CN105101813A - 豆浆发酵物 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题是提供一种具有与将牛奶进行乳酸发酵而得到的酸奶同等的风味和顺滑的物性的豆浆发酵物，就所述豆浆发酵物而言，在制造以豆浆为原料的发酵物时，即使在仅将嗜热链球菌(Streptococcus？thermophilus)和德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus？delbrueckii？subsp.bulgaricus)作为乳酸菌混合发酵剂的情况下，也不对作为原料的豆浆实施酶处理、提取处理等加工处理，并且也不添加糖源等原料。利用使用包含嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种的乳酸菌混合发酵剂而得到的豆浆发酵物来解决上述课题，所述嗜热链球菌在接种至豆浆中并进行培养时，能够在发酵物中蓄积0.4g/L以上的果糖，所述德氏乳杆菌保加利亚亚种在接种至豆浆中并进行培养时，能够在发酵物中蓄积0.4g/L以上的D-乳酸。

Description

豆浆发酵物
技术领域
本发明涉及一种通过将豆浆用乳酸菌发酵而得到的豆浆发酵物。
背景技术
大豆也被称为“田中之肉”，是含有丰富的植物性蛋白质的食品原材料，豆浆是利用热水等使蛋白质以外的成分从该大豆中溶出、并除去纤维质而得到的乳状饮料，作为低胆固醇、高蛋白质的健康原材料而一直受到瞩目。另外，通过使用同样作为健康原材料而受到瞩目的乳酸菌使豆浆发酵，也期待着由大豆和乳酸菌的协同效果而带来的健康功能。然而，现状是大豆独特的难闻气味或豆腥味、由乳酸菌产生的发酵气味或腌制品气味成为问题，难以渗透到市场中。
另一方面，在牛奶中，被FAO/WHO联合食品法典委员会(Codex委员会)制定的CODEX(以下称为“CODEX”)定义为酸奶用乳酸菌的嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)和德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)构建共生关系，这一直以来都是已知的。另外，也已知通过构筑这种共生关系，两个菌种的生长与单独发酵相比飞跃性地提高，结果产生风味良好的酸奶。
然而，已知在豆浆中，即使将嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种直接接种并发酵，也不会像牛奶那样充分地进行发酵，如果不增加向豆浆中添加乳糖等的操作，则难以利用乳酸的生成来形成物性良好的凝乳(curd)或产生良好的风味。其主要原因是，德氏乳杆菌保加利亚亚种无法同化(assimilation)豆浆所含的蔗糖，从而不能正常地进行乳酸发酵或使菌数增加。
迄今为止，已报道了许多利用乳酸发酵来制造风味良好的豆浆发酵物的方法。例如，有如下方法，即，通过将嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)、德氏乳杆菌保加利亚亚种、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、嗜热链球菌这5种乳酸菌混合，并且向无调整的豆浆中添加糖分、脂质、明胶，从而改善风味的方法(参见专利文献1)。
另外，还有下述通过向嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种中进一步加入不同的菌种、或将这些菌种替换为其他菌种，从而促进豆浆中的乳酸发酵、改善风味的各种报道，即，通过使用植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)及乳酸乳球菌这2种乳酸菌进行发酵来改善风味的方法(参见专利文献2)，使用嗜酸乳杆菌或干酪乳杆菌中的任一种和双歧杆菌(Bifidobacterium)属乳酸菌及德氏乳杆菌保加利亚亚种(至少3个菌种)进行发酵、得到改善了风味的豆浆发酵物的方法(参见专利文献3)，以及使用选自德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜酸乳杆菌中的1种菌株和干酪乳杆菌及嗜热链球菌这3种乳酸菌使豆浆发酵的方法(参见专利文献4)等。此外，还报道了为改善口感而向豆浆中同时加入糖及乳酸菌和蛋白酶并进行发酵的方法(参见专利文献5)。
专利文献
专利文献1：日本特开昭63-7743号公报
专利文献2：日本特开平5-184320号公报
专利文献3：日本特开平10-201415号公报
专利文献4：日本特开2011-167190号公报
专利文献5：日本特开平7-147898号公报
发明内容
但是，在上述现有技术中，由于不仅使用了作为由CODEX定义的酸奶用乳酸菌的嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种这2种乳酸菌，还使用了与上述乳酸菌种类不同的乳酸菌来发酵豆浆，因此，存在下述问题：产生来自该乳酸菌的杂味、腌制品气味等，或形成与将牛奶发酵而得到的酸奶大为不同的风味、物性。另外，由于使用3种以上的乳酸菌，因此还存在下述问题：各菌株的制造·管理变得非常繁杂，制造批次的品质保持变得困难的问题；调合大豆来源以外的食品原料、或在接种乳酸菌的同时添加酶等，使得加工方面的繁杂程度增加的问题。
