KR101794772B1 - 폴리아민 고생산 신균주 바실러스 서브틸리스 ee5 균주 - Google Patents

폴리아민 고생산 신균주 바실러스 서브틸리스 ee5 균주 Download PDF

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Abstract

본 발명은 폴리아민 고함유 낫토를 생산하는 바실러스 서브틸리스 EE5 균주, 이를 이용하여 발효시킨 배양물 및 이를 이용한 폴리아민의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 바실러스 서브틸리스 EE5 균주는 폴리아민 고함유 기능성 식품이 필요한 분야에서 기호성 높은 폴리아민 고함유 기능성 낫토를 경제적이고 효율적으로 제공할 수 있는 수단으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

폴리아민 고생산 신균주 바실러스 서브틸리스 EE5 균주{Novel strains of Bacillus subtilis EE5 producing high amount of polyamine}
본 발명은 폴리아민 고함유 낫토를 생산하는 바실러스 속 균주에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 폴리아민 고함유 낫토를 생산하는 바실러스 서브틸리스 EE5 균주(Bacillus subtilis EE5)에 관한 것이다.
폴리아민은 세포 내에 다량으로 존재하는 생리활성물질의 하나로서 세포 증식 작용, 항알러지 작용, 항노화 작용 등을 나타내는 것으로 알려져 있다. 특히, 최근에는 염증 억제 작용을 나타내는 것으로 알려져, 노화에 수반되는 질환의 진행을 억제하는 작용이 기대되고 있다.
이와 같은 폴리아민의 효과가 밝혀짐에 따라 일상적으로 소비되는 가공식품을 통하여 폴리아민을 섭취하기 위한 다양한 연구가 진행되고 있다.
종래에는, 효모 균체 또는 동물의 장기 등 폴리아민을 다량 포함하는 원료로부터 폴리아민을 추출하고, 이를 섭취 가능한 음식물로 제조하는 방법에 관한 기술 내용이 개시된 바 있다.
일례로, 종래 기술문헌 1(일본 특허공개 제2010-263816호)에서는, 연어의 정소, 돼지의 간장, 맥아, 콩, 낫토, 차 등의 동식물 소재에 염화나트륨, 염화마그네슘 또는 염화칼슘 등을 포함하는 염용액을 첨가해 폴리아민을 추출하고, 이를 포함하고 섭취 가능한 음식물에 관한 기술 내용이 개시되어 있다.
또 다른 예로, 종래 기술문헌 2(일본 특허공개 제2013-051483호)에서는, 종래 기술문헌 1과 동일하게 염용액을 이용해 식물에서 폴리아민을 추출하고, 이를 건강식품, 화장품, 식품 또는 의약품에 활용하는 방법에 관한 기술 내용이 개시되어 있다.
하지만, 문헌 1 및 2에 개시된 방법은 폴리아민의 생산을 위해 복잡한 추출 및 별도의 정제 공정을 필요로 하여 생산 비용이 높고, 해당 방법에 의해 제조된 폴리아민으로 제조한 식품은 기호도 또는 함량이 떨어지는 등의 문제점이 있어, 이를 보완할 수 있는 방법에 대한 연구가 필요하다.
대한민국 특허등록 제10-1373224호(2014.03.05.) 대한민국 특허공개 제10-2013-0054504호(2013.05.27.) 대한민국 특허등록 제10-1495602호(2015.02.16.) 대한민국 특허공개 제10-2011-0018898호(2011.02.24.)
본 발명자들은 폴리아민의 함량이 보다 향상된 식품 개발에 대하여 연구하던 중, 낫토의 발효와 관련된 균주 중에 특정 균주가 폴리아민 생합성능이 현저히 높다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 폴리아민 고함유 낫토를 생산하는 신규한 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, 폴리아민을 고생산하는 능력을 갖는 바실러스 서브틸리스 EE5 균주(Bacillus subtilis EE5, 수탁번호 KCTC13019BP)가 제공된다.
