WO2014163123A1 - 豆乳発酵物 - Google Patents

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WO2014163123A1
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lactic acid
strain
soymilk
fermented
bulgaricus
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PCT/JP2014/059786
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金子大輔
青山顕司
エングルス ウィム
ウェグカンプ アーノ
キンマ フェデ
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キッコーマン株式会社
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    • A23V2400/21—Streptococcus, lactococcus
    • A23V2400/249—Thermophilus

Definitions

  • the present invention relates to a soymilk fermented product obtained by fermenting soymilk with lactic acid bacteria.
  • Soybean also called field meat
  • soymilk is a milky beverage obtained by elution of protein and other ingredients from the soybean with hot water, etc., and removing fiber. It has been attracting attention as a low cholesterol, high protein health material.
  • fermenting soy milk with lactic acid bacteria which are also attracting attention as health materials, is also expected to have a healthy function due to the synergistic effect of soybeans and lactic acid bacteria.
  • the unpleasant odor peculiar to soybeans, the soy odor, the fermentation odor and pickle odor due to lactic acid bacteria are problems, and it is difficult to penetrate the market.
  • a method for improving flavor by fermentation with two types of lactic acid bacteria, Lactobacillus plantarum and Lactococcus lactis see Patent Document 2
  • Lactobacillus acidophilus or Lactobacillus casei
  • Bulgaricus see Patent Document 3
  • Lactobacillus delbruecki subsp see Patent Document 3
  • Streptococcus thermophilus and lac including a method of fermenting soy milk with one strain selected from Bulgaricus and Lactobacillus acidophilus and three lactic acid bacteria of Lactobacillus casei and Streptococcus thermophilus (see Patent Document 4)
  • Various varieties that promote lactic acid fermentation and improve flavor in soy milk by adding different bacterial species to Bacillus delbruecki, subspice sheath bulgaricus, or replacing these bacterial species with other bacterial species There is a report.
  • a method of fermenting soymilk by adding sugar, lactic acid bacteria and protease simultaneously to soy milk has also been reported (see Patent Document 5).
  • JP-A-63-7743 JP-A-5-184320 Japanese Patent Laid-Open No. 10-201415 JP 2011-167190 A JP-A-7-147898
  • lactic acid bacteria makes the production and management of each strain extremely complicated, making it difficult to maintain the quality of production lots, preparing food ingredients other than soybean-derived foods, and inoculating lactic acid bacteria.
  • processing complexity is added, such as adding an enzyme.
  • the problem to be solved by the present invention is that only when Streptococcus thermophilus and Lactobacillus delbrukis subspice bulgaricus (Lactobacillus delbrueckis subbulis. Even if it is used as a lactic acid bacteria mixed starter, soy milk, which is a raw material, is not subjected to processing such as enzyme treatment or extraction treatment, and without adding raw materials such as sugar sources, it is equivalent to yogurt fermented with milk.
  • the object is to provide a fermented soymilk product having a flavor and smooth physical properties.
  • Streptococcus thermophilus which is a lactic acid bacterium for yogurt defined by CODEX
  • Lactobacillus delbruecki subspice bulgaricus In a lactic acid bacteria mixed starter, when combined with Streptococcus thermophilus capable of accumulating 0.4 g / L or more of fructose in soy milk, D-lactic acid of 0.4 g / L or more can be produced when combined with the Streptococcus thermophilus.
  • the present invention when the present invention is (1) inoculated and cultured in soy milk, inoculated into Streptococcus thermophilus that can accumulate 0.4 g / L or more fructose in the fermented product and soy milk,
  • a fermented soymilk product obtained by using a mixed starter of lactic acid bacteria containing Lactobacillus delbruecki subspice bulgaricus capable of accumulating 0.4 g / L or more of D-lactic acid in the fermented product. It is.
  • the present invention also includes (2) Streptococcus thermophilus capable of accumulating 0.4 g / L or more of fructose in the fermented product when inoculated and cultured in soy milk, and inoculated and cultured in soy milk.
  • the present invention provides a mixed starter for lactic acid bacteria comprising Lactobacillus delbrucky subspice bulgaricus capable of accumulating 0.4 g / L or more of D-lactic acid in a fermented product.
  • soymilk is used as a raw material, and even if only Streptococcus thermophilus and Lactobacillus delbruecki subspice bulgaricus are used as a lactic acid bacteria mixed starter, the soymilk as a raw material is subjected to enzyme treatment, extraction treatment, etc. It is possible to provide a fermented soymilk product that is as excellent in flavor and physical properties as yoghurt that is obtained by subjecting milk to lactic acid fermentation without processing and without adding a raw material such as a sugar source. Since the fermented yogurt-like soymilk of the present invention does not give an unpleasant odor peculiar to fermented soybeans, it can be expected to spread as a health material having an excellent function due to the synergistic effect of soybeans and lactic acid bacteria.
  • FIG. 3 is a view showing the amount of D-lactic acid in the obtained fermented soymilk.
  • FIG. 3 is a graph showing the amount of D-lactic acid in fermented soymilk.
  • a soymilk membrane permeate obtained by adding 1.0% (w / v) fructose to a solution obtained by permeating unadjusted soymilk through an MF ultrafiltration membrane was obtained at 42 ° C.
  • FIG. 3 is a diagram showing the amount of D-lactic acid produced in a fermentation broth obtained by fermentation with S. bulgaricus alone at 42 ° C. for 24 hours.
  • FIG. 3 is a graph showing the amount of D-lactic acid produced in a fermented soymilk obtained by fermentation at 42 ° C. for 24 hours.
  • the fermented soymilk of the present invention can be obtained by fermenting soymilk with only two types of lactic acid bacteria, Streptococcus thermophilus and Lactobacillus delbrucky subspice bulgaricus, without adding a special processing such as enzyme treatment.
  • soy milk used in the present invention any soy milk obtained by a conventional method may be used, and commercially available soy milk may be used.
  • a liquid obtained by steaming and grinding beans that have been swollen by immersing exfoliated soybeans or defatted soybeans in water and using a liquid obtained by removing okara from the liquids And more preferable from the viewpoint of texture.
  • the JAS standard defines soybean solid content of 8.0% or more as soy milk, prepared soybean milk is defined as 6.0% or more, and soy milk beverage is defined as 4.0% or more. It is not particularly limited.
  • the Streptococcus thermophilus used in the present invention can be grown in soy milk, and when grown alone in soy milk, it decomposes sucrose in soy milk to produce glucose and fructose, of which fructose is 0.4 g / L. It is required to have the property of accumulating at the above concentration.
  • Lactobacillus delbruecki subspice bulgaricus cannot assimilate sucrose in soy milk as a sugar source, but Streptococcus thermophilus assimilate them by breaking down sucrose into glucose and fructose Lactobacillus delbruecki subsp. Bulgaricus can also grow.
  • Streptococcus thermophilus takes in its own degradation product as a sugar source while decomposing sucrose, but if a strain with a particularly high degradability is selected, the decomposed sugar accumulates in the fermented product. And in the fermented soymilk in which the amount of accumulated fructose exceeds 0.4 g / L, Lactobacillus delbruecki subsp. Bulgaricus grows well and produces various metabolites during the growth process. Can play a big role in shaping the flavor of yogurt.
  • the metabolism of Lactobacillus delbrucky subspice bulgaricus is important for fermenting soymilk like yogurt, but D-lactic acid produced by the metabolism is produced in Streptococcus thermophilus that produces only L-lactic acid. Therefore, it can be used as an easily measurable index indicating the metabolic activity of Lactobacillus delbruecki, subspice bulgaricus.
  • the fermented product in which the amount of D-lactic acid accumulates 0.4 g / L or more in the fermented product has a particularly good flavor as a result of active production of metabolites by Lactobacillus delbruecki, subspice bulgaricus. I found out.
  • Lactic acid bacteria having the above properties can be selected from lactic acid bacteria used in the production of milk yogurt and similar lactic acid bacteria in the environment.
  • all generally widely used means can be used.
  • 0.4 g / L or more of fructose is accumulated in soy milk by inducing mutation using ultraviolet light, inducing mutation using a drug, or subculture in a medium containing soy milk as a main component. It is possible to obtain Streptococcus thermophilus and Lactobacillus delbruecki subspice bulgaricus which show a high production amount of D-lactic acid of 0.4 g / L or more in soymilk when cultured at the same time.
  • Lactic acid bacteria that produce D-lactic acid are Lactobacillus delbruecki subspice bulgaricus, but cannot assimilate sucrose, which is the main component of sugar in soy milk, and cannot grow alone, It can be killed.
  • many Streptococcus thermophilas can assimilate sucrose and grow to some extent in soy milk.
  • the lactic acid bacteria decompose sucrose to produce glucose and fructose, which results in Lactobacillus delbrucky subspice bulgaricus. The inventors have found that, when they coexist, they can be utilized and gradually grown.