因此，本发明要解决的课题在于，提供一种具有与将牛奶进行乳酸发酵而得到的酸奶同等的风味和顺滑的物性的豆浆发酵物，就所述豆浆发酵物而言，在制造以豆浆为原料的发酵物时，即使在仅将嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)和德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)作为乳酸菌混合发酵剂的情况下，也不对作为原料的豆浆实施酶处理、提取处理等加工处理，并且也不添加糖源等原料。
本申请的发明人们为解决上述课题而进行了深入研究，结果发现，在组合了作为由CODEX定义的酸奶用乳酸菌的嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种这2种乳酸菌的乳酸菌混合发酵剂中，通过组合能够在豆浆中蓄积0.4g/L以上的果糖的嗜热链球菌、和在与该嗜热链球菌组合时能够生成0.4g/L以上的D-乳酸的德氏乳杆菌保加利亚亚种，即使在豆浆环境中，两种双方的菌也与在奶环境中几乎同等程度地生长，可以得到具有与将牛奶进行乳酸发酵而得到的酸奶相近的风味、物性的豆浆发酵物，从而完成了本发明。
即，本发明提供(1)一种豆浆发酵物，是使用乳酸菌混合发酵剂而得到的，所述乳酸菌混合发酵剂包含：嗜热链球菌，其在接种至豆浆中并进行培养时，能够在发酵物中蓄积0.4g/L以上的果糖；和德氏乳杆菌保加利亚亚种，其在接种至豆浆中并进行培养时，能够在发酵物中蓄积0.4g/L以上的D-乳酸。
另外，本发明还提供(2)一种乳酸菌混合发酵剂，包含：嗜热链球菌，其在接种至豆浆中并进行培养时，能够在发酵物中蓄积0.4g/L以上的果糖；和德氏乳杆菌保加利亚亚种，其在接种至豆浆中并进行培养时，能够在发酵物中蓄积0.4g/L以上的D-乳酸。
根据本发明，可以提供一种风味·物性与将牛奶乳酸发酵而得到的酸奶同等程度地优异的豆浆发酵物，就所述豆浆发酵物而言，即使在以豆浆为原料、仅将嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种作为乳酸菌混合发酵剂时，也不对作为原料的豆浆实施酶处理、提取处理等加工处理，并且也不添加糖源等原料的。就本发明的类似酸奶的豆浆发酵物而言，由于不会令人感受到大豆发酵物特有的难闻气味，因此可以期待作为具有由大豆和乳酸菌的协同效果带来的优异功能的健康原材料而普及。
附图说明
图1是表示将育种的德氏乳杆菌保加利亚亚种(K1581菌株)和从市售混合发酵剂中分离并筛选而得的嗜热链球菌菌株或育种的嗜热链球菌菌株(K1580菌株)混合并接种至豆浆中，于42℃发酵24小时而得到的豆浆发酵物中的D-乳酸量的图。
图2是表示将育种的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株(K1585菌株)和从市售混合发酵剂中分离的嗜热链球菌菌株混合并接种至豆浆中，于42℃发酵24小时而得到的豆浆发酵物中的D-乳酸量的图。
图3是表示将育种的嗜热链球菌菌株(K1580菌株)和从市售混合发酵剂中分离的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株混合并接种至豆浆中，于42℃发酵24小时而得到的豆浆发酵物中的D-乳酸量的图。
图4是表示仅使用未进行育种、分离操作、筛选操作等的市售混合发酵剂(嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种的混合发酵剂)进行发酵(42℃、24小时)而得到的豆浆发酵物中的D-乳酸量的图。
图5是测定通过下述方法得到的发酵液中的D-乳酸生成量的图：利用MF超滤膜使无调整豆浆透过，向所得液体中添加1.0％(w/v)的果糖，得到豆浆膜透过液，将该豆浆膜透过液单独用德氏乳杆菌保加利亚亚种于42℃发酵24小时，得到发酵液。
图6是测定通过下述方法得到的发酵液中的D-乳酸生成量的图：利用MF超滤膜使无调整豆浆透过，向所得液体中添加1.0％(w/v)的果糖，并将pH调节为5.0，得到酸性豆浆膜透过液，将该酸性豆浆膜透过液单独用德氏乳杆菌保加利亚亚种于42℃发酵24小时，得到发酵液。
图7是测定通过下述方法得到的豆浆发酵物中的果糖浓度的图：使用从市售混合发酵剂(嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种的混合发酵剂)中分离的嗜热链球菌株于42℃发酵24小时，得到豆浆发酵物。
图8是测定通过下述方法得到的豆浆发酵物中的D-乳酸生成量的图：将从市售混合发酵剂YO-MIX305、499中分离的嗜热链球菌菌株和同样地从市售混合发酵剂YO-MIX505、511、863中分离的德氏乳杆菌保加利亚亚种以1：1的比例混合，于42℃发酵24小时，得到豆浆发酵物。
图9是表示单独使用作为育种的乳酸菌的嗜热链球菌K1580菌株于42℃对豆浆进行发酵时的蔗糖浓度的经时性推移的图。
图10是表示单独使用作为育种的乳酸菌的嗜热链球菌K1580菌株于42℃对豆浆进行发酵时的果糖浓度的经时性推移的图。
图11是表示使用作为育种的乳酸菌的嗜热链球菌K1580菌株和作为育种的乳酸菌的德氏乳杆菌保加利亚亚种K1581菌株于42℃对豆浆进行共发酵时的果糖浓度的经时性推移的图。
