KR20230170105A - 콜라겐을 분해할 수 있는 균주 및 이의 응용 - Google Patents
콜라겐을 분해할 수 있는 균주 및 이의 응용 Download PDFInfo
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Abstract
레인헤이메라속 신균(Rheinheimera indica) SM2107 및 이의 응용을 제공한다. 해당 균주의 기탁 번호는 CCTCC M 2021506이다. 상기 균주는 콜라겐 분해능을 가지며, 콜라게나제를 제조할 수 있고, 상기 균주가 생산한 콜라게나제는 콜라겐을 효소 분해할 수 있어, 콜라겐 올리고펜타이드를 생산한다.
Description
본 발명은 콜라겐을 분해할 수 있는 균주 및 이의 응용에 관한 것으로, 생명공학 기술분야에 속한다.
콜라겐은 동물 체내에서 함량이 가장 풍부한 단백질이며, 세포외 기질 내의 주요 구조 단백질이다. 콜라겐은 널리 분포되어 있고, 포유동물 결합 조직의 주성분이며, 수산 및 해양동물의 껍질, 뼈, 비늘 등 부위에도 풍부한 콜라겐이 함유되어 있는데, 주로 불용성 섬유상 단백질의 형태로 존재한다. 이러한 콜라겐은 식품 가공 과정에서 스크랩으로 처리되는 경우가 많아 생물 자원의 낭비를 초래할 뿐만 아니라 환경에도 부정적인 영향을 미치게 된다. 식품 가공 과정에서 발생하는 이러한 폐기물을 충분히 합리적으로 이용하면 축산 및 수산 가공 산업의 발전을 촉진할 수 있을 뿐만 아니라 환경 오염도 줄일 수 있다.
콜라겐 원료를 이용하여 콜라겐 올리고펩타이드를 생산하는 것은 식품 가공 과정에서 생성되는 콜라겐 스크랩을 고부가가치로 이용하는 중요한 경로이다. 콜라겐 올리고펩타이드는 항균, 혈압 강하, 항산화, 면역 조절 등과 같은 독특한 생물학적 활성을 갖고 있다. 또한, 육지 유래 동물을 원료로 하여 제조된 콜라겐 펩타이드와 비교하여 수산 및 해양동물의 콜라겐 펩타이드는 생물학적 안전성이 더 높고, 면역원성 및 기타 독특한 물리화학적 성질이 더 낮으며, 유기체에 대한 건강 기능이 우수하여 생물학적 제약, 미용 및 피부 관리, 위생 건강, 식품 보건 등 분야에서 거대한 응용 잠재력을 갖고 있다.
콜라겐은 분자량이 크고 삼중 나선형 초분자의 구조 및 각 층에 존재하는 가교 응집 작용으로 인해 분자 안정성이 매우 높으며 쉽게 분해되지 않는다. 현재 산업 생산에서 콜라겐을 효소법으로 추출하는 공정에 사용되는 프로테아제는 주로 미생물 프로테아제, 식물 프로테아제, 동물 프로테아제 이 세 가지로 분류되는데, 이러한 효소는 콜라겐 섬유의 말단 펩타이드를 가수분해하고 제거하여 유기산에 용해될 수 있지만 콜라겐의 삼중 나선 특성을 파괴하지는 못한다. 따라서 새로운 특이성을 지닌 효율적인 콜라게나제를 스크리닝하는 것이 특히 중요하다. 성숙한 미생물 발효 공정과 산물 추출 및 정제 공정을 통해 미생물 유래 콜라게나제가 특히 주목을 받고 있다.
현재 사람들은 바실러스 서브틸리스, 바실러스 세레젠스, 방선균, 슈도알데로모나스 등의 미생물에서 콜라게나제를 얻고 있으나 대부분의 균주는 효소 생성 활성이 낮거나 특수한 유도 조건을 필요로 하며, 효율적인 콜라게나제를 분비하여 콜라겐을 분해할 수 있는 균주는 아직 매우 부족한 실정이다.
본 발명은 종래 기술의 단점을 고려하여 콜라겐을 분해할 수 있는 균주 및 이의 응용을 제공한다. 상기 균주는 레인헤이메라속의 신종에 속하며, 분비할 수 있는 콜라게나제는 콜라겐 분해에 사용될 수 있어 축산, 수산 가공에서 콜라겐 스크랩의 부가가치를 향상시킨다.
본 발명의 기술적 해결수단은 다음과 같다.
레인헤이메라속 신균 Rheinheimera indica SM2107로서, 상기 균주는 2021년 5월 8일 중국 전형 배양물 기탁 센터에 기탁되되, 기탁 번호는 CCTCC M 2021506이고, 주소는 중국 우한 우한 대학이다.
상기 균주는 인도양 남서부의 다금속 황화물 영역 열액구(E 49.34627°, S 37.89947°)의 퇴적물 샘플로부터 분리하여 얻었다.
본 발명에 따르면, 바람직하게는, 상기 레인헤이메라속 신균 Rheinheimera indica SM2107의 16S rDNA 유전자 서열은 서열번호 1로 표시된다.
본 발명에 따르면, 바람직하게는, 상기 레인헤이메라속 신균 Rheinheimera indica SM2107의 성장 온도 범위는 4~40℃이고, 최적 성장 온도는 25~30℃이며; 성장을 위한 NaCl 농도 범위는 0~10.0%(w/v)이고, 성장을 위한 최적 NaCl 농도는 3.0~4.0%(w/v)이며; 성장을 위한 pH 범위는 6.5~10.5이고, 성장을 위한 최적 pH값은 7.5이다.
콜라게나제의 제조 및 콜라겐 분해에 있어서 본 발명에 따른 레인헤이메라속 신균 Rheinheimera indica SM2107의 응용.
상기 응용은,
(1) 콜라게나제 제조: 레인헤이메라속 신균 Rheinheimera indica SM2107을 발효 배지에 접종하여 발효 배양하되, 쉐이커 속도 150~200 rpm, 배양 온도 23~27℃에서 4~6일간 배양하여 발효액을 얻은 후; 발효액을 원심분리하여 콜라게나제 용액인 상층액을 얻는 단계; 및
(2) 콜라겐 분해: 콜라겐에 단계 (1)에서 얻은 콜라게나제 용액을 첨가하고, 45~55℃조건에서 2~3 h 동안 반응시켜 원심분리한 후 침전물을 제거하여 콜라게나제 분해액인 상층액을 얻는 단계를 포함한다.
