CN102753026A - 经改进的豆奶发酵 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用L.delbrueckii和能够刺激L.delbrueckii生长的菌株来制备基于大豆的发酵食品的方法，和能够通过此类方法获得的食品。本发明还提供了包含所述菌株的培养物，及其用于制备所述发酵食品的用途。

Description

经改进的豆奶发酵
发明领域
本发明属于发酵包含大豆蛋白(soy protein)作为主要蛋白质组分的水性培养基、特别是为了获得大豆酸乳(soy yogurt)的领域。本发明提供了用于生产基于大豆的发酵食品的方法，和藉此获得的基于大豆的发酵食品。本发明还涉及用于制备此类基于大豆的发酵食品的新培养物。
发明背景
根据the Codex Alimentarius(FAO/WHO 1977)，酸乳是用Lactobacillusdelbrueckii subsp.bulgaricus和Streptococcus thermophilus的共生培养物发酵的乳类。有时在牛乳酸乳的制备中也使用Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis。
在大豆酸乳中，主要的蛋白质来源不是乳类，而是大豆。大豆酸乳通常用酸乳培养物，即Lactobacillus bulgaricus(Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus)和Streptococcus thermophilus的共生培养物发酵，所述共生培养物任选地与其他乳酸细菌组合。
与牛乳相比大豆价格更低并且更加丰富，并且不含有胆固醇。酸乳是西方社会中最快速生长的经培养的牛乳制品之一。大豆酸乳可由于不含胆固醇的优势而掌控市场。因此，存在开发大豆酸乳的经济学动机，所述大豆酸乳中大豆可被用作主要成分。此类大豆酸乳的基础可以是源自大豆的豆奶。大豆中主要的碳水化合物是蔗糖、棉子糖和木苏糖(stachyose)。限制大豆及其衍生物如大豆酸乳的广泛消费的主要问题是它们令人不悦的豆腥味(beany flavor)和高水平的寡糖棉子糖和木苏糖，所述高水平的寡糖在以可观量消费时可导致胃气胀。
Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus(下文也称作“Lactobacillusdelbrueckii bulgaricus”、“Lactobacillus bulgaricus”或“L.bulgaricus”)在豆奶中通常显示与在牛乳中相比受限制的生长。这影响使用Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus发酵的发酵大豆制品的特性。本发明人目前发现，某些Lactobacillus plantarum菌株促进含有大豆蛋白的培养基中Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus的生长，从而与不存在此类Lactobacillus plantarum菌株时发酵获得的此类制品相比，使用Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus和Streptococcus thermophilus通过发酵豆奶获得的酸乳型产物得到改善。
L.delbrueckii subsp.bulgaricus较差地降解作为豆奶中存在的主要糖组分之一的蔗糖。不希望受理论束缚，假设影响L.delbrueckii subsp.Bulgaricus生长的Lactobacillus plantarum菌株能够将蔗糖、棉子糖和/或木苏糖分子降解成允许L.delbrueckii subsp.bulgaricus生长的底物。
发明内容
开发了鉴定与天然底物中混合培养物表现相关的菌株依赖型性状的组合筛选途径，并用于针对乳和豆奶中与Streptococcus thermophilusCNRZ1066和Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus ATCC-BAA365的2物种或3物种混合培养生长来筛选L.plantarum菌株的集合。这揭示了L.plantarum B1839、B2484和B2485对豆奶中L.bulgaricus的菌株依赖型刺激效应，导致不依赖于S.thermophilus存在的相关性相互关系。尽管在与L.plantarum的40种混合培养物中的38种中，在豆奶中发酵(37℃下5-ml静态分批发酵24小时)4轮后L.bulgaricus水平低于检测极限(500CFU/ml)，但是与相应的单种培养(monoculture)相比菌株B1839刺激L.bulgaricus超过100倍，得到接近108CFU/ml。在还包括S.thermophilus的3物种混合培养物中也观察到所述效应，得到3物种的稳定培养物。所述刺激效应能够在1L搅拌分批发酵中再现，其中，所述发酵可被进行来在豆奶中研究L.plantarum菌株B1839的所有可能组合的种群动态(population dynamics)。显然，菌株B1839刺激天然豆奶(不添加额外的糖)中L.bulgaricus的生产，并且藉此能够对发酵的豆奶制品赋予酸乳样特性。在3物种混合培养物中，菌株B2484和B2485也在豆奶中对L.bulgaricus具有刺激效应。