图12是表示使用市售混合发酵剂或育种菌株的混合发酵剂、或筛选菌株的混合发酵剂进行发酵而得到的豆浆发酵物的粒度分布的测定结果的图。
具体实施方式
以下，详细地说明本发明。
本发明的豆浆发酵物可如下得到：不对豆浆施加酶处理等特别的加工处理，而仅使用嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种这2种乳酸菌进行发酵。
作为本发明使用的豆浆，只要是利用以往的方法而得到的，则可以为任何豆浆，也可以使用市售的豆浆。例如，可以使用将脱皮的大豆或脱脂大豆浸渍于水中使其膨润、将已膨润的豆类蒸煮·磨碎而得到的液体，从味道、口感的观点考虑，更优选使用从该液体中除去了豆渣的液体。另外，也可以使用溶解有全脂大豆粉、脱脂大豆粉等的液体。JAS标准中，将大豆固态成分为8.0％以上的液体定义为豆浆，将大豆固态成分为6.0％以上的液体定义为调制豆浆，将大豆固态成分为4.0％以上的液体定义为豆浆饮料，但本发明关于大豆固态成分量没有特别限定。
本发明中使用的嗜热链球菌要求具有下述性质：能够在豆浆中增殖，单独在豆浆中增殖时，将豆浆中的蔗糖分解而生成葡萄糖和果糖，其中以0.4g/L以上的浓度蓄积果糖。
虽然德氏乳杆菌保加利亚亚种无法将豆浆所含的蔗糖作为糖源同化，但通过嗜热链球菌将蔗糖分解为葡萄糖和果糖，德氏乳杆菌保加利亚亚种将同化葡萄糖和果糖从而也能够增殖。
嗜热链球菌虽然在分解蔗糖的同时也摄入自分解产物作为糖源，但只要筛选分解能力特别高的菌株，分解产生的糖就会在发酵物中蓄积。如此一来，在蓄积的果糖的量超过0.4g/L的豆浆发酵物中，德氏乳杆菌保加利亚亚种良好地增殖，并且在增殖过程中生成各种代谢产物，从而在形成酸奶的风味方面起到重大作用。
如上所述，德氏乳杆菌保加利亚亚种的代谢对于将豆浆发酵成酸奶那样是重要的，而经其代谢生成的D-乳酸由于不被仅生成L-乳酸的嗜热链球菌生成，因此，可以有效地用作反映德氏乳杆菌保加利亚亚种的代谢活动的容易测定的指标。本发明中发现，由于德氏乳杆菌保加利亚亚种活跃地生成代谢产物，使得该D-乳酸量在发酵物中蓄积0.4g/L以上的发酵物的风味变得特别良好。
具有上述性质的乳酸菌可以从用于牛奶的酸奶制造的乳酸菌、环境中的同种乳酸菌中筛选。育种乳酸菌时，通常被广泛应用的手段全都可以利用。例如，通过进行使用紫外线的突变诱发、使用药剂的突变诱发、在以豆浆为主要成分的培养基中的传代培养等，能够得到在豆浆中蓄积0.4g/L以上的果糖的嗜热链球菌、在与其同时培养时显示出在豆浆中的高D-乳酸生成量(0.4g/L以上)的德氏乳杆菌保加利亚亚种。
实施乳酸菌的育种时，同时接种嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种，在30～45℃、较优选为32～42℃的发酵温度下，进行4～24小时的发酵，由此能够培育产酸能力高的菌株。
生成D-乳酸的乳酸菌为德氏乳杆菌保加利亚亚种，但由于其无法同化豆浆中的糖的主要成分即蔗糖，因此单独时无法增殖，有时也会死亡。另一方面，发明人们发现，嗜热链球菌多数可以同化蔗糖并在豆浆中以某种程度生长，此时，该乳酸菌通过分解蔗糖而生成葡萄糖和果糖，如果使德氏乳杆菌保加利亚亚种与其共存，则可以同化这些分解产物并缓慢生长。
为使德氏乳杆菌保加利亚亚种增殖，也可以考虑在豆浆中添加糖以作补充，但也有只补充糖时未显示出生成足量的D-乳酸的情况，并且，除糖的补充关系之外，还存在两种菌株的相容性，因此，选择在与蓄积果糖的嗜热链球菌共同培养时代谢活跃(以D-乳酸量计能够生成0.4g/L以上)的德氏乳杆菌保加利亚亚种是重要的。
通过从多数存在的嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种中筛选或育种适当的菌株的组合，两个菌种在豆浆中共同活化，从而可以形成类似酸奶的良好的风味、物性，嗜热链球菌大量同化蔗糖的结果是，该菌生成的L-乳酸也在发酵物中生成。
为了得到类似酸奶的良好的豆浆发酵物，需要不仅含有D-乳酸，而且也含有由嗜热链球菌生成的L-乳酸。
本发明中使用的乳酸菌可以如上所述利用筛选或育种得到，在本申请说明书的实施例中，嗜热链球菌K1580菌株和德氏乳杆菌保加利亚亚种K1581菌株的组合、嗜热链球菌K1584菌株和德氏乳杆菌保加利亚亚种K1585菌株的组合、嗜热链球菌DaniscoCo.,Ltd.制菌株(从混合发酵剂YO-MIX499分离的菌株)和德氏乳杆菌保加利亚亚种DaniscoCo.,Ltd.制菌株(从混合发酵剂YO-MIX505、511、863分离的菌株)的组合等即相当于此。本发明的豆浆发酵物由于可以通过使用具有上述性质的乳酸菌得到，因此并不限定于实施例记载的菌株。
关于将豆浆用乳酸菌发酵的方法，可以基于通常已知的酸奶、乳酸菌饮料的制法进行，例如，在豆浆中接种嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种，使得嗜热链球菌为1×104～1×108cfu/mL、更优选为1×105～1×107cfu/mL，使得德氏乳杆菌保加利亚亚种为1×102～1×107cfu/mL、更优选为1×103～1×105cfu/mL，于30～45℃、更优选为37～42℃的发酵温度，在4～24小时的范围内发酵即可，发酵形态没有特别限制。
