JP6829430B2 - 乳酸発酵豆乳の製造方法 - Google Patents
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Description
本発明はγ−アミノ酪酸を含み、良好な食感及び風味を有する乳酸発酵豆乳の製造方法に関する。
豆乳は良質の植物性タンパク質と、必須脂肪酸であるリノール酸、リノレン酸を含有する優れた食品であり、豆乳を原料とした多くの商品が市場に溢れている。そして、豆乳を乳酸発酵させて得られるヨーグルト様の食品である乳酸発酵豆乳を製造しようとする多くの試みが成されてきた。
しかしながら、牛乳を原料とする乳酸発酵乳と比較すると風味と食感の点において、乳酸発酵豆乳には未だ多くの課題が残されている。乳酸発酵豆乳はザラッぽさを有し、喉越しが悪いという第一の課題がある。更に、乳酸発酵豆乳が独特の不快臭（脂質の酸化臭）を有し、更には、渋み、えぐ味といった不快味を有する場合があるという第二の課題がある。
例えば、一般に流通している、牛乳を原料とする固形タイプのヨーグルトは、非常に緩やかな結合の凝集体を形成しており、口に入れた瞬間に崩れ、非常に滑らかな食感を呈する。一方、乳酸発酵豆乳の場合は、牛乳の発酵物に比べて高粘度の凝集物を生成し易く、ザラッぽく、喉越しの悪い食感が形成される。特に、牛乳を原料とする乳酸発酵乳と、豆乳を原料とする乳酸発酵豆乳との食感の違いは、牛乳中タンパク質と豆乳中のタンパク質の性質の違いによるものと考えられる。
近年の健康志向の高まりから、乳製品市場では乳酸発酵を利用した飲食品の開発が盛んに行われてきているが、乳酸発酵豆乳は上記した二つの理由により、消費者の嗜好に馴染まない場合があった。
しかしながら、牛乳を原料とする乳酸発酵乳と比較すると風味と食感の点において、乳酸発酵豆乳には未だ多くの課題が残されている。乳酸発酵豆乳はザラッぽさを有し、喉越しが悪いという第一の課題がある。更に、乳酸発酵豆乳が独特の不快臭（脂質の酸化臭）を有し、更には、渋み、えぐ味といった不快味を有する場合があるという第二の課題がある。
例えば、一般に流通している、牛乳を原料とする固形タイプのヨーグルトは、非常に緩やかな結合の凝集体を形成しており、口に入れた瞬間に崩れ、非常に滑らかな食感を呈する。一方、乳酸発酵豆乳の場合は、牛乳の発酵物に比べて高粘度の凝集物を生成し易く、ザラッぽく、喉越しの悪い食感が形成される。特に、牛乳を原料とする乳酸発酵乳と、豆乳を原料とする乳酸発酵豆乳との食感の違いは、牛乳中タンパク質と豆乳中のタンパク質の性質の違いによるものと考えられる。
近年の健康志向の高まりから、乳製品市場では乳酸発酵を利用した飲食品の開発が盛んに行われてきているが、乳酸発酵豆乳は上記した二つの理由により、消費者の嗜好に馴染まない場合があった。
現在の市場では低粘度で食感、喉越しの良いドリンクタイプのヨーグルト製品、いわゆる「飲むヨーグルト」が市場を席巻している。この液体ヨーグルトの様な緩やかな結合の流動性の凝集体の場合には、流動性の凝集物が口中に万遍なく広がるため、ザラっぽさや喉越しの悪さがあると、これらを感じ易くなる。乳酸発酵豆乳を低粘度タイプとする場合は、特にこの食感と喉越しの改善が重要課題となる。
また、牛乳の乳酸発酵では、アルデヒド類、ケトン類、ラクトン類等の成分に起因する動物性の乳臭さ（脂肪分解臭、酸化臭等）が、原乳以上に強くなると言われている。一方、豆乳の乳酸発酵においても、含有するリノール酸、リノレン酸（不飽和脂肪酸）が発酵中に酸化され、所謂大豆臭さや青臭みといった不快な臭いが原料豆乳以上に強くなる場合が多い。
また、牛乳の乳酸発酵では、アルデヒド類、ケトン類、ラクトン類等の成分に起因する動物性の乳臭さ（脂肪分解臭、酸化臭等）が、原乳以上に強くなると言われている。一方、豆乳の乳酸発酵においても、含有するリノール酸、リノレン酸（不飽和脂肪酸）が発酵中に酸化され、所謂大豆臭さや青臭みといった不快な臭いが原料豆乳以上に強くなる場合が多い。
特許文献１には、豆乳にニガリ又はアルカリ土類金属の塩若しくは水酸化物を添加した後、加熱処理及び均質化処理した後に乳酸発酵することにより、滑らかな乳酸発酵豆乳を得る方法が提案されている。
特許文献２には、豆乳を含む大豆製品をストレプトコッカス・サーモフィラスの特定菌株であるStreptococcus thermophilus 3261株の単独培養物と接触させることを特徴とする、大豆製品の風味及び色調を改善する方法が提案されている。
特許文献３には、乳酸発酵豆乳を製造する方法において、豆乳を発酵する段階の前又は発酵中にパラチノースを豆乳に添加することで、乳酸発酵豆乳の風味をパラチノースのマスキング効果により改善する方法が提案されている。
特許文献４には、豆乳の乳酸発酵時に、無酸素雰囲気になるよう密封容器中に豆乳を満たすか、ヘッドスペース等の雰囲気の気体部分の酸素濃度を低くすることによって、良好な発酵豆乳を得る方法が提案されている。
特許文献２には、豆乳を含む大豆製品をストレプトコッカス・サーモフィラスの特定菌株であるStreptococcus thermophilus 3261株の単独培養物と接触させることを特徴とする、大豆製品の風味及び色調を改善する方法が提案されている。
特許文献３には、乳酸発酵豆乳を製造する方法において、豆乳を発酵する段階の前又は発酵中にパラチノースを豆乳に添加することで、乳酸発酵豆乳の風味をパラチノースのマスキング効果により改善する方法が提案されている。
特許文献４には、豆乳の乳酸発酵時に、無酸素雰囲気になるよう密封容器中に豆乳を満たすか、ヘッドスペース等の雰囲気の気体部分の酸素濃度を低くすることによって、良好な発酵豆乳を得る方法が提案されている。
一方、γ−アミノ酪酸（GABA、γ−amino butyric acid；IUPAC名：4-aminobutanoic acid）は、抑制性の神経伝達物質で血圧上昇抑制作用や抗ストレス作用が確認されており、これらの効果を有する機能性表示食品が各種登録されている。また、γ−アミノ酪酸による腎機能向上や、精神安定等の生理学的効果が期待されている。豆乳の乳酸発酵において、γ−アミノ酪酸の生産を安定して行うことができれば、乳酸発酵豆乳に含まれる豆乳成分から生産される種々の生産物に期待される栄養学的及び生理学的効果に加えて、種々の生理的効果が期待されるγ−アミノ酪酸を含む乳酸発酵豆乳の安定供給が可能となる。
特許文献５には、豆乳に、グルタミン酸又はグルタミン酸含有物と、γ−アミノ酪酸生産能を有する乳酸菌株とを添加して乳酸発酵を行うことにより、γ−アミノ酪酸を高含有させ、かつ、風味の良い飲食品又は調味食品を製造する方法が提案されている。なお、特許文献４では、乳酸菌の具体例として、ラクトバチルス・ブレビスの特定菌株が単独使用されている。
特許文献５には、豆乳に、グルタミン酸又はグルタミン酸含有物と、γ−アミノ酪酸生産能を有する乳酸菌株とを添加して乳酸発酵を行うことにより、γ−アミノ酪酸を高含有させ、かつ、風味の良い飲食品又は調味食品を製造する方法が提案されている。なお、特許文献４では、乳酸菌の具体例として、ラクトバチルス・ブレビスの特定菌株が単独使用されている。
特許文献１に記載されるように、豆腐用凝固剤であるニガリやアルカリ土類金属の塩若しくは水酸化物を添加した豆乳を加熱処理することにより、大豆タンパク質が凝固し、その後の加圧下での物理的な均質化処理と乳酸発酵のみでは、ザラッぽさや喉越しの悪さが残る場合がある。更に、特許文献１に記載される方法では、滑らかな食感に必要な凝固状態を得るための加熱処理条件を制御することが難しい場合がある。特許文献１において挙げている水酸化カルシウム（消石灰）は、水への溶解性が極めて低く、所定量の濃度を添加しようとすると、不溶性区分を含む懸濁液を添加することとなって、消石灰の微粉末を直接添加することになり、呈味性や後味に悪い影響を与えるという問題を抱えている。
また、特許文献２及び３では、大豆由来の不快臭、不快味の問題を十分に解決することができず、未だに乳酸発酵豆乳の大豆臭さや青臭みといった不快な臭いが原豆乳以上に強くなる場合がある。
さらに、特許文献４では、乳酸発酵時に無酸素雰囲気になるよう密封容器中に豆乳を満たすための、あるいはヘッドスペース等の雰囲気の気体部分の酸素濃度を低くするための特別な製造装置や製造条件の制御が必要となり、乳酸発酵豆乳の大量生産における生産コストの上昇を招く場合がある。
更に、特許文献２及び５のように、豆乳の乳酸発酵に乳酸菌の単独菌株を使用する場合では、用いる単独菌株の栄養要求性等に応じて、豆乳に含まれる成分を、各種添加剤の添加により調整する必要があり、また、乳酸発酵を安定して進行させるための単独菌株に特有の培養条件の制御が必要となる場合もある。
本発明の目的は、γ−アミノ酪酸含有乳酸発酵豆乳を安定して生産することが出来る生産方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、豆乳に由来する独特の不快臭や不快味がなく、かつ滑らかな食感で喉越しが良いγ−アミノ酪酸含有乳酸発酵豆乳の製造方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、乳酸発酵原料としての豆乳に対する制限のない、γ−アミノ酪酸含有乳酸発酵豆乳の生産方法を提供することにある。
また、特許文献２及び３では、大豆由来の不快臭、不快味の問題を十分に解決することができず、未だに乳酸発酵豆乳の大豆臭さや青臭みといった不快な臭いが原豆乳以上に強くなる場合がある。
さらに、特許文献４では、乳酸発酵時に無酸素雰囲気になるよう密封容器中に豆乳を満たすための、あるいはヘッドスペース等の雰囲気の気体部分の酸素濃度を低くするための特別な製造装置や製造条件の制御が必要となり、乳酸発酵豆乳の大量生産における生産コストの上昇を招く場合がある。
更に、特許文献２及び５のように、豆乳の乳酸発酵に乳酸菌の単独菌株を使用する場合では、用いる単独菌株の栄養要求性等に応じて、豆乳に含まれる成分を、各種添加剤の添加により調整する必要があり、また、乳酸発酵を安定して進行させるための単独菌株に特有の培養条件の制御が必要となる場合もある。
本発明の目的は、γ−アミノ酪酸含有乳酸発酵豆乳を安定して生産することが出来る生産方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、豆乳に由来する独特の不快臭や不快味がなく、かつ滑らかな食感で喉越しが良いγ−アミノ酪酸含有乳酸発酵豆乳の製造方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、乳酸発酵原料としての豆乳に対する制限のない、γ−アミノ酪酸含有乳酸発酵豆乳の生産方法を提供することにある。