因此，在第一方面中，本发明提供了制备发酵的大豆制品的方法，所述方法包括下述步骤：用除Lactobacillus delbrueckii以外还包含能够刺激Lactobacillus delbrueckii生长的菌株的混合细菌培养物发酵包含0.25-10％(w/w)大豆蛋白的水性培养基。
在第二方面中，本发明涉及包含Lactobacillus delbrueckii和能够刺激Lactobacillus delbrueckii生长的菌株的发酵大豆制品。
在又一方面中，本发明涉及包含Lactobacillus delbrueckii和能够刺激Lactobacillus delbrueckii生长的菌株的培养物。
在其他方面中，本发明提供了Lactobacillus plantarum B1839、B2482和/或B2485用于刺激Lactobacillus delbrueckii、优选地Lactobacillusdelbrueckii subsp.bulgaricus、优选地Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus ATCC-BAA365、ATCC-11842或Ib在包含0.25-10％(w/w)大豆蛋白的水性培养基中的生长的用途，及其在包含0.25-10％(w/w)大豆蛋白的水性培养基的混合培养物发酵中的用途。
还在另一方面中，本发明提供了用于鉴定能够刺激培养基中Lactobacillus delbrueckii生长的乳酸细菌菌株的方法，所述方法包括步骤：a)在所述培养基中培养Lactobacillus delbrueckii的单种培养物；b)在所述培养基中培养Lactobacillus delbrueckii和所述乳酸细菌菌株的混合培养物；c)将Lactobacillus delbrueckii在所述单种培养物中的生长与在所述混合培养物中的生长进行比较；和d)选择提高所述培养基中Lactobacillusdelbrueckii菌落形成单位的乳酸细菌菌株。
具体实施方式
针对豆奶中的混合培养物发酵特性筛选L.plantarum菌株得到40种L.plantarum-S.thermophilus培养物，所述培养物的两种物种都具有高CFU水平。所述组合还优于包含L.bulgaricus的3物种混合培养物，然而，在这些培养物中的5种仍检测到L.bulgaricus。因为在所有单种培养物对照以及与S.thermophilus的混合培养物对照中均检测到L.bulgaricus，所以得出下述结论：所述物种在与L.plantarum的混合培养物中以及在3物种培养物中的生长是L.plantarum菌株依赖型的。三种L.plantarum菌株B1839、B2484和B2485甚至在相应的3物种组合中导致提高的L.bulgaricus的CFU水平。与L.plantarum菌株B1839一起时，L.bulgaricusCFU水平最高：分别是相应的单种培养物对照和混合培养物对照中的171倍和23倍。为此，选择菌株B1839来研究豆奶发酵期间的单种培养物和混合培养物的种群动态。在分批发酵罐中，L.bulgaricus水平保持低于(500CFU/ml的)检测极限，但是L.bulgaricus在每种混合培养物中生长良好。在分批发酵罐中，还观察到L.plantarum B1839和L.bulgaricus对彼此的重大积极影响。最可能的是L.bulgaricus对L.plantarum的积极影响与蛋白水解活性相关，因为菌株B1839不能完全降解单种培养物中的可用蔗糖。因为L.bulgaricus仅较差地发酵蔗糖，所以我们推测L.plantarum对L.bulgaricus的刺激效应与L.plantarum从豆奶糖类中释放糖单体相关。
在第一方面中，本发明涉及用于制备发酵大豆制品的方法，所述方法包括下述步骤：用除Lactobacillus delbrueckii以外还包含能够刺激Lactobacillus delbrueckii生长的菌株的混合细菌培养物发酵包含0.25-10％(w/w)大豆蛋白的水性培养基。
在本文中使用时，术语“Lactobacillus delbrueckii”包括亚种Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus和Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis。
根据本发明的发酵大豆制品中的大豆蛋白量是0.25-10％(w/w)，优选地0.5-10％(w/w)，例如0.5-8％(w/w)、0.5-7％(w/w)、1-7％(w/w)、2-6％(w/w)、3-6％(w/w)、4-6％(w/w)。其使用包含0.25-10％(w/w)，优选地0.5-10％(w/w)，0.5-8％(w/w)，例如0.5-7％(w/w)、1-7％(w/w)、2-6％(w/w)、3-6％(w/w)、4-6％(w/w)大豆蛋白的水性培养基制备。例如，此类水性培养基可以是豆奶。豆奶是大豆的水提取物。豆奶通常如下制造：磨碎并加热大豆，去除纤维豆渣(fibrous okara)(豆粕(soy pulp))，澄清，并巴氏消毒成大豆基质(soy base)。在本文中使用时，术语“大豆蛋白”包括可以被(部分)水解的大豆蛋白分离物，和可以被(部分)水解的大豆蛋白浓缩物。