这样得到的本发明的类似酸奶的豆浆发酵物，以含有0.4g/L以上的D-乳酸为特征，由于嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种的代谢均变得旺盛，所以显示出迄今在直接使用市售的乳酸菌混合发酵剂时无法得到的乳酸生成量，形成具有芳香成分(其源自各菌种)的、类似酸奶的风味和物性良好的豆浆发酵物。另外，由于可以不添加大豆来源以外的原料地进行发酵，因此，也不会被来自副原料的味道影响。此外，本发明的豆浆发酵物的通用性高，不仅可应用于类似酸奶的食品，而且也可以应用于调味料、奶酪、饮料形态等大豆相关饮食品中的任何制品。
需要说明的是，本实施方式中说明了仅使用嗜热链球菌及德氏乳杆菌保加利亚亚种这2种来制造乳酸发酵物的例子，但并不限定于此，只要不影响嗜热链球菌及德氏乳杆菌保加利亚亚种的乳酸发酵、所得的豆浆发酵物的风味，则除了本发明所示的2种乳酸菌之外，也可以并用嗜热链球菌及德氏乳杆菌保加利亚亚种以外的乳酸菌。
以下，通过实施例更具体地说明本发明。但是，本发明的技术范围不受这些例子的任何限定。
实施例
1.使用了市售的乳酸菌混合发酵剂的豆浆发酵物的D-乳酸量的测定
(1)乳酸菌混合发酵剂
作为乳酸菌混合发酵剂，使用市售的酸奶制造用乳酸菌混合发酵剂(DaniscoCo.,Ltd.制，含有嗜热链球菌菌株及德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株两者的冷冻干燥品。以下有时称为“市售混合发酵剂”)。该市售混合发酵剂根据嗜热链球菌菌株及德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株的性质而存在多种。具体而言，有YO-MIX300、YO-MIX305、YO-MIX496、YO-MIX499、YO-MIX505、YO-MIX511、YO-MIX863、YO-MIX883、YO-MIX885、YO-MIX401、YO-MIX421、YO-MIX495、YO-MIX601(均为产品编号)。
(2)发酵条件及测定方法
豆浆发酵原液使用市售的无调整豆浆(KikkomanSoyfoodsCompany制)。另一方面，将各乳酸菌混合发酵剂的冷冻干燥物在10mL的LM17培养基(Terzaghi及Sandine,Appl.Microbiol.29,807～813,1975)中培养后，将培养液用0.9％NaCl溶液离心·清洗，再次悬浮在10mL的0.9％NaCl溶液中。将该制备的悬浮液以1.0％(v/v)的量接种在上述豆浆发酵原液中，于42℃发酵24小时。接着，经过24小时后结束发酵，利用酶电极法(王子计测机器株式会社制，生物传感器(Biosensor)BF-5)测定豆浆发酵物中的D-乳酸量。
(3)结果
结果示于图4。测定24小时发酵而得到的豆浆发酵物中的D-乳酸量，结果确认到几乎没有生成D-乳酸，没有得到所希望的具有类似酸奶的风味的豆浆发酵物。
2.供试菌株的分离、筛选及育种
(1)嗜热链球菌
从市售发酵剂(均含有嗜热链球菌及德氏乳杆菌保加利亚亚种2个菌种)中仅分离嗜热链球菌菌株。基于市售发酵剂的产品编号，将分离的菌株记作嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus：St.)45菌株、St.40菌株、St.505菌株、St.511菌株、St.863菌株、St.883菌株、St.885菌株、St.300菌株、St.305菌株、St.495菌株、St.496菌株、St.499菌株、St.187菌株、St.205菌株、St.207菌株、St.208菌株、St.211菌株、St.401菌株、St.421菌株、St.492菌株、St.601菌株。
从上述分离菌株中筛选下述嗜热链球菌菌株作为筛选菌株，所述嗜热链球菌菌株在将分离菌株的种菌以1％的比率接种至豆浆中，并于37～45℃培养12～24小时时，能够在发酵物中蓄积0.4g/L以上的果糖。具体而言，将嗜热链球菌(St.)40菌株、St.511菌株、St.863菌株、St.885菌株、St.496菌株、St.499菌株、St.187菌株、St.205菌株、St.401菌株、St.421菌株、St.492菌株、St.601菌株作为筛选菌株。
另外，将NIZOfoodresearch公司(其基地设置在荷兰)持有的嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)St.2333菌株和德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)Lb.185菌株接种至无调整豆浆(KikkomanSoyfoodsCompany制)中，进行传代培养。将豆浆发酵物以1％(v/v)的比率反复接种至豆浆中，于37～45℃培养12～24小时。实施约700代的传代培养，将从所得豆浆发酵物中分离的嗜热链球菌菌株作为K1580株。
进而，将同样由NIZOfoodresearch公司持有的嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)St.131菌株和德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)Lb.194菌株接种至无调整豆浆(KikkomanSoyfoodsCompany制)中，进行传代培养。将豆浆发酵物以1％(v/v)的比率反复接种至豆浆中，于37～45℃培养12～24小时。实施约700代的传代培养，将从所得豆浆发酵物中分离的嗜热链球菌菌株作为K1584株。