  • Lactobacillus delbruecki, subspice bulgaricus In order to grow Lactobacillus delbruecki, subspice bulgaricus, it may be possible to supplement soymilk with sugar, but supplementation with sugar alone may not produce a sufficient amount of D-lactic acid. Because of the compatibility of the two strains other than the sugar complementation relationship, Lactobacillus is an active metabolite that can produce 0.4 g / L or more of D-lactic acid when cultured with Streptococcus thermophilus that accumulates fructose. It is important to select Derbrucky Subspices bulgaricus.
  • the lactic acid bacteria used in the present invention can be obtained by selection or breeding as described above.
  • a combination of Streptococcus thermophilus K1580 strain and Lactobacillus delbrukee subspice bulgaricus K1581 strain A combination of Streptococcus thermophilus K1584 and Lactobacillus delbruecki subsp.
  • Bulgaricus K1585, Streptococcus thermophilus Danisco strain isolated from mixed starter YO-MIX499) and Lactobacillus delbrukee subspice bulgaricus A combination of Danisco Co.
  • strains strains isolated from mixed starter YO-MIX505, 511, 863, and the like are applicable. Since the fermented soymilk of the present invention can be obtained by using a lactic acid bacterium having the above properties, it is not limited to the strains described in the Examples.
  • soymilk with lactic acid bacteria it can be carried out based on a generally known method for producing yogurt or lactic acid bacteria beverages, such as Streptococcus thermophilus 1 ⁇ 10 4 to 1 ⁇ 10 8 cfu / mL, More preferably, 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 7 cfu / mL, and Lactobacillus delbruecki subspice bulgaricus 1 ⁇ 10 2 to 1 ⁇ 10 7 cfu / mL, more preferably 1 ⁇ 10 3 to
  • the soy milk is inoculated to 1 ⁇ 10 5 cfu / mL and fermented at a fermentation temperature of 30 to 45 ° C., more preferably 37 to 42 ° C. within a range of 4 to 24 hours. Is not to be done.
  • the fermented yoghurt-like soymilk of the present invention thus obtained is characterized by containing 0.4 g / L or more of D-lactic acid, and metabolism of Streptococcus thermophilus and Lactobacillus delbruecki subspice bulgaricus Both of them are flourishing, showing the amount of lactic acid that could not be obtained by using commercially available lactic acid bacteria mixed starters as they are, and having yogurt-like flavor and physical properties having aromatic components derived from each bacterial species It becomes fermented soymilk. Moreover, since it is possible to ferment without adding raw materials other than soybean origin, it is not influenced by the taste derived from an auxiliary raw material. Furthermore, the fermented soymilk of the present invention has high versatility, and can be applied not only to yogurt-like foods but also to any products related to soybean-related foods and drinks such as seasonings, cheese, and beverage forms.
  • Lactic acid bacteria mixed starter As a lactic acid bacteria mixed starter, commercially available lactic acid bacteria mixed starter (manufactured by Danisco, Streptococcus thermophilus strain and Lactobacillus strain) A freeze-dried product containing both the Delbrucky, Subspice sheath, and Bulgaricus strains (hereinafter sometimes referred to as “commercially mixed starter”) was used. Various commercially available mixed starters exist depending on the properties of the Streptococcus thermophilus strain and Lactobacillus delbruecki subspice sheath bulgaricus strain.
  • YO-MIX300, YO-MIX305, YO-MIX496, YO-MIX499, YO-MIX505, YO-MIX511, YO-MIX863, YO-MIX883, YO-MIX885, YO-MIX401, YO-MIX421, YO -MIX495 and YO-MIX601 both are product numbers.
  • Streptococcus thermophilus Only commercially available Streptococcus thermophilus strains from commercially available starters (both including two strains of Streptococcus thermophilus and Lactobacillus delbruxii subspice bulgaricus) Isolated.
  • the isolated strains are Streptococcus thermophilus (St.) 45 strain, St. 40 strains, St. 505, St. 511, St. 863, St. 883 strain, St. 885, St. 300 shares, St. 305 strain, St. 495, St. 496 strain, St. 499 strain, St. 187, St. 205, St. 207 strain, St. 208, St. 211, St. 401, St. 421, St. 492 strain, St. 601 shares.
  • inoculum of 1% of the inoculum of the isolate is inoculated into soymilk and cultured at 37 to 45 ° C. for 12 to 24 hours.
  • 0.4 g / L or more of fructose is added.
  • Streptococcus thermophilus strains that can be accumulated were selected and designated as selected strains. Specifically, Streptococcus thermophilus (St.) 40 strain, St. 511 strain, St863 strain, St. 885, St. 496 strain, St. 499 strain, St. 187, St. 205, St. 401, St. 421, St. 492 strain, St. 601 strains were selected.
  • Streptococcus thermophilus St. Co., Ltd. owned by the NIZO food research company based in the Netherlands. 2333 strain and Lactobacillus delbruecki subspice bulgaricus (Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus) Lb. 185 strains were inoculated into unadjusted soymilk (manufactured by Kikkoman Soy Foods) and subcultured. The soymilk fermented product was repeatedly inoculated into soymilk at a ratio of 1% (v / v) and cultured at 37-45 ° C. for 12-24 hours. Subculturing was carried out for about 700 generations, and the Streptococcus thermophilus strain isolated from the obtained soymilk fermented product was designated as K1580 strain.
  • Streptococcus thermophilus St. owned by NIZO food research, Inc. 131 strain and Lactobacillus delbruecki subspice bulgaricus (bacteria Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus) Lb. 194 strains were inoculated into unadjusted soymilk (manufactured by Kikkoman Soy Foods) and subcultured. The soymilk fermented product was repeatedly inoculated into soymilk at a ratio of 1% (v / v) and cultured at 37-45 ° C. for 12-24 hours. The Streptococcus thermophilus strain isolated from the obtained fermented soymilk was subcultured for about 700 generations, and was designated as K1584 strain.
  • Lactobacillus delbruecki subspicis bulgaricus Only the Lactobacillus delbrucky subspices bulgaricus strain was isolated from the commercial starter. The isolated strain is based on Lactobacillus delbruecki subsp. Bulgaricus (Lb.) 300 strain, Lb. 305 strain, Lb. 401 strain, Lb. Lb. 421, Lb. 492 strain, Lb. 495 strain, Lb. 496 strain, Lb. 499 strain, Lb. 505 strain, Lb. 511, Lb. 601 strain, Lb. 863, Lb. 883 strain, Lb. There were 885 strains.
  • Streptococcus thermophilus St. owned by NIZO food research. 2333 strain and Lactobacillus bulgaricus Lb. 185 was inoculated into unadjusted soy milk (manufactured by Kikkoman Soy Foods) and subcultured. The soymilk fermented product was repeatedly inoculated into soymilk at a ratio of 1% (v / v) and cultured at 37-45 ° C. for 12-24 hours. Subculturing was carried out for about 700 generations, and the Lactobacillus delbruecki subspice sheath bulgaricus strain isolated from the fermented soymilk was designated as K1581 strain.
  • Streptococcus thermophilus St. which is also owned by NIZO food research.
  • 131 and Lactobacillus delbruecki subspice bulgaricus (Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus) Lb. 194 was inoculated into unadjusted soymilk (Kikkoman Soy Foods) and subcultured.
  • the soymilk fermented product was repeatedly inoculated into soymilk at a ratio of 1% (v / v) and cultured at 37-45 ° C. for 12-24 hours.
  • Lactobacillus delbruecki subspice sheath bulgaricus strain isolated from the obtained soymilk fermented product was designated as K1585 strain.
  • St. 131 and Lb The Lactobacillus delbruecki subspices bulgaricus strain obtained from 185 subcultures was designated as K1583 strain.
  • component-unadjusted soy milk manufactured by Kikkoman Soy Foods
  • a composition comprising a lactic acid bacteria mixed starter composed of Streptococcus thermophilus strain and Lactobacillus delbrucky subspice sheath bulgaricus strain was added and fermented at 42 ° C. for 24 hours. After the fermentation was completed, the amount of D-lactic acid in the obtained fermented soymilk was measured by the enzyme electrode method (Oji Scientific Co., Ltd., Biosensor BF-5).
  • FIG. 1 shows fermentation of soy milk obtained by fermentation of various Streptococcus thermophilus strains and a breeding strain, Lactobacillus delbruecki subspice sheath bulgaricus K1581 strain, and a lactic acid bacteria mixed starter. It is a figure which shows the result of having measured the amount of D-lactic acid in a thing.
  • FIG. 2 shows that, instead of Lactobacillus delbruecki subspice sheath bulgaricus K1581 strain, Lactobacillus delbruecki subspice sheath bulgaricus K1585 strain, which is also a breeding strain, is used as a lactic acid bacteria mixed starter.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of measuring the amount of D-lactic acid in the soymilk fermented product obtained by fermenting soymilk.
  • FIG. 3 shows a Streptococcus thermophilus K1580 strain, which is a breeding strain, and each Lactobacillus delbruecki subspice sheath bulgaricus strain isolated from a commercially available starter.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of measuring the amount of D-lactic acid in a fermented soymilk obtained by fermentation under the same conditions.