本発明にかかる乳酸発酵豆乳の製造方法の一態様は、
豆乳を原料とする乳酸発酵豆乳の製造方法において、
豆乳に乳酸菌を添加して乳酸発酵を行い、乳酸発酵豆乳を得る乳酸発酵工程を有し、
前記乳酸菌が、共生関係においてγ−アミノ酪酸（以降GABAと称す）を生産するストレプトコッカス・サーモフィラスとラクトバチルス・デルブリュッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスの組合せであり、該組合せとしてストレプトコッカス・サーモフィラス T-1株（Streptococcus thermophilus T-1株：NITE P-02365）と、ラクトバチルス・デルブリュッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス T-2株（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus T-2： NITE P-02366）の組合せを用いることを特徴とする。
本発明にかかる乳酸発酵豆乳の製造方法の一態様は、
豆乳を原料とする乳酸発酵豆乳の製造方法において、
豆乳に乳酸菌を添加して乳酸発酵を行い、乳酸発酵豆乳を得る乳酸発酵工程と、
前記乳酸発酵豆乳に水酸化カルシウムを含有するショ糖水溶液を添加する工程と、
を有し、
前記乳酸菌が、共生関係においてGABAを生産するストレプトコッカス・サーモフィラスとラクトバチルス・デルブリュッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスの組合せであり、該組合せとしてストレプトコッカス・サーモフィラス T-1株（Streptococcus thermophilus T-1株：NITE P-02365）と、ラクトバチルス・デルブリュッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス T-2株（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus T-2： NITE P-02366）の組合せを用いることを特徴とする。
豆乳を原料とする乳酸発酵豆乳の製造方法において、
豆乳に乳酸菌を添加して乳酸発酵を行い、乳酸発酵豆乳を得る乳酸発酵工程を有し、
前記乳酸菌が、共生関係においてγ−アミノ酪酸（以降GABAと称す）を生産するストレプトコッカス・サーモフィラスとラクトバチルス・デルブリュッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスの組合せであり、該組合せとしてストレプトコッカス・サーモフィラス T-1株（Streptococcus thermophilus T-1株：NITE P-02365）と、ラクトバチルス・デルブリュッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス T-2株（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus T-2： NITE P-02366）の組合せを用いることを特徴とする。
本発明にかかる乳酸発酵豆乳の製造方法の一態様は、
豆乳を原料とする乳酸発酵豆乳の製造方法において、
豆乳に乳酸菌を添加して乳酸発酵を行い、乳酸発酵豆乳を得る乳酸発酵工程と、
前記乳酸発酵豆乳に水酸化カルシウムを含有するショ糖水溶液を添加する工程と、
を有し、
前記乳酸菌が、共生関係においてGABAを生産するストレプトコッカス・サーモフィラスとラクトバチルス・デルブリュッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスの組合せであり、該組合せとしてストレプトコッカス・サーモフィラス T-1株（Streptococcus thermophilus T-1株：NITE P-02365）と、ラクトバチルス・デルブリュッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス T-2株（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus T-2： NITE P-02366）の組合せを用いることを特徴とする。
豆乳の乳酸発酵用の乳酸菌として、共生関係にあり、GABA生産可能なストレプトコッカス・サーモフィラスとラクトバチルス・デルブリュッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスの組合せを用いることによって、豆乳に由来する独特の不快臭や不快味が極めて少ない、GABA含有乳酸発酵豆乳を安定して生産可能となる。
そして、豆乳の乳酸発酵により得られる乳酸発酵豆乳に水酸化カルシウムを含有するショ糖水溶液を添加混合することによって、豆乳に由来する独特の不快臭や不快味が極めて少なく、更には、滑らかな食感を有し、かつ喉越しの良い、GABA含有乳酸発酵豆乳を提供することが可能となる。
そして、豆乳の乳酸発酵により得られる乳酸発酵豆乳に水酸化カルシウムを含有するショ糖水溶液を添加混合することによって、豆乳に由来する独特の不快臭や不快味が極めて少なく、更には、滑らかな食感を有し、かつ喉越しの良い、GABA含有乳酸発酵豆乳を提供することが可能となる。
本発明者らは、豆乳の乳酸発酵を効率良くかつ安定して進行させ、更に乳酸発酵豆乳の栄養価を高め、その食感や風味、呈味を改善できる乳酸発酵豆乳の製造方法を提供するという技術課題について鋭意検討した。その結果、共生関係にあり、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus、以下S. thermophilusと表記する）とラクトバチルス・デルブリュッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus、以下 L. delbrueckii subsp. bulgaricusと表記する）とのGABAを生産する組合せを乳酸発酵用として用いることにより、上記技術課題を達成し得ることを新たに見出した。
まず、上記２つの異なる乳酸菌種の組合せは、乳酸発酵乳製品であるヨーグルトの安定生産を可能とするスターターとして伝統的に利用されてきており、これらの菌種の共生による乳酸発酵のメカニズムについても多くの知見が開示されている。そこで、これらの２種の菌種によって豆乳の汎用品を用いた場合においても、効率良く、かつ安定して乳酸発酵を進行させることができれば、単独菌種を用いる場合におけるような豆乳に含まれる成分に対する制限をなくして、豆乳の汎用品を用いた場合においても豆乳乳酸発酵を効率良く、かつ安定して進行させることができる。
更に、これらの２種の菌種の共生による乳酸発酵においてGABAを生産させることによって、豆乳由来の独特な不快臭や不快味の発生を抑制し、風味、呈味の良好な乳酸発酵豆乳を得ることができる。共生によりGABA生産能を有するこれらの２種の菌種の組合せにおいて、かかる効果が得られる理由については、本発明者らは以下のように推定している。
GABAは、グルタミン酸デカルボキシラーゼの作用によりグルタミン酸が脱炭酸されて生成し、その際、炭酸ガスが発生する。GABA生産量の増加に伴って炭酸ガスの発生量も増加し、乳酸発酵培養系内における酸素ガスに対する炭酸ガスの濃度を相対的に高くして乳酸発酵培養液中に含まれる成分の酸化を抑制する。その結果、豆乳由来の成分の酸化による不快臭や不快味の原因となる成分の生成が効率良く抑制される。なお、上記２種の菌種は、エネルギー代謝産物として乳酸を生成し、炭酸ガスまでの酸化を行わないホモ型発酵乳酸菌であるため、豆乳由来の成分の酸化を抑えることによる上述の効果を得るためには、GABAの生産による炭酸ガスの乳酸発酵液中での発生が必須の要件となる。このように、乳酸発酵液中にGABAを生産させることによって、乳酸発酵豆乳の栄養価や機能性食品としての価値を高めることもできる。
本発明者らは、以上のGABA生産による豆乳の乳酸発酵に対する効果に関する新たな知見に加えて、乳酸発酵豆乳に水酸化カルシウムを含有するショ糖水溶液を添加混合することによって、食感としての滑らかさと喉越しを調整し、目的とする良好な滑らかさと喉越しの両方を乳酸発酵豆乳に付与できるとの新たな知見を得た。本発明はこれらの本発明者らによる新たな知見に基づいて成されたものである。
まず、上記２つの異なる乳酸菌種の組合せは、乳酸発酵乳製品であるヨーグルトの安定生産を可能とするスターターとして伝統的に利用されてきており、これらの菌種の共生による乳酸発酵のメカニズムについても多くの知見が開示されている。そこで、これらの２種の菌種によって豆乳の汎用品を用いた場合においても、効率良く、かつ安定して乳酸発酵を進行させることができれば、単独菌種を用いる場合におけるような豆乳に含まれる成分に対する制限をなくして、豆乳の汎用品を用いた場合においても豆乳乳酸発酵を効率良く、かつ安定して進行させることができる。
更に、これらの２種の菌種の共生による乳酸発酵においてGABAを生産させることによって、豆乳由来の独特な不快臭や不快味の発生を抑制し、風味、呈味の良好な乳酸発酵豆乳を得ることができる。共生によりGABA生産能を有するこれらの２種の菌種の組合せにおいて、かかる効果が得られる理由については、本発明者らは以下のように推定している。
GABAは、グルタミン酸デカルボキシラーゼの作用によりグルタミン酸が脱炭酸されて生成し、その際、炭酸ガスが発生する。GABA生産量の増加に伴って炭酸ガスの発生量も増加し、乳酸発酵培養系内における酸素ガスに対する炭酸ガスの濃度を相対的に高くして乳酸発酵培養液中に含まれる成分の酸化を抑制する。その結果、豆乳由来の成分の酸化による不快臭や不快味の原因となる成分の生成が効率良く抑制される。なお、上記２種の菌種は、エネルギー代謝産物として乳酸を生成し、炭酸ガスまでの酸化を行わないホモ型発酵乳酸菌であるため、豆乳由来の成分の酸化を抑えることによる上述の効果を得るためには、GABAの生産による炭酸ガスの乳酸発酵液中での発生が必須の要件となる。このように、乳酸発酵液中にGABAを生産させることによって、乳酸発酵豆乳の栄養価や機能性食品としての価値を高めることもできる。
本発明者らは、以上のGABA生産による豆乳の乳酸発酵に対する効果に関する新たな知見に加えて、乳酸発酵豆乳に水酸化カルシウムを含有するショ糖水溶液を添加混合することによって、食感としての滑らかさと喉越しを調整し、目的とする良好な滑らかさと喉越しの両方を乳酸発酵豆乳に付与できるとの新たな知見を得た。本発明はこれらの本発明者らによる新たな知見に基づいて成されたものである。