본 발명에 따르면, 바람직하게는, 단계 (1)에서, 상기 발효 배지의 성분은 소뼈 콜라겐 3부, 효모 분말 2부, 천일염 30부, 물 1000부이고, pH = 7.0~7.4이며, 모두 중량부이다.
본 발명에 따르면, 바람직하게는, 단계 (1)에서, 상기 발효 배양 조건은 쉐이커 속도 180 rpm, 배양 온도 25℃ 배양 시간 5 d이고; 상기 원심분리 속도는 6000~8000 r/min이며, 원심분리 시간은 8~12 min이다.
본 발명에 따르면, 바람직하게는, 단계 (2)에서, 상기 원심분리 속도는 6000~8000 r/min이고, 원심분리 시간은 8~12 min이며; 상기 콜라겐은 소뼈 콜라겐이다.
본 발명에 따르면, 바람직하게는, 단계 (2)에서, 상기 콜라게나제 용액의 첨가량은 효소 대 물질 비율(E/S)이 1300~1700 U/g이다.
재조합 발현 벡터로서, 상기 재조합 발현 벡터는 서열번호 2로 표시되는 코딩 유전자를 포함한다.
본 발명에 따르면, 바람직하게는, 상기 재조합 발현 벡터는 플라스미드 pET-22b를 이용하여 구축된다.
본 발명에 따르면, 바람직하게는, 상기 재조합 발현 벡터를 숙주 세포로 형질전환시켜 재조합 세포를 생성한다.
본 발명에 따르면, 바람직하게는, 상기 숙주 세포는 대장균이다.
본 발명에 따르면, 바람직하게는, 상기 대장균은 대장균 BL21(DE3)이다.
재조합 세포로서, 상기 재조합 세포는 서열번호 2로 표시되는 코딩 유전자를 포함한다.
재조합 발현 균주로서, 재조합 세포를 배양하여 상기 균주를 얻는다.
본 발명에 따르면, 바람직하게는, 재조합 세포를 배양하는 조건은 다음과 같다.
LB 액체 배지를 사용하여 쉐이커에서 배양 온도 37℃로 5~7 h 동안 배양하고, 원심분리하여 재조합 발현 균주를 얻는다.
콜라게나제로서, 상기 콜라게나제는 상기 재조합 발현 균주에 의해 발현된다.
본 발명에 따르면, 콜라겐 분해에 있어서 상기 콜라게나제의 응용을 제공한다.
콜라겐 분해 방법으로서,
서열번호 2로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 사용하여 상기 뉴클레오티드 서열을 플라스미드에 클로닝하여 재조합 백터로 사용하고, 상기 재조합 백터를 숙주 세포로 형질전환시켜 재조합 세포를 구축하며; 발효 배지에서 재조합 세포를 배양하여 재조합 발현 균주를 얻는 단계; 및 재조합 발현 균주를 발현하여 콜라게나제를 얻고, 콜라게나제로 콜라겐을 분해하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따르면, 바람직하게는, 상기 플라스미드는 플라스미드 pET-22b이다.
본 발명에 따르면, 바람직하게는, 상기 숙주 세포는 대장균이고, 더 바람직하게는 대장균 BL21(DE3)이다.
본 발명에 따르면, 바람직하게는, 발효 배지에서 재조합 세포를 배양하는 조건은 다음과 같다.
LB 액체 배지를 사용하여 쉐이커에서 배양 온도 37℃로 5~7 h 동안 배양하고, 원심분리하여 재조합 발현 균주를 얻는다.
본 발명에 따르면, 바람직하게는, 콜라게나제는 콜라겐을 올리고펩타이드 분자량이 5000 Da 미만인 펩타이드 단편으로 분해한다.
본 발명에 따르면, 바람직하게는, 상기 콜라겐은 소뼈 또는 생선 껍질로부터 유래된다.
본 발명에 따르면, 바람직하게는, 콜라게나제로 콜라겐을 분해하는 단계는 다음과 같다.
콜라겐에 콜라게나제 용액을 첨가하고, 45~55℃ 조건에서 2~3 h 동안 반응시켜 원심분리한 후 침전물을 제거하여 콜라게나제 분해액인 상층액을 얻는다.
본 발명에 따르면, 바람직하게는, 원심분리 속도는 6000~8000 r/min이고, 원심분리 시간은 8~12 min이다.
본 발명에 따르면, 바람직하게는, 콜라게나제 용액의 첨가량은 효소 대 물질 비율(E/S)이 1300~1700 U/g이다.
본 발명에 의해 제공되는 레인헤이메라속 신균 Rheinheimera indica SM2107은 레인헤이메라속의 신종에 속하며, 콜라겐 분해능을 갖는다. 본 발명에 의해 제조된 콜라게나제는 콜라겐을 효소 분해하여 콜라겐 올리고펩타이드를 생산하는 데 응용될 수 있다. 특히 소뼈 등 콜라겐 원료에 대해 매우 강한 분해능을 가져 소뼈, 생선 껍질 등 육류 가공 및 어업 가공 부산물에 대한 추가 효소 분해 처리에 사용될 수 있다. 소뼈를 원료로 사용하여 제조된 콜라겐 올리고펩타이드의 분자량이 5000 Da 미만인 펩타이드 단편이 77% 이상에 달하여 분자량이 작고 균일성이 높으며, 인체에 쉽게 흡수 이용되므로, 콜라겐 부산물의 부가가치를 효과적으로 향상시키며, 우수한 경제적 효과를 갖는다.
도 1은 레인헤이메라속 신균 Rheinheimera indica SM2107의 투과 전자 현미경(TEM) 사진이다.
도 2는 레인헤이메라속 신균 Rheinheimera indica SM2107 및 기타 박테리아의 16S rDNA 서열에 따라 구축된 계통수 도면이다.
도 3은 레인헤이메라속 신균 Rheinheimera indica SM2107의 극성 지질에 대한 양방향 크로마토그램이다.
도면에서: 도 a는 포스포몰리브덴산 염색이고, 도 b는 닌히드린 염색이다.