液体豆奶、豆奶粉、大豆蛋白分离物和大豆蛋白浓缩物等等是可商业获得的，例如可商业得自Devansoy。
在本发明中使用的混合细菌培养物包含至少一种Lactobacillusdelbrueckii，优选地Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus菌株，和至少一种能够刺激Lactobacillus delbrueckii、优选地刺激Lactobacillusdelbrueckii subsp.bulgaricus生长的菌株，优选地乳酸细菌菌株。在本文中使用时，术语“乳酸细菌”是指生产乳酸作为碳水化合物发酵的主要或唯一终产物的革兰氏阳性杆状或球形细菌。公知的属包括Bifidobacterium、Carnobacterium、Enterococcus、Lactobacillus、Lactococcus、Lactospaera、Leuconostoc、Oenococcus、Pediococcus、Streptococcus、Vagococcus和Weissella。所述混合细菌培养物可还包含额外的乳酸细菌，例如Streptococcus thermophilus、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillussubsp.casei。在一个实施方式中，所述混合细菌培养物还至少包含Streptococcus thermophilus。混合细菌培养物也可包含非乳酸细菌，例如Propionibacterium属的细菌，或任何其他食品级细菌。
所述Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus可以是任何Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus菌株。技术人员能够选择可在本发明的发酵大豆制品的制备中使用的Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus菌株。
包含0.25-10％(w/w)大豆蛋白的水性培养基的发酵可包括一个或多个以下步骤：a)提供所述水性培养基；b)对所述水性培养基进行热处理和匀化；c)添加所述混合细菌培养物；和d)允许发酵在33-45℃、优选地35-43℃、进一步更优选地37-40℃范围内的温度下发生。
在一个实施方式中，所述能够刺激Lactobacillus delbrueckii、优选地Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus生长的菌株刺激L.delbrueckii、优选地Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus在含蔗糖的水性培养基中的生长，所述培养基除0.5-10％(w/w)大豆蛋白以外，优选地还包含蔗糖和寡糖木苏糖和棉子糖作为仅有的碳水化合物。因此在一个合适的实施方式中，所述水性培养基还包含蔗糖、木苏糖和/或棉子糖作为仅有的碳水化合物。优选地，所述蔗糖以约0.25％到约20％(w/w)、优选地0.25-18％(w/w)、0.4-17％(w/w)、0.5-15％(w/w)、1-13％(w/w)的量存在于所述水性培养基中。在本文中使用时，“(w/w)”是用于描述混合物或溶液中物质浓度的“按重量计”的缩写。例如，重量百分比2,2％(w/w)，表示物质的质量是水性培养基总质量的2％，即每100g水性培养基2g。
在一个合适的实施方式中，所述能够刺激Lactobacillus delbrueckii、优选地Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus生长的菌株是Lactobacillus plantarum菌株。所述Lactobacillus plantarum菌株可以是选自由Lactobacillus plantarum B1839、B2484和B2485组成的组的一种或多种菌株。本文所称Lactobacillus plantarum菌株B1839对应于Figuero et al.公开的Lactobacillus plantarum SF2A35B(1995.Lactic acid bacteria of the sourcassava starch fermentation.Lett.Appl.Microbiol.21：126-130)。其已根据布达佩斯条约被保藏于Centraalbureau for Schimmelcultures，并领受了保藏号CBS 125104。Lactobacillus plantarum菌株B2484(NCTH19-1)和B2485(NCTH19-2)源自来自越南的酸腌猪肉肠(sour pickled pork sausage)(Nem Chua)。“Nem chua”由切碎的猪肉、切成片的猪皮和制成粉末的烤米、盐、胡椒、糖和大蒜的混合物制成。这些成分被充分混合，之后用芳香的、新鲜的叶子包成小的、盒状的卷，之后储藏进行三到五天的发酵过程，制成后可以直接享用或在木炭炉中烧烤。B2484和B2485在发酵过程后和进一步加工之前被分离。它们已根据布达佩斯条约被保藏于Centraalbureau for Schimmelcultures，并领受保藏号CBS 125105(B2484)和CBS 125106(B2485)。