本発明の乳酸発酵豆乳の生産に用いるS. thermophilus及びL. delbrueckii subsp. bulgaricusとしては、共生により乳酸発酵を進行させることができるものであれば特に限定されない。公知の菌株、あるいは公知文献に記載の方法によって単離できる菌株から、本発明において目的とする豆乳の乳酸発酵能を有する上記２種の菌種に属する菌株をそれぞれ選択して用いることができる。
選択された菌株が本発明の目的に適合しているかどうかについては、豆乳を用いてGABAを含み、目的とする食感や呈味を有する乳酸発酵豆乳を得ることができるかどうかについて予備試験をすることによって確認することができる。
この予備試験には、上記２種の菌種にそれぞれ属する菌株の組合せにおけるGABA生産性を検証できる方法であれば特に制限なく利用できる。このような予備試験方法には、後述する実験例１でも利用されている、以下の予備試験用培養液及び培養条件を好ましく利用することができる。
（ａ）予備試験用培養液の組成
・豆乳原液（固形分濃度１２．８質量％、タンパク質濃度７．０質量％）：１９５質量部
・３３質量％グルコース水溶液：９質量部
・水：９０質量部
（ｂ）培養条件
・３７℃、３日間
上記の２種の菌種のそれぞれに属する菌株の組合せとしては、後述する実験例１において豆乳の乳酸発酵においてGABA生産が認められた混合菌に含まれる菌株の組合せを挙げることができる。
選択された菌株が本発明の目的に適合しているかどうかについては、豆乳を用いてGABAを含み、目的とする食感や呈味を有する乳酸発酵豆乳を得ることができるかどうかについて予備試験をすることによって確認することができる。
この予備試験には、上記２種の菌種にそれぞれ属する菌株の組合せにおけるGABA生産性を検証できる方法であれば特に制限なく利用できる。このような予備試験方法には、後述する実験例１でも利用されている、以下の予備試験用培養液及び培養条件を好ましく利用することができる。
（ａ）予備試験用培養液の組成
・豆乳原液（固形分濃度１２．８質量％、タンパク質濃度７．０質量％）：１９５質量部
・３３質量％グルコース水溶液：９質量部
・水：９０質量部
（ｂ）培養条件
・３７℃、３日間
上記の２種の菌種のそれぞれに属する菌株の組合せとしては、後述する実験例１において豆乳の乳酸発酵においてGABA生産が認められた混合菌に含まれる菌株の組合せを挙げることができる。
上記の２種の菌種のそれぞれに属する菌株の組合せのGABA生産能としては、上述した予備試験用培養液における培養において、少なくとも０．０４ｇ／ＬのGABAを生産する能力を有する菌株の組合せを選択することが好ましい。
上記の２種の菌種のそれぞれに属する菌株の組合せとして特に好ましい組合せとしては、本発明者らにより豆乳を原料とするGABAの優良生産菌株の組合せとして選抜された以下の２種の菌株の組合せを挙げることができる。
・Streptococcus thermophilus T-1株
・Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus T-2
これらの２種の株は、国内の発酵乳から京都府中小企業技術センター（住所、〒600-8813、京都市下京区中堂寺南町134）により単離された株であり、独立行政法人製品評価技術基盤機構、特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室）に寄託されている。これらの受託日及び受託番号等は以下の通りである。
・受託日：２０１６年９月２８日
識別の表示及び受託番号
・Streptococcus thermophilus T-1株
・・識別の表示：ST T-1
・・受託番号：NITE P-02365
・Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus T-2株
・・識別の表示：LB T-2
・・受託番号：NITE P-02366
上記２種の生化学的性質は以下の通りである。
・Streptococcus thermophilus T-1株
・・細胞形態：球菌
・・コロニー：クリーム色
・・グラム染色：陽性
・・カタラーゼ試験：陰性
・・糖資化性（ブドウ糖（＋）、果糖（＋）、乳糖（＋）、ショ糖（＋））
・Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus T-2株
・・細胞形態：桿菌
・・コロニー：クリーム色
・・グラム染色：陽性
・・カタラーゼ試験：陰性
・・糖資化性（ブドウ糖（＋）、果糖（＋）、マンノース（＋）、乳糖（＋））
上記の２種の株の同定は以下の方法により簡易的に行うことができる。
・使用キット
API同定kit
・API 50CH (bioMerieux)
・API 50CHL
・培養温度及び培養時間
３７℃、４８時間
・同定判定
アピウエブ（40011、シスメックス・ビオメリュー株式会社）
・判定結果
菌株ＡはStreptococcus salivarius ssp. thermophilusであり、菌株ＢはLactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricusであると同定された。
上記の２種の株の菌種の同定に利用された培養試験における試験項目の結果を以下の表１−１及び表１−２に示す。
上記の２種の菌種のそれぞれに属する菌株の組合せとして特に好ましい組合せとしては、本発明者らにより豆乳を原料とするGABAの優良生産菌株の組合せとして選抜された以下の２種の菌株の組合せを挙げることができる。
・Streptococcus thermophilus T-1株
・Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus T-2
これらの２種の株は、国内の発酵乳から京都府中小企業技術センター（住所、〒600-8813、京都市下京区中堂寺南町134）により単離された株であり、独立行政法人製品評価技術基盤機構、特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室）に寄託されている。これらの受託日及び受託番号等は以下の通りである。
・受託日：２０１６年９月２８日
識別の表示及び受託番号
・Streptococcus thermophilus T-1株
・・識別の表示：ST T-1
・・受託番号：NITE P-02365
・Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus T-2株
・・識別の表示：LB T-2
・・受託番号：NITE P-02366
上記２種の生化学的性質は以下の通りである。
・Streptococcus thermophilus T-1株
・・細胞形態：球菌
・・コロニー：クリーム色
・・グラム染色：陽性
・・カタラーゼ試験：陰性
・・糖資化性（ブドウ糖（＋）、果糖（＋）、乳糖（＋）、ショ糖（＋））
・Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus T-2株
・・細胞形態：桿菌
・・コロニー：クリーム色
・・グラム染色：陽性
・・カタラーゼ試験：陰性
・・糖資化性（ブドウ糖（＋）、果糖（＋）、マンノース（＋）、乳糖（＋））
上記の２種の株の同定は以下の方法により簡易的に行うことができる。
・使用キット
API同定kit
・API 50CH (bioMerieux)
・API 50CHL
・培養温度及び培養時間
３７℃、４８時間
・同定判定
アピウエブ（40011、シスメックス・ビオメリュー株式会社）
・判定結果
菌株ＡはStreptococcus salivarius ssp. thermophilusであり、菌株ＢはLactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricusであると同定された。
上記の２種の株の菌種の同定に利用された培養試験における試験項目の結果を以下の表１−１及び表１−２に示す。
一方、本発明者らの検討によれば、上記のS. thermophilus T-1株とL. delbrueckii subsp. bulgaricus T-2株の組合せでの豆乳を原料とする乳酸発酵へのショ糖の添加は、GABAの生産性には全く寄与していないことが明らかとなった。また、本菌株の組み合わせでは、３５℃〜４３℃でGABA生産がよく行われ、特に４１〜４３℃が最も効率の良いことが確認された。さらには、乳酸発酵時間が２０時間を超えると発酵豆乳の呈味に変化を与える場合があり、２０時間以内での発酵がより好ましいことが判明した。
更に、乳酸発酵後の乳酸発酵豆乳に水酸化カルシウムを含有するショ糖水溶液を添加混合することによって、豆乳に由来する独特の不快臭や不快味が極めて少なく、かつ滑らかな食感を有し、かつ喉越しの良い乳酸発酵豆乳を提供することが可能となる。
なお、本発明にかかる乳酸発酵豆乳の製造方法は、ソフトタイプまたはドリンクタイプに分類される乳酸発酵豆乳の製造に特に好適に利用できる。例えば、乳酸発酵終了後にハンドミキサー（パナソニック(株)製、ＭＫ−Ｈ４）で３０秒間撹拌のような均質化処理によって、均一化した状態で２５００ｍＰａ・ｓ（２０℃測定）以下の粘度のソフトタイプまたはドリンクタイプの乳酸発酵豆乳を得ることができる。
更に、乳酸発酵後の乳酸発酵豆乳に水酸化カルシウムを含有するショ糖水溶液を添加混合することによって、豆乳に由来する独特の不快臭や不快味が極めて少なく、かつ滑らかな食感を有し、かつ喉越しの良い乳酸発酵豆乳を提供することが可能となる。
なお、本発明にかかる乳酸発酵豆乳の製造方法は、ソフトタイプまたはドリンクタイプに分類される乳酸発酵豆乳の製造に特に好適に利用できる。例えば、乳酸発酵終了後にハンドミキサー（パナソニック(株)製、ＭＫ−Ｈ４）で３０秒間撹拌のような均質化処理によって、均一化した状態で２５００ｍＰａ・ｓ（２０℃測定）以下の粘度のソフトタイプまたはドリンクタイプの乳酸発酵豆乳を得ることができる。
以下に各工程について詳しく説明する。
［原料豆乳調製工程］
原料としての豆乳は、目的とする乳酸発酵豆乳の生産に利用できるものであれば特に限定されない。豆乳とは、大豆を原料として得られる水可溶性区分を加熱処理したタンパク質、脂質等を含有する溶液を言う。原料豆乳としては、例えば以下の各豆乳を利用することができる。
（Ｉ）水に浸漬した大豆を水または熱水で磨砕し、加熱処理後に固液分離して得られる豆乳。
（II）浸漬大豆を水で磨砕、固液分離した後に加熱処理をして得られる豆乳。
