JP6454052B2 - ポリアミン高生産新菌株バチルス・サブチリスｅｅ５菌株 - Google Patents
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Description
本発明は、ポリアミン高含有納豆を生産するバチルス属菌株に係り、より詳細には、ポリアミン高含有納豆を生産するバチルス・サブチリスＥＥ５菌株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＥＥ５）に関する。
ポリアミンは、細胞内に多量で存在する生理活性物質の１つであって、細胞増殖作用、抗アレルギー作用、抗老化作用などを示すと知られている。特に、最近、炎症抑制作用を示すと知られて、老化に伴われる疾患の進行を抑制する作用が期待されている。
このようなポリアミンの効果が明らかになることによって、日常的に消費される加工食品を通じてポリアミンを摂取するための多様な研究が進められている。
従来、酵母菌体または動物の臓器などポリアミンを多量含む原料からポリアミンを抽出し、それを摂取可能な食べ物として製造する方法に関する技術内容が開示されている。
一例として、従来技術文献１（特開第２０１０−２６３８１６号公報）では、鮭の精巣、豚の肝臓、麦芽、大豆、納豆、お茶などの動植物素材に塩化ナトリウム、塩化マグネシウムまたは塩化カルシウムなどを含む塩溶液を添加してポリアミンを抽出し、それを含み、摂取可能な食べ物に関する技術内容が開示されている。
さらに他の例として、従来技術文献２（特開第２０１３−０５１４８３号公報）では、従来技術文献１と同様に塩溶液を用いて植物からポリアミンを抽出し、それを健康食品、化粧品、食品または医薬品に活用する方法に関する技術内容が開示されている。
しかし、技術文献１及び技術文献２に開示された方法は、ポリアミンの生産のために複雑な抽出及び別途の精製工程を必要として、生産コストが高く、当該方法によって製造されたポリアミンに製造した食品は、嗜好度または含量が落ちるなどの問題点があって、それを補完することができる方法についての研究が必要である。
本発明者らは、ポリアミンの含量がより向上した食品開発について研究中、納豆の発酵と関連した菌株中に特定の菌株がポリアミン生合成能が顕著に高いということを見つけた。
したがって、本発明は、ポリアミン高含有納豆を生産する新規な菌株を提供することを目的とする。
本発明の一態様によって、ポリアミンを高生産する能力を有するバチルス・サブチリスＥＥ５菌株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＥＥ５、受託番号ＫＣＴＣ１３０１９ＢＰ）が提供される。
一具現例で、前記菌株は、配列番号１の１６ｓ ＲＮＡを有することを特徴とし、ポリアミン、特に、スペルミジンを高含有・高効率で生産することができる。
本発明のさらに他の態様によって、前記菌株を用いて発酵させた培養物が提供される。一具現例で、前記培養物は、納豆であり得る。
また、本発明のさらに他の態様によって、前記培養物を含む食品組成物が提供される。
また、本発明のさらに他の態様によって、前記菌株を用いて発酵させる段階を含むポリアミンの製造方法が提供される。一具現例で、前記発酵は、納豆の発酵であり、前記ポリアミンは、スペルミジンであり得る。
本発明によって、新規な菌株であるバチルス・サブチリスＥＥ５で発酵させた納豆は、一般納豆に比べて、約５倍以上のポリアミンを含有すると表われて、納豆１ケース（５０ｇ）としてポリアミン１日必要量を供給することができるということが明かになった。
したがって、本発明のバチルス・サブチリスＥＥ５菌株は、ポリアミン高含有機能性食品が必要な分野で既存の納豆製造工程にそのまま適用されて、嗜好性の高いポリアミン高含有機能性納豆を経済的かつ効率的に提供することができるという手段として有用に使われる。
本発明は、ポリアミンを高生産する能力を有するバチルス・サブチリスＥＥ５菌株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＥＥ５、受託番号ＫＣＴＣ１３０１９ＢＰ）を提供する。
前記菌株は、稲わら及び乾草から耐熱性胞子を形成する菌を分離し、突然変異誘発過程を経て、そのうち、納豆から高含有のポリアミンを生産する菌株を選別することで得られる。選別された前記菌株は、ポリアミン、特に、スペルミジンを高含有で生産し、納豆の発酵において、一般菌株を使用した場合に比べて、約５．８倍の高いポリアミンを生産することができる。
前記菌株は、下記の配列番号１の１６ｓ ＲＮＡを有することを特徴とする。
