢＡＲＡＫＩｌｓｔ−１は、次のようにして得たものである。市販スターター株である宮城野菌をきな粉平板培地（きな粉０．５％、塩化ナトリウム０．２％、グルコース０．１％、寒天１．５％）に植え３７℃で４８時間培養した。生育したコロニーを新たなきな粉平板培地に植え継ぎ３７℃で４８時間培養する作業を５回繰り返した。植え継ぎを繰り返し、きな粉平板培地で生育したコロニーを釣菌し、ＬＢ平板培地に植菌して３７℃で２４時間培養した。元のコロニーと形態が変化したコロニーを新たなＬＢ平板培地に植え継ぎ純粋培養を行った。

単離した細菌株全てについて納豆を試作した。単離した全ての候補株をシェファー平板培地（ニュートリエントブロス（Ｄｉｆｃｏ）１．２ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．０２５ｇ、塩化カリウム０．１ｇ、硫酸鉄７水和物０．０２７８ｍｇ、硝酸カルシウム４水和物２３．６ｍｇ、塩化マンガン４水和物０．１９８ｍｇ、寒天１．５ｇ、水１００ｍｌ）に塗布して３７℃で２日間培養して胞子化した。その後、胞子を収集して滅菌水に懸濁した。調整した胞子液の菌数を確認後、以下に示すようにして納豆を試作した。最初に、大豆を３倍量の水（２０℃）に１６時間浸漬した後、よく水を切り、０．１８ＭＰａの条件で３０分間蒸煮した。次に、蒸煮大豆１ｇに対して上記納豆菌の菌数が１０^３個となるように納豆菌胞子懸濁液を噴霧し、よく攪拌した。これを、発泡スチロール製の容器に所定量充填し、小孔のあるポリスチレン製フィルムで被覆して蓋をした。次に、３９℃、湿度９０％で１８時間発酵処理を行った後、２０℃、５０％であら熱を取り、５℃で１日以上冷蔵して熟成させ目的とする納豆を得た。その結果、通常では１８時間程度の発酵を行うが、それよりも長い時間発酵させても糸引きが弱い納豆が製造可能であった。製造した納豆について菌の被り、豆の硬さ、糸引きから、従来の納豆菌株よりも糸引きの弱い納豆菌株を選抜した。選抜した細菌株について、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の解析及びビオチン要求性試験を行い、その結果からバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）に属する納豆菌であることを確認した。これにより、本発明のバチルス・サブチリスＩＢＡＲＡＫＩｌｓｔ−１（ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＩＢＡＲＡＫＩｌｓｔ−１）を得た。この納豆菌変異株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、受託番号ＮＩＴＥＰ−０１８３６で寄託されたバチルス・サブチリスＩＢＡＲＡＫＩｌｓｔ−１（ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＩＢＡＲＡＫＩｌｓｔ−１）である。なお、納豆菌と納豆菌以外のバチルス・サブチリスとの相違は、納豆菌がビオチン要求性を示し、かつ粘質物産出能を有するのに対し、納豆菌以外のバチルス・サブチリスはこれらの特性を示さないことにある。

以上のようにして本発明のＩＢＡＲＡＫＩｌｓｔ−１を用いて製造した納豆をかき混ぜた状態の外観写真を図１に示す。また、市販納豆スターター株である宮城野菌で製造した納豆についてもかき混ぜた状態の外観写真を比較例として図２に示す。図１に示すように、本発明の納豆菌株（ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＩＢＡＲＡＫＩｌｓｔ−１）で製造した納豆の場合は、γ−ＰＧＡ量が少なく、かき混ぜても全体がまとまることがないことが確認できる。一方、宮城野菌で製造した納豆は、図２に示すように、見た目にγ−ＰＧＡが多いことが確認でき、また粘りが強いため中央にまとまっていることが分かる。そこで、本発明のＩＢＡＲＡＫＩｌｓｔ−１及び市販納豆スターター株である宮城野菌を用いてそれぞれ製造した納豆について、生成するγ−ＰＧＡの量を比較した。