(2)德氏乳杆菌保加利亚亚种
从上述市售发酵剂中，仅分离德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株。基于市售发酵剂的产品编号，将分离的菌株记作德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus：Lb.)300菌株、Lb.305菌株、Lb.401菌株、Lb.421菌株、Lb.492菌株、Lb.495菌株、Lb.496菌株、Lb.499菌株、Lb.505菌株、Lb.511菌株、Lb.601菌株、Lb.863菌株、Lb.883菌株、Lb.885菌株。
从上述分离菌株中筛选下述德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株作为筛选菌株，所述德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株在将上述分离菌株的种菌1.0％与上述嗜热链球菌的筛选菌株1.0％共同接种至豆浆中，于37～45℃培养12～24小时时，能够在发酵物中蓄积0.4g/L以上的D-乳酸。具体而言，将德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lb.)492菌株、Lb.505菌株、Lb.511菌株、Lb.601菌株作为筛选菌株。
另外，将NIZOfoodresearch持有的嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)St.2333菌株和保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus)Lb.185接种至无调整豆浆(KikkomanSoyfoodsCompany制)中，进行传代培养。将豆浆发酵物以1％(v/v)的比率反复接种至豆浆中，于37～45℃培养12～24小时。实施约700代的传代培养，将从所得豆浆发酵物中分离的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株作为K1581株。
进而，将同样由NIZOfoodresearch持有的嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)St.131和德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)Lb.194接种至无调整豆浆(KikkomanSoyfoodsCompany制)中，进行传代培养。将豆浆发酵物以1％(v/v)的比率反复接种至豆浆中，于37～45℃培养12～24小时。实施约700代的传代培养，将从所得豆浆发酵物中分离的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株作为K1585菌株。同样地，将从St.131和Lb.185的传代培养中得到的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株作为K1583菌株。
3.豆浆发酵物中的D-乳酸量的比较
(1)供试菌株
使用从市售混合发酵剂中分离的乳酸菌及筛选·育种的乳酸菌(参见上述2)使豆浆发酵，测定·比较所得豆浆发酵物中的D-乳酸量。
(2)发酵条件及测定方法
发酵原料使用成分无调整豆浆(KikkomanSoyfoodsCompany制)。向该发酵原料中添加构成包含嗜热链球菌菌株和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株的乳酸菌混合发酵剂的物质，于42℃发酵24小时。发酵结束后，利用酶电极法(王子计测机器株式会社制，生物传感器BF-5)测定所得豆浆发酵物中的D-乳酸量。
(3)结果
图1是表示测定由各种嗜热链球菌菌株和作为育种菌株的德氏乳杆菌保加利亚亚种K1581菌株构成乳酸菌混合发酵剂并进行发酵而得到的豆浆发酵物中的D-乳酸量的结果的图。
图2是表示测定代替德氏乳杆菌保加利亚亚种K1581菌株而使用同样为育种菌株的德氏乳杆菌保加利亚亚种K1585菌株作为乳酸菌混合发酵剂、并在同样的条件下将豆浆进行发酵而得到的豆浆发酵物中的D-乳酸量的结果的图。
如图1及图2所示，确认到即使为相同的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株，D-乳酸生成量也根据组合的嗜热链球菌菌株的不同而不同，因此，德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株的代谢能力也会因嗜热链球菌菌株的特征而变化。特别地，以果糖的生成量为0.4g/L以上为指标筛选的菌株中，存在D-乳酸生成量显著升高的倾向。
图3是表示测定将由作为育种菌株的嗜热链球菌K1580菌株和从市售发酵剂中分离的各德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株构成的乳酸菌混合发酵剂接种至豆浆中、并在同样的条件下进行发酵而得到的豆浆发酵物中的D-乳酸量的结果的图。