  • both the Streptococcus thermophilus strain and the Lactobacillus delbruecki subspice sheath bulgaricus strain were obtained by fermentation using a commercially available lactic acid bacteria mixed starter as it is.
  • the fermented product not much D-lactic acid is produced, whereas by substituting both the Streptococcus thermophilus strain and the Lactobacillus delbrucky subspice sheath bulgaricus strain with selected or bred strains, 0.
  • a soymilk fermented product containing 4 g / L or more of D-lactic acid can be obtained.
  • lactic acid bacteria mixed starter composed of lactic acid bacteria bred in the present invention (Streptococcus thermophilus K1580 strain and Lactobacillus delbruecki subspice sheath bulgaricus strain K1581 strain)
  • further D-lactic acid is used.
  • a large amount of fermented soymilk can be obtained (see FIG. 1).
  • Lactobacillus delbruecki subspice sheath bulgaricus strain selected and bred and difference in metabolic ability in soy milk membrane permeation of Lactobacillus delbruecki subspice sheath bulgaricus strain isolated from commercial starter
  • soy milk membrane permeate is obtained by removing insoluble proteins and lipids from macromolecules from soy milk, and it is considered that there are no significant differences in free amino acids, soluble peptides, sugars, minerals, etc. in soy milk.
  • the amount of D-lactic acid produced by the Lactobacillus delbruecki subspice sheath bulgaricus strain bred in the present invention was significantly higher than that of the commercially available starter and ATCC 11842 strain.
  • the acidic soymilk membrane permeate a marked difference was observed in the amount of D-lactic acid produced between the commercial starter and the breeding strain compared to the unadjusted soymilk membrane permeate.
  • the Lactobacillus delbruecki subspice sheath bulgaricus strain isolated from a commercially available starter produces a low amount of D-lactic acid, especially under low pH conditions (pH 5.0), whereas Thus, it was confirmed that about 3 times or more of D-lactic acid was produced.
  • pH is lowered by the growth of the thermophilus strain first, and then the Lactobacillus delbrukee subspice sheath bulgaricus strain grows.
  • Some of the isolates derived from commercial starters are Lb. 505 and Lb. 3 and the like, strains that produced 0.4 g / L or more of D-lactic acid as a selected strain in FIG. 3 are also included, and in FIGS. 5 and 6, D-lactic acid is higher than strains derived from other commercially available starters. Although production is shown, the production amount of 0.4 g / L has not been reached. This is considered to be due to the absence of Streptococcus thermophilus in the tests shown in FIGS.
  • Fructose is supplemented to the unadjusted soymilk membrane permeate, but in order to increase the production of D-lactic acid by activating the metabolism of Lactobacillus delbruecki, subspice sheath bulgaricus, simply supply fructose
  • Streptococcus thermophilus is considered to have other roles.
  • soymilk fermentation undiluted solution commercially available unadjusted soymilk (manufactured by Kikkoman Soy Foods) was used.
  • This soymilk fermentation stock solution was inoculated with 1.0% (v / v) of the suspension prepared above and fermented at 42 ° C. for 24 hours. After fermentation, the centrifugal supernatant was collected, and the amount of residual sugar in fructose was measured using F kit D-glucose / fructose (manufactured by JK International). The results are shown in FIG.
  • Streptococcus thermophilus strains include St. 496 strain, St. 499 strain, St. It was found that there are strains that accumulate 0.4 g / L or more of fructose in fermented soymilk and strains that do not accumulate, such as 885 strain.
  • FIG. 8 shows the measurement results of the amount of D-lactic acid produced in the fermented soymilk.
  • a Streptococcus thermophilus strain that accumulates fructose
  • 0.4 g / L or more of D-lactic acid is produced, and even when no auxiliary material is added, Lactobacillus delbruecki subspecies Bulgari It was confirmed that a symbiotic relationship with Kas was also established in soy milk.
  • Streptococcus thermophilus strain It is considered indispensable to supply a sugar source to the Lactobacillus delbruecki subspecies bulgaricus strain by degrading certain sucrose and accumulating fructose.
  • the amount of residual sugars of sucrose and fructose when the Streptococcus thermophilus K1580 strain bred alone was fermented alone, or when the Streptococcus thermophilus K1580 strain and Lactobacillus delbruxii subspecies bulgaricus K1581 strain were co-fermented. was measured over time. The fermentation temperature was set at 42 ° C. The time course of sucrose is shown in FIG. 9, and the time course of fructose is shown in FIG.
  • FIG. 11 is a graph showing the transition of fructose concentration over time when soy milk was co-fermented at 42 ° C. with Streptococcus thermophilus K1580 strain and Lactobacillus delbruecki subspecies bulgaricus K1581 strain.
  • fructose is metabolized by the K1581 strain, and as a result, contributes to the production of D-lactic acid and other aromatic components.
  • Streptococcus thermophilus is divided into a strain that actively assimilate fructose and a strain that does not so, and it is characterized in that it is accumulated in a fermented product without assimilating fructose like the selected strain and breeding strain in this example.
  • the amount of D-lactic acid in the fermented product was prepared by appropriately mixing the fermented soymilk product and the co-fermented product that had been fermented separately. That is, 100% co-fermented product (sample 1), 40% co-fermented product (sample 2), 30% co-fermented product (sample 3), 20% co-fermented product (sample 4), 15% co-fermented product (sample 5) ) 10% co-fermented product (sample 6) and 100% single fermented product (sample 7) were prepared.
  • Table 2 shows the estimated D-lactic acid and the estimated D / L ratio of each sample.
  • Streptococcus thermophilus strains (St. 885 strain, St. 496 strain) derived from commercially available mixed starters YO-MIX885 and YO-MIX496 were isolated.
  • Lactobacillus delbruxii subspecies bulgaricus strains (Lb.305 strain, Lb.492 strain, Lb.601 strain) derived from commercially available mixed starters YO-MIX305, YO-MIX492, YO-MIX601 were isolated, Each was stored as a glycerol stock bacterial solution and used for testing.
  • Streptococcus thermophilus K1580 and K1584 strains, and Lactobacillus delbruxii subspecies Bulgaricus strains K1581 and K1585 were used as breeding strains.
  • the produced Streptococcus thermophilus strain (St. strain) and Lactobacillus delbruecki subspecies bulgaricus strain (Lb. strain) were mixed at a ratio of 1: 1 (for example, K1580 strain + K1581 strain or St. 885 strain + Lb). .305 strain) was fermented with 10 mL of non-adjusted soymilk (manufactured by Kikkoman Soy Foods) to obtain a pre-fermented product. 1.0% (v / v) of this pre-fermented product was inoculated into unadjusted soymilk (manufactured by Kikkoman Soy Foods) and fermented at 42 ° C. for 24 hours to obtain a fermented soymilk product.
  • the lactic acid analysis value of each soymilk fermented product is shown below.
  • the soymilk fermented product produced using the lactic acid bacteria mixed starter according to the present invention (lactic acid bacteria mixed starter comprising a selected or bred strain) has a superior flavor. And found to have a taste.
  • YO-MIX300, YO-MIX305 both are product numbers
  • Fermented soymilk fermented product obtained by fermentation, and fermented soymilk fermented by selected or bred strains K1580 strain + K1581 strain, St.496 + Lb.601, St.885 + Lb.305) are uniformly stirred, and laser The particle size distribution was measured using a diffraction type particle size distribution measuring device (SALD-2200 (Shimadzu Corporation)).
  • the measurement results are shown in FIG. In the graph, the integrated results are shown together with the appearance frequency of the particle diameter with the same symbol for each sample.
  • the proportion of particles having a particle size of 100 micrometers or more is 10% or less, It was confirmed that it was a fermented soymilk with a smooth touch.