도 4는 레인헤이메라속 신균 Rheinheimera indica SM2107에 의한 소뼈 콜라겐의 효소 분해 효과도이다.
도면에서: 1은 분해 전이고, 2는 분해 후이다.
도 5는 실시예 6의 상이한 효소 물질 비율을 갖는 소뼈 콜라겐 의 가수분해율 꺽은선 그래프이다.
도 6은 실시예 6의 소뼈 콜라겐 가수분해물의 분자량 분포도이다.
도 7은 실시예 7의 콜라게나제의 SDS-PAGE 그래프이다.
도 8은 실시예 7의 소뼈를 콜라게나제 효소 분해 후 산물의 분자량 분포도이다.
도 2는 레인헤이메라속 신균 Rheinheimera indica SM2107 및 기타 박테리아의 16S rDNA 서열에 따라 구축된 계통수 도면이다.
도 3은 레인헤이메라속 신균 Rheinheimera indica SM2107의 극성 지질에 대한 양방향 크로마토그램이다.
도면에서: 도 a는 포스포몰리브덴산 염색이고, 도 b는 닌히드린 염색이다.
도 4는 레인헤이메라속 신균 Rheinheimera indica SM2107에 의한 소뼈 콜라겐의 효소 분해 효과도이다.
도면에서: 1은 분해 전이고, 2는 분해 후이다.
도 5는 실시예 6의 상이한 효소 물질 비율을 갖는 소뼈 콜라겐 의 가수분해율 꺽은선 그래프이다.
도 6은 실시예 6의 소뼈 콜라겐 가수분해물의 분자량 분포도이다.
도 7은 실시예 7의 콜라게나제의 SDS-PAGE 그래프이다.
도 8은 실시예 7의 소뼈를 콜라게나제 효소 분해 후 산물의 분자량 분포도이다.
이하, 실시예를 결부하여 본 발명의 기술적 해결수단을 더욱 자세히 설명하나 본 발명의 보호 범위는 이에 한정되지 않는다.
레인헤이메라속 신균 Rheinheimera indica SM2107로서, 상기 균주는 2021년 5월 8일 중국 전형 배양물 기탁 센터에 기탁되되, 기탁 번호는 CCTCC M 2021506이고, 주소는 중국 우한 우한 대학이다.
실시예에서 배지를 조제하기 위한 원료는 모두 당업계에서 통상적으로 사용되는 원료이며; 소뼈 콜라겐은 시중에서 구입할 수 있다.
실시예 1 균주의 스크리닝 및 분리
(1) 샘플 채취
인도양 남서부의 다금속 황화물 영역 열액구(E 49.34627 °, S 37.89947 °)에서 퇴적물을 채취하여 아이박스에 담아 실험실로 가져왔다.
(2) 농축 및 가축화
퇴적물 샘플 500 μL를 취하여 유일한 탄소원 액체 배지 50 mL에 첨가하고, 쉐이커에서 25℃, 180 rpm의 조건으로 1주일 동안 배양하여 농축된 균액을 얻었다.
(3) 균주의 스크리닝 및 분리
단계 (2)에서 농축된 균액을 101, 102, 103, 104, 105의 배수로 구배 희석한 후, 각각 스크리닝 배지 플레이트에 접종하고, 25℃ 조건에서 48 h 동안 배양한 후, 추가로 플레이트 스크라이빙법을 사용하여 정제하여 젤라틴 배지에 접종하고; 이어서 분해원을 형성한 균주를 젤라틴 배지에서 추출하여 효율적인 콜라겐 분해능을 가진 균주를 얻어 이를 글리세롤 튜브법으로 보존하였다.
상기 배지 성분은,
유일한 탄소 및 질소원 액체 배지: NaCl 30부, NH4Cl 0.5부, MgCl2·6H2O 3부, K2SO4 2부, K2HPO4 0.2부, CaCl2 0.01부, FeCl3·6H2O 0.006부, Na2MoO4·7H2O 0.005부, CuCl2·2H2O 0.004부, Tris 6부, 키틴 10부이고, pH 7.8~8.0이며, 모두 중량부이다. 이 배지는 키틴을 유일한 탄소원으로 사용한다.
스크리닝 배지: 유일한 탄소 및 질소원 액체 배지에 리터당 한천 분말 15g을 첨가하되, pH 7.8~8.0이다.
젤라틴 배지: 펩톤 5부, 젤라틴 20부, 한천 분말 15부, 천일염 30부, 증류수 1000부이고, 모두 중량부이다.
실시예 2 균주의 형태학적 동정
실시예 1에서 스크리닝 및 분리된 균주를 TYS 고체 배지 플레이트에 스크라이빙하고, 온도 25℃의 조건에서 24 h 동안 배양하여 플레이트 상의 콜로니의 성장을 관찰 기록하고, 콜로니 형태의 투과 전자 현미경(TEM) 사진을 도 1에 나타내었다.
도 1에서 알 수 있듯이, 상기 균주는 TYS 고체 배지 플레이트에 있고, 콜로니는 투명(후기에 황변함)하며, 원형이고, 모서리가 깔끔한데 이는 매끄럽고 촉촉함을 나타내며; 그람 염색은 빨간색으로 나타나는데, 이는 그람음성균임을 나타내고; 투과 전자 현미경(TEM) 사진에서 세포는 막대 모양으로 길이와 폭이 1.2~2.4×0.5~1.1 μm이고, 단세포이며, 다량의 세포외 중합체를 분비할 수 있다.
TYS 고체 배지: 펩톤 5부, 효모 분말 1부, 천일염 30부, 물 1000부이고, pH 7.0~7.4이며, 모두 중량부이다.
실시예 3 균주의 생리학적 및 생화학적 동정
기존의 생리학적 및 생화학적 실험과 API 20NE, ZYM 시약 스트립을 통해 실시예 1에서 스크리닝 및 분리된 균주의 생리학적 및 생화학적 특징을 동정하였다.
동정 분석 결과는 표 1에 나타내었다.