如图3所示，确认到即使在使用育种的嗜热链球菌K1580菌株时，D-乳酸量的生成也根据德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株的不同而存在较大差异。
如图1、图2、图3、图4所示，对于嗜热链球菌菌株和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株而言，在通过直接使用市售的乳酸菌混合发酵剂的发酵得到的豆浆发酵物中，均几乎不生成D-乳酸，与此相对，通过将嗜热链球菌菌株和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株两者置换为筛选或育种的菌株，可以得到含有0.4g/L以上的D-乳酸的豆浆发酵物。特别地，使用由本发明中育种的乳酸菌(嗜热链球菌K1580菌株和德氏乳杆菌保加利亚亚种K1581菌株)构成的乳酸菌混合发酵剂时，可以得到D-乳酸量更多的豆浆发酵物(参见图1)。
根据以上结果，可见嗜热链球菌所具备的特征使得由共同发酵的德氏乳杆菌保加利亚亚种带来的D-乳酸生成量有较大变化，另外，确认到德氏乳杆菌保加利亚亚种也由于菌株的不同而使得在豆浆中的D-乳酸生成量大为不同。
4.无调整豆浆膜透过液中的利用德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株发酵后的D-乳酸量的比较
(1)如上所述，发现了根据嗜热链球菌菌株的特征，由德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株带来的D-乳酸生成量大大改变。于是，为了确认筛选·育种的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株和从市售发酵剂分离的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株在豆浆膜透过液中的代谢能力的区别，比较了在预先补充了果糖的豆浆膜透过液中的D-乳酸生成量。豆浆膜透过液是从豆浆中除去了高分子的不溶性蛋白质、脂质而得的液体，可以认为豆浆中的游离氨基酸、可溶性肽、糖分、矿物质等没有大的区别。
(2)无调整豆浆膜透过液的制作
使用空心丝状超滤组件(型式：USP-143(旭化成公司制))并通过真空泵抽吸(-60kPa)市售的无调整豆浆(KikkomanSoyfoodsCompany制)，将透过了膜的液体作为成分无调整的豆浆膜透过液。向该液体中无菌地添加果糖，使得最终浓度为1.0％(v/v)(无调整豆浆膜透过液)。进而，向该豆浆膜透过液中添加盐酸，制作调节为pH5.0的酸性豆浆膜透过液。
(3)豆浆膜透过液中的培养后的D-乳酸生成量的测定
在MRS培养基中分别培养下述菌株：从市售的酸奶制造用粉末混合发酵剂(DaniscoCo.,Ltd.制：含有嗜热链球菌菌株及保加利亚乳杆菌菌株的冷冻干燥品)中分离的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株、3株育种的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株(K1581菌株、K1583菌株、K1585菌株)、野生菌株(ATCC11842菌株)。将所得菌液用0.85％灭菌盐水离心·清洗2次，将得到的沉淀(pellet)悬浮在无调整豆浆膜透过液中，制成发酵剂菌液。
分别在无调整豆浆膜透过液、酸性(pH5.0)豆浆膜透过液中接种1.0％的经洗菌后的菌液，于42℃培养(单独培养德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株)24小时，测定培养后的菌液的D-乳酸量(图5及图6)。
在无调整豆浆膜透过液中，与市售发酵剂、ATCC11842菌株相比，由本发明中育种的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株带来的D-乳酸产生量显示出了显著高的数值。同样地，与无调整豆浆膜透过液相比，在酸性豆浆膜透过液中，可见市售发酵剂和育种的菌株在D-乳酸生成量上有显著区别。确认到利用市售发酵剂分离的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株在特别低的pH条件下(pH5.0)D-乳酸的生成量低，与此相对，育种的菌株在相同条件下产生了约3倍以上的D-乳酸。可以认为在与嗜热链球菌菌株在豆浆中的共发酵中，先由嗜热链球菌菌株的生长使得pH降低，之后德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株生长。就市售的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株而言，确认到在上述那样的环境中，不存在D-乳酸的生成超过0.4(g/L)的菌株，在豆浆环境中生长·代谢果然受到了限制。结合上述结果，关于育种的菌株，推测即使在低pH、并且为豆浆的条件下，与市售菌株、ATCC11842菌株相比，代谢也非常旺盛地进行，结果可以认为能够制作具有类似酸奶的良好的酸味、风味的豆浆发酵物。