일 구현예에서, 상기 균주는 서열번호 1의 16s RNA를 갖는 것을 특징으로 하며, 폴리아민, 특히, 스퍼미딘을 고함유 고효율로 생산할 수 있다.
본 발명의 또 다른 태양에 따라, 상기 균주를 이용하여 발효시킨 배양물이 제공된다. 일 구현예에서, 상기 배양물은 낫토일 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 태양에 따라, 상기 배양물을 포함하는 식품 조성물이 제공된다.
또한, 본 발명의 또 다른 태양에 따라, 상기 균주를 이용하여 발효시키는 단계를 포함하는 폴리아민의 제조방법이 제공된다. 일 구현예에서, 상기 발효는 낫토의 발효일 수 있으며, 상기 폴리아민은 스퍼미딘일 수 있다.
본 발명에 의해, 신규한 균주인 바실러스 서브틸리스 EE5로 발효시킨 낫토는 일반 낫토에 비하여 약 5배 이상의 폴리아민을 함유하는 것으로 나타나, 낫토 1케이스(50g)로서 폴리아민 1일 필요량을 공급할 수 있다는 것이 밝혀졌다.
따라서, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 EE5 균주는 폴리아민 고함유 기능성 식품이 필요한 분야에서 기존의 낫토 제조 공정에 그대로 적용되어 기호성 높은 폴리아민 고함유 기능성 낫토를 경제적이고 효율적으로 제공할 수 있는 수단으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 낫토 중의 폴리아민을 TLC에 의해 분석한 결과이다(EE5: 바실러스 서브틸리스 EE5 균주; 일반낫토균: 미야기노균(Bacillus subtilis var. natto Miura); 파란색 화살표는 낫토의 대표적인 폴리아민인 스퍼미딘[spermidine]임).
도 2는 바실러스 서브틸리스 EE5 균주가 낫토에서 생산한 폴리아민을 확인하기 위하여 폴리아민의 단실(dansyl) 유도체를 HPLC로 확인한 크로마토그램(A), 및 해당 피크의 MS 스펙트럼(B)이다.
도 3은 바실러스 서브틸리스 EE5 균주의 전자현미경 이미지이다.
도 4는 바실러스 서브틸리스 EE5 균주의 분류학상 위치를 나타낸 것이다.
본 발명은 폴리아민을 고생산하는 능력을 갖는 바실러스 서브틸리스 EE5 균주(Bacillus subtilis EE5, 수탁번호 KCTC13019BP)를 제공한다.
상기 균주는 볏짚 및 건초로부터 내열성 포자를 형성하는 균을 분리하고, 돌연변이 유발 과정을 거쳐 이 중 낫토에서 고함유의 폴리아민을 생산하는 균주를 선별함으로써 얻을 수 있다. 선별된 상기 균주는 폴리아민, 특히, 스퍼미딘을 고함유로 생산하며, 낫토의 발효에 있어서 일반 균주를 사용한 경우에 비하여 약 5.8배의 높은 폴리아민을 생산할 수 있다.
상기 균주는 하기 서열번호 1의 16s RNA를 갖는 것을 특징으로 한다.
서열번호 1:
Figure 112016055065204-pat00001
본 발명의 또 다른 태양에 따라, 상기 균주를 이용하여 발효시킨 배양물이 제공된다. 일 구현예에서, 상기 배양물은 콩류의 배양물일 수 있으며, 바람직하게는 낫토일 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 태양에 따라, 상기 배양물을 포함하는 식품 조성물이 제공된다.
또한, 본 발명의 또 다른 태양에 따라, 상기 균주를 이용하여 발효시키는 단계를 포함하는 폴리아민의 제조방법이 제공된다. 상기 제조방법에서의 발효는 낫토의 발효일 수 있으며, 상기 폴리아민은 스퍼미딘일 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.