（III）大豆を脱皮し、そのまま、または短時間水に浸漬し、水または熱水と共に磨砕し、加熱処理後に固液分離して得られる豆乳。
必要に応じて、これらの豆乳の２種以上を混合して用いることができる。
豆乳のタンパク質濃度は、ケルダール分析法でのトータル窒素量（全窒素量：ＴＮ）を指標として定量することができる。原料として利用する豆乳のトータル窒素量は、０．３〜１．２質量％であることが好ましく、０．５〜１．０質量％であることがより好ましく、０．６〜０．９質量％であることが更に好ましい。豆乳のタンパク質濃度は、ＴＮ×６．２５の値により概算できる。
豆乳のｐＨは、目的とする乳酸発酵を行うことができる値であれば特に制限されない。豆乳のｐＨは、例えば、６．０〜７．５の範囲から選択することができ、必要に応じて、豆乳のｐＨをこの範囲内で調整してもよい。
［原料豆乳調製工程］
原料としての豆乳は、目的とする乳酸発酵豆乳の生産に利用できるものであれば特に限定されない。豆乳とは、大豆を原料として得られる水可溶性区分を加熱処理したタンパク質、脂質等を含有する溶液を言う。原料豆乳としては、例えば以下の各豆乳を利用することができる。
（Ｉ）水に浸漬した大豆を水または熱水で磨砕し、加熱処理後に固液分離して得られる豆乳。
（II）浸漬大豆を水で磨砕、固液分離した後に加熱処理をして得られる豆乳。
（III）大豆を脱皮し、そのまま、または短時間水に浸漬し、水または熱水と共に磨砕し、加熱処理後に固液分離して得られる豆乳。
必要に応じて、これらの豆乳の２種以上を混合して用いることができる。
豆乳のタンパク質濃度は、ケルダール分析法でのトータル窒素量（全窒素量：ＴＮ）を指標として定量することができる。原料として利用する豆乳のトータル窒素量は、０．３〜１．２質量％であることが好ましく、０．５〜１．０質量％であることがより好ましく、０．６〜０．９質量％であることが更に好ましい。豆乳のタンパク質濃度は、ＴＮ×６．２５の値により概算できる。
豆乳のｐＨは、目的とする乳酸発酵を行うことができる値であれば特に制限されない。豆乳のｐＨは、例えば、６．０〜７．５の範囲から選択することができ、必要に応じて、豆乳のｐＨをこの範囲内で調整してもよい。
［発酵工程］
発酵工程は、原料豆乳に乳酸菌を添加混合し発酵させて、発酵豆乳を得る工程である。
通常、原料豆乳を１２０〜１５０℃で１秒〜数分間の加熱殺菌処理を行った後に、加熱処理された原料豆乳に乳酸菌スターターを接種して乳酸発酵を開始する。
乳酸菌スターターとして、S. thermophilusに属する菌株とL. delbrueckii subsp. bulgaricusに属する菌株とのGABA生産性を有する組合せを用いる。
乳酸発酵促進のために、グルコース、乳糖、果糖、各種オリゴ糖、各種液糖の何れか１種、或いは、２種以上の糖質を原料豆乳に予め添加してもよい。オリゴ糖や液糖としては、市販のあるいは当業者に知られているものから目的とする乳酸発酵促進効果が得られるものを選択して用いることができる。
糖質の豆乳への添加量は、豆乳に対して０．１〜１０質量％の範囲から選択することができ、好ましくは０．５〜５質量％、さらに好ましくは１〜２質量％の範囲から選択することができる。
糖質の豆乳への添加は、原料豆乳及び乳酸発酵液の少なくとも１つに対して行うことができ、複数回に分けて糖質を添加する場合には、その総量が上述した割合となるように設定することが好ましい。原料豆乳に対して糖質を添加する場合には、豆乳の加熱殺菌処理前及び／または加熱殺菌処理後に行うことができる。加熱殺菌後に糖質を加える場合には、糖質を含む水溶液を予め無菌フィルターにより無菌ろ過してから加熱殺菌された豆乳に無菌的に添加することが好ましい。
発酵温度は、３０〜４８℃、好ましくは３５〜４５℃、より好ましくは３７〜４３℃の範囲から、スターターとして利用する乳酸菌株に応じて選択することができる。S. thermophilus T-1株と、L. delbrueckii subsp. bulgaricus T-2株との組合せにおいては、好ましくは３５℃〜４３℃、より好ましくは４１〜４３℃の範囲から発酵温度を選択することができる。
発酵時間は、４〜２４時間、好ましくは８〜２０時間、より好ましくは１０〜１８時間である。
本発明においては、GABA生産量の増加に伴って炭酸ガスの発生量も増加し、乳酸発酵培養系内における酸素ガスに対する炭酸ガスの濃度を相対的に高くして乳酸発酵培養液中に含まれる成分の酸化を抑制していると推定される。従って、本発明においては、特許文献４に記載されるように、雰囲気中の酸素濃度（Ｖ／Ｖ）が５．０％以下又は実質的無酸素雰囲気の状態で豆乳原料の乳酸発酵を行う必要はなく、空気雰囲気に豆乳原料が接触した状態または豆乳原料の溶存酸素濃度が高い状態でも、豆乳由来の成分の酸化による不快臭や不快味の原因となる成分の生成を効率良く抑制することができる。
発酵工程は、原料豆乳に乳酸菌を添加混合し発酵させて、発酵豆乳を得る工程である。
通常、原料豆乳を１２０〜１５０℃で１秒〜数分間の加熱殺菌処理を行った後に、加熱処理された原料豆乳に乳酸菌スターターを接種して乳酸発酵を開始する。
乳酸菌スターターとして、S. thermophilusに属する菌株とL. delbrueckii subsp. bulgaricusに属する菌株とのGABA生産性を有する組合せを用いる。
乳酸発酵促進のために、グルコース、乳糖、果糖、各種オリゴ糖、各種液糖の何れか１種、或いは、２種以上の糖質を原料豆乳に予め添加してもよい。オリゴ糖や液糖としては、市販のあるいは当業者に知られているものから目的とする乳酸発酵促進効果が得られるものを選択して用いることができる。
糖質の豆乳への添加量は、豆乳に対して０．１〜１０質量％の範囲から選択することができ、好ましくは０．５〜５質量％、さらに好ましくは１〜２質量％の範囲から選択することができる。
糖質の豆乳への添加は、原料豆乳及び乳酸発酵液の少なくとも１つに対して行うことができ、複数回に分けて糖質を添加する場合には、その総量が上述した割合となるように設定することが好ましい。原料豆乳に対して糖質を添加する場合には、豆乳の加熱殺菌処理前及び／または加熱殺菌処理後に行うことができる。加熱殺菌後に糖質を加える場合には、糖質を含む水溶液を予め無菌フィルターにより無菌ろ過してから加熱殺菌された豆乳に無菌的に添加することが好ましい。
発酵温度は、３０〜４８℃、好ましくは３５〜４５℃、より好ましくは３７〜４３℃の範囲から、スターターとして利用する乳酸菌株に応じて選択することができる。S. thermophilus T-1株と、L. delbrueckii subsp. bulgaricus T-2株との組合せにおいては、好ましくは３５℃〜４３℃、より好ましくは４１〜４３℃の範囲から発酵温度を選択することができる。
発酵時間は、４〜２４時間、好ましくは８〜２０時間、より好ましくは１０〜１８時間である。
本発明においては、GABA生産量の増加に伴って炭酸ガスの発生量も増加し、乳酸発酵培養系内における酸素ガスに対する炭酸ガスの濃度を相対的に高くして乳酸発酵培養液中に含まれる成分の酸化を抑制していると推定される。従って、本発明においては、特許文献４に記載されるように、雰囲気中の酸素濃度（Ｖ／Ｖ）が５．０％以下又は実質的無酸素雰囲気の状態で豆乳原料の乳酸発酵を行う必要はなく、空気雰囲気に豆乳原料が接触した状態または豆乳原料の溶存酸素濃度が高い状態でも、豆乳由来の成分の酸化による不快臭や不快味の原因となる成分の生成を効率良く抑制することができる。
［カルシウム添加工程］
乳酸発酵豆乳の食感や呈味を含む品質を調整して更に向上させ、かつ、カルシウム成分の補強を図るために、水酸化カルシウムを乳酸発酵豆乳に添加することができる。水酸化カルシウムは、ショ糖水溶液に溶解した形態で用いる。以下、この水酸化カルシウムを含有するショ糖水溶液を「ショ糖・水酸化カルシウム水溶液」という。
ショ糖・水酸化カルシウム水溶液は、ショ糖とともに水酸化カルシウムが水に溶解していることによって、高濃度のカルシウムを溶解状態で含むことができる。その結果、水酸化カルシウム濃度を目的に応じて調整したショ糖・水酸化カルシウム水溶液として、乳酸発酵豆乳中に目的とする濃度のカルシウムを効率良く添加することができる。
ショ糖・水酸化カルシウム水溶液は、発酵終了後に得られる乳酸発酵豆乳に添加することができる。その後の乳酸発酵豆乳の商品形態により、無菌ろ過が必要かどうかを判断して、必要であればショ糖・水酸化カルシウム水溶液を無菌ろ過して用いればよい。
ショ糖・水酸化カルシウム水溶液として乳酸発酵豆乳に添加されるカルシウムの割合は、豆乳中のタンパク質濃度（ＴＮ×６．２５）から算出される豆乳に含まれるタンパク質量当たり０．２〜１．６質量％とすることが好ましい。
乳酸発酵豆乳の食感や呈味を含む品質を調整して更に向上させ、かつ、カルシウム成分の補強を図るために、水酸化カルシウムを乳酸発酵豆乳に添加することができる。水酸化カルシウムは、ショ糖水溶液に溶解した形態で用いる。以下、この水酸化カルシウムを含有するショ糖水溶液を「ショ糖・水酸化カルシウム水溶液」という。
ショ糖・水酸化カルシウム水溶液は、ショ糖とともに水酸化カルシウムが水に溶解していることによって、高濃度のカルシウムを溶解状態で含むことができる。その結果、水酸化カルシウム濃度を目的に応じて調整したショ糖・水酸化カルシウム水溶液として、乳酸発酵豆乳中に目的とする濃度のカルシウムを効率良く添加することができる。
ショ糖・水酸化カルシウム水溶液は、発酵終了後に得られる乳酸発酵豆乳に添加することができる。その後の乳酸発酵豆乳の商品形態により、無菌ろ過が必要かどうかを判断して、必要であればショ糖・水酸化カルシウム水溶液を無菌ろ過して用いればよい。
ショ糖・水酸化カルシウム水溶液として乳酸発酵豆乳に添加されるカルシウムの割合は、豆乳中のタンパク質濃度（ＴＮ×６．２５）から算出される豆乳に含まれるタンパク質量当たり０．２〜１．６質量％とすることが好ましい。
［ショ糖・水酸化カルシウム水溶液］
カルシウム添加用として用いるショ糖・水酸化カルシウム水溶液は、水酸化カルシウムを糖とともに水に添加して撹拌混合するか、あるいは、糖を溶解した糖水溶液に水酸化カルシウムの過剰量を加え撹拌混合し、その後不溶性の画分を除く方法等によって調製することができる。水酸化カルシウムとしては、食品用途して利用し得るものであれば特に限定されない。工業的な大量生産における製造コストの低減という観点からは、石灰岩から得られる食添用消石灰が有用である。