γ−ＰＧＡを主成分とする粘性物質の量測定法は、次の通りである。ＩＢＡＲＡＫＩｌｓｔ−１と宮城野菌を用いて、前記と同じ方法で胞子化と納豆の製造を行い、サンプルとなる納豆を得た。納豆（約１３ｇ）を５０ｍｌの遠心チューブに秤量し、１ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ７．０）を５ｍｌ添加した。大豆表面をよく撹拌・洗浄した後、大豆試料に掛がる遠心力が８，７００×ｇとなる条件で、４℃で５分間遠心し、上清を新しい５０ｍｌの遠心チューブに分取する作業を３回繰り返し、水溶性成分を回収した。回収した水溶性成分を、遠心力８，７００×ｇの条件で、４℃で２０分間遠心し、上清を回収する作業を２回繰り返した。得られた上清１０ｍｌに９９．５％エタノール２５ｍｌを添加した。さらに、遠心力８，７００×ｇの条件で、４℃で１０分間遠心し、γ−ＰＧＡを回収した。回収した粘性物質を減圧乾燥後、重量を測定した。尚、試験は３連で行い、平均値と標準偏差を算出して比較を行った。

その結果、宮城野菌が納豆１ｇ当たりの粘性物質が１５．３±０．４ｍｇであるのに比べてＩＢＡＲＡＫＩｌｓｔ−１では１１．５±０．６ｍｇとなっていた。つまり、ＩＢＡＲＡＫＩｌｓｔ−１の粘性物質生産量は宮城野菌に比べて約２５％減少していることが明らかになった。このことからＩＢＡＲＡＫＩｌｓｔ−１は宮城野菌よりも粘りの少ない納豆を製造できることが確認された。

納豆の粘性を調べる為に、ラピッドビスコアナライザーＲＶＡ−４（ＮＥＷＰＯＲＴＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を用いて、宮城野菌と本発明納豆菌を用いて製造した納豆のかき混ぜ抵抗を測定した。具体的には次のとおりである。納豆そのもののかき混ぜ抵抗は粘度が高すぎて測定不可能である為、納豆１０ｇに水１ｍｌを添加して測定サンプルを調製した。かき混ぜ抵抗を測定するパドル及びカップはＲＶＡ−４専用のものを用いた。回転数を毎分１８０回転、サンプル温度を２０℃、測定時間２分で最高粘度の測定を行った。尚、測定は４連で行い、平均値と標準偏差を算出して比較を行った。

その結果、宮城野菌では混ぜ抵抗が５８２±２７ＲＶＵだったのに対し、ＩＢＡＲＡＫＩｌｓｔ−１では２０１±４９ＲＶＵという結果となり、ＩＢＡＲＡＫＩｌｓｔ−１で製造した納豆をかき混ぜた際の最高粘度は宮城野菌で製造した納豆に比べ６５％以上低下したことが明らかになった。この結果から、宮城野菌で製造した納豆に比べて、ＩＢＡＲＡＫＩｌｓｔ−１で製造した納豆は、捌けが良く、取り扱いや食べるのが容易であることが示唆された。

本発明の糸引性低下納豆菌株（ＩＢＡＲＡＫＩｌｓｔ−１）及び市販納豆スターター株である宮城野菌を用い、前記と同じ方法で製造して得られた納豆について、官能試験を行った。なお、官能試験は、下記に示す方法により行った。