配列番号１：
本発明のさらに他の態様によって、前記菌株を用いて発酵させた培養物が提供される。一具現例で、前記培養物は、大豆類の培養物であり、望ましくは、納豆であり得る。
また、本発明のさらに他の態様によって、前記培養物を含む食品組成物が提供される。
また、本発明のさらに他の態様によって、前記菌株を用いて発酵させる段階を含むポリアミンの製造方法が提供される。前記製造方法での発酵は、納豆の発酵であり、前記ポリアミンは、スペルミジンであり得る。
以下、本発明を実施例を通じてより詳しく説明する。しかし、下記の実施例は、本発明を例示するためのものであって、本発明の範囲が、これに制限されるものではない。
１．菌株の探索
韓国、中国、日本、米国など世界各地から収集した約５００余点の稲わら及び乾草を試料として微生物を分離した。各試料を滅菌食塩水に少量加えて懸濁させた後、８０℃恒温水槽で２０分間熱処理して得た胞子液を２％寒天を含有するＬＢ平板培地（１％トリプトン、０．２％砂糖、０．５％酵母抽出物及び０．５％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）に塗抹し、３０℃培養器で２日間培養した。培養後、菌集落を形成する菌体を分離した。耐熱性胞子を形成する菌が生産するポリアミンの生産量を調査するために、分離された菌株を５ｍｌの５％大豆粉を懸濁した培地に接種し、３７℃で２４時間培養した。前記培養液を遠心分離して、上澄み液からポリアミンの量を測定した。
２．ポリアミンの定量
培養済の５％大豆培地１ｍｌに５％ＨＣｌＯ４ １ｍｌを加え、６時間振盪した後、遠心分離した。上澄み液１ｍｌを取って、飽和Ｎａ２ＨＣＯ３ ２ｍｌ、１％ダンシルクロリド（ｄａｎｓｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）２ｍｌを加え、７０℃で１時間反応させた。これに１％プロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）２ｍｌを添加し、７０℃で３０分間反応させた。反応液０．５ｍｌにトルエン０．５ｍｌを加えて渦流撹拌（ｖｏｌｔｅｘ）した後、遠心分離して上澄み液をＴＬＣ分析試料とした。ＴＬＣ（固定相：シリカゲル（ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ）を利用した分析は、展開溶媒としてシクロヘキサン（ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ）：酢酸エチル（ｅｔｈｙｌａｃｅｔａｔｅ）（３：２ｖ／ｖ）を使用し、ダンシル処理した試料１〜３μｌとスペルミジン標準物質（ｓｔａｎｄａｒｄ）１〜３μｌとをローディングして展開した後、紫外線下で撮影し、デンシトメータ（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ）でスポット（ｓｐｏｔ）の強度を測定して、検量線（ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ）からスペルミジンの量を求めた。
培養済の５％大豆培地１ｍｌに５％ＨＣｌＯ４ １ｍｌを加え、６時間振盪した後、遠心分離した。上澄み液１ｍｌを取って、飽和Ｎａ２ＨＣＯ３ ２ｍｌ、１％ダンシルクロリド（ｄａｎｓｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）２ｍｌを加え、７０℃で１時間反応させた。これに１％プロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）２ｍｌを添加し、７０℃で３０分間反応させた。反応液０．５ｍｌにトルエン０．５ｍｌを加えて渦流撹拌（ｖｏｌｔｅｘ）した後、遠心分離して上澄み液をＴＬＣ分析試料とした。ＴＬＣ（固定相：シリカゲル（ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ）を利用した分析は、展開溶媒としてシクロヘキサン（ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ）：酢酸エチル（ｅｔｈｙｌａｃｅｔａｔｅ）（３：２ｖ／ｖ）を使用し、ダンシル処理した試料１〜３μｌとスペルミジン標準物質（ｓｔａｎｄａｒｄ）１〜３μｌとをローディングして展開した後、紫外線下で撮影し、デンシトメータ（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ）でスポット（ｓｐｏｔ）の強度を測定して、検量線（ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ）からスペルミジンの量を求めた。