水酸化カルシウムの糖の共存下における溶解度は水溶液の調製温度によって変化する。通常は、同一糖濃度の水溶液中への水酸化カルシウムの溶解濃度は温度と反比例する。すなわち、より低い温度の方がより高い濃度で水酸化カルシウムを溶解させることができる。また、糖濃度や温度等の条件によっては水酸化カルシウムの溶解濃度を正確に予測できない場合があり、そのような場合は、過剰量の水酸化カルシウムを添加して、調製された水溶液中に残存する固形分を分離した後のアルカリ水溶液を利用することができる。この固形分の分離は、静置後の上清取得によって行えば良いが、さらに、遠心分離、膜ろ過、或いは、ろ過助剤の使用による清澄処理等の公知の分離方法で、浮遊している微細な粒子を取り除き、所謂透明な溶液として使用することがより好ましい。
カルシウム添加用として用いるショ糖・水酸化カルシウム水溶液は、水酸化カルシウムを糖とともに水に添加して撹拌混合するか、あるいは、糖を溶解した糖水溶液に水酸化カルシウムの過剰量を加え撹拌混合し、その後不溶性の画分を除く方法等によって調製することができる。水酸化カルシウムとしては、食品用途して利用し得るものであれば特に限定されない。工業的な大量生産における製造コストの低減という観点からは、石灰岩から得られる食添用消石灰が有用である。
水酸化カルシウムの糖の共存下における溶解度は水溶液の調製温度によって変化する。通常は、同一糖濃度の水溶液中への水酸化カルシウムの溶解濃度は温度と反比例する。すなわち、より低い温度の方がより高い濃度で水酸化カルシウムを溶解させることができる。また、糖濃度や温度等の条件によっては水酸化カルシウムの溶解濃度を正確に予測できない場合があり、そのような場合は、過剰量の水酸化カルシウムを添加して、調製された水溶液中に残存する固形分を分離した後のアルカリ水溶液を利用することができる。この固形分の分離は、静置後の上清取得によって行えば良いが、さらに、遠心分離、膜ろ過、或いは、ろ過助剤の使用による清澄処理等の公知の分離方法で、浮遊している微細な粒子を取り除き、所謂透明な溶液として使用することがより好ましい。
ショ糖・水酸化カルシウム水溶液を調製する際のショ糖の投入量としては、目的とする水酸化カルシウムの溶解濃度を達成できる量であればよく、例えば、水に対して２〜３０質量％、好ましくは４〜２０質量％、さらに好ましくは５〜１５質量％の範囲から選択するとよい。
ショ糖・水酸化カルシウム水溶液に含まれる溶解状態にある水酸化カルシウムの濃度は、０．２５質量％〜６．５質量％の範囲から選択することができる。
ショ糖・水酸化カルシウム水溶液の調製温度は、特に制限はないが、５℃〜７０℃、例えば９〜１１℃の冷却温度や２１〜２５℃の通常の室温から選択することができる。
ショ糖・水酸化カルシウム水溶液のｐＨは、例えば１２．０〜１３．０、好ましくは１２．０〜１２．８、より好ましくは１２．３〜１２．８の範囲から選択したｐＨのアルカリ性とすることができる。
ショ糖・水酸化カルシウム水溶液に含まれる溶解状態にある水酸化カルシウムの濃度は、０．２５質量％〜６．５質量％の範囲から選択することができる。
ショ糖・水酸化カルシウム水溶液の調製温度は、特に制限はないが、５℃〜７０℃、例えば９〜１１℃の冷却温度や２１〜２５℃の通常の室温から選択することができる。
ショ糖・水酸化カルシウム水溶液のｐＨは、例えば１２．０〜１３．０、好ましくは１２．０〜１２．８、より好ましくは１２．３〜１２．８の範囲から選択したｐＨのアルカリ性とすることができる。
ショ糖・水酸化カルシウム水溶液は、５０℃以下の水溶液の状態を保持する温度条件下において極めて安定であり、大量に調製して密封貯蔵し、必要に応じて希釈して使用することができる。すなわち、ショ糖・水酸化カルシウム水溶液は、水酸化カルシウムに非還元糖を共存させたことにより、水酸化カルシウムの固形分を含まず、水酸化カルシウムを高濃度で含む状態においても、保存安定性に優れる。従って、大量製造したショ糖・水酸化カルシウム水溶液をストックして必要に応じて使用することができ、更に、乳酸発酵豆乳の製造時における効率的な水酸化カルシウムの利用を達成することができる。
更に、ショ糖・水酸化カルシウム水溶液は固形分を含まないため、無菌濾過による簡便な処理によって無菌化を行うことができる。
［発酵終了工程］
乳酸発酵の終了は、目的とする品質の乳酸発酵豆乳が得られた時点に設定する。例えば、乳酸発酵豆乳の食感及び風味、呈味、並びにｐＨ、GABA生産量及び粘度等の少なくとも１つを指標として乳酸発酵の終了時点を設定することができる。
乳酸発酵豆乳のｐＨを基準として乳酸発酵の終了時点を設定する場合は、乳酸発酵豆乳のｐＨを３．８〜４．５の範囲とすることが好ましく、ｐＨ３．９〜４．４の範囲とすることがより好ましく、ｐＨ４．０〜４．３の範囲とすることが更に好ましい。
乳酸発酵豆乳中のGABA生産量を基準とする場合は、例えば、乳酸発酵豆乳中のGABAの含有量が０．０４ｇ／Ｌ以上の目的とする量に達成した段階で、乳酸発酵を終了することが好ましい。
ショ糖・水酸化カルシウム水溶液を添加する場合には、乳酸発酵豆乳のｐＨが上述した範囲内となるようにその添加量を調節することが好ましい。
乳酸発酵終了後の発酵豆乳には、砂糖などの糖類、酸味料、塩化マグネシウム、乳化安定剤、果汁、香料、甘味料等を必要に応じて加え、その風味を調えてもよい。
乳酸発酵終了後の乳酸発酵豆乳は、そのまま、或いは、ショ糖・水酸化カルシウム水溶液、糖類等により風味を調え、均質化工程を経た後に包装し、乳酸菌の生菌を含んだ状態で低温流通してもよい。
更に、ショ糖・水酸化カルシウム水溶液は固形分を含まないため、無菌濾過による簡便な処理によって無菌化を行うことができる。
［発酵終了工程］
乳酸発酵の終了は、目的とする品質の乳酸発酵豆乳が得られた時点に設定する。例えば、乳酸発酵豆乳の食感及び風味、呈味、並びにｐＨ、GABA生産量及び粘度等の少なくとも１つを指標として乳酸発酵の終了時点を設定することができる。
乳酸発酵豆乳のｐＨを基準として乳酸発酵の終了時点を設定する場合は、乳酸発酵豆乳のｐＨを３．８〜４．５の範囲とすることが好ましく、ｐＨ３．９〜４．４の範囲とすることがより好ましく、ｐＨ４．０〜４．３の範囲とすることが更に好ましい。
乳酸発酵豆乳中のGABA生産量を基準とする場合は、例えば、乳酸発酵豆乳中のGABAの含有量が０．０４ｇ／Ｌ以上の目的とする量に達成した段階で、乳酸発酵を終了することが好ましい。
ショ糖・水酸化カルシウム水溶液を添加する場合には、乳酸発酵豆乳のｐＨが上述した範囲内となるようにその添加量を調節することが好ましい。
乳酸発酵終了後の発酵豆乳には、砂糖などの糖類、酸味料、塩化マグネシウム、乳化安定剤、果汁、香料、甘味料等を必要に応じて加え、その風味を調えてもよい。
乳酸発酵終了後の乳酸発酵豆乳は、そのまま、或いは、ショ糖・水酸化カルシウム水溶液、糖類等により風味を調え、均質化工程を経た後に包装し、乳酸菌の生菌を含んだ状態で低温流通してもよい。
［殺菌工程］
乳酸発酵豆乳は、８５℃以上の加熱を行って流通させても良いが、８５℃〜１５０℃、好ましくは１２０〜１５０℃で、１秒〜３０分、例えば１秒〜５分程度の加熱処理を行い、冷却後に無菌的に包装し、流通させてもよい。高温瞬間加熱滅菌処理後に無菌包装を行えば常温流通が可能である。
乳酸発酵豆乳は、８５℃以上の加熱を行って流通させても良いが、８５℃〜１５０℃、好ましくは１２０〜１５０℃で、１秒〜３０分、例えば１秒〜５分程度の加熱処理を行い、冷却後に無菌的に包装し、流通させてもよい。高温瞬間加熱滅菌処理後に無菌包装を行えば常温流通が可能である。
以下、実験例及び実施例により本発明について更に詳細に説明する。
各実験例及び実施例における各種成分の濃度または含有量、物性は以下の方法により求めた。
（１）豆乳に含まれるタンパク質の濃度
豆乳に含まれるタンパク質の濃度（質量％）は、ケルダール分析法での試料に含まれるトータル窒素量（全窒素量：ＴＮ）を用い、ＴＮ×６．２５として算出された値をタンパク質量として用いて豆乳中のタンパク質濃度を算出した。
（２）GABAの含有量の測定
発酵前豆乳または乳酸発酵豆乳を沸騰浴中で１０分間加熱後、この加熱処理により生じた離水液中のGABAの含有量を以下の条件での高速液体クロマトグラフィー（（株）島津製作所製、型式ＬＣ−１０Ａ）を用いて測定し、得られた測定値から発酵前豆乳または乳酸発酵豆乳のGABA含有量（濃度）を求めた。
Ｉ．分離条件
カラム：Shim-pack Amino-Li(100mmL.×6.0mmI.D.)
移動相：島津アミノ酸移動相キットLi型
A：0.15Nクエン酸（リチウム）緩衝液(pH2.68)、7質量%メチルセロソルブ含む
B：0.30Nクエン酸（リチウム）緩衝液(pH10.0)
C：0.2M水酸化リチウム
グラジエント溶出：
流量： 0.6mL/min
温度： 39℃
II．検出条件
反応試薬：島津アミノ酸分析キットOPA試薬
A：0.002質量%次亜塩素酸ナトリウム溶液
B：0.08質量% o-フタルアルデヒド溶液
流量 ：各0.3mL/min(PRR-2A 目盛り30)
反応温度：39℃
検出器 ：蛍光検出器RF-10AxL
Ex; 350nm
Em; 450nm
Sensitivity; 3
Response; 3
Gain; 1
注入量 ：10μL
（３）二酸化炭素（ＣＯ２）副生値（理論値）
ＣＯ２副生理論値（g/L）の算出は以下の式で求めた。
（Ａ−Ｂ）÷１０３．１２×４４．０１
Ａ：乳酸発酵豆乳のGABA含量（g/Ｌ）
Ｂ：発酵前豆乳のGABA含量（g/L）
Ｃ：GABAの分子量１０３．１２
Ｄ：二酸化炭素（ＣＯ２）の分子量４４．０１
（４）酸度
乳酸発酵豆乳の酸度測定は、フェノールフタレイン指示薬を用いて以下の方法で行った。
（１）フェノールフタレイン試薬を１〜２滴加える。
（２）０．１mol水酸化ナトリウム水溶液で滴定（薄赤色を呈するまで）し、乳酸発酵豆乳１ｇ当たりの滴下量を酸度とした。
（５）ｐＨ
乳酸発酵豆乳のｐＨ測定は、ガラス電極式水素イオン濃度指示計（(株)堀場製作所製、型式ＳＳ０５６）を使用して実施した。
各実験例及び実施例における各種成分の濃度または含有量、物性は以下の方法により求めた。
（１）豆乳に含まれるタンパク質の濃度
豆乳に含まれるタンパク質の濃度（質量％）は、ケルダール分析法での試料に含まれるトータル窒素量（全窒素量：ＴＮ）を用い、ＴＮ×６．２５として算出された値をタンパク質量として用いて豆乳中のタンパク質濃度を算出した。
（２）GABAの含有量の測定
発酵前豆乳または乳酸発酵豆乳を沸騰浴中で１０分間加熱後、この加熱処理により生じた離水液中のGABAの含有量を以下の条件での高速液体クロマトグラフィー（（株）島津製作所製、型式ＬＣ−１０Ａ）を用いて測定し、得られた測定値から発酵前豆乳または乳酸発酵豆乳のGABA含有量（濃度）を求めた。
Ｉ．分離条件
カラム：Shim-pack Amino-Li(100mmL.×6.0mmI.D.)