표 1 실시예 1에서 분리된 균주 및 레인헤이메라속과 친화 관계가 유사한 균주의 생리학적 및 생화학적 특징 비교
표에서, 1은 실시예 1에서 분리된 균주이고; 2는 균종 Rheinheimera tuosuensis CGMCC 1.12461T이며; 3은 균종 Rheinheimera perlucida BA131T이고; 4는 균종 Rheinheimera longhuensis LH2-2T이며; 5는 균종 Rheinheimera baltica OSBAC1T이고; 6은 균종 Rheinheimera nanhaiensis E407-8T이다. +는 양성을 나타내고; w는 약한 양성을 나타내며; -, negative reaction; A, 호기성; FA, 통성 호기성; ND, 이용 가능한 데이터가 없음을 나타낸다.
표 1에서 알 수 있듯이, 실시예 1에서 스크리닝 및 분리된 균주의 성장 온도 범위는 4~40℃이고, 최적 성장 온도는 25~30℃이며; 성장을 위한 NaCl 농도 범위는 0~10%(w/v)이고, 성장을 위한 최적 NaCl 농도는 3.0~4.0%이며; 성장을 위한 pH 범위는 6.5~10.5이고, 성장을 위한 최적 pH값은 7.5이다. 실시예 1에서 스크리닝 및 분리된 균주는 질산염을 아질산염으로 환원시킬 수 있으며, 산화효소와 카탈리아제의 반응은 양성이다. 아울러 상기 균주는 카세인, 젤라틴, Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80, 전분 및 에스쿨린을 가수분해할 수 있다.
실시예 4 균주의 16S rDNA 서열의 증폭 및 동정
BioTeke박테리아 게놈 추출 키트를 사용하여 실시예 1에서 스크리닝 및 분리된 균주 내의 DNA를 추출하였으며, 구체적인 추출 방법은 상기 키트의 설명서를 참조한다.
PCR 프라이머는 범용 프라이머:
27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3',
1492R: 5'-GGTTACCTTGTTACGACTTC-3'을 사용하였다.
PCR 반응 조건은 다음과 같다. 온도 95℃에서 5 min 동안 프리 변성; 95℃에서 30 s 동안 변성; 55℃에서 30 s 동안 어닐링; 72℃에서 90 s 동안 연장; 30 사이클, 72℃에서 5 min 동안 연장하고, 4℃에서 보존한다.
PCR 산물은 베이징 칭커 바이오테크놀로지에서 시퀀싱하고, 시퀀싱 결과는 서열목록의 서열번호 1로 표시되며, 길이는 1523 bp이다.
증폭된 16S rDNA 서열을 EZBioCloud 데이터베이스에서 모든 표준 균주 16S rDNA 서열과 상동성 분석을 진행한 결과 상동성이 높은 서열이 레인헤이메라속에 속하는 것으로 나타났으며, 레인헤이메라속 내의 유사한 친화 관계를 갖는 균주를 선택하여 실시예 1에서 분리된 균주와 계통 발생 분석을 진행하였다. MEGA-X 소프트웨어를 사용하여 도 2와 같이 인접 결합 방법(Neighbor-joining)으로 계통수를 구축하였다.
16S rDNA 서열 비교 결과와 상기 균주의 생물학적 특성을 결합하여 상기 균주를 레인헤이메라속 신균으로 동정하고, 이를 Rheinheimera indica SM2107로 명명하였다.
실시예 5 균주의 지방산, 세포 퀴논 및 극성 지질 성분 분석
MIDI(Microbial Identification)사의Sherolock 자동 박테리아 동정 시스템을 사용하여 레인헤이메라속 신균 Rheinheimera indica SM2107에 대해 지방산 성분 분석을 진행하였으며, 구체적인 분석 방법은 상기 자동 박테리아 동정 시스템의 설명서를 참조하고, 분석 결과는 표 2에 나타내었다.
박층 양방향 크로마토그래피(TLC)로 실시예 1에서 스크리닝 및 분리된 레인헤이메라속 신균 Rheinheimera indica SM2107의 극성 지질 조성을 분석하였으며, 결과는 도 3에 나타내었다.
역상 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 옥타데실실란 크로마토그래피 컬럼(ODS 5mm, 150Х4.6mm)으로 레인헤이메라속 신균 Rheinheimera indica SM2107의 호흡 퀴논 성분을 분석하였다.
표 2 레인헤이메라속 신균 Rheinheimera indica SM2107과 친화 관계가 유사한 균주의 지방산 함량 비교
표에서, 1은 균종 Rheinheimera indicate SM2107T이고; 2는 균종 Rheinheimera tuosuensis CGMCC 1.12461T이며; 3은 균종 Rheinheimera perlucida BA131T이고; 4눈 균종 Rheinheimera longhuensis LH2-2T이며; 5는 균종 Rheinheimera baltica OSBAC1T이고; 6은 균종 Rheinheimera nanhaiensis E407-8T이다.
TR, Trace (<0.5%); -, not detected or reported. Major fatty acids (>10%) in each strain are shown in bold.
표 2에서 알 수 있듯이, 레인헤이메라속 신균 Rheinheimera indica SM2107의 주요 지방산은 C18:1ω7c and/or C18:1ω6c, C16:0, C17:1ω8c, and C16:1ω7c and/or C16:1ω6c이고; 주요 호흡 퀴논은 Q-8이며, 주요 극성 지질류는 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine, PE), 포스파티딜글리세롤(phosphatidylglycerol, PG)이다. 레인헤이메라속 신균 Rheinheimera indica SM2107 게놈 DNA의 G+C 함량은 48.76 mol %이다.
실시예 6
콜라겐 분해에 있어서 실시예 1에서 스크리닝 및 분리된 레인헤이메라속 신균 Rheinheimera indica SM2107의 응용으로서,
레인헤이메라속 신균 Rheinheimera indica SM2107을 발효 배지에 접종하여 발효 배양하되, 쉐이커 속도 180 rpm, 배양 온도 25℃, 배양 시간 5 d이고, 발효액을 7000 r/min으로 10 min 동안 원심분리하여 콜라게나제 용액인 상층액을 얻는 단계; 그 후 효소 대 물질 비율 1700 U/g에 따라 소뼈 콜라겐에 콜라게나제 용액을 첨가하고, 50℃에서 2 h 동안 반응시키는 단계; 및 양자의 반응이 완료된 후 7000 r/min으로 10 min 동안 원심분리 후 침전물을 제거하여 콜라게나제 분해액인 상층액을 얻는 단계를 포함한다.