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Abstract

【課題】豆乳を原料とする発酵物を製造する際に、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）とラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）のみを乳酸菌混合スターターとする場合であっても、原料である豆乳に酵素処理や抽出処理などの加工処理を施さず、また糖源などの原料を加えることなく、牛乳を乳酸発酵したヨーグルトと同等の風味や滑らかな物性を有する豆乳発酵物を提供する。 【解決手段】豆乳に接種し培養した際に、発酵物中に０．４ｇ／Ｌ以上のフラクトースを蓄積可能であるストレプトコッカス・サーモフィラスと、豆乳に接種して培養した際に、発酵物中に０．４ｇ／Ｌ以上のＤ－乳酸を蓄積可能であるラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスと、を含む乳酸菌混合スターターを使用して得られた豆乳発酵物により解決する。

Description

豆乳発酵物
　本発明は、豆乳を乳酸菌で発酵することにより得られる豆乳発酵物に関する。
　大豆は畑の肉とも呼ばれ、豊富な植物性タンパク質を含む食品素材で、豆乳はその大豆から熱水等によりタンパク質その他の成分を溶出させ、繊維質を除去して得られる乳状の飲料であり、低コレステロール、高蛋白な健康素材として以前から注目されている。また、同様に健康素材として注目されている乳酸菌で豆乳を発酵させることによって、大豆と乳酸菌の相乗効果による健康機能も期待されている。しかしながら、大豆独特の不快臭または大豆臭や乳酸菌による発酵臭や漬物臭が課題となり、なかなか市場に浸透していないのが現状である。
　一方、牛乳においては、ＦＡＯ／ＷＨＯ合同食品規格委員会（コーデックス委員会）が定めたＣＯＤＥＸ（以下、「ＣＯＤＥＸ」という）によりヨーグルト用乳酸菌として定義されているストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）とラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）が、共生関係を構築することは以前から知られている。また、この共生関係を構築することによって両菌種の生育が単独発酵と比べ飛躍的に向上し、結果として風味の良いヨーグルトとなることも知られている。
　しかしながら、豆乳ではストレプトコッカス・サーモフィラスとラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカスをそのまま接種して発酵しても牛乳のように十分に発酵が進まず、豆乳に乳糖を添加するなどの操作を加えなければ乳酸生成によって物性の良好なカードを形成させたり良好な風味を生成したりすることが難しいことが知られている。これはラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカスが豆乳に含まれるシュークロースを資化することができず、正常に乳酸発酵を行ったり菌数を増やしたりすることができない事が主因である。
　これまでに、乳酸発酵によって風味良好な豆乳発酵物を製造する方法は、多数報告されている。例えば、ラクトバチルス・アシドフィラス、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカス、ラクトコッカス・ラクティス、ストレプトコッカス・サーモフィラスの５種の乳酸菌を混合させ、かつ、無調整の豆乳に糖分や脂質、ゼラチンを添加することで風味を改善する方法がある（特許文献１参照）。
　また、ラクトバチルス・プランタラム及びラクトコッカス・ラクティスの２種の乳酸菌で発酵することで風味を改善する方法（特許文献２参照）や、ラクトバチルス・アシドフィラス、又は、ラクトバチルス・カゼイのいずれかとビフィドバクテリウム属乳酸菌及びラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカスの少なくとも３菌種で発酵させ、風味の改善した豆乳発酵物を得る方法（特許文献３参照）、そしてラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカスとラクトバチルス・アシドフィルスから選択される菌株１種とラクトバチルス・カゼイ及びストレプトコッカス・サーモフィラスの３種の乳酸菌で豆乳を発酵させる方法（特許文献４参照）など、ストレプトコッカス・サーモフィラスとラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカスに更に異なる菌種を加えたり、あるいはこれらの菌種を別の菌種に置き換えたりすることで豆乳中の乳酸発酵を促進し、風味を改善する種々の報告がある。また、口当たりを改善するために豆乳に糖および乳酸菌とプロテアーゼを同時に加えて発酵する方法（特許文献５参照）も報告されている。
特開昭６３－７７４３号公報 特開平５－１８４３２０号公報 特開平１０－２０１４１５号公報 特開２０１１－１６７１９０号公報 特開平７－１４７８９８号公報
　しかし、これらの従来技術においては、ＣＯＤＥＸで定義されたヨーグルト用乳酸菌であるストレプトコッカス・サーモフィラスとラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカスの２種類の乳酸菌だけでなく、該乳酸菌とは異なる種類の乳酸菌を使用して豆乳を発酵するため、その乳酸菌由来の雑味や漬物臭等が生じてしまったり、牛乳を発酵したヨーグルトとは大きく異なる風味や物性になってしまう問題があった。また、３種類以上の乳酸菌を用いることで、各菌株の製造・管理が非常に煩雑となり、製造ロットの品質の維持が容易でなくなる問題や、大豆由来以外の食品原料を調合したり、乳酸菌接種と同時に酵素を添加するなど、加工上の煩雑さが加わるといった問題もある。
　従って本発明が解決しようとする課題は、豆乳を原料とする発酵物を製造する際に、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）とラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）のみを乳酸菌混合スターターとする場合であっても、原料である豆乳に酵素処理や抽出処理などの加工処理を施さず、また糖源などの原料を加えることなく、牛乳を乳酸発酵したヨーグルトと同等の風味や滑らかな物性を有する豆乳発酵物を提供することにある。
　本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、ＣＯＤＥＸで定義されたヨーグルト用乳酸菌であるストレプトコッカス・サーモフィラスとラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカスの２種類の乳酸菌を組み合わせた乳酸菌混合スターターにおいて、豆乳中でフラクトースを０．４ｇ／Ｌ以上蓄積することができるストレプトコッカス・サーモフィラスと、同ストレプトコッカス・サーモフィラスと組み合わせた際に０．４ｇ／Ｌ以上のＤ－乳酸を生成することができるラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカスを組み合わせることにより、豆乳環境においても乳環境とほぼ同程度に２種類両方の菌が生育し、牛乳を乳酸発酵したヨーグルトに近い風味や物性を有する豆乳発酵物が得られることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、（１）豆乳に接種し培養した際に、発酵物中に０．４ｇ／Ｌ以上のフラクトースを蓄積可能であるストレプトコッカス・サーモフィラスと、豆乳に接種して培養した際に、発酵物中に０．４ｇ／Ｌ以上のＤ－乳酸を蓄積可能であるラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカスと、を含む乳酸菌混合スターターを使用して得られた豆乳発酵物を提供するものである。
　また、本発明は、（２）豆乳に接種し培養した際に、発酵物中に０．４ｇ／Ｌ以上のフラクトースを蓄積可能であるストレプトコッカス・サーモフィラスと、豆乳に接種して培養した際に、発酵物中に０．４ｇ／Ｌ以上のＤ－乳酸を蓄積可能であるラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカスと、を含む乳酸菌混合スターターを提供するものである。
　本発明によれば、豆乳を原料とし、ストレプトコッカス・サーモフィラスとラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカスのみを乳酸菌混合スターターとする場合であっても、原料である豆乳に酵素処理や抽出処理などの加工処理を施さず、また糖源などの原料を加えることなく、牛乳を乳酸発酵したヨーグルトと同程度に風味・物性が優れた豆乳発酵物を提供することができる。本発明のヨーグルト様豆乳発酵物は、大豆発酵物特有の不快臭を感じさせないため、大豆と乳酸菌の相乗効果による優れた機能を有する健康素材として普及することが期待できる。