移動相：島津アミノ酸移動相キットLi型
A：0.15Nクエン酸（リチウム）緩衝液(pH2.68)、7質量%メチルセロソルブ含む
B：0.30Nクエン酸（リチウム）緩衝液(pH10.0)
C：0.2M水酸化リチウム
グラジエント溶出：
流量： 0.6mL/min
温度： 39℃
II．検出条件
反応試薬：島津アミノ酸分析キットOPA試薬
A：0.002質量%次亜塩素酸ナトリウム溶液
B：0.08質量% o-フタルアルデヒド溶液
流量 ：各0.3mL/min(PRR-2A 目盛り30)
反応温度：39℃
検出器 ：蛍光検出器RF-10AxL
Ex; 350nm
Em; 450nm
Sensitivity; 3
Response; 3
Gain; 1
注入量 ：10μL
（３）二酸化炭素（ＣＯ２）副生値（理論値）
ＣＯ２副生理論値（g/L）の算出は以下の式で求めた。
（Ａ−Ｂ）÷１０３．１２×４４．０１
Ａ：乳酸発酵豆乳のGABA含量（g/Ｌ）
Ｂ：発酵前豆乳のGABA含量（g/L）
Ｃ：GABAの分子量１０３．１２
Ｄ：二酸化炭素（ＣＯ２）の分子量４４．０１
（４）酸度
乳酸発酵豆乳の酸度測定は、フェノールフタレイン指示薬を用いて以下の方法で行った。
（１）フェノールフタレイン試薬を１〜２滴加える。
（２）０．１mol水酸化ナトリウム水溶液で滴定（薄赤色を呈するまで）し、乳酸発酵豆乳１ｇ当たりの滴下量を酸度とした。
（５）ｐＨ
乳酸発酵豆乳のｐＨ測定は、ガラス電極式水素イオン濃度指示計（(株)堀場製作所製、型式ＳＳ０５６）を使用して実施した。
［実験例１］
国産全粒大豆を一晩水に浸漬し、水を切った膨潤大豆に新しい水を加えながら磨砕した生呉を加熱後、固液分離して豆乳を得た。得られた豆乳に対して、１３０℃、６８秒の加熱処理を行い、アセプティック充填包装機（オリヒロ(株)製、型式ＯＮＰＡＣＫ−ＡＦ２０００）で１ｋｇの無菌包装を行い、豆乳原液（固形分濃度１２．８質量％、タンパク質濃度７．０質量％）として使用した。この豆乳中の溶存酸素濃度をマルチ水質チェッカー（(株)佐藤商事製、型式ＷＡ−２０１７ＳＤＪ＋ＯＸＰＢ−１１）で測定したところ１２ｍｇ／Ｌであった。
豆乳原液１９５ｇに、無菌ろ過処理を行った３３質量％グルコース溶液９ｇ、殺菌水９０ｇを加えた２９４ｇの調整溶液を発酵前豆乳（タンパク質濃度４．６質量％）とした。
こうして得られた発酵前豆乳に、スターター９ｇを添加して３７℃で３日間培養した。
スターターとして、S. thermophilusとL. delbrueckii subsp. bulgaricusの組合せからなる以下の混合菌（Ａ）〜（Ｅ）をそれぞれ個々に用いた。
（Ａ）S. thermophilus T-1株４．５ｇと、L. delbrueckii subsp. bulgaricus T-2株４．５ｇの混合菌、
（Ｂ）ＹＯ−ＭＩＸ３００ＬＹＯ５０ＤＣＵ（ダニスコ社製）、
（Ｃ）ＹＣ−３５０（クリスチャンハンセン社製）、
（Ｄ）ＣＨ−１（クリスチャンハンセン社製）、
（Ｅ）ＹＦ−３３３１（クリスチャンハンセン社製）
なお、混合菌（Ｂ）〜（Ｅ）は市販の乳酸発酵用のスターターである。
発酵終了後、夫々の乳酸発酵豆乳各５０ｇについて、GABAの含有量を算出した。発酵前豆乳並びに発酵後の乳酸発酵豆乳中のGABA生産の推移を表２及び図１に示した。
国産全粒大豆を一晩水に浸漬し、水を切った膨潤大豆に新しい水を加えながら磨砕した生呉を加熱後、固液分離して豆乳を得た。得られた豆乳に対して、１３０℃、６８秒の加熱処理を行い、アセプティック充填包装機（オリヒロ(株)製、型式ＯＮＰＡＣＫ−ＡＦ２０００）で１ｋｇの無菌包装を行い、豆乳原液（固形分濃度１２．８質量％、タンパク質濃度７．０質量％）として使用した。この豆乳中の溶存酸素濃度をマルチ水質チェッカー（(株)佐藤商事製、型式ＷＡ−２０１７ＳＤＪ＋ＯＸＰＢ−１１）で測定したところ１２ｍｇ／Ｌであった。
豆乳原液１９５ｇに、無菌ろ過処理を行った３３質量％グルコース溶液９ｇ、殺菌水９０ｇを加えた２９４ｇの調整溶液を発酵前豆乳（タンパク質濃度４．６質量％）とした。
こうして得られた発酵前豆乳に、スターター９ｇを添加して３７℃で３日間培養した。
スターターとして、S. thermophilusとL. delbrueckii subsp. bulgaricusの組合せからなる以下の混合菌（Ａ）〜（Ｅ）をそれぞれ個々に用いた。
（Ａ）S. thermophilus T-1株４．５ｇと、L. delbrueckii subsp. bulgaricus T-2株４．５ｇの混合菌、
（Ｂ）ＹＯ−ＭＩＸ３００ＬＹＯ５０ＤＣＵ（ダニスコ社製）、
（Ｃ）ＹＣ−３５０（クリスチャンハンセン社製）、
（Ｄ）ＣＨ−１（クリスチャンハンセン社製）、
（Ｅ）ＹＦ−３３３１（クリスチャンハンセン社製）
なお、混合菌（Ｂ）〜（Ｅ）は市販の乳酸発酵用のスターターである。
発酵終了後、夫々の乳酸発酵豆乳各５０ｇについて、GABAの含有量を算出した。発酵前豆乳並びに発酵後の乳酸発酵豆乳中のGABA生産の推移を表２及び図１に示した。
GABA生産能力が最も高かったのは混合菌（Ａ）（S. thermophilus T-1株とL. delbrueckii subsp. bulgaricus T-2の組合せ）であり、次いで高かったのは混合菌（Ｅ）（ＹＦ−３３３１；クリスチャンハンセン社製）であり、他の３種の混合菌は全くGABA生産を行わなかった。
以上の結果から、S. thermophilusとL. delbrueckii subsp. bulgaricusとの混合菌でのGABAの生産については、これまで豆乳を基質としては全く報告されていなかったが、本発明者らによって一部の菌株によるGABA生産の可能性を見出し、特に、上記の２種の菌株の組合せからなる混合菌（Ａ）の優良性が認められた。
以上の結果から、S. thermophilusとL. delbrueckii subsp. bulgaricusとの混合菌でのGABAの生産については、これまで豆乳を基質としては全く報告されていなかったが、本発明者らによって一部の菌株によるGABA生産の可能性を見出し、特に、上記の２種の菌株の組合せからなる混合菌（Ａ）の優良性が認められた。
［実験例２］
実験例１で使用した豆乳原液１９５ｇに、無菌ろ過処理を行った３３質量％グルコース溶液９ｇ、殺菌水９０ｇを加えた２９４ｇの調整溶液を発酵前豆乳（タンパク質濃度４．６質量％）とした。こうして得られた発酵前豆乳に、スターターとして、実験例１においてGABA生産混合菌として確認した混合菌（Ａ）における２種の菌株としての、S. thermophilus T-1株４．５ｇと、L. delbrueckii subsp. bulgaricus T-2 株４．５ｇを加え、４３℃で１５時間静置発酵させ、得られた乳酸発酵豆乳をＡタイプとした。
これに対し、上記同様に調整した発酵前豆乳に、スターターとして、実験例１においてGABA非生産混合菌として確認した混合菌（Ｂ）（ＹＯ−ＭＩＸ３００ＬＹＯ５０ＤＣＵ 株；ダニスコ社製）９ｇを加え、４３℃で１５時間静置発酵させ、得られた乳酸発酵豆乳をＢタイプとした。
発酵終了後、Ａタイプ及びＢタイプの夫々の乳酸発酵豆乳各５０ｇについてGABAの含有量を算出し、それに伴うＣＯ２副生値を求めた。各タイプの乳酸発酵豆乳における、発酵前豆乳並びに発酵後の乳酸発酵豆乳中のGABAの含有量、GABA生産に伴うＣＯ２副生値、並びに、専門パネルによる乳酸発酵豆乳の官能評価の結果を図２及び表３に示した。
乳酸発酵豆乳の官能評価は、７名のパネラーのそれぞれによる図２に示すチェック項目についての１（弱い）〜５（強い）の５段階評価の平均値により行った。
実験例１で使用した豆乳原液１９５ｇに、無菌ろ過処理を行った３３質量％グルコース溶液９ｇ、殺菌水９０ｇを加えた２９４ｇの調整溶液を発酵前豆乳（タンパク質濃度４．６質量％）とした。こうして得られた発酵前豆乳に、スターターとして、実験例１においてGABA生産混合菌として確認した混合菌（Ａ）における２種の菌株としての、S. thermophilus T-1株４．５ｇと、L. delbrueckii subsp. bulgaricus T-2 株４．５ｇを加え、４３℃で１５時間静置発酵させ、得られた乳酸発酵豆乳をＡタイプとした。
これに対し、上記同様に調整した発酵前豆乳に、スターターとして、実験例１においてGABA非生産混合菌として確認した混合菌（Ｂ）（ＹＯ−ＭＩＸ３００ＬＹＯ５０ＤＣＵ 株；ダニスコ社製）９ｇを加え、４３℃で１５時間静置発酵させ、得られた乳酸発酵豆乳をＢタイプとした。
発酵終了後、Ａタイプ及びＢタイプの夫々の乳酸発酵豆乳各５０ｇについてGABAの含有量を算出し、それに伴うＣＯ２副生値を求めた。各タイプの乳酸発酵豆乳における、発酵前豆乳並びに発酵後の乳酸発酵豆乳中のGABAの含有量、GABA生産に伴うＣＯ２副生値、並びに、専門パネルによる乳酸発酵豆乳の官能評価の結果を図２及び表３に示した。
乳酸発酵豆乳の官能評価は、７名のパネラーのそれぞれによる図２に示すチェック項目についての１（弱い）〜５（強い）の５段階評価の平均値により行った。