需要说明的是，虽然来自市售发酵剂的分离菌株中也含有Lb.505菌株、Lb.511菌株等在图3中作为筛选菌株生成了0.4g/L以上的D-乳酸的菌株，在图5、图6中也显示出了比其它来自市售发酵剂的菌株高的D-乳酸生成，但并未达到0.4g/L的生成量。可以认为这是因为图5、图6所示的试验中不存在嗜热链球菌。可以认为虽然向无调整豆浆膜透过液中补充了果糖，但在使德氏乳杆菌保加利亚亚种的代谢活跃从而提高D-乳酸的生成量时，嗜热链球菌并不仅仅单纯地供给果糖，还承担着其它作用。
5.单独使用嗜热链球菌进行发酵而得到的豆浆发酵液中的果糖残糖量的测定
从市售的乳酸菌混合发酵剂(DaniscoCo.,Ltd.制)YO-MIX300、305、496、499、501、885中仅分离嗜热链球菌菌株(St.300菌株、St.305菌株、St.496菌株、St.499菌株、St.501菌株、St.885菌株)。将分离的各菌株在10mL的LM17培养基中培养后，将培养液用0.9％NaCl溶液离心·清洗，再次悬浮在10mL的0.9％NaCl溶液中。豆浆发酵原液使用市售的无调整豆浆(KikkomanSoyfoodsCompany制)。将该豆浆发酵原液以1.0％(v/v)的量接种在上文中制备的悬浮液中，于42℃发酵24小时。发酵后，回收离心上清液，利用FKitD-葡萄糖/果糖(JKINTERNATIONALCo.,Ltd.制)测定果糖的残糖量。结果示于图7。
如图7所示，嗜热链球菌菌株中，存在St.496菌株、St.499菌株、St.885菌株这样在豆浆发酵物中蓄积0.4g/L以上的果糖的菌株、和在豆浆发酵物中不蓄积果糖的菌株。
6.由乳酸菌发酵剂的组合带来的对D-乳酸量的生成的影响
将具有蓄积果糖的特征的嗜热链球菌(St.499菌株)和不蓄积果糖的菌株(St.305菌株)与从市售混合发酵剂YO-MIX505、511、863中分离的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株(Lb.505菌株、Lb.511菌株、Lb.863菌株)以1：1的比例组合，构成乳酸菌混合发酵剂。向市售的无调整豆浆(KikkomanSoyfoodsCompany制)中添加该乳酸菌混合发酵剂，于42℃发酵24小时，得到豆浆发酵物。接着，发酵结束后，利用酶电极法(王子计测机器株式会社制，生物传感器BF-5)测定所得豆浆发酵物中的D-乳酸量。
图8表示豆浆发酵物中的D-乳酸生成量的测定结果。如图8所示，确认到通过与蓄积果糖的嗜热链球菌菌株组合，生成了0.4g/L以上的D-乳酸，即使不添加副原料，在豆浆中也能构建与德氏乳杆菌保加利亚亚种的共生关系。
7.豆浆发酵中的糖浓度的经时性推移
可以认为，为了使嗜热链球菌菌株和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株在豆浆中构建共生关系，必须通过利用嗜热链球菌菌株将作为豆浆的主要糖分的蔗糖分解并蓄积果糖，从而对德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株提供糖源。此次，经时性地测定了在单独使用育种的嗜热链球菌K1580菌株发酵时，及将嗜热链球菌K1580菌株和德氏乳杆菌保加利亚亚种K1581菌株共发酵时的蔗糖、果糖的残糖量。发酵温度设定为42℃。蔗糖的经时变化示于图9，果糖的经时变化示于图10。
图11是表示使用嗜热链球菌K1580菌株和德氏乳杆菌保加利亚亚种K1581菌株于42℃将豆浆共发酵时的果糖浓度的经时性推移的图。
在单独使用嗜热链球菌K1580菌株发酵的条件下，蔗糖的量经时性减少，并确认到果糖的蓄积(图9、图10)。另一方面，可知在使用嗜热链球菌K1580菌株和德氏乳杆菌保加利亚亚种K1581菌株共发酵时，果糖一度少量蓄积，之后减少(图11)。
根据上述2个结果，可以认为果糖被K1581菌株代谢，结果有助于D-乳酸、其他芳香成分的生成。嗜热链球菌分为积极同化果糖的菌株和不积极同化果糖的菌株，通过使用本实施例中的筛选菌株及育种菌株这样具有不同化果糖而使其在发酵物中蓄积的特征的嗜热链球菌，在豆浆中也可以构建与德氏乳杆菌保加利亚亚种的共生关系，并赋予豆浆发酵物源自德氏乳杆菌保加利亚亚种的风味，结果能够生产出风味良好的豆浆发酵物。
8.使用育种菌株的感官评价
制备包含作为育种菌株的嗜热链球菌K1580菌株和德氏乳杆菌保加利亚亚种K1581菌株的乳酸菌混合发酵剂，使用该乳酸菌混合发酵剂于42℃使无调整豆浆(KikkomanSoyfoodsCompany制)发酵24小时，得到豆浆发酵物。另一方面，将嗜热链球菌K1580菌株单独添加至无调整豆浆中，于42℃发酵24小时，得到豆浆发酵物。各豆浆发酵物的成分分析值如下所述。
表1
接着，通过将单独发酵的豆浆发酵物和共发酵物适当混合，调整发酵物中的D-乳酸量。即，分别制作100％共发酵物(样品1)、40％共发酵物(样品2)、30％共发酵物(样品3)、20％共发酵物(样品4)、15％共发酵物(样品5)、10％共发酵物(样品6)、100％单独发酵物(样品7)。各样品的D-乳酸推测值、推算D/L比如表2所示。
另外，品尝各样品，依照下述评价基准评价D-乳酸量与豆浆发酵物的风味的关系。
(评价基准)
◎：风味非常好
○：风味良好
△：风味略差
×：风味差