在一个优选的实施方式中，所述能够刺激Lactobacillus delbrueckii、优选地Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus生长的菌株是Lactobacillus plantarum B1839，因为该菌株对包含0.25-10％(w/w)大豆蛋白的水性培养基中Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus的刺激效应最为显著。
在一个实施方式中，所述Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus选自由Lactobacillus delbrueckii bulgaricus ATCC-BAA365、ATCC-11842和Ib组成的组。
在一个合适的实施方式中，发酵的大豆制品是大豆酸乳。本发明的大豆酸乳可以是具有硬实的凝胶质地的凝固型酸乳(set-style yogurt)，或可以是具有可舀动质地(spoonable texture)或流体质地的搅拌型酸乳。在一个实施方式中，针对凝固型大豆酸乳的发酵在包装后发生在酸乳的包装中。搅拌型大豆酸乳优选地在发酵罐中发酵。发酵后，可以低速搅拌产物，之后通过抽泵和填充来运输。中到低的剪切速率对于实现搅拌型酸乳期望的粘稠特性而言是至关重要的。可以对大豆酸乳添加甜味剂、盐和香料、钙、水果和维生素A与D。在大豆酸乳中也可以使用稳定剂，通过提高硬实度来改善形体和质地，并且在大豆酸乳中包含水果时帮助保持水果被均匀地混合在大豆酸乳中。大豆酸乳中常规使用的稳定剂包括藻酸盐(鹿角菜胶)、明胶、胶质(刺槐豆胶、瓜尔胶)、果胶和淀粉。可以使用其他常规的大豆酸乳成分。本领域技术人员应当能够确定合适的常规大豆酸乳成分。
在又一方面中，本发明涉及发酵的大豆制品，其包含Lactobacillusdelbrueckii、优选地Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus，和能够刺激Lactobacillus delbrueckii、优选地Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus生长的菌株。
优选地，能够刺激Lactobacillus delbrueckii、优选地Lactobacillusdelbrueckii subsp.bulgaricus生长、尤其是在包含0.25-10％(w/w)大豆蛋白的水性培养基中生长的菌株是Lactobacillus plantarum菌株，其优选地选自由Lactobacillus plantarum B1839、B2484和B2485组成的组，更优选地是Lactobacillus plantarum B1839。
在一个实施方式中，所述Lactobacillus delbrueckii bulgaricus选自由Lactobacillus delbrueckii bulgaricus ATCC-BAA365、ATCC-11842和Ib组成的组。如上文所述，在一个有利的实施方式中，发酵的大豆制品是大豆酸乳。
发酵的大豆制品可包含其他食物成分，例如糖，其他蛋白质，脂肪和油，脂肪酸，稳定剂，增稠剂，着色剂，调味剂等等。根据期望的终产物选择此类其他食物成分在本领域技术人员的技术范围内。
在另一方面中，本发明涉及混合的细菌培养物，其包含Lactobacillusdelbrueckii、优选地Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus，和能够刺激包含0.25-10％(w/w)大豆蛋白的水性培养基中Lactobacillus delbrueckii、优选地Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus生长的菌株。能够刺激此类培养基中Lactobacillus delbrueckii、优选地Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus生长的菌株可有利地是Lactobacillus plantarum菌株，其优选地选自由Lactobacillus plantarum B1839、B2484和B2485组成的组。更优选地，所述能够刺激此类培养基中Lactobacillus delbrueckii、优选地Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus生长的菌株是Lactobacillusplantarum B1839。在又一个实施方式中，所述Lactobacillus delbrueckiibulgaricus选自Lactobacillus delbrueckii bulgaricus ATCC-BAA365、ATCC-11842和Ib的组。培养物可以是酸乳起子培养物(starter culture)，其还包含S.thermophilus。或者，所述能够刺激包含0.25-10％(w/w)大豆蛋白的水性培养基中Lactobacillus delbrueckii、优选地Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus生长的菌株可以被添加至水性培养基中，作为除包含Lactobacillus delbrueckii、优选地Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus和S.thermophilus的起子培养物以外的辅助培养物(的部分)。