育種したラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカス（Ｋ１５８１株）と、市販混合スターターより単離して選抜したストレプトコッカス・サーモフィラス株または、育種したストレプトコッカス・サーモフィラス株（Ｋ１５８０株）とを混合して豆乳に接種し、４２℃、２４時間発酵して得た豆乳発酵物中のＤ－乳酸量を示した図である。 育種したラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカス株（Ｋ１５８５株）と市販混合スターターより単離したストレプトコッカス・サーモフィラス株とを混合して、豆乳に接種し、４２℃、２４時間発酵して得た豆乳発酵物中のＤ－乳酸量を示した図である。 育種したストレプトコッカス・サーモフィラス株（Ｋ１５８０株）と、市販混合スターターより単離したラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス株とを混合して豆乳に接種し、４２℃、２４時間発酵して得た豆乳発酵物中のＤ－乳酸量を示した図である。 育種や単離操作、選抜操作などを行っていない市販混合スターター（ストレプトコッカス・サーモフィラスとラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカスの混合スターター）のみで発酵（４２℃、２４時間）して得た豆乳発酵物中のＤ－乳酸量を示した図である。 無調整豆乳をＭＦ限外ろ過膜によって透過した液に１．０％（ｗ／ｖ）のフラクトースを添加した豆乳膜透過液をラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス単独で、４２℃、２４時間発酵して得た発酵液中のＤ―乳酸生成量を測定した図である。 無調整豆乳をＭＦ限外ろ過膜によって透過した液に１．０％（ｗ／ｖ）のフラクトースを添加し、ｐＨを５．０に合わせた酸性豆乳膜透過液をラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス単独で、４２℃、２４時間発酵して得た発酵液中のＤ－乳酸生成量を測定した図である。 市販混合スターター（ストレプトコッカス・サーモフィラスとラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカスの混合スターター）から単離したストレプトコッカス・サーモフィラス株を４２℃、２４時間発酵して得た豆乳発酵物中のフラクトース濃度を測定した図である。 市販混合スターターＹＯ－ＭＩＸ３０５、４９９から単離したストレプトコッカス・サーモフィラス株と同じく市販混合スターターＹＯ－ＭＩＸ５０５、５１１、８６３から単離したラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスを１：１で混合し、４２℃、２４時間発酵して得た豆乳発酵物中のＤ－乳酸生成量を測定した図である。 育種した乳酸菌であるストレプトコッカス・サーモフィラスＫ１５８０株を単独で豆乳を４２℃で発酵した際の経時的なスクロース濃度の推移を示した図である。 育種した乳酸菌であるストレプトコッカス・サーモフィラスＫ１５８０株を単独で豆乳を４２℃で発酵した際の経時的なフラクトース濃度の推移を示した図である。 育種した乳酸菌であるストレプトコッカス・サーモフィラスＫ１５８０株と育種した乳酸菌であるラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカスＫ１５８１株で豆乳を４２℃で共発酵した際の経時的なフラクトース濃度の推移を示した図である。 市販混合スターター又は育種株の混合スターター、あるいは選抜株の混合スターターで発酵して得た豆乳発酵物の粒度分布の測定結果を示した図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明の豆乳発酵物は、豆乳に酵素処理など特別な加工処理を加えずに、ストレプトコッカス・サーモフィラスとラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカスの２種類の乳酸菌のみで発酵することにより得られる。
　本発明で使用する豆乳としては、従来の方法により得られるものであれば何れのものでも良く、市販の豆乳を使用しても良い。例えば、脱皮した大豆または脱脂大豆を水に浸漬して膨潤させた豆類を蒸煮・摩砕して得られる液体を使用することができ、該液体からおからを除去した液体を使用することが味や食感の観点からより好ましい。さらに、全粒大豆粉、脱脂大豆粉等を溶解した液を用いても良い。ＪＡＳ規格では、大豆固形分８．０％以上のものは豆乳と定義され、調製豆乳は６．０％以上、豆乳飲料は４．０％以上と定義されているが、大豆固形分量に関しては、特に限定されるものではない。
　本発明で使用するストレプトコッカス・サーモフィラスは豆乳で増殖可能であり、単独で豆乳中に増殖させた場合に豆乳中のシュークロースを分解してグルコースとフラクトースを生成し、そのうちフラクトースを０．４ｇ／Ｌ以上の濃度で蓄積する性質を有することが求められる。
　ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカスは豆乳に含まれるシュークロースを糖源として資化することができないが、ストレプトコッカス・サーモフィラスがシュークロースをグルコースとフラクトースに分解することにより、それらを資化してラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカスも増殖することができる。
　ストレプトコッカス・サーモフィラスはシュークロースを分解しながら、自ら分解産物を糖源として取り込むが、特に分解力が高い菌株を選抜すれば発酵物中に分解した糖が蓄積する。そしてそのようにして蓄積したフラクトースの量が０．４ｇ／Ｌを越える豆乳発酵物中では、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカスは良く増殖し、そして増殖過程において種々の代謝産物を生成してヨーグルトの風味を形成するうえで大きな役割を担うことができる。
　このようにラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカスの代謝は豆乳をヨーグルト様に発酵する上で重要だが、その代謝によって生成するＤ－乳酸は、Ｌ－乳酸のみを生成するストレプトコッカス・サーモフィラスでは生成しないことからラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカスの代謝活動を示す測定容易な指標として活用することができる。本発明においてそのＤ－乳酸量が発酵物中で０．４ｇ／Ｌ以上蓄積する発酵物はラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカスが活発に代謝産物を生成した結果、特に風味が良くなることを見い出したのである。
　上記性質を有する乳酸菌は、牛乳のヨーグルト製造に用いられる乳酸菌や環境中の同種の乳酸菌から選抜することができる。乳酸菌を育種する場合には、一般的に広く用いられる手段は全て利用することができる。例えば、紫外線を用いた変異の誘発や薬剤を用いた変異の誘発、豆乳を主成分とする培地での継代培養などを行うことによって、豆乳中に０．４ｇ／Ｌ以上のフラクトースを蓄積するストレプトコッカス・サーモフィラスやそれらと同時に培養した際に豆乳中での０．４ｇ／Ｌ以上の高いＤ－乳酸生成量を示すラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカスを得ることが可能である。
　乳酸菌の育種を行うに当たっては、ストレプトコッカス・サーモフィラスとラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカスを同時に接種して、発酵温度を３０～４５℃、より好ましくは３２～４２℃で、発酵時間を４～２４時間を行うことによって酸生成力の高い株を育種することができる。
　Ｄ－乳酸を生成する乳酸菌はラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカスであるが、豆乳中の糖の主成分であるスクロースを資化することができないため、単独では増殖することができず、死滅してしまうこともある。一方、ストレプトコッカス・サーモフィラスはスクロースを資化して豆乳中である程度生育できるものが多く、その際に同乳酸菌がスクロースを分解することによってグルコースとフラクトースが生成され、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカスを共存させると、それらを資化して徐々に生育することができるようになることを発明者らは見出した。
　ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカスを増殖させるために、豆乳に糖を添加して補完させることも考えられるが、糖の補完だけでは十分な量のＤ－乳酸生成を示さない場合もあり、糖の補完関係以外に２つの株の相性が存在することから、フラクトースを蓄積するストレプトコッカス・サーモフィラスと共に培養した際にＤ－乳酸量として０．４ｇ／Ｌ以上生成できる代謝が活発なラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカスを選択することが重要である。
　多数存在するストレプトコッカス・サーモフィラスとラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカスの中から適切な株の組合せを選抜あるいは育種することによって、豆乳中で両菌種が共に活性化しヨーグルト様の良好な風味や物性を形成することができるが、ストレプトコッカス・サーモフィラスがシュークロースを盛んに資化する結果、同菌が生成するＬ－乳酸も発酵物中に生成される。
　ヨーグルト様の良好な豆乳発酵物を得るためには、Ｄ－乳酸だけでなく、ストレプトコッカス・サーモフィラスによって生成されるＬ－乳酸も含まれている必要がある。
　本発明で用いる乳酸菌は、上述したように選抜あるいは育種によって得ることができ、本願明細書の実施例においては、ストレプトコッカス・サーモフィラスＫ１５８０株とラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカスＫ１５８１株の組合せ、ストレプトコッカス・サーモフィラスＫ１５８４株とラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカスＫ１５８５株の組合せ、ストレプトコッカス・サーモフィラス　ダニスコ社株（混合スターターＹＯ－ＭＩＸ４９９より単離した株）とラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカス　ダニスコ社株（混合スターターＹＯ－ＭＩＸ５０５、５１１、８６３より単離した株）の組合せ、などが該当する。本発明の豆乳発酵物は、上記性質を有する乳酸菌を使用することにより得ることができるため、実施例記載の菌株に限定されるものではない。
　豆乳を乳酸菌で発酵する方法に関しては、一般的に知られているヨーグルトや乳酸菌飲料の製法に基づいて行うことができ、例えば、ストレプトコッカス・サーモフィラスを１×１０４～１×１０８ｃｆｕ／ｍＬ、より好ましくは、１×１０５～１×１０７ｃｆｕ／ｍＬ、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカスを１×１０２～１×１０７ｃｆｕ／ｍＬ、より好ましくは、１×１０３～１×１０５ｃｆｕ／ｍＬとなるように豆乳に接種し、発酵温度３０～４５℃、より好ましくは３７～４２℃で、４～２４時間の範囲内で発酵すれば良く、発酵形態は特に制限されるものではない。
　このようにして得られる本発明のヨーグルト様豆乳発酵物は、Ｄ－乳酸を０．４ｇ／Ｌ以上含有することを特徴としており、ストレプトコッカス・サーモフィラスとラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカスの代謝が共に盛んになることで、これまで市販の乳酸菌混合スターターをそのまま用いた場合では得られなかった乳酸生成量を示し、それぞれの菌種に由来する芳香成分を有するヨーグルト様の風味や物性の良い豆乳発酵物となる。また、大豆由来以外の原料を添加せずに発酵することが可能であることから、副原料由来の味に影響されることも無い。さらに、本発明の豆乳発酵物は汎用性が高く、ヨーグルト様食品だけでなく、調味料やチーズ、飲料形態など、大豆関連飲食品のいずれの製品にも応用することが可能である。