상기 발효 배지 성분은 소뼈 콜라겐 3부, 효모 분말 2부, 천일염 30부, 물 1000부이고, pH 7.0~7.4이며, 모두 중량부이다.
본 실시예에서 소뼈 콜라겐의 효소 분해 효과는 도 4에 나타내고, 반응 후, 반응에서 남은 기질의 양을 칭량하여 소뼈 콜라겐 기질의 효소 분해율을 계산하고 결과를 도 5에 나타내었다.
도 4~5에서 알 수 있듯이, 레인헤이메라속 신균 Rheinheimera indica SM2107에 의해 생성된 콜라게나제는 소뼈 콜라겐을 효율적으로 효소 분해할 수 있으며, 최고 효소 분해율은 97.52%에 달한다.
본 실시예에서 소뼈 콜라겐을 분해하여 얻은 콜라게나제 분해액을 동결 건조시킨 후, 이동상 용액(아세토니트릴: 증류수: 트리플루오로아세트산 = 45: 55: 0.1)으로 5.0 mg/mL의 콜라게나제 분해액을 조제하고, 샘플이 충분히 용해된 후, 0.22 μm의 필터로 여과하며, 그 후 HPLC로 효소 분해액 중 콜라겐 펩타이드의 분자량 분포를 분석하여 결과를 도 6 및 표 3에 나타내었다.
표 3 소뼈 콜라게나제 분해액에서 분자량이 상이한 펩타이드 단편의 상대적 존재비
도 6 및 표 3에서 알 수 있듯이, 본 발명에 의해 제공되는 레인헤이메라속 신균 Rheinheimera indica SM2107에 의해 분비되는 콜라게나제를 사용하여 소뼈를 분해하여 얻어진 콜라게나제 분해액 중 분자량이 상이한 콜라겐 펩타이드 분자량이 5000 Da 미만인 콜라겐 펩타이드가 전체 펩타이드 단편의 77% 이상을 차지한다. 따라서, 레인헤이메라속 신균 Rheinheimera indica SM2107 및 이에 의해 분비되는 콜라게나제는 소뼈 콜라겐을 분해하여 분자량이 상이한 콜라겐 펩타이드를 제조하는 데 사용될 수 있다.
실시예 7
실시예 4에서 추출한 레인헤이메라속 신균 Rheinheimera indica SM2107 게놈 DNA를 시퀀싱하였다(상하이 링엔 바이오테크놀로지). 프로테아제 라이브러리 MEROPS에서 S8 패밀리의 프로테아제를 찾은 후, 시퀀싱 결과에 따라 S8 패밀리의 프로테아제를 비교 분석하고, 분석 결과 레인헤이메라속 신균 Rheinheimera indica SM2107 게놈에 하나의 콜라게나제 유전자가 있는 것으로 나타났으며, 상기 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 2로 표시되고, 길이는 1539bp이며, 아미노산 서열은 서열번호 3으로 표시되고, 512개 아미노산으로 구성되며, 이를 콜라게나제 48로 명명하였다.
실시예 4에서 추출한 레인헤이메라속 신균 Rheinheimera indica SM2107 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR 증폭을 진행하였으며, 프라이머는 다음과 같다.
pET-22b-F: AAGAAGGAGATATACATATGAAAACTACAAAAACCCTCTTA
pET-22b-R: TGGTGGTGGTGGTGCTCGAGGTACTGATAGCTGTATGTCA
PCR 반응 조건은 다음과 같다. 95℃ 온도에서 5 min 동안 프리 변성; 95℃에서 30 s 동안 변성; 55℃에서 30 s 동안 어닐링; 72℃에서 90 s 동안 연장; 30 사이클, 72℃에서 5 min 동안 연장하고, 4℃에서 보존한다.
PCR 산물을 Nde I와 Xho I로 이중 효소 절단하고, 효소 절단된 PCR 산물을 아가로스 겔 전기영동으로 회수한 후, 효소 절단된 PCR 산물을 마찬가지로 이중 효소 절단을 거친 pET-22b 백터 플라스미드와 연결하고, 연결 산물을 대장균 DH5α 균주로 형질전환시킨 후, 100 μg/mL 암피실린 나트륨을 함유하는 LB 배지 고체 플레이트에 도포하고, 37℃에서 14h 동안 배양하였으며, 단일 클론을 선택하고; 단일 클론을 100 μg/mL 암피실린 나트륨을 함유하는 액체 LB 배지에서 배양하여 플라스미드를 추출하고;
이어서 상기 재조합 플라스미드를 베이징 칭커 바이오테크놀로지에 보낸 결과, pET-22b의 Nde I와 Xho I 효소 절단 부위 사이에 서열번호 2로 표시되는 콜라게나제 유전자가 성공적으로 삽입되고 삽입 방향이 정확함을 보여주었다.
콜라게나제 유전자의 이종 발현:
(1) 구축된 재조합 플라스미드 백터를 "분자 클로닝 실험 지침" 상의 열충격 형질전환 방법에 따라 대장균 BL21(DE3)(난징 노위찬 바이오테크놀로지에서 구입) 컴피턴트 세포로 형질전환하고, 100 μg/mL 암피실린을 함유하는 담수 LB 고체 플레이트에 도포하여 37℃에서 밤새 배양하고;
(2) 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하여 100 μg/mL 암피실린을 함유하는 담수 LB 액체 배지에 접종하고, 37℃에서 밤새 배양하여 종자액을 얻었으며;
(3) 종자액을 1%(v/v) 접종량에 따라 100 μg/mL 암피실린을 함유하는 담수 LB 액체 배지에 옮기고, 쉐이커 속도 150~200 rpm, 배양 온도 37℃에서 5~7시간 동안 배양한 후, 배양 조건을 18℃, 120 rpm으로 조정하여 반시간 동안 계속 배양한 후 IPTG를 최종 농도 0.1 mM으로 첨가하고, 18℃, 120 rpm에서 12-16 h 동안 발현을 유도하여 발효액을 얻었다. 발효액을 원심분리하여 콜라게나제 용액인 상층액을 얻었다.