本发明还涉及Lactobacillus plantarum B1839、B2484和/或B2485用于刺激包含0.25-10％(w/w)大豆蛋白的水性培养基中Lactobacillusdelbrueckii，优选地Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus，优选地Lactobacillus delbrueckii bulgaricus ATCC-BAA365、ATCC-11842或Ib，优选地ATCC-BAA365生长的用途。
本发明还涉及Lactobacillus plantarum B1839、B2484和/或B2485、优选地B1839在包含0.25-10％(w/w)大豆蛋白的水性培养基的混合培养物发酵中的用途。
在又一方面中，本发明提供了用于鉴定能够刺激培养基中Lactobacillus delbrueckii、优选地Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus生长的乳酸细菌菌株的方法，所述方法包括如下步骤：i)在所述培养基中培养Lactobacillus delbrueckii、优选地Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus的单种培养物；ii)在所述培养基中培养Lactobacillusdelbrueckii、优选地Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus和所述乳酸细菌菌株的混合培养物；iii)将Lactobacillus delbrueckii、优选地Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus在所述单种培养物中的生长与在所述混合培养物中的生长进行比较；和iv)选择提高所述培养基中Lactobacillus delbrueckii、优选地Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus菌落形成单位的乳酸细菌菌株。所述培养基优选地是含有蔗糖的培养基，更优选地是含有0.25-10％(w/w)大豆蛋白的水性培养基，例如豆奶。
还应当明白，说明书、附图和实施例被包括在本文中仅用于阐述本发明的一些实施方式，并不限制保护范围。技术人员基于该公开会明白更多实施方式，包括属于本发明保护和实质范围内的实施方式，和属于现有技术和本专利公开的明显组合的实施方式。
附图
本发明使用图1进行阐述，其中混合物培养物生长对L.plantarum生长的影响与相应的单种培养物中的生长进行比较，针对41种个体L.plantarum菌株进行了评价。A.乳发酵，B.豆奶发酵。X轴上展示了单种培养物中生长的NIZO菌株数和对数CFU值，Y轴上展示了存在S.thermophilus、L.bulgaricus或二者时的生长差异(作为log10CFU值)。灰色：与S.thermophilus的混合培养物，白色：与L.bulgaricus的混合培养物，深灰色：与S.thermophilus和L.bulgaricus二者的混合培养物。
实施例
材料和方法
筛选途径
在通过UHT处理重溶的脱脂乳粉(Friesland Foods，Leeuwarden，荷兰)和Benesoy豆奶粉(Devansoy，Carroll，Iowa，美国)制备的乳和豆奶中，研究混合培养物生长和酸化特性。分别在42℃和37℃下于MRS中培养Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus菌株ATCC-BAA365和41种Lactobacillus plantarum菌株(表1)，并在42℃下于GM17中培养Streptococcus thermophilus菌株CNRZ1066。如下一式两份制备用于乳和豆奶发酵的单种培养物和混合培养物：将每种菌株的培养物稀释至～1的O.D.(600nm)，随后将1％经稀释的培养物转移至含有5-ml新鲜制备的底物的10-ml聚苯乙烯螺旋盖管中。将乳和豆奶培养物在37℃下孵育24小时，然后使用接种针转移至新鲜的、经预热的底物中。在每次转移之前，将培养物在Infors Microtron II培养箱(Infors AG，瑞士)中彻底混合15分钟。在乳或豆奶中进行4轮发酵后，针对个体菌株的生长和最终pH检查培养物。
表1.Lactobacillus plantarum菌株。
Figure BPA00001516748700101
Figure BPA00001516748700111