<실시예>
1. 균주의 탐색
한국, 중국, 일본, 미국 등 세계 각지에서 수집한 약 500여점의 볏짚 및 건초를 시료로 하여 미생물을 분리하였다. 각 시료를 멸균 식염수에 소량 가하여 현탁시킨 다음, 80 ℃ 항온 수조에서 20분간 열처리하여 얻은 포자액을 2% 한천을 함유하는 LB 평판배지(1% 트립톤, 0.2% 설탕, 0.5% 효모추출물 및 0.5% NaCl, pH 7.0)에 도말하고, 30 ℃ 배양기에서 2일간 배양하였다. 배양 후 균 집락을 형성하는 균체를 분리하였다. 내열성 포자를 형성하는 균이 생산하는 폴리아민의 생산량을 조사하기 위하여, 분리된 균주를 5 ml의 5% 콩가루를 현탁한 배지에 접종하고 37 ℃에서 24시간 동안 배양하였다. 상기 배양액을 원심분리하여 상등액으로부터 폴리아민의 양을 측정하였다.
2. 폴리아민의 정량
배양이 끝난 5% 콩배지 1 ml에 5% HClO4 1 ml를 가하고 6시간 진탕한 후 원심분리하였다. 상등액 1 ml를 취하여 포화 Na2HCO3 2 ml, 1% 단실 클로라이드(dansyl chloride) 2 ml를 가하고 70 ℃에서 1시간 반응시켰다. 여기에 1% 프롤린(proline) 2 ml를 첨가하고 70 ℃에서 30분간 반응시켰다. 반응액 0.5 ml에 톨루엔 0.5 ml를 가하여 와류교반(voltex)한 후 원심분리하여 상등액을 TLC 분석시료로 하였다. TLC(고정상 : 실리카겔[silica gel])를 이용한 분석은 전개용매로 시클로헥산(cyclohexane) : 에틸아세테이트(ethylacetate)(3 : 2 v/v)을 사용하였으며, 단실 처리한 시료 1 ~ 3 μl와 스퍼미딘 표준물질(standard) 1 ~ 3 μl를 로딩하여 전개한 후, 자외선 하에서 촬영하고 덴시토미터(densitometer)로 스팟(spot)의 강도를 측정하여 검량선(standard curve)으로부터 스퍼미딘의 양을 구하였다.
낫토의 경우 배양된 낫토 3 g에 3.5% 과염소산(perchloric acid) 30 ml를 넣어 폴리트론으로 미세균질 분쇄한 현탁액을 4 ℃에서 1시간 진탕하고 원심분리 한 다음 상등액을 단실화(dansylation)하여 TLC 또는 HPLC를 이용하여 측정하였다.
또한, 액체 크로마토그래피(HPLC)로 폴리아민을 분리하고, 분리된 폴리아민을 질량분석법으로 분석하여 폴리아민을 동정하였다. HPLC(Shiseido SP-LC [Shiseido, Japan])를 이용한 분석은, 단실 유도체를 HPLC 컬럼(Imtakt Unison UK-C18 Column, 75 X 2 mm, particle size 3 μm)으로 25 ℃에서 H2O:MeOH을 이동상으로 0.2 ml/min의 유속으로 50:50 → 0:100 농도구배 용출(gradient elution)하였으며, 하기 표 1에 나타낸 바와 같은 조건에서 HPLC를 수행하였다.
Figure 112016055065204-pat00002
또한, 액체 크로마토그래피에 의해 분리된 폴리아민을 질량분석법(MS/MS : Thermo Scientific TSQ Quantum Ultra, Thermo Scientific, USA)으로 분석하여 낫토에 포함된 폴리아민을 동정하였으며, 질량분석은 하기 표 2에 나타낸 바와 같은 조건에서 수행하였다.
Figure 112016055065204-pat00003
표 2에 나타낸 조건으로 질량분석을 수행한 결과, 상기 폴리아민은 낫토의 대표적인 폴리아민인 스퍼미딘(spermidine)임을 확인하였다.