콜라게나제의 분리 정제:
(1) 조효소액의 제조: 균체를 Lysis buffer(50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 0.5% 글리세롤, pH =8.0)에 재현탁하고, 압력 파쇄기를 사용하여 세포를 파쇄하였으며, 4℃, 10000 rpm에서 60 min 동안 원심분리하여 조효소액인 상층액을 얻었으며;
(2) 니켈 친화성 크로마토그래피
니켈 친화성 컬럼을 Lysis buffer로 전처리한 후, 조효소액을 니켈 친화성 컬럼에 로딩하고, 그 후 Lysis buffer로 컬럼 부피를 평형화한 후, Wash buffer(50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 0.5% 글리세롤, 10 mM Imidazole, pH 8.0)로 하나의 컬럼 부피를 헹구고, 마지막으로 Elution buffer(50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 0.5% 글리세롤, 250 mM Imidazole, pH =8.0)로 표적 단백질을 용출하였으며;
(3) 겔 여과 크로마토그래피
분자체 buffer(10 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH = 8.0)로 Superdex 200 Increase column 겔 여과 크로마토그래피 컬럼을 평형화한 후, 니켈 친화성 크로마토그래피로 정제된 샘플을 농축하여 크로마토그래피 컬럼에 로딩하고, 분자체 buffer로 용출하였으며; 표적 단백질 피크의 피크 팁 샘플을 수집하고, 10% 글리세롤을 첨가한 후 -80℃에서 보관하여 준비해 두었으며;
(4) 단백질 순도 검출
폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 콜라게나제 48의 발현을 검출한 결과를 도 7에 나타내었으며, 콜라게나제 48은 전기영동 겔에서 단일 밴드를 가지며, 분자량 크기는 35-45 kDa 사이이고, 위치는 예측된 분자량과 일치하였다.
실시예 8
1 mL의 실시예 7의 이종 유도 발현된 콜라게나제 48을 취하여 10 mg의 소뼈에 첨가하여 효소 분해 반응을 진행하되, 효소 분해 반응 조건은 쉐이커 속도 180 rpm, 반응 온도 50℃, 반응 시간 2 h이다. 반응 산물을 7000 r/min에서 10 min 동안 원심분리하여 콜라게나제 분해액인 상층액을 얻었으며; 그 후 콜라게나제 분해액을 동결 건조한 후, 실시예 6의 방법에 따라 처리한 다음 HPLC로 콜라게나제 분해액 중 콜라겐 펩타이드의 분자량 분포를 분석하였다. 결과는 도 8 및 표 4에 나타내었다.
표 4 소뼈 콜라게나제 분해액 중 분자량이 상이한 펩타이드 단편의 상대적 존재비
도 8 및 표 4에서 알 수 있듯이, 본 발명에 의해 제공되는 콜라게나제 48을 사용하여 소뼈를 분해하여 얻어진 콜라게나제 분해액 중 분자량이 상이한 콜라겐 펩타이드 분자량이 5000 Da 미만인 콜라겐 펩타이드가 전체 펩타이드 단편의 76% 이상을 차지하고, 분자량이 1000 Da 미만인 콜라겐 펩타이드가 전체 펩타이드 단편의 40% 이상을 차지한다. 따라서, 콜라게나제 48는 소뼈 콜라겐을 분해하여 분자량이 상이한 콜라겐 펩타이드, 특히 분자량이 1000 Da 미만인 콜라겐 펩타이드를 제조하는 데 사용될 수 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> Shandong University
<120> A strain capable of degrading collagen and its application
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1523
<212> DNA
<213> Rheinhiemera indica SM2107T, a new strain of genus of Rheinheimera
<400> 1
agagtttgat catggctcag attgaacgct ggcggcaggc ctaacacatg caagtcgagc 60
ggtaacatgc cttcgggtga tgacgagcgg cggacgggtg agtaatgtat aggaagctgc 120
ccgatagagg gggataacca ctggaaacgg tggctaatac cgcataatgt ctacggacca 180
aagtatggga ccttcgggcc atatgctatc ggatgcgcct atatgggatt agctagttgg 240
tgtggtaatg gcgcaccaag gcgacgatcc ctagctggtt tgagaggatg atcagccaca 300
ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtggggaat attggacaat 360
gggcgcaagc ctgatccagc catgccgcgt gtgtgaagaa ggccttcggg ttgtaaagca 420
ctttcagcga ggaggaaggg gttgttgtta atagcaacaa tttttgacgt tactcgcaga 480
agaagcaccg gctaactccg tgccagcagc cgcggtaata cggagggtgc aagcgttaat 540
cggaattact gggcgtaaag cgcacgcagg cggcttttta agtcggatgt gaaagccccg 600
ggctcaacct gggaattgca ttcgatactg gggagctaga gtatgtgaga ggggggtaga 660
attccaagtg tagcggtgaa atgcgtagag atttggagga ataccagtgg cgaaggcggc 720
cccctggcac aatactgacg ctcaggtgcg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac 780
cctggtagtc cacgccgtaa acgatgtcta ctagatgttc gtggtcttgt accgtgagta 840
tcgcagctaa cgcattaagt agaccgcctg gggagtacgg tcgcaagatt aaaactcaaa 900
tgaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgac gcaacgcgaa 960
gaaccttacc tactcttgac atctacggaa gttagcagag atgctgatgt gccttcggga 1020
accgtaagac aggtgctgca tggctgtcgt cagctcgtgt tgtgaaatgt tgggttaagt 1080
cccgcaacga gcgcaaccct tatccttagt tgccagcacg taatggtggg aactctaggg 1140
agactgccgg tgataaaccg gaggaaggtg gggacgacgt caagtcatca tggcccttac 1200
gagtagggct acacacgtgc tacaatggta cgtacagagg gaggcaagct ggcgacagtg 1260
agcggatctc ataaagcgta tcgtagtccg gattggagtc tgcaactcga ctccatgaag 1320
tcggaatcgc tagtaatcgt gaatcagaat gtcacggtga atacgttccc gggccttgta 1380
cacaccgccc gtcacaccat gggagtgggt tgcaaaagaa gtagatagct taaccttcgg 1440