生长的定量；HT涂板
基于Sieuwerts et al(LAM文献)近期描述的方法，使用涂板方案测定菌落形成单位(CFU)。使用多通道移液管在TY发酵液中制备培养物稀释液，并通过将20μl每种稀释液移液在12平方cm皮氏培养皿中的TY琼脂上将其涂板。L.plantarum平板含有1％半乳糖，并且在30℃下孵育24-36h。将S.thermophilus涂布在pH被调节至7.5的TY琼脂上，并添加葡萄糖(1％)作为底物。将L.delbrueckii subsp.bulgaricus涂布在含1％甘露糖的TY琼脂上。对(中度嗜热)酸乳物种而言，首先将平板在37℃下孵育4小时，然后将温度提高至45℃。在缺氧条件下，在含有氮(85％)、二氧化碳(10％)和氢(5％)混合物的罐中孵育L.delbrueckii subsp.bulgaricus平板。孵育24-36小时后测定CFU计数。在Tecan Safire II分光光度计(Tecan Austria GmbH，澳大利亚)中，使用hydroplates测定培养物的最终pH。
种群动态
在含有1L底物的分批发酵罐中研究种群动态，每1.5小时从所述底物中采样。根据上文所述方案测定CFU，另外通过将0.1ml样品与0.9mlTE混合来制备用于通过实时定量PCR进行定量的样品。混合样品后，通过在14,000xg下离心收集细胞沉淀物，并储存于-20℃。用于以16S核糖体DNA序列为基础对个体物种进行定量的引物由文献改造，或使用Amplicon设计并使用Netprimer and Primer Express验证(表2)。使用Norgen乳细菌DNA分离试剂盒分离DNA。起始材料的量被降至0.1ml，消化时间段提高至1h。定量在Applied Biosystems 7500快速检测系统上进行。
表2.用于以16S核糖体DNA序列为基础对个体物种进行定量的引物。使用的引物的DNA序列加有下划线，并描述了整个被扩增的序列的DNA序列。
Figure BPA00001516748700121
结果
组合筛选途径
在与S.thermophilus和L.delbrueckii subsp.bulgaricus的混合培养物组合中针对发酵乳和豆奶的能力筛选41种L.plantarum菌株的每一种，并与单种培养物中的生长比较。开发出所述筛选途径以满足若干标准。为了允许使每种物种适应发酵条件和一种或多种其他物种的存在，将每种培养物转移至新鲜底物3次。这也提高了选择具有感兴趣的特性的个体的机会，因为这使得快速生长的菌株能够竞争过不存在或仅存在较小内部相关性的其他菌株。发酵温度被设定为37℃，以允许每种物种的良好生长，并且在转移至新鲜底物之前充分混合每种培养物。为了最小化(交叉)污染的机会，使用接种针转移培养物。为了在乳或豆奶中的4轮培养后评价每种物种的生长，针对感兴趣的3种物种中的每一种优化先前开发的涂板方案(Sieuwerts，S.，F.A.de Bok，E.Mols，W.M.de Vos，and J.E.van HylckamaVlieg.2008.A simple and fast method for determining colony forming units.Lett Appl Microbiol 47：275-8)。使用多通道移液管在TY发酵液中制备培养物稀释液，并使用多通道移液管将20μl每种稀释液点在用TY琼脂填充的12平方cm皮氏培养皿中，每行6个点，仅使用移液管的奇数或偶数尖头，从而最适地使用可用的空间。选择TY琼脂进行涂板，因为所有3种物种和41种L.plantarum菌株都在TY琼脂上生产能与MRS琼脂(对L.delbrueckii和L.plantarum而言)或含1％葡萄糖的GM17琼脂(对S.thermophilus而言)上生长相比较的CFU。将L.delbrueckii和S.thermophilus平板在45℃下孵育，以排除L.plantarum的生长。然而，因为这导致与37℃下孵育相比时这些物种的CFU显著更少，所以将平板先在37℃下孵育4小时，然后将温度提高至45℃。通过将琼脂的pH提高至7.5，排除S.thermophilus平板上L.delbrueckii的生长，在所述pH下S.thermophilus的生长不受抑制。使用甘露糖作为L.delbrueckii的底物，因为API测试显示S.thermophilus不能在甘露糖上生长。L.delbrueckii的菌落形成在缺氧条件下最佳。L.plantarum平板含有半乳糖作为选择性底物，并在30℃下孵育这些平板。使用多通道移液管在TY发酵液中制备培养物稀释液，并使用多通道移液管将20μl每种稀释液点在用TY琼脂填充的12平方cm皮氏培养皿中。对每种培养物而言涂布稀释液10-1到10-5，藉此检测下限被设定为每ml 500CFU。将总计涂布了36种培养物稀释液的琼脂平板晾干然后孵育。使用hydroplates测定培养物的最终pH值，所述hydroplates通过包含pH4-9范围内的缓冲液来校准。
在乳中筛选混合培养物