　なお、本実施形態ではストレプトコッカス・サーモフィラス及びラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカスの２種類のみを用いて乳酸発酵物を製造する例を説明したが、これに限定されず、ストレプトコッカス・サーモフィラス及びラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカスの乳酸発酵や得られる豆乳発酵物の風味に影響を与えない限り、本発明に示す２種の乳酸菌に加えてストレプトコッカス・サーモフィラス及びラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカス以外の乳酸菌を併用してもよい。
　以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲は、それらの例により何ら限定されるものではない。
１．市販の乳酸菌混合スターターを用いた豆乳発酵物のＤ－乳酸量の測定
（１）乳酸菌混合スターター
　乳酸菌混合スターターとして、市販のヨーグルト製造用の乳酸菌混合スターター（ダニスコ社製、ストレプトコッカス・サーモフィラス株及びラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス株の両方を含む凍結乾燥品。以下、「市販混合スターター」ということがある）を使用した。この市販混合スターターは、ストレプトコッカス・サーモフィラス株及びラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス株の性質に応じて、種々のものが存在する。具体的には、ＹＯ－ＭＩＸ３００、ＹＯ－ＭＩＸ３０５、ＹＯ－ＭＩＸ４９６、ＹＯ－ＭＩＸ４９９、ＹＯ－ＭＩＸ５０５、ＹＯ－ＭＩＸ５１１、ＹＯ－ＭＩＸ８６３、ＹＯ－ＭＩＸ８８３、ＹＯ－ＭＩＸ８８５、ＹＯ－ＭＩＸ４０１、ＹＯ－ＭＩＸ４２１、ＹＯ－ＭＩＸ４９５、ＹＯ－ＭＩＸ６０１である（いずれも製品番号）。
（２）発酵条件及び測定方法
　豆乳発酵原液には、市販の無調整豆乳（キッコーマンソイフーズ社製）を用いた。一方、各乳酸菌混合スターターの凍結乾燥物を１０ｍＬのＬＭ１７培地（Ｔｅｒｚａｇｈｉ及びＳａｎｄｉｎｅ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９，８０７～８１３，１９７５）で培養し、培養液を０．９％ＮａＣｌ溶液で遠心・洗浄し、１０ｍＬの０．９％ＮａＣｌ溶液に再懸濁した。この調製した懸濁液を上記豆乳発酵原液に１．０％（ｖ／ｖ）接種し、４２℃、２４時間発酵した。そして、２４時間経過後に発酵を終了し、豆乳発酵物中のＤ－乳酸量を、酵素電極法（王子計測社製、バイオセンサーＢＦ－５）により測定した。
（３）結果
　結果を図４に示す。２４間発酵させて得られた豆乳発酵物中のＤ－乳酸量を測定したところ、Ｄ－乳酸はほとんど生成されず、所望のヨーグルト様の風味を持つ豆乳発酵物が得られないことを確認した（図４）。
２．供試菌株の単離、選抜及び育種
（１）ストレプトコッカス・サーモフィラス
　市販スターター（いずれもストレプトコッカス・サーモフィラス及びラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカスの２菌種を含む）から、ストレプトコッカス・サーモフィラス株のみを単離した。単離した株は、市販スターターの製品番号に基づき、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ：Ｓｔ．）４５株、Ｓｔ．４０株、Ｓｔ．５０５株、Ｓｔ．５１１株、Ｓｔ．８６３株、Ｓｔ．８８３株、Ｓｔ．８８５株、Ｓｔ．３００株、Ｓｔ．３０５株、Ｓｔ．４９５株、Ｓｔ．４９６株、Ｓｔ．４９９株、Ｓｔ．１８７株、Ｓｔ．２０５株、Ｓｔ．２０７株、Ｓｔ．２０８株、Ｓｔ．２１１株、Ｓｔ．４０１株、Ｓｔ．４２１株、Ｓｔ．４９２株、Ｓｔ．６０１株とした。
　上記の単離株のうち、単離菌株の種菌を１％の比率で豆乳に接種し、３７～４５℃で１２～２４時間培養した際に発酵物中に０．４ｇ／Ｌ以上のフラクトースを蓄積可能であるストレプトコッカス・サーモフィラス株を選抜し、選抜株とした。具体的には、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔ．）４０株、Ｓｔ．５１１株、Ｓｔ８６３株、Ｓｔ．８８５株、Ｓｔ．４９６株、Ｓｔ．４９９株、Ｓｔ．１８７株、Ｓｔ．２０５株、Ｓｔ．４０１株、Ｓｔ．４２１株、Ｓｔ．４９２株、Ｓｔ．６０１株を選抜株とした。
　また、オランダに拠点を置くＮＩＺＯ　ｆｏｏｄ　ｒｅｓｅａｒｃｈ社が保有するストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｓｔ．２３３３株とラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）Ｌｂ．１８５株を無調整豆乳（キッコーマンソイフーズ社製）に接種し、継代培養を行った。豆乳発酵物を１％（ｖ／ｖ）の比率で繰り返し豆乳に接種し、３７～４５℃で１２～２４時間培養した。およそ７００世代、継代培養を実施し、得られた豆乳発酵物から単離したストレプトコッカス・サーモフィラス株をＫ１５８０株とした。
　さらに同じくＮＩＺＯ　ｆｏｏｄ　ｒｅｓｅａｒｃｈ社が保有するストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｓｔ．１３１株とラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）Ｌｂ．１９４株を無調整豆乳（キッコーマンソイフーズ社製）に接種し、継代培養を行った。豆乳発酵物を１％（ｖ／ｖ）の比率で繰り返し豆乳に接種し、３７～４５℃で１２～２４時間培養した。およそ７００世代、継代培養を実施し、得られた豆乳発酵物から単離したストレプトコッカス・サーモフィラス株をＫ１５８４株とした。
（２）ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカス
　上記市販スターターから、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス株のみを単離した。単離した株は、市販スターターの製品番号に基づき、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ：Ｌｂ．）３００株、Ｌｂ．３０５株、Ｌｂ．４０１株、Ｌｂ．Ｌｂ．４２１株、Ｌｂ．４９２株、Ｌｂ．４９５株、Ｌｂ．４９６株、Ｌｂ．４９９株、Ｌｂ．５０５株、Ｌｂ．５１１株、Ｌｂ．６０１株、Ｌｂ．８６３株、Ｌｂ．８８３株、Ｌｂ．８８５株とした。
　上記の単離株のうち、上述したストレプトコッカス・サーモフィラスの選抜株１．０％と共に、上記単離株の種菌１．０％を豆乳に接種して３７～４５℃で１２～２４時間培養した際に、発酵物中に０．４ｇ／Ｌ以上のＤ－乳酸を蓄積するラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス株を選抜し、選抜株とした。具体的には、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス（Ｌｂ．）４９２株、Ｌｂ．５０５株、Ｌｂ．５１１株、Ｌｂ．６０１株を選抜株とした。
　また、ＮＩＺＯ　ｆｏｏｄ　ｒｅｓｅａｒｃｈが保有するストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｓｔ．２３３３株とラクトバチルス・ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）Ｌｂ．１８５を無調整豆乳（キッコーマンソイフーズ社製）に接種し、継代培養を行った。豆乳発酵物を１％（ｖ／ｖ）の比率で繰り返し豆乳に接種し、３７～４５℃で１２～２４時間培養した。およそ７００世代、継代培養を実施し、得られた豆乳発酵物から単離したラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス株をＫ１５８１株とした。
　さらに同じくＮＩＺＯ　ｆｏｏｄ　ｒｅｓｅａｒｃｈが保有するストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｓｔ．１３１とラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）Ｌｂ．１９４を無調整豆乳（キッコーマンソイフーズ社製）に接種し、継代培養を行った。豆乳発酵物を１％（ｖ／ｖ）の比率で繰り返し豆乳に接種し、３７～４５℃で１２～２４時間培養した。およそ７００世代、継代培養を実施し、得られた豆乳発酵物から単離したラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス株をＫ１５８５株とした。同様にＳｔ．１３１とＬｂ．１８５の継代培養から得たラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス株をＫ１５８３株とした。
３．豆乳発酵物中のＤ－乳酸量の比較
（１）供試菌株
　市販混合スターターから単離した乳酸菌及び選抜・育種した乳酸菌（上記２参照）を用いて豆乳を発酵させ、得られた豆乳発酵物中のＤ－乳酸量を測定・比較した。
（２）発酵条件及び測定方法
　発酵原料は、成分無調整豆乳（キッコーマンソイフーズ社製）を用いた。この発酵原料に、ストレプトコッカス・サーモフィラス株とラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス株からなる乳酸菌混合スターターを構成したものを添加し、４２℃、２４時間発酵した。発酵終了後、得られた豆乳発酵物中のＤ－乳酸量を酵素電極法（王子計測社製、バイオセンサーＢＦ－５）で測定した。
（３）結果
　図１は、各種ストレプトコッカス・サーモフィラス株と、育種株であるラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカスＫ１５８１株とで乳酸菌混合スターターを構成し、発酵して得られた豆乳発酵物中のＤ－乳酸量を測定した結果を示す図である。
　図２は、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカスＫ１５８１株に代えて、同じく育種株であるラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカスＫ１５８５株を乳酸菌混合スターターとし、同様の条件で豆乳を発酵し、得られた豆乳発酵物中のＤ－乳酸量を測定した結果を示す図である。