図２に示されている様に、GABA非生産混合菌によるＢタイプ乳酸発酵豆乳が渋み、嫌な味、嫌な臭いが強いのに比べ、GABA生産混合菌によるＡタイプ乳酸発酵豆乳では渋み、嫌な味、嫌な臭いが明らかに抑えられていた。このことは、表３で示されている様にGABA生産混合菌によるＡタイプ乳酸発酵豆乳では、二酸化炭素の副生値がGABA非生産混合菌による場合の１０倍程度となっており、発酵中の豆乳品質の酸化劣化を防いだものと考えられる。
［実験例３］
実験例１で使用した豆乳原液１９５ｇに、無菌ろ過処理を行った３３質量％グルコース溶液９ｇ、殺菌水９０ｇを加えた発酵前豆乳（タンパク質濃度４．６質量％）２９４ｇに、以下の各スターターをそれぞれ個々に添加した。
（Ｉ）S. thermophilus T-1株４．５ｇ及びL. delbrueckii subsp. bulgaricus T-2株４．５ｇの組合せ。
（ＩＩ）L. delbrueckii subsp. bulgaricus T-2株９ｇ単独。
（ＩＩＩ）S. thermophilus T-1株９ｇ単独。
これらスターター（Ｉ）〜（ＩＩＩ）をそれぞれ個々に豆乳原液に添加して４３℃で１５時間発酵させた。
これらの操作は無菌的に行い、静置発酵を行った。こうして得られたそれぞれの乳酸発酵豆乳中のGABA含有量、それに伴うＣＯ２副生値を求めた。更に、実験例２と同様にして専門パネルによる乳酸発酵豆乳の官能評価を行った。その結果を図３及び表４に示した。
実験例１で使用した豆乳原液１９５ｇに、無菌ろ過処理を行った３３質量％グルコース溶液９ｇ、殺菌水９０ｇを加えた発酵前豆乳（タンパク質濃度４．６質量％）２９４ｇに、以下の各スターターをそれぞれ個々に添加した。
（Ｉ）S. thermophilus T-1株４．５ｇ及びL. delbrueckii subsp. bulgaricus T-2株４．５ｇの組合せ。
（ＩＩ）L. delbrueckii subsp. bulgaricus T-2株９ｇ単独。
（ＩＩＩ）S. thermophilus T-1株９ｇ単独。
これらスターター（Ｉ）〜（ＩＩＩ）をそれぞれ個々に豆乳原液に添加して４３℃で１５時間発酵させた。
これらの操作は無菌的に行い、静置発酵を行った。こうして得られたそれぞれの乳酸発酵豆乳中のGABA含有量、それに伴うＣＯ２副生値を求めた。更に、実験例２と同様にして専門パネルによる乳酸発酵豆乳の官能評価を行った。その結果を図３及び表４に示した。
図３に示されている様に、上記２種の菌株のそれぞれの単独発酵では、共にえぐ味と嫌な味が強く感じられた。特に、スターター（III）としてのS. thermophilus T-1株単独発酵では、渋み、嫌な臭いが強く感じられ、GABA生産を伴わない単独発酵では風味や後味の悪さが強調されることが明らかとなった。上記２種の菌株の混合発酵ではGABAの生産に伴う二酸化炭素の副生によって発酵豆乳の風味の劣化の抑止が成されているものと考えられる。
なお、S. thermophilus T-1株を単独で用いたスターター（III）により得られた発酵豆乳について、果糖の含有量を測定（(株)Ｊ．Ｋ．インターナショナル製、Ｆ−キット ショ糖／グルコース／果糖）したところ、果糖の含有量の測定値は発酵前豆乳で０．２６ｇ／Ｌ、４３℃、１５時間発酵後で０．３０ｇ／Ｌであった（試みに、２５時間まで発酵させた場合では、０．４３ｇ／Ｌであった）。
なお、S. thermophilus T-1株を単独で用いたスターター（III）により得られた発酵豆乳について、果糖の含有量を測定（(株)Ｊ．Ｋ．インターナショナル製、Ｆ−キット ショ糖／グルコース／果糖）したところ、果糖の含有量の測定値は発酵前豆乳で０．２６ｇ／Ｌ、４３℃、１５時間発酵後で０．３０ｇ／Ｌであった（試みに、２５時間まで発酵させた場合では、０．４３ｇ／Ｌであった）。
［実験例４］
実験例１と同様の殺菌済み豆乳原液３９０ｇに無菌ろ過処理を行った３３質量％グルコース溶液１８ｇと、殺菌水１８０ｇを添加して発酵前豆乳（タンパク質濃度４．６質量％）とした。なお、これらの操作は無菌的に行った。発酵前豆乳にスターターとしてS. thermophilus T-1株９ｇ、及びL. delbrueckii subsp. bulgaricus T-2株９ｇを加え、４３℃で１５時間発酵させた（発酵終了時ｐＨ３．９５）。
こうして得られた乳酸発酵豆乳から一部（５０ｇ）を測定用試料として採取し、乳酸発酵豆乳のGABA含有量を求めた。乳酸発酵豆乳を各２５０ｇの２組に分け、一方には殺菌水８．９ｇを加え、ヒスコトロン（（株）マイクロテックニチオン、型式ＮＳ−５０）を用いて乳化した。もう一方には、６．０質量％ショ糖水溶液に水酸化カルシウムを溶解して調製したショ糖・水酸化カルシウム水溶液（１．５６質量％水酸化カルシウム水溶液）８．９ｇ（カルシウムとして７５ｍｇ）を、ヒスコトロンでの乳化工程で添加し、ｐＨ調整を行った（調整後ｐＨ４．１１）。
乳酸発酵豆乳中のＧＡＢＡ含有量、それに伴うＣＯ２副生値、並びに、実験例２と同様にして行った専門パネルによる乳酸発酵豆乳の官能評価の結果を図４及び表５に示した。
実験例１と同様の殺菌済み豆乳原液３９０ｇに無菌ろ過処理を行った３３質量％グルコース溶液１８ｇと、殺菌水１８０ｇを添加して発酵前豆乳（タンパク質濃度４．６質量％）とした。なお、これらの操作は無菌的に行った。発酵前豆乳にスターターとしてS. thermophilus T-1株９ｇ、及びL. delbrueckii subsp. bulgaricus T-2株９ｇを加え、４３℃で１５時間発酵させた（発酵終了時ｐＨ３．９５）。
こうして得られた乳酸発酵豆乳から一部（５０ｇ）を測定用試料として採取し、乳酸発酵豆乳のGABA含有量を求めた。乳酸発酵豆乳を各２５０ｇの２組に分け、一方には殺菌水８．９ｇを加え、ヒスコトロン（（株）マイクロテックニチオン、型式ＮＳ−５０）を用いて乳化した。もう一方には、６．０質量％ショ糖水溶液に水酸化カルシウムを溶解して調製したショ糖・水酸化カルシウム水溶液（１．５６質量％水酸化カルシウム水溶液）８．９ｇ（カルシウムとして７５ｍｇ）を、ヒスコトロンでの乳化工程で添加し、ｐＨ調整を行った（調整後ｐＨ４．１１）。
乳酸発酵豆乳中のＧＡＢＡ含有量、それに伴うＣＯ２副生値、並びに、実験例２と同様にして行った専門パネルによる乳酸発酵豆乳の官能評価の結果を図４及び表５に示した。
表５に示されている様に、ショ糖・水酸化カルシウム水溶液を添加することにより酸度が低減するので、図４に示すように酸味が和らぐのは当然であるが、さらに、渋み、嫌な味、嫌な臭い、ザラつきが低減するという効果をもたらした。
［実験例５］
実験例１で使用した豆乳原液２００ｇに、無菌ろ過処理を行った３３質量％グルコース溶液を０ｇ、１．６ｇ、３．２ｇ、６．４ｇ、８．０ｇ、１６ｇを加えた後、それぞれに殺菌水を５７ｇ、５５．４ｇ、５３．８ｇ、５０．６ｇ、４９ｇ、４１ｇを加えて、トータル重量を２５７ｇ（タンパク質濃度５．４質量％）に揃えた。
上記の様にグルコース無添加豆乳に対して、グルコースを０、０．２、０．４、０．８、１．０、２．０質量％まで６段階に調整した発酵前豆乳それぞれに、スターターとしてS. thermophilus T-1株４ｇ及びL. delbrueckii subsp. bulgaricus T-2株４ｇを加え、３７℃で２４時間発酵させた。
それぞれの乳酸発酵豆乳中のGABA含有量と共に、ＣＯ２副生値を求め、その結果を表６に示した。
［実験例５］
実験例１で使用した豆乳原液２００ｇに、無菌ろ過処理を行った３３質量％グルコース溶液を０ｇ、１．６ｇ、３．２ｇ、６．４ｇ、８．０ｇ、１６ｇを加えた後、それぞれに殺菌水を５７ｇ、５５．４ｇ、５３．８ｇ、５０．６ｇ、４９ｇ、４１ｇを加えて、トータル重量を２５７ｇ（タンパク質濃度５．４質量％）に揃えた。
上記の様にグルコース無添加豆乳に対して、グルコースを０、０．２、０．４、０．８、１．０、２．０質量％まで６段階に調整した発酵前豆乳それぞれに、スターターとしてS. thermophilus T-1株４ｇ及びL. delbrueckii subsp. bulgaricus T-2株４ｇを加え、３７℃で２４時間発酵させた。
それぞれの乳酸発酵豆乳中のGABA含有量と共に、ＣＯ２副生値を求め、その結果を表６に示した。
表６に示されている様に、グルコース無添加豆乳であってもGABA生産は成されているが、グルコース１．０質量％までの添加では添加量に比例してGABA生産量は向上した。
［実施例１］
固形分濃度１１質量％、タンパク質濃度５．６質量％の豆乳（ｐＨ６．６）に対して、１３０℃、６８秒の加熱処理を行い、２０℃迄冷却した殺菌豆乳４００ｋｇを、殺菌済みの発酵タンク（空気濾過フィルター付き）に入れ、無菌ろ過処理を行った３３質量％グルコース溶液１０ｋｇを加え、発酵前豆乳とした。なお、これらの操作は無菌的に行った。発酵前豆乳にスターターとしてS. thermophilus T-1株５ｋｇ、及びL. delbrueckii subsp. bulgaricus T-2株５ｋｇを加え、４３℃で１５時間静置発酵させた。（発酵豆乳のタンパク質：５．３質量％、グルコース：０．８質量％、スターター：２．４質量％）