納豆の場合、培養された納豆３ｇに３．５％過塩素酸（ｐｅｒｃｈｌｏｒｉｃ ａｃｉｄ）３０ｍｌを入れて、ポリトロンで微細均質粉砕した懸濁液を４℃で１時間振盪し、遠心分離した後、上澄み液をダンシル化（ｄａｎｓｙｌａｔｉｏｎ）してＴＬＣまたはＨＰＬＣを用いて測定した。
また、液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）でポリアミンを分離し、該分離されたポリアミンを質量分析法で分析して、ポリアミンを同定した。ＨＰＬＣ（Ｓｈｉｓｅｉｄｏ ＳＰ−ＬＣ、Ｓｈｉｓｅｉｄｏ、Ｊａｐａｎ）を利用した分析は、ダンシル誘導体をＨＰＬＣカラム（Ｉｍｔａｋｔ Ｕｎｉｓｏｎ ＵＫ−Ｃ１８ Ｃｏｌｕｍｎ、７５×２ｍｍ、ｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｉｚｅ ３μｍ）で２５℃でＨ２Ｏ：ＭｅＯＨを移動相で０．２ｍｌ／ｍｉｎの流速で５０：５０→０：１００濃度勾配溶出（ｇｒａｄｉｅｎｔ ｅｌｕｔｉｏｎ）し、下記表１に示すような条件でＨＰＬＣを行った。
また、液体クロマトグラフィーによって分離されたポリアミンを質量分析法（ＭＳ／ＭＳ：Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＴＳＱ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｕｌｔｒａ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）で分析して、納豆に含まれたポリアミンを同定し、質量分析は、下記表２に示すような条件で行った。
表２に示した条件で質量分析を行った結果、前記ポリアミンは、納豆の代表的なポリアミンであるスペルミジン（ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ）であることを確認した。
また、バチルス・サブチリスＥＥ５菌株が、納豆から生産するポリアミンを追加的に究明及び確認するために、ポリアミンのダンシル（ｄａｎｓｙｌ）誘導体をＨＰＬＣで分析し（図２の（Ａ））、当該ピークのＭＳスペクトル（図２の（Ｂ））から生産物がスペルミジンであると確認した。そして、質量分析結果を下記表３に示した。
［ダンシル化されたスペルミジン（Ｄａｎｓｙｌａｔｅｄ ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ）］
−先駆イオン（Ｐａｒｅｎｔ Ｉｏｎ、Ｍ＋：８４６．０１８
−断片イオン１（Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｉｏｎ １）：３０５．００（３０４．９９９−３０５．００１）
−断片イオン２（Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｉｏｎ ２）：３６０．００（３５９．９９９−３６０．００１）
−先駆イオン（Ｐａｒｅｎｔ Ｉｏｎ、Ｍ＋：８４６．０１８
−断片イオン１（Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｉｏｎ １）：３０５．００（３０４．９９９−３０５．００１）
−断片イオン２（Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｉｏｎ ２）：３６０．００（３５９．９９９−３６０．００１）
３．納豆の製造
大豆を常温で１２時間ふやかした後、１２１℃で４０分間煮た。煮た大豆が冷却する前、ｇ当たり１０３匹の胞子を接種した後、５０ｇずつ納豆製造用発泡スチレン容器に入れ、ビニールカバーを被せた後、３７℃で２０時間培養した。該培養された納豆を１２時間冷蔵保管した後、ポリアミン含量の測定及び官能評価を行った。
大豆を常温で１２時間ふやかした後、１２１℃で４０分間煮た。煮た大豆が冷却する前、ｇ当たり１０３匹の胞子を接種した後、５０ｇずつ納豆製造用発泡スチレン容器に入れ、ビニールカバーを被せた後、３７℃で２０時間培養した。該培養された納豆を１２時間冷蔵保管した後、ポリアミン含量の測定及び官能評価を行った。
４．菌株の選抜