gagggcgttt accactttgt gattcatgac tggggtgaag tcgtaacaag gtaaccgtag 1500
gggaacctgc ggttggatca cct 1523
<210> 2
<211> 1539
<212> DNA
<213> Rheinhiemera indica SM2107T, a new strain of genus of Rheinheimera
<400> 2
atgaaaacta caaaaaccct cttagcactt ggcgtaagca gttgcttcgc attggcatca 60
gctactccgg caatggctga cagtctggtc gacgatagcg ataaaagcag ccgttatatt 120
atcaagttca agcctacggc agcagtaatg aacagcaaca atggccagag tgaattttca 180
actcagcagg cggaaaccgt attgcgaggc catcaggttg cagcattaat gcatttaaag 240
tcggccaatg ccagtgtggc taagttatct gctaagcaat taaaggcatt gcaggcaaac 300
ccgaatgtgc aatatgttga agaagatgcc aaacgttatc tgatggatgt tattacgccg 360
atggcgcaat ctacccctta tggcattaat atggtgcagg ccaatcaact aagtgatggt 420
agtgccggca atattaaagt ttgtgtcatt gataccggct atacctatgg ccatgaagat 480
ttgcaaagct ccggtgttac cggctatgcg tttccaggcc atggtaactg gtattctgac 540
ggtaatggcc acggtactca cgtagcgggc actatggtcg cgctggacaa taactccggc 600
gttgtcggcg ttattggttc aggtcaggcc ggtgtgcata tcgttaaaat atttaacgac 660
tcaggcaact ggacctatgc gtccaatctt attcagggca ttcagtcgtg tcaggacgct 720
ggcgccaaag tggtgaatat gagcctgggc ggcggttcgt cgaaccagac tgaaaataat 780
gcgatgaaca atttctataa taacggcatg ttactggttg ctgcagcagg taatgccggc 840
aataccagtt tgtcttatcc ggcgtcgtac aactcggtag tatcggtggc agcggtagat 900
tcaaaccgca acctggccag tttctcgcag cgtaactcgc aggtagaaat tgccggccct 960
atgggcgtaa atgtcagttc aacctggcgt aatggcggct ataacagtat tagtggtact 1020
tcggcgtcgc cgcatgtggc gggtgttgct gctttagtgt ggagtaatca cccatcctgt 1080
tcagcatcgc aaattcgtaa tgcgttgaat accacagccc aggacagagg cgctgcaggg 1140
cgtgataact cttacggttt tggtatcgtg caggccaaag cagcgagtga ctatatcact 1200
aacaacggct gtgatggcag cggtggtggt ggtacccctc cgggcggcgg tgcaaccttc 1260
ccgaacctgt cggcgtctac cggtcagtgg ttacgcggca gctatcagat cccggctggc 1320
gtgtcgcaaa tcaccttcca gatttcaggt ggcagcggtg atgctgactt gtatgtacgt 1380
tatggcagcc agccaagcac cagtgcctac acttgccggc catatttaac cggtaataac 1440
gaagtgtgca ccattaacaa cccgcaagcc ggtacctggc atgttggcat ccgcgcctac 1500
agcgcgttta gtggtgtgac atacagctat cagtactaa 1539
<210> 3
<211> 512
<212> PRT
<213> Rheinhiemera indica SM2107T, a new strain of genus of Rheinheimera
<400> 3
Met Lys Thr Thr Lys Thr Leu Leu Ala Leu Gly Val Ser Ser Cys Phe
1 5 10 15
Ala Leu Ala Ser Ala Thr Pro Ala Met Ala Asp Ser Leu Val Asp Asp
20 25 30
Ser Asp Lys Ser Ser Arg Tyr Ile Ile Lys Phe Lys Pro Thr Ala Ala
35 40 45
Val Met Asn Ser Asn Asn Gly Gln Ser Glu Phe Ser Thr Gln Gln Ala
50 55 60
Glu Thr Val Leu Arg Gly His Gln Val Ala Ala Leu Met His Leu Lys
65 70 75 80
Ser Ala Asn Ala Ser Val Ala Lys Leu Ser Ala Lys Gln Leu Lys Ala
85 90 95
Leu Gln Ala Asn Pro Asn Val Gln Tyr Val Glu Glu Asp Ala Lys Arg
100 105 110
Tyr Leu Met Asp Val Ile Thr Pro Met Ala Gln Ser Thr Pro Tyr Gly
115 120 125
Ile Asn Met Val Gln Ala Asn Gln Leu Ser Asp Gly Ser Ala Gly Asn
130 135 140
Ile Lys Val Cys Val Ile Asp Thr Gly Tyr Thr Tyr Gly His Glu Asp
145 150 155 160
Leu Gln Ser Ser Gly Val Thr Gly Tyr Ala Phe Pro Gly His Gly Asn
165 170 175
Trp Tyr Ser Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Met
180 185 190
Val Ala Leu Asp Asn Asn Ser Gly Val Val Gly Val Ile Gly Ser Gly
195 200 205
Gln Ala Gly Val His Ile Val Lys Ile Phe Asn Asp Ser Gly Asn Trp
210 215 220
Thr Tyr Ala Ser Asn Leu Ile Gln Gly Ile Gln Ser Cys Gln Asp Ala
225 230 235 240
Gly Ala Lys Val Val Asn Met Ser Leu Gly Gly Gly Ser Ser Asn Gln
245 250 255
Thr Glu Asn Asn Ala Met Asn Asn Phe Tyr Asn Asn Gly Met Leu Leu
260 265 270
Val Ala Ala Ala Gly Asn Ala Gly Asn Thr Ser Leu Ser Tyr Pro Ala
275 280 285
Ser Tyr Asn Ser Val Val Ser Val Ala Ala Val Asp Ser Asn Arg Asn
290 295 300
Leu Ala Ser Phe Ser Gln Arg Asn Ser Gln Val Glu Ile Ala Gly Pro