　図１及び図２に示すように、同じラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス株でも、組み合わせるストレプトコッカス・サーモフィラス株によってＤ－乳酸生成量が異なることから、ストレプトコッカス・サーモフィラス株の特徴によってもラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス株の代謝能が変化することを確認した。特に、フラクトースの生成量が０．４ｇ／Ｌ以上となることを指標に選抜した株では顕著にＤ－乳酸生成量が高くなる傾向にあった。
　図３は、育種株であるストレプトコッカス・サーモフィラスＫ１５８０株と、市販スターターから単離した各ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス株とで乳酸菌混合スターターを構成し、これを豆乳に接種し、同様の条件で発酵して得た豆乳発酵物中のＤ－乳酸量を測定した結果を示す図である。
　図３に示すように、育種したストレプトコッカス・サーモフィラスＫ１５８０株を使用した場合でも、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス株によってそのＤ－乳酸量の生成に大きな違いがあることを確認した。
　図１、図２、図３、図４で示すように、ストレプトコッカス・サーモフィラス株、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス株共に、市販の乳酸菌混合スターターをそのまま用いた発酵によって得た豆乳発酵物中では、Ｄ－乳酸があまり生成されないのに対し、ストレプトコッカス・サーモフィラス株、およびラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス株の両方を選抜または育種した株に置き換えることによって、０．４ｇ／Ｌ以上のＤ－乳酸を含んだ豆乳発酵物を得ることができる。特に、本発明にて育種した乳酸菌同士（ストレプトコッカス・サーモフィラスＫ１５８０株とラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス株Ｋ１５８１株）から構成された乳酸菌混合スターターを用いた場合では、更にＤ－乳酸量の多い豆乳発酵物を得ることができる（図１参照）。
　以上の結果から、ストレプトコッカス・サーモフィラスの持つ特徴によって共に発酵するラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカスによるＤ－乳酸生成量に大きな変化が見られ、またラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカスも株により豆乳中でのＤ－乳酸生成量が大きく異なることを確認した。
４．無調整豆乳膜透過液中でのラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス株による発酵後のＤ－乳酸量の比較
（１）上述のように、ストレプトコッカス・サーモフィラス株の特徴によってラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス株によるＤ－乳酸生成量が大きく変化したことが分かった。そこで、選抜・育種したラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス株と市販スターターから単離したラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス株の豆乳膜透過中での代謝能の違いを確認するため、予めフラクトースを補糖した豆乳膜透過液中でのＤ－乳酸生成量を比較した。豆乳膜透過液は豆乳から高分子の不溶性タンパク質や脂質が取り除かれたものであり、豆乳中の遊離アミノ酸、可溶性のペプチド、糖分やミネラルなど大きな違いはないものと考えられる。
（２）無調整豆乳膜透過液の作製
　市販の無調整豆乳（キッコーマンソイフーズ社製）を中空糸状の限外ろ過モジュール（型式：ＵＳＰ－１４３（旭化成社製））を用い、真空ポンプで吸引し（－６０ｋＰａ）、膜を透過した液を成分無調整の豆乳膜透過液とした。この液に対し、終濃度１．０％（ｖ／ｖ）となるようにフラクトースを無菌的に添加した（無調整豆乳膜透過液）。更に、この豆乳膜透過液に塩酸を添加し、ｐＨ５．０に調整した酸性豆乳膜透過液を作製した。
（３）豆乳膜透過液での培養後のＤ－乳酸生成量の測定
　市販のヨーグルト製造用粉末混合スターター（ダニスコ社製：ストレプトコッカス・サーモフィラス株およびラクトバチルス・ブルガリカス株を含む凍結乾燥品）から単離したラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス株、育種したラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス株３株（Ｋ１５８１株、Ｋ１５８３株、Ｋ１５８５株）、野生株（ＡＴＣＣ１１８４２株）をそれぞれＭＲＳ培地で培養した。得られた菌液を０．８５％滅菌食塩水で２度遠心・洗浄し、得られたペレットを無調整豆乳膜透過液に懸濁し、スターター菌液とした。
　無調整豆乳膜透過液、酸性（ｐＨ５．０）豆乳膜透過液それぞれに洗菌した菌液を１．０％接種し、４２℃で２４時間培養（ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス株単独培養）し、培養後の菌液のＤ－乳酸量を測定した（図５及び図６）。
　無調整豆乳膜透過液では、市販スターターやＡＴＣＣ１１８４２株に比べ、本発明にて育種したラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス株によるＤ－乳酸産生量は顕著に高い値を示した。同様に、酸性豆乳膜透過液では無調整豆乳膜透過液に比べ、市販スターターと育種した株とで、Ｄ－乳酸生成量に顕著な違いが見られた。市販スターターより分離したラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス株では特に低ｐＨ条件下（ｐＨ５．０）において、Ｄ－乳酸の生成量が低いのに対し、育種した株は同条件下で、およそ３倍以上のＤ－乳酸を産生することを確認した。豆乳中でのストレプトコッカス・サーモフィラス株との共発酵では、先にサーモフィラス株の生育によりｐＨが低下し、その後ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス株が生育すると考えられる。市販のラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス株では、以上のような環境では、Ｄ－乳酸の生成が０．４（ｇ／Ｌ）を超える株が存在せず、やはり、豆乳環境中では生育・代謝が制限されていることが確認された。以上の結果と合わせ、育種した株に関しては、低ｐＨ、かつ豆乳条件下においても、市販株やＡＴＣＣ１１８４２株と比べ、非常に代謝が盛んに起こっていると推察され、結果として、ヨーグルト様の良好な酸味や風味のある豆乳発酵物を作製することができるものと考えられる。
　なお、市販スターター由来の単離株の中にはＬｂ．５０５株やＬｂ．５１１株など、図３において選抜株として０．４ｇ／Ｌ以上のＤ-乳酸を生成した株も含まれており、図５、図６においても他の市販スターター由来の株よりも高いＤ－乳酸生成を示しているが、０．４ｇ／Ｌの生成量には至っていない。これは図５、図６に示した試験においてはストレプトコッカス・サーモフィルスが存在しないためであると考えられる。無調整豆乳膜透過液にフラクトースを補糖しているが、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカスの代謝を活発化してＤ－乳酸の生成量を高めるには単純にフラクトースを供給するだけでなく、ストレプトコッカス・サーモフィルスは他の役割も担っていると考えられる。
５．サーモフィラス単独で発酵して得た豆乳発酵液中のフラクトース残糖量の測定
　市販の乳酸菌混合スターター（ダニスコ社製）ＹＯ－ＭＩＸ３００、３０５、４９６、４９９、５０１、８８５からストレプトコッカス・サーモフィラス株（Ｓｔ．３００株、Ｓｔ．３０５株、Ｓｔ．４９６株、Ｓｔ．４９９株、Ｓｔ．５０１株、Ｓｔ．８８５株）のみを単離した。単離した各菌株を１０ｍＬのＬＭ１７培地で培養し、培養液を０．９％ＮａＣｌ溶液で遠心・洗浄し、１０ｍＬの０．９％ＮａＣｌ溶液に再懸濁した。豆乳発酵原液には、市販の無調整豆乳（キッコーマンソイフーズ社製）を用いた。この豆乳発酵原液に上述で調製した懸濁液を１．０％（ｖ／ｖ）接種し、４２℃、２４時間発酵した。発酵後、遠心上清を回収し、フラクトースの残糖量をＦキット　Ｄ－グルコース/果糖（ジェイ・ケイ・インターナショナル社製）により測定した。結果を図７に示す。
　図７に示すように、ストレプトコッカス・サーモフィラス株の中には、Ｓｔ．４９６株、Ｓｔ．４９９株、Ｓｔ．８８５株のように、豆乳発酵物中にフラクトースを０．４ｇ／Ｌ以上蓄積する株と、蓄積しない株が存在することが判明した。
６．乳酸菌スターターの組み合わせによるＤ－乳酸量の生成に及ぼす影響
　フラクトースを蓄積する特徴のあるストレプトコッカス・サーモフィラス株（Ｓｔ．４９９株）と蓄積しない株（Ｓｔ．３０５株）を市販混合スターターＹＯ－ＭＩＸ５０５、５１１、８６３から単離したラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス株（Ｌｂ．５０５株、Ｌｂ．５１１株、Ｌｂ．８６３株）と１：１で組合せた乳酸菌混合スターターを構成した。これを市販の無調整豆乳（キッコーマンソイフーズ社製）に添加し４２℃で２４時間、発酵して豆乳発酵物を得た。そして、発酵終了後、得られた豆乳発酵物中のＤ－乳酸量を酵素電極法（王子計測社製、バイオセンサーＢＦ－５）で測定した。
　図８に、豆乳発酵物中のＤ－乳酸生成量の測定結果を示す。図８に示すように、フラクトースを蓄積するストレプトコッカス・サーモフィラス株と組合せることで、０．４ｇ／Ｌ以上のＤ－乳酸が生成され、副原料無添加でもラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスとの共生関係が豆乳でも構築されることを確認した。
７．豆乳発酵中の糖濃度の経時的推移