乳酸発酵終了後、撹拌機で均一にし、発酵豆乳をサンプリングしてｐＨを測定（ｐＨ３．９７）、粘度は２０℃測定で２，１８０ｍＰａ・ｓ（東機産業(株)製、Ｂ型粘度計使用）であった。さらにこうして得られた乳酸発酵豆乳のGABA含有量及びそれに伴うＣＯ２副生値を求めた。GABA含有量は０．１９４g/L、ＣＯ２副生値（理論値）は０．０７０g/Lであった。
固形分濃度１１質量％、タンパク質濃度５．６質量％の豆乳（ｐＨ６．６）に対して、１３０℃、６８秒の加熱処理を行い、２０℃迄冷却した殺菌豆乳４００ｋｇを、殺菌済みの発酵タンク（空気濾過フィルター付き）に入れ、無菌ろ過処理を行った３３質量％グルコース溶液１０ｋｇを加え、発酵前豆乳とした。なお、これらの操作は無菌的に行った。発酵前豆乳にスターターとしてS. thermophilus T-1株５ｋｇ、及びL. delbrueckii subsp. bulgaricus T-2株５ｋｇを加え、４３℃で１５時間静置発酵させた。（発酵豆乳のタンパク質：５．３質量％、グルコース：０．８質量％、スターター：２．４質量％）
乳酸発酵終了後、撹拌機で均一にし、発酵豆乳をサンプリングしてｐＨを測定（ｐＨ３．９７）、粘度は２０℃測定で２，１８０ｍＰａ・ｓ（東機産業(株)製、Ｂ型粘度計使用）であった。さらにこうして得られた乳酸発酵豆乳のGABA含有量及びそれに伴うＣＯ２副生値を求めた。GABA含有量は０．１９４g/L、ＣＯ２副生値（理論値）は０．０７０g/Lであった。
［実施例２］
固形分濃度１０．１質量％、タンパク質濃度５．１質量％の豆乳（ｐＨ６．５）に対して、１３０℃、６８秒の加熱処理を行い、２０℃迄冷却した豆乳４００ｋｇを、殺菌済み発酵タンク（空気濾過フィルター付き）に入れ、滅菌水３０ｋｇ、無菌ろ過処理を行った３３％グルコース溶液１１ｋｇを加え、発酵前豆乳とした。なお、これらの操作は無菌的に行った。発酵前豆乳にスターターとして、S. thermophilus T-1株６ｋｇ、及びL. delbrueckii subsp. bulgaricus T-2株６ｋｇを加え、４１℃で１６時間発酵させた。（発酵豆乳のタンパク質：４．５質量％、グルコース：０．８質量％、スターター：２．６質量％）
乳酸発酵豆乳をサンプリングし、ｐＨを測定（ｐＨ３．９７）し、GABA含有量及びそれに伴うＣＯ２副生量を求めたところ、GABA含有量は０．１０６ｇ／Ｌ、ＣＯ２副生値（理論値）は０．０３７ｇ／Ｌ．であった。
この乳酸発酵豆乳の粘度（東機産業(株)製、Ｂ型粘度計使用）は、２０℃測定で１，３００ｍＰａ・ｓであった。
発酵終了後の発酵豆乳４００ｋｇに対して、ショ糖・水酸化カルシウム水溶液（６％ショ糖溶液に溶解した１．４６質量％水酸化カルシウム水溶液）１５．３ｋｇ（カルシウムとして１２０ｍｇ）を添加、ｐＨは４．１３、粘度は２０℃測定で１，２７０ｍＰａ・ｓであった。さらに、果糖ブドウ糖液糖、砂糖、結晶セルロースを加えて乳化、均質化処理を行った後に、１３０℃、９４秒の加熱理、乳化処理を行ってスタンディングパウチ無菌製袋充填包装機（オリヒロ(株)製、ＯＮＰＡＣＫ−ＡＦ−３０３０）で、１３０ｇ充填を行った。
なお、各実験例及び各実施例の一連の操作では混合に殺菌済み容器を使用し、無菌豆乳への殺菌水や無菌ろ過したグルコース溶液の添加混合、さらには、無菌雰囲気下で調整されたスターターを清浄な実験室内で開封して添加混合し、全体を清浄なポリフイルムで包装して乳酸発酵を行った。
固形分濃度１０．１質量％、タンパク質濃度５．１質量％の豆乳（ｐＨ６．５）に対して、１３０℃、６８秒の加熱処理を行い、２０℃迄冷却した豆乳４００ｋｇを、殺菌済み発酵タンク（空気濾過フィルター付き）に入れ、滅菌水３０ｋｇ、無菌ろ過処理を行った３３％グルコース溶液１１ｋｇを加え、発酵前豆乳とした。なお、これらの操作は無菌的に行った。発酵前豆乳にスターターとして、S. thermophilus T-1株６ｋｇ、及びL. delbrueckii subsp. bulgaricus T-2株６ｋｇを加え、４１℃で１６時間発酵させた。（発酵豆乳のタンパク質：４．５質量％、グルコース：０．８質量％、スターター：２．６質量％）
乳酸発酵豆乳をサンプリングし、ｐＨを測定（ｐＨ３．９７）し、GABA含有量及びそれに伴うＣＯ２副生量を求めたところ、GABA含有量は０．１０６ｇ／Ｌ、ＣＯ２副生値（理論値）は０．０３７ｇ／Ｌ．であった。
この乳酸発酵豆乳の粘度（東機産業(株)製、Ｂ型粘度計使用）は、２０℃測定で１，３００ｍＰａ・ｓであった。
発酵終了後の発酵豆乳４００ｋｇに対して、ショ糖・水酸化カルシウム水溶液（６％ショ糖溶液に溶解した１．４６質量％水酸化カルシウム水溶液）１５．３ｋｇ（カルシウムとして１２０ｍｇ）を添加、ｐＨは４．１３、粘度は２０℃測定で１，２７０ｍＰａ・ｓであった。さらに、果糖ブドウ糖液糖、砂糖、結晶セルロースを加えて乳化、均質化処理を行った後に、１３０℃、９４秒の加熱理、乳化処理を行ってスタンディングパウチ無菌製袋充填包装機（オリヒロ(株)製、ＯＮＰＡＣＫ−ＡＦ−３０３０）で、１３０ｇ充填を行った。
なお、各実験例及び各実施例の一連の操作では混合に殺菌済み容器を使用し、無菌豆乳への殺菌水や無菌ろ過したグルコース溶液の添加混合、さらには、無菌雰囲気下で調整されたスターターを清浄な実験室内で開封して添加混合し、全体を清浄なポリフイルムで包装して乳酸発酵を行った。
Claims (10)
- 豆乳を原料とする乳酸発酵豆乳の製造方法において、
豆乳に乳酸菌を添加して乳酸発酵を行い、乳酸発酵豆乳を得る乳酸発酵工程を有し、
前記乳酸菌が、共生関係においてγ−アミノ酪酸を生産するストレプトコッカス・サーモフィラスとラクトバチルス・デルブリッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスの組合せであり、該組合せとしてストレプトコッカス・サーモフィラス T-1株（Streptococcus thermophilus T-1株：NITE P-02365）と、ラクトバチルス・デルブリュッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス T-2株（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus T-2： NITE P-02366）の組合せを用いることを特徴とする乳酸発酵豆乳の製造方法。 - 豆乳を原料とする乳酸発酵豆乳の製造方法において、
豆乳に乳酸菌を添加して乳酸発酵を行い、乳酸発酵豆乳を得る乳酸発酵工程と、
前記乳酸発酵豆乳に水酸化カルシウムを含有するショ糖溶液を添加する工程と、
を有し、
前記乳酸菌が、共生関係においてγ−アミノ酪酸を生産するストレプトコッカス・サー
モフィラスとラクトバチルス・デルブリュッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスの組
合せであり、該組合せとしてストレプトコッカス・サーモフィラス T-1株（Streptococcus thermophilus T-1株：NITE P-02365）と、ラクトバチルス・デルブリュッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス T-2株（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus T-2： NITE P-02366）の組合せを用いることを特徴とする乳酸発酵豆乳の製造方法。 - ショ糖・水酸化カルシウム水溶液によってカルシウムが、前記豆乳中の大豆タンパク質の０．２〜１．６質量％の量で添加される請求項２に記載の乳酸発酵豆乳の製造方法。
- 前記乳酸発酵豆乳のγ−アミノ酪酸濃度が、０．０４ｇ／Ｌ以上である請求項１乃至３のいずれか１項に記載の乳酸発酵豆乳の製造方法。
- 乳酸発酵豆乳のｐＨが３．８〜４．５である請求項１乃至４のいずれか１項に記載の乳酸発酵豆乳の製造方法。
- 前記豆乳に含まれるたんぱく質量が、ケルダール分析法での前記豆乳のトータル窒素量（ＴＮ）が、０．３〜１．２質量％である請求項１乃至５のいずれか１項に記載の乳酸発酵豆乳の製造方法。
- 前記乳酸発酵豆乳の粘度が、２，５００ｍＰａ・ｓ以下である請求項１乃至６のいずれか１項に記載の乳酸発酵豆乳の製造方法。
- 前記豆乳にグルコース、乳糖、果糖、オリゴ糖、液糖の何れか１種、或いは、２種以上を混合して添加する請求項１乃至７のいずれか１項に記載の乳酸発酵豆乳の製造方法。
- 前記乳酸発酵豆乳が、糖類、酸味料、塩化マグネシウム、乳化安定剤、果汁、香料及び甘味料の少なくとも１種を含む請求項１乃至８のいずれか１項に記載の乳酸発酵豆乳の製造方法。
- 前記乳酸発酵豆乳を８５℃〜１５０℃、１秒〜３０分の範囲で加熱処理を行う加熱工程を有する請求項１乃至９のいずれか１項に記載の乳酸発酵豆乳の製造方法。
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