针对在与S.thermophilus和L.delbrueckii subsp.bulgaricus的混合培养物乳发酵和单种培养物乳发酵中的生长，筛选41种L.plantarum菌株的集合，所述菌株集合的选择以分离来源、地理起源和系统发生距离的差异为基础。在乳中进行4轮培养后，5种L.plantarum菌株的单种培养物中的活细胞计数低于500CFU/ml的检测极限，而大部分其他菌株在这些条件下生产至少多于106CFU/ml(图1)。尽管17种菌株的CFU水平多于107，但是乳中的L.plantarum单种培养物无一超过108CFU/ml。因此，所述菌株无一能够将乳的pH降至低于6.3，这仅比乳对照的平均pH小0.25。除一个例外之外，在乳中与S.thermophilus或L.delbrueckii任一一起培养时L.plantarum菌株无一生产更多的CFU。然而，存在S.thermophilus和L.bulgaricus二者时，21种菌株生产更多CFU，几乎所有这些菌株在单种培养物中显示较差的生长(图1)。L.plantarum的存在对乳中S.thermophilus或L.bulgaricus的生长不具有显著影响。
在豆奶中筛选混合培养物
还使用与上文针对乳所述的相同的物种、菌株和组合，对豆奶进行针对单种培养物和混合培养物生长的筛选。除一个例外之外，在单种培养物中所有L.plantarum菌株和S.thermophilus都能够发酵豆奶。在豆奶中进行4轮发酵后，L.bulgaricus仍可检出，但是在5种单种培养物对照的任何中都不超过106CFU/ml(平均；3.1±1.7·105)，因此不影响pH。若干L.plantarum菌株的生长被S.thermophilus的存在降低至2对数刻度，但是未观察到L.plantarum对S.thermophilus生长的显著影响。除了L.bulgaricus对L.plantarum菌株B1839的较小刺激之外，未观察到L.bulgaricus、S.thermophilus或二者对任何L.plantarum菌株生长的显著积极影响。在几乎所有2物种和3物种组合中，L.bulgaricus的CFU水平跌至低于检测极限(500CFU/ml)。然而，在一些组合中L.bulgaricus仍然存在，并且在与L.plantarum B1839的2物种和3物种组合中，以及与L.plantarum菌株B2484和B2485的3物种组合中，与不含L.plantarum的相应培养物相比其CFU水平高达10-100倍。与L.plantarum菌株B2776的共同培养物中的水平与L.bulgaricus单种培养物中的水平可比，这与该菌株不能发酵豆奶一致。
单种培养物和混合培养物乳发酵和豆奶发酵的种群动态
通过针对感兴趣的若干单种培养物和豆奶中与L.plantarum菌株B1836(WCFS1)、B2485和B1839和乳中与菌株B2258和B3400的感兴趣的混合培养物重复筛选方案，来评价筛选实验的可再现性。尽管在与菌株B2485的混合培养物中L.bulgaricus生产多达20倍的CFU，但是针对豆奶的CFU数值与初始筛选实验可比。对乳而言，针对菌株B2258的结果是可比的，但是对3物种混合培养物中B3400的生长而言，CFU数值变小超过10倍。选择菌株B1839和B3400，分别用于研究豆奶和乳发酵的种群动态。针对每种单种培养物和混合培养物重复筛选方案，但是第4次发酵在含有1L底物的分批(搅拌)发酵罐中进行，每1.5小时从中取样。这些条件下乳中的L.plantarum B3400生长显示持续整个发酵时间段，中间迟滞期在4和12小时之间，该模式对4种混合培养物组合中的每一种而言是相似的。在整个发酵期间，对3物种发酵而言，B3400的发酵CFU数值约是单种培养物的100倍，并是2物种发酵中每一种的10倍和1000倍之间。S.thermophilus的动态对存在所述物种的4种培养物而言几乎相同，并且由两个对数生长期表征。L.bulgaricus单种培养物的动态和与L.plantarum的混合培养物几乎相同，但是在与S.thermophilus的共同培养物中该物种的动态与3物种乳发酵非常相似。
在豆奶中，L.plantarum菌株B1839在发酵的最初10-12小时进行指数生长，与一种或两种其他物种的存在无关，发酵的最后12小时在所述培养物中均未观察到CFU的显著提高。在与L.bulgaricus的混合培养物中，在整个发酵时间段中，B1839的CFU水平约为每种其他培养物的10倍。在单种培养物和与两种酸乳物种的混合培养物中，10小时后CFU水平仍然提高，而与S.thermophilus的培养物中，发酵10小时后培养物中的水平保持基本恒定。在每种豆奶培养物中，S.thermophilus的表现几乎相同，在发酵的最初6小时为指数生长期，并且在发酵时间段的剩余部分中无CFU水平的显著提高。单种培养物中L.bulgaricus的CFU水平不超过检测极限，但是与L.bulgaricus和两种其他物种的混合培养物中其动态是可比的。观察到L.plantarum对L.bulgaricus的显著积极影响，特别是不存在S.thermophilus时。用2种不同的L.delbrueckii subsp.bulgaricus菌株(即ATCC-11842和Ib)重复试验，得到可比的结果。因此得出结论：L.plantarum B1839对L.delbrueckii subsp.bulgaricus的生长具有积极影响。
Figure IPA00001516748200021

Claims (16)