　ストレプトコッカス・サーモフィラス株とラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス株が豆乳中で共生関係を構築するためには、ストレプトコッカス・サーモフィラス株によって豆乳の主要糖分であるスクロースを分解し、フラクトースを蓄積することで、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス株に糖源を供給することが不可欠であると考えられる。今回、育種したストレプトコッカス・サーモフィラスＫ１５８０株を単独で発酵した時、また、ストレプトコッカス・サーモフィラスＫ１５８０株とラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスＫ１５８１株を共発酵した時のスクロース、フラクトースの残糖量を経時的に測定した。発酵温度は４２℃に設定した。スクロースの経時変化を図９に、フラクトースの経時変化を図１０に示す。
　図１１は、ストレプトコッカス・サーモフィラスＫ１５８０株とラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスＫ１５８１株で豆乳を４２℃で共発酵した際の経時的なフラクトース濃度の推移を示した図である。
　ストレプトコッカス・サーモフィラスＫ１５８０株を単独で発酵した条件では、スクロースの量が経時的に減少し、フラクトースの蓄積が確認された（図９、図１０）。一方、ストレプトコッカス・サーモフィラスＫ１５８０株とラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスＫ１５８１株で共発酵した際には、一度、フラクトースが少量蓄積され、その後減少することが分かった（図１１）。
　２つの結果から、Ｋ１５８１株によってフラクトースが代謝され、結果としてＤ－乳酸やその他、芳香成分の生成に寄与しているものと考えられる。ストレプトコッカス・サーモフィラスにはフラクトースを積極的に資化する株とそうでない株とに分けられ、本実施例における選抜株及び育種株の様にフラクトースを資化せずに、発酵物中に蓄積させる特徴のあるストレプトコッカス・サーモフィラスを用いることで、豆乳中においてもラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスと共生関係を構築し、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス由来の風味を豆乳発酵物に付与することができ、結果として風味の良い豆乳発酵物を産み出すことが可能となる。
８．育種株を用いた官能評価
　育種株であるストレプトコッカス・サーモフィラスＫ１５８０株とラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスＫ１５８１株からなる乳酸菌混合スターターを調製し、これを用いて、無調整豆乳（キッコーマンソイフーズ社製）を４２℃、２４時間発酵させて豆乳発酵物を得た。一方、ストレプトコッカス・サーモフィラスＫ１５８０株を単独で無調整豆乳に添加し、４２℃、２４時間発酵させ、豆乳発酵物を得た。それぞれの成分分析値は以下のとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　次に、単独発酵した豆乳発酵物と共発酵物を適宜混合することで、発酵物中のＤ－乳酸量を調製した。すなわち、１００％共発酵物（サンプル１）、４０％共発酵物（サンプル２）、３０％共発酵物（サンプル３）、２０％共発酵物（サンプル４）、１５％共発酵物（サンプル５）、１０％共発酵物（サンプル６）、１００％単独発酵物（サンプル７）をそれぞれ作製した。各サンプルのＤ－乳酸推測値、推定Ｄ／Ｌ比は表２のとおりである。
　また、各サンプルを試食し、Ｄ－乳酸量と豆乳発酵物の風味との関係を下記の評価基準で評価した。
（評価基準）
　◎：非常に風味が良い
　○：風味が良い
　△：風味が少し悪い
　×：風味が悪い
　結果を表２に示す。表２に示すように、サンプル１からサンプル３までは風味良好であることが判明した。従って、豆乳発酵物においては、Ｄ－乳酸を少なくとも０．４ｇ／Ｌ以上生成するラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス株を使用することで風味が良好になることが判明した。また、単にラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス株のみが旺盛に生育するだけでは良好な風味が得られるのではなく、ストレプトコッカス・サーモフィラスの生育とのバランスが重要であり、Ｄ／Ｌ乳酸比が０．０５以上であることが好ましいことが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
９．その他市販混合スターターを用いて発酵して得た豆乳発酵物の官能評価
　市販のヨーグルト製造用粉末混合スターター（ダニスコ社製：ストレプトコッカス・サーモフィラス株およびラクトバチルス・ブルガリカス株を含む凍結乾燥品）ＹＯ－ＭＩＸ３００、ＹＯ－ＭＩＸ３０５、ＹＯ－ＭＩＸ５１１、ＹＯ－ＭＩＸ８６３（いずれも製品番号）の粉末を滅菌水で溶解し、同量の懸濁液を無調整豆乳（キッコーマンソイフーズ社製）に接種し、４２℃、２４時間発酵させ、豆乳発酵物を得た。
　一方、市販混合スターターＹＯ－ＭＩＸ８８５、ＹＯ－ＭＩＸ４９６由来のストレプトコッカス・サーモフィラス株（Ｓｔ．８８５株、Ｓｔ．４９６株）を単離した。また、市販混合スターターＹＯ－ＭＩＸ３０５、ＹＯ－ＭＩＸ４９２、ＹＯ－ＭＩＸ６０１由来のラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス株（Ｌｂ．３０５株、Ｌｂ．４９２株、Ｌｂ．６０１株）を単離し、それぞれグリセロールストック菌液として保管し、試験に用いた。
　また、育種株として、ストレプトコッカス・サーモフィラスＫ１５８０株及びＫ１５８４株とラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスＫ１５８１株及びＫ１５８５株を用いた。
　作製したストレプトコッカス・サーモフィラス株（Ｓｔ．株）とラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス株（Ｌｂ．株）をそれぞれ１：１で混合し（例えば、Ｋ１５８０株＋Ｋ１５８１株やＳｔ．８８５株＋Ｌｂ．３０５株など）、１０ｍＬの無調整豆乳（キッコーマンソイフーズ社製）で発酵させ、前発酵物を得た。この前発酵物１．０％（ｖ／ｖ）を無調整豆乳（キッコーマンソイフーズ社製）に接種し、４２℃、２４時間発酵させ、豆乳発酵物を得た。各豆乳発酵物の乳酸分析値を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　上記のようにして得られた各豆乳発酵物に、終濃度６．０％（ｗ／ｖ）となるようにショ糖を添加し、風味や呈味について官能評価を実施した。その結果、Ｄ－乳酸を含まない豆乳発酵物では、甘さが先行し、好ましいものにはならなかったが、Ｄ－乳酸を０．４ｇ／Ｌ以上含む豆乳発酵物では、酸甘バランスが取れ、風味良好な豆乳発酵物となることが判明した。以上のことから、豆乳発酵物に砂糖を添加した場合においても、本発明に係る乳酸菌混合スターター（選抜または育種した株からなる乳酸菌混合スターター）を用いて製造した豆乳発酵物の方が優れた風味や呈味を有することを見出した。
１０．豆乳発酵物の物性測定
　豆乳発酵物の物性を測定し、評価を実施した。物性の評価に関しては、豆乳発酵物中にどのような粒子径の粒子が、どのような割合で含まれているかを示す指標である粒度分布を用いた。粒度分布を測定することで、発酵物を口に含んだときの舌触りや滑らかさを評価することができる。
　市販のヨーグルト製造用粉末混合スターター（ダニスコ社製：ストレプトコッカス・サーモフィラス株およびラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス株を含む凍結乾燥品）ＹＯ－ＭＩＸ３００、ＹＯ－ＭＩＸ３０５（いずれも製品番号）によって発酵して得た豆乳発酵物、また、選抜または育種した株（Ｋ１５８０株＋Ｋ１５８１株、Ｓｔ．４９６＋Ｌｂ．６０１、Ｓｔ．８８５＋Ｌｂ．３０５）によって発酵して得た豆乳発酵物を均一に撹拌し、レーザー回折式粒度分布測定装置（ＳＡＬＤ－２２００（島津製作所））に供し、粒度分布を測定した。
　測定結果を図１２に示す。グラフ内には各サンプルごとに同一シンボルで粒子径の出現頻度と共に積算結果も示した。市販スターターによって発酵して得た豆乳発酵物に比べ、選抜または育種した株の発酵によって得た豆乳発酵物においては、粒子径１００マイクロメートル以上の粒子が全体に占める比率が１０％以下であり、より舌触りのなめらかな豆乳発酵物であることが確認された。これは育種あるいは選抜によって豆乳発酵時のストレプトコッカス・サーモフィラスとラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスの代謝がそれぞれ活性化されたことにより、それら乳酸菌が生成する多糖類の生成も盛んになり、結果としてザラツキの原因となる大豆タンパクの過剰な凝集を防止して物性が改善されたことを示すものである。

Claims (6)

  1. 　豆乳に接種し培養した際に、発酵物中に０．４ｇ／Ｌ以上のフラクトースを蓄積可能であるストレプトコッカス・サーモフィラスと、
    　豆乳に接種して培養した際に、発酵物中に０．４ｇ／Ｌ以上のＤ－乳酸を蓄積可能であるラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスと、
    　を含む乳酸菌混合スターターを使用して得られた豆乳発酵物。
  2. 　前記ストレプトコッカス・サーモフィラス及び前記ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスが、豆乳を主成分とする培地で育種されたものである、請求項１に記載の豆乳発酵物。
  3. 　前記ストレプトコッカス・サーモフィラス及び前記ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスが、豆乳を主成分とする培地に同時に接種して育種されたものである、請求項１に記載の豆乳発酵物。
  4. 　請求項１に記載した豆乳発酵物であって、前記豆乳発酵物の粒度分布において粒子径１００マイクロメートル以上の粒子の全体に占める比率が１０％以下である、豆乳発酵物。
  5. 　豆乳に接種し培養した際に、発酵物中に０．４ｇ／Ｌ以上のフラクトースを蓄積可能であるストレプトコッカス・サーモフィラスと、
    　豆乳に接種して培養した際に、発酵物中に０．４ｇ／Ｌ以上のＤ－乳酸を蓄積可能であるラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスと、
    　を含む乳酸菌混合スターター。
  6. 　前記乳酸菌混合スターターが、豆乳発酵物の製造に使用される、請求項６に記載の乳酸菌混合スターター。
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