前記過程で約１００種の細菌をポリアミン高生産菌として１次選抜した後、バージェイズマニュアルによるバチルス属菌株の分類学的特性の分析方法（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、２００２）によってバチルス・サブチリスに分類される菌８種を２次選抜した。該選抜された８種の菌株は、下記表４に記載の通りである。
前記過程で約１００種の細菌をポリアミン高生産菌として１次選抜した後、バージェイズマニュアルによるバチルス属菌株の分類学的特性の分析方法（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、２００２）によってバチルス・サブチリスに分類される菌８種を２次選抜した。該選抜された８種の菌株は、下記表４に記載の通りである。
前記８種の菌株を使用して、それぞれ納豆を製造し、ポリアミンの生産性が高く、粘質物の生成有無、香り、胞子形成の容易性などの基準によって納豆製造に最も適したＪＲ−０１８菌株を最終選抜した。
５．ＪＲ−０１８菌株の突然変異誘発
ＪＲ−０１８菌株をニトロソグアニジン（ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ、ＮＴＧ、１００μｇ／ｍｌ）で死滅率９９．９％になるように処理して、突然変異を誘発した後、５ｍＭジシクロヘキシルアミン（ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌａｍｉｎｅ）を含有したスピジーゼン（Ｓｐｉｚｉｚｅｎ）最小培地に１枚当たり１０５匹を塗抹し、３７℃で５日間培養して、生き残った菌を５％大豆培地で培養して、ポリアミン量を測定した。最大に上昇した菌株をバチルス・サブチリスＥＥ５（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＥＥ５）と名付け、韓国生命工学研究院生物資源センター（ＫＣＴＣ）に２０１６年５月３日付で寄託し（寄託番号：ＫＣＴＣ１３０１９ＢＰ）、納豆を製造して、ポリアミンの生産量、製造した納豆の官能性を評価した。
ＪＲ−０１８菌株をニトロソグアニジン（ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ、ＮＴＧ、１００μｇ／ｍｌ）で死滅率９９．９％になるように処理して、突然変異を誘発した後、５ｍＭジシクロヘキシルアミン（ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌａｍｉｎｅ）を含有したスピジーゼン（Ｓｐｉｚｉｚｅｎ）最小培地に１枚当たり１０５匹を塗抹し、３７℃で５日間培養して、生き残った菌を５％大豆培地で培養して、ポリアミン量を測定した。最大に上昇した菌株をバチルス・サブチリスＥＥ５（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＥＥ５）と名付け、韓国生命工学研究院生物資源センター（ＫＣＴＣ）に２０１６年５月３日付で寄託し（寄託番号：ＫＣＴＣ１３０１９ＢＰ）、納豆を製造して、ポリアミンの生産量、製造した納豆の官能性を評価した。
一般菌株、ＪＲ−０１８菌株及びバチルス・サブチリスＥＥ５を使用して発酵させた納豆のポリアミン含量を下記表５に示した。
表５に示されたように、バチルス・サブチリスＥＥ５を使用して発酵させた納豆は、一般菌株を使用した場合に比べては、約５．８倍、ＪＲ−０１８菌株を使用した場合に比べては、約１．９倍の高いポリアミン含量を示した。
また、煮た大豆１ｇ当たり１０３個の納豆菌胞子を接種して、３７℃で２０時間発酵させた後、１２時間４℃で冷蔵し、納豆に含有されたポリアミンを抽出して、ＴＬＣで分析した結果を図１に示した。図１に示されたように、バチルス・サブチリスＥＥ５菌株によって発酵した納豆は、一般納豆と比較してポリアミンの量が顕著に増加した。
６．分離された菌株の形態学的及び生化学的特性の究明
（１）分離された菌株の形態学的特性
前記分離されたポリアミン高生産菌株は、ＬＢ寒天平板培地で乳白色の菌集落を形成し、菌集落は、縁部が不規則であり、中央に乳白色の大きな点が形成された外形を示した。菌の成長に及ぼす温度の影響と関連しては、２５℃以上４０℃以下の範囲で成長が良好であり、５０℃以上では、菌体成長が確認されていない。ＬＢ液体培地を利用した菌体成長の対数期で顕微鏡観察した結果、グラム陽性の短い棒状の外形として比較菌株であるバチルス・サブチリスと類似し、菌株は、グラム陽性であり、細胞のサイズは、ほぼ０．６〜０．７×１．５〜１．７μｍであった（図３）。
（１）分離された菌株の形態学的特性