１０代から６０代以上の健康な男女３８名により、それぞれの納豆がどのようなものか情報を与えずに２種類の納豆について比較評価を実施した。評価は図３に示す評価表を用いて行った。図３に示すように、宮城野菌で製造した納豆を全ての評価項目において３点（普通）とし、その点数に対して本発明の納豆菌（ＩＢＡＲＡＫＩｌｓｔ−１）で製造した納豆の性状及び特性を比較する形で評価を行った。また、６つの評価項目を設定し、それぞれの項目について、宮城野菌で製造した納豆の方が良い（強い）、どちらも違いがない、本発明の納豆菌（ＩＢＡＲＡＫＩｌｓｔ−１）で製造した納豆の方が良い（強い）という三者択一の形式でも質問を行った。５点法による納豆の評価結果及び三者択一による納豆の評価結果として集計したものを、それぞれ下記の表１及び表２に示す。表１を見ると、糸引きの項目の評価結果は、宮城野菌の３点に対してＩＢＡＲＡＫＩｌｓｔ−１は１．５点であり、両者の違いが認識されていることが明らかになった。また、糸引き以外の項目では、菌の生え具合を示す「菌の被り」の項目を除き、宮城野菌と比較して遜色ないか、むしろ良い評価結果が得られた。また、表２を見ると、糸引きについて、３８人中３８人全員が宮城野菌の方が強いと回答した。つまり１００％の人が本発明のＩＢＡＲＡＫＩｌｓｔ−１の方で糸引きが弱いと感じられ、宮城野菌との間に差があることが明らかになった。また、食べやすいのがどちらかという質問については、宮城野菌で製造した納豆であると回答した者の数が６人であるのに対し、ＩＢＡＲＡＫＩｌｓｔ−１の方が食べやすいと回答した者は、その４倍の２４人であった。また、その食べやすさと扱いやすさから介護食として適しているのはどちらかという質問に対し、３８人中３２人の人がＩＢＡＲＡＫＩｌｓｔ−１の方が適していると回答した。このように、表１及び表２の評価結果から、本発明のＩＢＡＲＡＫＩｌｓｔ−１を用いて製造した納豆は、味を含めた品質では従来の納豆と比べて何ら遜色なく、糸引きが弱いという点のみで異なることが分かる。

次に、本発明の糸引性低下納豆菌株（ＩＢＡＲＡＫＩｌｓｔ−１）及び市販納豆スターター株である宮城野菌を用い、前記と同じ方法で製造して得られた納豆について、硬さと色の測定及び成分分析を行った。

納豆の硬さは、既報に従い（久保雄司ら、日本食品科学工学会誌、６０、５７７〜５８１（２０１３））測定した。具体的には、納豆試験法（納豆試験法研究会編）に記載の切断用のアダプター及びピークホールドタイプの重量計を用いて、５０粒分の納豆について、それぞれ短軸方向の切断強度（硬さ）を測定した。その最大値及び最小値から各１０粒分のデータを除き、中間３０粒の平均値及び標準偏差を算出して測定結果とした。その結果、宮城野菌で製造した納豆の硬さは、８８．９±９．５ｇであり、ＩＢＡＲＡＫＩｌｓｔ−１で製造した納豆は８５．２±８．７ｇであった。この結果を統計的に処理して、Ｐ値０．０５でｔ検定を行うと、０．１１９となる。この値は０．０５（Ｐ値）より大きいことから、両者の間で納豆の硬さには有意差がない。つまり、２つの菌株を用いて納豆を製造すると、ほぼ同じ硬さに仕上がることが測定データから確認された。

納豆の色は、分光式色差計ＳＥ−２０００（日本電色工業（株））を用いて測定を行った。１０粒分のＬ^※ａ^※ｂ^※測定値の平均値を算出して測定結果とした。その結果、宮城野菌で製造した納豆は、Ｌ^※値が５８．９７．ａ^※値が４．５５、ｂ^※値が１０．３２となり、一方、ＩＢＡＲＡＫＩｌｓｔ−１で製造した納豆は、Ｌ^※値が５５．１４、ａ^※値が５．４９、ｂ^※値が１１．９０となった。したがって、両者の納豆はほぼ同じ色合いになることが、データからも示された。