1.用于制备发酵的大豆制品的方法，所述方法包括下述步骤：用除Lactobacillus delbrueckii以外还包含能够刺激Lactobacillus delbrueckii生长的菌株的混合细菌培养物发酵包含0.25-10％(w/w)大豆蛋白的水性培养基。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述能够刺激Lactobacillusdelbrueckii生长的菌株是Lactobacillus plantarum菌株，优选地是Lactobacillus plantarum B1839、B2484和/或B2485，更优选地是B1839。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述Lactobacillusdelbrueckii是Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus，优选地是Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus ATCC-BAA365、ATCC-11842或Ib。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述发酵的大豆制品是大豆酸乳。
5.包含Lactobacillus delbrueckii和能够刺激Lactobacillus delbrueckii生长的菌株的发酵大豆制品。
6.根据权利要求5所述的发酵大豆制品，其中所述能够刺激Lactobacillus delbrueckii生长的菌株是Lactobacillus plantarum菌株，优选地是Lactobacillus plantarum B1839、B2484和/或B2485，更优选地是B1839。
7.根据权利要求5或6中任一项所述的发酵大豆制品，其中所述Lactobacillus delbrueckii是Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus，优选地是Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus ATCC-BAA365、ATCC-11842或Ib。
8.根据权利要求5-7中任一项所述的发酵大豆制品，所述大豆制品是包含0.25-10％(w/w)大豆蛋白的水性大豆制品。
9.根据权利要求5到8中任一项所述的发酵大豆制品，其中所述大豆制品是大豆酸乳。
10.包含Lactobacillus delbrueckii和能够刺激Lactobacillus delbrueckii生长的菌株的培养物。
11.根据权利要求10所述的培养物，其中所述能够刺激Lactobacillusdelbrueckii生长的菌株是Lactobacillus plantarum菌株，优选地是Lactobacillus plantarum B1839、B2484和/或B2485，更优选地是B1839。
12.根据权利要求10或11中任一项所述的培养物，其中所述Lactobacillus delbrueckii bulgaricus是Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus，优选地是Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus ATCC-BAA365、ATCC-11842或Ib。
13.Lactobacillus plantarum B1839用于刺激Lactobacillus delbrueckii、优选地Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus、优选地Lactobacillusdelbrueckii subsp.bulgaricus ATCC-BAA365、ATCC-11842或Ib在包含0.25-10％(w/w)大豆蛋白的水性培养基中的生长的用途。
14.Lactobacillus plantarum B1839、B2484和/或B2485、优选地B1839在包含0.25-10％(w/w)大豆蛋白的水性培养基的混合培养物发酵中的用途。
15.用于鉴定能够刺激培养基中Lactobacillus delbrueckii生长的乳酸细菌菌株的方法，所述方法包括如下步骤：
a)在所述培养基中培养Lactobacillus delbrueckii的单种培养物；
b)在所述培养基中培养Lactobacillus delbrueckii和所述乳酸细菌菌株的混合培养物；
c)将Lactobacillus delbrueckii在所述单种培养物中的生长与在所述混合培养物中的生长进行比较；和
d)选择提高所述培养基中Lactobacillus delbrueckii菌落形成单位的乳酸细菌菌株。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述培养基是含蔗糖的培养基，优选地是包含0.25-10％(w/w)大豆蛋白的水性培养基，例如豆奶。
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