前記分離されたポリアミン高生産菌株は、ＬＢ寒天平板培地で乳白色の菌集落を形成し、菌集落は、縁部が不規則であり、中央に乳白色の大きな点が形成された外形を示した。菌の成長に及ぼす温度の影響と関連しては、２５℃以上４０℃以下の範囲で成長が良好であり、５０℃以上では、菌体成長が確認されていない。ＬＢ液体培地を利用した菌体成長の対数期で顕微鏡観察した結果、グラム陽性の短い棒状の外形として比較菌株であるバチルス・サブチリスと類似し、菌株は、グラム陽性であり、細胞のサイズは、ほぼ０．６〜０．７×１．５〜１．７μｍであった（図３）。
（２）分離された菌株の生化学的特性
バージェイズマニュアルによるバチルス属菌株の分類学的特性の分析方法（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、２００２）とＡＰＩ５０ＣＨＢキット（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社、Ｆｒａｎｃｅ）とを使用して、本発明による菌株の生化学的特性などを調査した。本発明の菌株は、グラム陽性の円筒状であって、胞子は細胞中央に形成され、硝酸塩の還元力があり、インドールを生成しなかった。また、カゼインと澱粉とを分解し、カタラーゼを生産し、好気的条件のみで成長を行うと確認された。本発明による菌株の詳細な形態学的特性及び生化学的特性（ＡＰＩ ｔｅｓｔ結果）を下記表６に示し、生化学的特性（ＡＰＩ ｔｅｓｔ結果）を下記表７に示した。
バージェイズマニュアルによるバチルス属菌株の分類学的特性の分析方法（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、２００２）とＡＰＩ５０ＣＨＢキット（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社、Ｆｒａｎｃｅ）とを使用して、本発明による菌株の生化学的特性などを調査した。本発明の菌株は、グラム陽性の円筒状であって、胞子は細胞中央に形成され、硝酸塩の還元力があり、インドールを生成しなかった。また、カゼインと澱粉とを分解し、カタラーゼを生産し、好気的条件のみで成長を行うと確認された。本発明による菌株の詳細な形態学的特性及び生化学的特性（ＡＰＩ ｔｅｓｔ結果）を下記表６に示し、生化学的特性（ＡＰＩ ｔｅｓｔ結果）を下記表７に示した。
また、バチルス・サブチリスＥＥ５菌株の１６ｓ ｒＲＮＡ配列分析の結果、下記の配列番号１で分析された。
配列番号１：
前記結果を総合して、バチルス・サブチリスＥＥ５菌株の分類学上の位置を図４に示した。
前記のような結果を通じて、本発明による新菌株であるバチルス・サブチリスＥＥ５を納豆の発酵に利用する場合、ポリアミンであるスペルミジンの生合成能が顕著に高く、ポリアミン高含有納豆を生産することができるということを確認することができた。
また、前記バチルス・サブチリスＥＥ５菌株は、ポリアミン高含有機能性食品が必要な分野で既存の納豆製造工程にそのまま適用されて、嗜好性の高いポリアミン高含有機能性納豆を経済的かつ効率的に提供することができるという手段として有用に使われると予測された。
本発明のバチルス・サブチリスＥＥ５菌株は、ポリアミン高含有機能性食品が必要な分野に有用に使われる。
寄託機関名：韓国生命工学研究院韓国微生物資源センター（ＫＣＴＣ）
受託番号：ＫＣＴＣ１３０１９ＢＰ
受託日：２０１６０５０３
受託番号：ＫＣＴＣ１３０１９ＢＰ
受託日：２０１６０５０３
（受託証）
Claims (10)
- ポリアミンを高生産する能力を有するバチルス・サブチリスＥＥ５菌株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＥＥ５、受託番号ＫＣＴＣ１３０１９ＢＰ）。
- 前記菌株が、配列番号１の１６ｓ ＲＮＡを有することを特徴とする請求項１に記載の菌株。
- 前記菌株が、ポリアミンを生産することを特徴とする請求項１に記載の菌株。
- 前記菌株が、スペルミジンを高生産することを特徴とする請求項１に記載の菌株。
- 請求項１〜請求項４のうちいずれか一項に記載の菌株を用いて発酵させた培養物。
- 前記培養物が、納豆であることを特徴とする請求項５に記載の培養物。
- 請求項５に記載の培養物を含む食品組成物。
- 請求項１〜請求項４のうちいずれか一項に記載の菌株を用いて発酵させる段階を含むポリアミンの製造方法。
- 前記発酵が、納豆の発酵であることを特徴とする請求項８に記載の製造方法。
- 前記ポリアミンが、スペルミジンであることを特徴とする請求項８に記載の製造方法。
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