更に、納豆の有効成分として注目されるポリアミン（プトレスシン、スペルミジン、スペルミン）の分析を実施した。前記と同じ方法で納豆を製造して凍結乾燥した後、ミルミキサーで破砕した。サンプル１ｇに対し５％トリクロロ酢酸５ｍｌを添加してボルテックスミキサーにて混和した。遠心力８，７００×ｇの条件で、４℃で１０分間遠心分離し、上清を回収した。この作業を３回繰り返した後、メスアップして２５ｍｌとした。メスアップした抽出液５０μｌに６ｎｍｏｌ／ｍｌの１，７−ジアミノヘプタン／０．１Ｍ塩酸溶液を５０μｌ、炭酸ナトリウム飽和溶液を２００μｌ及び１０ｍｇ／ｍｌのダンシルクロライド／アセトン溶液を２００μｌ加え、ヒートブロックを用い７０℃で１５分間インキュベートした。１００ｍｇ／ｍｌのＬ−プロリン水溶液を２５μｌ加え、更に７０℃で５分間インキュベートした。トルエン５００μｌを加え、よく混合した後、上層５００μｌを抽出した。これを減圧乾燥後、アセトニトリル８００μｌに溶解し、０．４５μｍのメンブレンフィルターで濾過して分析サンプルとした。ポリアミンの分析は、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）により行った。移動層には１０ｍＭリン酸二水素アンモニウム（Ａ液とする）及びアセトニトリル（Ｂ液とする）を用いた。Ａ液とＢ液の比が４５：５５の状態からスタートして、分析時間中にＢ液の割合が直線的に高まる条件で分析を行った。その際の流速は０．９ｍｌ／分で一定にした。カラムはＯＤＳカラムを用い、カラムオーブンは５０℃に設定した。検出は蛍光検出器を用い、励起波長が３４０ｎｍで蛍光波長が５１５ｎｍとした。標準品を用いた検量線からサンプル中のポリアミン量を算出した。

納豆に含まれるポリアミン成分の分析結果を下記の表３に示す。ポリアミンを一切含まない合成培地で納豆菌を培養し、培養液中に含まれるポリアミン含量を分析した場合には、スペルミンは検出されない。納豆菌が主に生合成するのはスペルミジンである。表３の結果を見ると、宮城野菌に含まれるスペルミジン含量は乾燥納豆１ｇあたり、３０．５５±０．６５μｇであるのに対し、ＩＢＡＲＡＫＩｌｓｔ−１では３０．６２±０．２３μｇである。表３に示すように、納豆に含まれる有効成分においても、ＩＢＡＲＡＫＩｌｓｔ−１は市販スターター株である宮城野菌に引けをとらないことが明らかになった。

以上のように、本発明による糸引性低下納豆菌株（ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＩＢＡＲＡＫＩｌｓｔ−１）は、新規なバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）に属する納豆菌であり、納豆の糸に当たるガンマポリグルタミン酸（γ−ＰＧＡ）を主体とする粘性物質の生産量が従来の納豆菌株よりも少なくできるため、粘りの少なく、糸引きが弱い納豆を安定して製造することが出来る。このようにして製造される納豆は嚥下が容易になる為、介護食としての利用や、粘性が低くなり扱いが容易になることから加工食材として利用するときに大きな需要が見込める。

納豆菌株の受託番号

ＮＩＴＥＰ−０１８３６

Claims

バチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）に属する納豆菌変異株であって、粘性物質の生産量が少ない糸引性低下納豆菌株ＩＢＡＲＡＫＩ１ｓｔ−１株（ＮＩＴＥＰ−０１８３６）。
糸引きが弱い納豆を製造しうることを特徴とする請求項１に記載の糸引性低下納豆菌株ＩＢＡＲＡＫＩ１ｓｔ−１株（ＮＩＴＥＰ−０１８３６）。
請求項１又は２に記載の糸引性低下納豆菌株ＩＢＡＲＡＫＩ１ｓｔ−１株（ＮＩＴＥＰ−０１８３６）を用い、大豆を原料として納豆を製造することを特徴とする納豆の製造方法。
請求項３に記載の製造方法により得られる納豆。