또한, 바실러스 서브틸리스 EE5 균주가 낫토에서 생산하는 폴리아민을 추가적으로 규명 및 확인하기 위하여, 폴리아민의 단실(dansyl) 유도체를 HPLC로 분석하였으며(도 2의 (A)), 해당 피크의 MS 스펙트럼(도 2의 (B))으로부터 생산물이 스퍼미딘(spermidine)인 것으로 확인하였다. 그리고, 질량분석결과를 하기 표 3에 나타내었다.
[단실화된 스퍼미딘(Dansylated spermidine)]
- 선구이온(Parent Ion, M+) : 846.018
- 토막이온 1(Fragment Ion 1) : 305.00(304.999-305.001)
- 토막이온 2(Fragment Ion 2) : 360.00(359.999-360.001)
Figure 112016055065204-pat00004
3. 낫토의 제조
콩을 상온에서 12시간 불린 후 121 ℃에서 40분간 삶았다. 삶은 콩이 냉각되기 전 g당 103 마리의 포자를 접종한 후 50 g씩 낫토 제조용 발포스티렌 용기에 넣고 비닐막을 씌운 다음, 37 ℃에서 20시간 동안 배양하였다. 배양된 낫토를 12시간 동안 냉장보관한 후 폴리아민 함량의 측정 및 관능평가를 수행하였다.
4. 균주의 선발
상기 과정으로 약 100종의 세균을 폴리아민 고생산균으로 1차 선발한 후, 버지스 매뉴얼에 의한 바실러스 속 균주의 분류학적 특성 분석 방법(Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 2002)에 따라서 바실러스 서브틸리스로 분류되는 균 8종을 2차 선발하였다. 선발된 8종의 균주는 하기 표 4에 기재된 바와 같다.
상기 8종의 균주를 사용하여 각각 낫토를 제조하였고, 폴리아민의 생산성이 높고 점질물 생성 여부, 향기, 포자 형성 용이성 등의 기준에 따라 낫토 제조에 가장 적합한 JR-018 균주를 최종 선발하였다.
Figure 112016055065204-pat00005
5. JR-018 균주의 돌연변이 유발
JR-018 균주를 니트로소구아니딘(nitrosoguanidine, NTG, 100 μg/ml)으로 사멸율 99.9%가 되게 처리하여 돌연변이를 유발한 후, 5 mM 디시클로헥실아민(dicyclohexylamine)을 함유한 스피자이젠(Spizizen) 최소배지에 1장당 105 마리를 도말하고 37 ℃에서 5일간 배양하여 살아남은 균을 5% 콩배지에서 배양하여 폴리아민 양을 측정하였다. 최대로 상승한 균주를 바실러스 서브틸리스 EE5(Bacillus subtilis EE5)로 명명하고 한국생명공학 연구원 생물자원센터(KCTC)에 2016.05.03. 일자로 기탁하였으며(기탁번호: KCTC13019BP), 낫토를 제조하여 폴리아민의 생산량, 제조한 낫토의 관능성을 평가하였다.
일반 균주, JR-018 균주 및 바실러스 서브틸리스 EE5를 사용하여 발효시킨 낫토의 폴리아민 함량을 하기 표 5에 나타내었다.
Figure 112016055065204-pat00006
표 5에 나타난 바와 같이, 바실러스 서브틸리스 EE5를 사용하여 발효시킨 낫토는 일반 균주를 사용한 경우에 비하여는 약 5.8배, JR-018 균주를 사용한 경우에 비하여는 약 1.9배의 높은 폴리아민 함량을 나타내었다.
또한, 삶은 콩 1 g 당 103개의 낫토균 포자를 접종하여 37 ℃에서 20시간 발효시킨 후, 12시간 4 ℃에서 냉장하고 낫토에 함유된 폴리아민을 추출하여 TLC로 분석한 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타난 바와 같이, 바실러스 서브틸리스 EE5 균주에 의하여 발효된 낫토는 일반 낫토와 비교하여 폴리아민의 양이 현저하게 증가되었다.