结果示于表2。如表2所示，确认到样品1至样品3为风味良好。因此，确认到对于豆浆发酵物而言，通过使用生成至少0.4g/L以上的D-乳酸的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株，风味变得良好。另外，可知并非只要德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株旺盛地生长就能得到良好的风味，与嗜热链球菌的生长之间的均衡性是重要的，且D/L乳酸比优选为0.05以上。
表2
9.使用其它市售混合发酵剂进行发酵而得到的豆浆发酵物的感官评价
将市售的酸奶制造用粉末混合发酵剂(DaniscoCo.,Ltd.制：含有嗜热链球菌菌株及保加利亚乳杆菌菌株的冷冻干燥品)YO-MIX300、YO-MIX305、YO-MIX511、YO-MIX863(均为产品编号)的粉末用灭菌水溶解，在无调整豆浆(KikkomanSoyfoodsCompany制)中接种等量的悬浮液，于42℃发酵24小时，得到豆浆发酵物。
另一方面，分离来自市售混合发酵剂YO-MIX885、YO-MIX496的嗜热链球菌菌株(St.885菌株、St.496菌株)。另外，分离来自市售混合发酵剂YO-MIX305、YO-MIX492、YO-MIX601的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株(Lb.305菌株、Lb.492菌株、Lb.601菌株)，分别制成甘油保存菌液进行保管，并用于试验。
另外，作为育种菌株，使用嗜热链球菌K1580菌株及K1584菌株和德氏乳杆菌保加利亚亚种K1581菌株及K1585菌株。
将制作的嗜热链球菌菌株(St.菌株)和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株(Lb.菌株)各自以1：1的比例混合(例如，K1580菌株+K1581菌株、St.885菌株+Lb.305菌株等)，在10mL无调整豆浆(KikkomanSoyfoodsCompany制)中进行发酵，得到前发酵物。在无调整豆浆(KikkomanSoyfoodsCompany制)中接种1.0％(v/v)的该前发酵物，于42℃发酵24小时，得到豆浆发酵物。各豆浆发酵物的乳酸分析值如下所示。
表3
向通过上述操作得到的各豆浆发酵物中添加蔗糖，使得最终浓度为6.0％(w/v)，并实施关于风味、呈味的感官评价。其结果是，确认到不含D-乳酸的豆浆发酵物的甜味突出，不令人满意，而含有0.4g/L以上的D-乳酸的豆浆发酵物则取得了酸甜的均衡，成为风味良好的豆浆发酵物。综上所述，发现了即使在向豆浆发酵物中添加了砂糖时，使用本发明的乳酸菌混合发酵剂(包含筛选或育种的菌株的乳酸菌混合发酵剂)制造的豆浆发酵物也具有优异的风味、呈味。
10.豆浆发酵物的物性测定
测定豆浆发酵物的物性，实施评价。关于物性的评价，使用了粒度分布，其为表示豆浆发酵物中以多大的比例含有多大粒径的粒子的指标。通过测定粒度分布，可以评价将发酵物含在口中时的舌面触觉感受、顺滑口感。
将利用市售的酸奶制造用粉末混合发酵剂(DaniscoCo.,Ltd.制：含有嗜热链球菌菌株及德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株的冷冻干燥品)YO-MIX300、YO-MIX305(均为产品编号)发酵而得到的豆浆发酵物、和利用筛选或育种的菌株(K1580菌株+K1581菌株、St.496+Lb.601、St.885+Lb.305)发酵而得到的豆浆发酵物均匀地搅拌，供于激光衍射式粒度分布测定装置(SALD-2200(岛津制作所))，测定粒度分布。
测定结果示于图12。图表内还对每个样品用同一图例示出粒径的出现频率和累计结果。确认到了与利用市售发酵剂发酵而得到的豆浆发酵物相比，在利用筛选或育种的菌株发酵而得到的豆浆发酵物中，粒径为100微米以上的粒子在总体中所占的比率为10％以下，是舌面触觉感受更滑润的豆浆发酵物。该结果表明，育种或选拔使得嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种在豆浆发酵时的代谢分别被活化，由此这些乳酸菌产生的多糖类也大量生成，结果防止了成为粗糙感的原因的大豆蛋白的过量凝集，改善了物性。

Claims (6)

1.一种豆浆发酵物，是使用乳酸菌混合发酵剂而得到的，所述乳酸菌混合发酵剂包含：
嗜热链球菌，其在接种至豆浆中并进行培养时，能够在发酵物中蓄积0.4g/L以上的果糖，和
德氏乳杆菌保加利亚亚种，其在接种至豆浆中并进行培养时，能够在发酵物中蓄积0.4g/L以上的D-乳酸。
2.如权利要求1所述的豆浆发酵物，其中，所述嗜热链球菌及所述德氏乳杆菌保加利亚亚种使用以豆浆为主要成分的培养基进行育种。
3.如权利要求1所述的豆浆发酵物，其中，所述嗜热链球菌及所述德氏乳杆菌保加利亚亚种是同时接种至以豆浆为主要成分的培养基中并进行育种的。
4.如权利要求1所述的豆浆发酵物，其中，所述豆浆发酵物的粒度分布中，粒径为100微米以上的粒子在总体中所占的比率为10％以下。
5.一种乳酸菌混合发酵剂，包含：
嗜热链球菌，其在接种至豆浆中并进行培养时，能够在发酵物中蓄积0.4g/L以上的果糖，和
德氏乳杆菌保加利亚亚种，其在接种至豆浆中并进行培养时，能够在发酵物中蓄积0.4g/L以上的D-乳酸。
6.如权利要求6所述的乳酸菌混合发酵剂，所述乳酸菌混合发酵剂被用于豆浆发酵物的制造。
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