6. 분리된 균주의 형태학적 및 생화학적 특성 규명
(1) 분리된 균주의 형태학적 특성
상기 분리된 폴리아민 고생산 균주는 LB 한천 평판배지에서 유백색의 균 집락을 형성하였고, 균 집락은 가장자리가 불규칙하며 중앙에 유백색의 큰점이 형성된 외형을 나타내었다. 균의 성장에 미치는 온도의 영향과 관련하여서는 25 ℃ 이상 40 ℃ 이하의 범위에서 성장이 양호하였으며, 50 ℃ 이상에서는 균체 성장이 확인되지 않았다. LB 액체배지를 이용한 균체 성장의 대수기에서 현미경 관찰한 결과, 그람 양성의 짧은 막대모양의 외형으로서 비교 균주인 바실러스 서브틸리스와 유사하였으며, 균주는 그람 양성이었고, 세포의 크기는 대략 0.6 ~ 0.7 × 1.5 ~ 1.7 ㎛였다(도 3).
(2) 분리된 균주의 생화학적 특성
버지스 매뉴얼에 의한 바실러스속 균주의 분류학적 특성 분석 방법 (Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 2002)과 API50CHB 키트(BioMerieux사, France)를 사용하여 본 발명에 의한 균주의 생화학적 특성 등을 조사하였다. 본 발명의 균주는 그람 양성의 원통형으로 포자는 세포 중앙에 형성되며, 질산염의 환원력이 있고, 인돌을 생성하지 않았다. 또한, 카제인과 전분을 분해하며, 카탈라아제를 생산하고, 호기적 조건에서만 성장을 하는 것으로 확인되었다. 본 발명에 따른 균주의 상세한 형태학적 특성 및 생화학적 특성(API test 결과)을 하기 표 6에 나타내었고, 생화학적 특성(API test 결과)을 하기 표 7에 나타내었다.
Figure 112016055065204-pat00007
Figure 112016055065204-pat00008
또한, 바실러스 서브틸리스 EE5 균주의 16s rRNA 서열분석 결과, 하기 서열번호 1로 분석되었다.
서열번호 1:
Figure 112016055065204-pat00009
상기 결과를 종합하여, 바실러스 서브틸리스 EE5 균주의 분류학상 위치를 도 4에 나타내었다.
상기한 바와 같은 결과를 통해, 본 발명에 따른 신균주인 바실러스 서브틸리스 EE5을 낫토의 발효에 이용할 경우, 폴리아민인 스퍼미딘(spermidine)의 생합성능이 현저히 높아, 폴리아민 고함유 낫토를 생산할 수 있음을 확인할 수 있었다.
또한, 상기한 바실러스 서브틸리스 EE5 균주는 폴리아민 고함유 기능성 식품이 필요한 분야에서 기존의 낫토 제조 공정에 그대로 적용되어 기호성 높은 폴리아민 고함유 기능성 낫토를 경제적이고 효율적으로 제공할 수 있는 수단으로 유용하게 사용될 것으로 예측되었다.
한국생명공학연구원 한국미생물자원센터(KCTC) KCTC13019BP 20160503
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Claims (10)

  1. 폴리아민을 생산하는 능력을 갖는, 서열번호 1의 16s rRNA를 갖는 바실러스 서브틸리스 EE5 균주(Bacillus subtilis EE5, 수탁번호 KCTC13019BP).
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 균주가 스퍼미딘을 생산하는 것을 특징으로 하는 균주.
  5. 제1항 또는 제4항의 균주를 이용하여 발효시킨 배양물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 배양물이 낫토인 것을 특징으로 하는 배양물.
  7. 제5항의 배양물을 포함하는 식품 조성물.
  8. 제1항 또는 제4항의 균주를 이용하여 발효시키는 단계를 포함하는 폴리아민의 제조방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 발효가 낫토의 발효인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 폴리아민이 스퍼미딘인 것을 특징으로 하는 제조방법.
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