305 310 315 320
Gly Val Asn Val Ser Ser Thr Trp Arg Asn Gly Gly Tyr Asn Ser Ile
325 330 335
Ser Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly Val Ala Ala Leu
340 345 350
Val Trp Ser Asn His Pro Ser Cys Ser Ala Ser Gln Ile Arg Asn Ala
355 360 365
Leu Asn Thr Thr Ala Gln Asp Arg Gly Ala Ala Gly Arg Asp Asn Ser
370 375 380
Tyr Gly Phe Gly Ile Val Gln Ala Lys Ala Ala Ser Asp Tyr Ile Thr
385 390 395 400
Asn Asn Gly Cys Asp Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Pro Pro Gly Gly
405 410 415
Gly Ala Thr Phe Pro Asn Leu Ser Ala Ser Thr Gly Gln Trp Leu Arg
420 425 430
Gly Ser Tyr Gln Ile Pro Ala Gly Val Ser Gln Ile Thr Phe Gln Ile
435 440 445
Ser Gly Gly Ser Gly Asp Ala Asp Leu Tyr Val Arg Tyr Gly Ser Gln
450 455 460
Pro Ser Thr Ser Ala Tyr Thr Cys Arg Pro Tyr Leu Thr Gly Asn Asn
465 470 475 480
Glu Val Cys Thr Ile Asn Asn Pro Gln Ala Gly Thr Trp His Val Gly
485 490 495
Ile Arg Ala Tyr Ser Ala Phe Ser Gly Val Thr Tyr Ser Tyr Gln Tyr
500 505 510
Claims (25)
- 레인헤이메라속 신균 Rheinheimera indica SM2107로서,
상기 균주는 2021년 5월 8일 중국 전형 배양물 기탁 센터에 기탁되되, 기탁 번호는 CCTCC M 2021506이고, 주소는 중국 우한 우한 대학인 레인헤이메라속 신균 Rheinheimera indica SM2107. - 제1항에 있어서,
상기 레인헤이메라속 신균 Rheinheimera indica SM2107의 16S rDNA 유전자 서열은 서열번호 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 레인헤이메라속 신균 Rheinheimera indica SM2107. - 제1항에 있어서,
상기 레인헤이메라속 신균 Rheinheimera indica SM2107의 성장 온도 범위는 4~40℃이고, 성장을 위한 NaCl 농도 범위는 0~10.0%(w/v)이며, 성장을 위한 pH 범위는 6.5~10.5인 것을 특징으로 하는 레인헤이메라속 신균 Rheinheimera indica SM2107. - 콜라게나제의 제조 및 콜라겐 분해에 있어서 제1항에 따른 레인헤이메라속 신균 Rheinheimera indica SM2107의 응용.
- 제4항에 있어서,
(1) 콜라게나제 제조: 레인헤이메라속 신균 Rheinheimera indica SM2107을 발효 배지에 접종하여 발효 배양하되, 쉐이커 속도 150~200 rpm, 배양 온도 23~27℃에서 4~6일간 배양하여 발효액을 얻은 후; 발효액을 원심분리하여 콜라게나제 용액인 상층액을 얻는 단계; 및
(2) 콜라겐 분해: 콜라겐에 단계 (1)에서 얻은 콜라게나제 용액을 첨가하고, 45~55℃조건에서 2~3 h 동안 반응시켜 원심분리한 후 침전물을 제거하여 콜라게나제 분해액인 상층액을 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 응용. - 제5항에 있어서,
단계 (1)에서, 상기 발효 배양 조건은 쉐이커 속도 180 rpm, 배양 온도 25℃, 배양 시간 5 d이고; 상기 원심분리 속도는 6000~8000 r/min이며, 원심분리 시간은 8~12 min인 것을 특징으로 하는 응용. - 제5항에 있어서,
단계 (2)에서, 상기 콜라겐은 소뼈 콜라겐이고; 상기 콜라게나제 용액의 첨가량은 효소 대 물질 비율(E/S)이 1300~1700 U/g인 것을 특징으로 하는 응용. - 재조합 발현 벡터로서,
상기 재조합 발현 벡터는 서열번호 2로 표시되는 코딩 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터. - 제8항에 있어서,
상기 재조합 발현 벡터는 플라스미드 pET-22b를 이용하여 구축되는 것을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터. - 제9항에 있어서,
상기 재조합 발현 벡터를 숙주 세포로 형질전환시켜 재조합 세포를 생성하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터. - 제10항에 있어서,
상기 숙주 세포는 대장균이고; 바람직하게는, 상기 대장균은 대장균 BL21(DE3)인 것을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터. - 재조합 세포로서,
상기 재조합 세포는 서열번호 2로 표시되는 코딩 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 세포. - 재조합 발현 균주로서,
상기 균주는 서열번호 2로 표시되는 코딩 유전자를 포함하는 재조합 세포를 배양하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 재조합 발현 균주. - 제13항에 있어서,
재조합 세포를 배양하는 조건은,
LB 액체 배지를 사용하여 쉐이커에서 배양 온도 37℃로 5~7 h 동안 배양하고, 원심분리하여 재조합 발현 균주를 얻는 것을 특징으로 하는 재조합 발현 균주. - 콜라게나제로서,
상기 콜라게나제는 제13항에 따른 재조합 발현 균주를 발현시켜 얻어지는 것을 특징으로 하는 콜라게나제. - 콜라겐 분해에 있어서 제15항에 따른 콜라게나제의 응용.
- 콜라겐 분해 방법으로서,
서열번호 2로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 사용하여 상기 뉴클레오티드 서열을 플라스미드에 클로닝하여 재조합 백터로 사용하고, 상기 재조합 백터를 숙주 세포로 형질전환시켜 재조합 세포를 구축하여 얻는 단계; 발효 배지에서 재조합 세포를 배양하여 재조합 발현 균주를 얻는 단계; 및 재조합 발현 균주를 발현하여 콜라게나제를 얻고, 콜라게나제로 콜라겐을 분해하는 단계를 포함하는 콜라겐 분해 방법. - 제17항에 있어서,
상기 플라스미드는 플라스미드 pET-22b인 것을 특징으로 하는 콜라겐 분해 방법. - 제17항에 있어서,
상기 숙주 세포는 대장균이고, 더 바람직하게는 대장균 BL21(DE3)인 것을 특징으로 하는 콜라겐 분해 방법. - 제17항에 있어서,
발효 배지에서 재조합 세포를 배양하는 조건은,
LB 액체 배지를 사용하여 쉐이커에서 배양 온도 37℃로 5~7 h 동안 배양하고, 원심분리하여 재조합 발현 균주를 얻는 것을 특징으로 하는 콜라겐 분해 방법. - 제17항에 있어서,
콜라게나제는 콜라겐을 올리고펩타이드 분자량이 5000 Da 미만인 펩타이드 단편으로 분해하는 것을 특징으로 하는 콜라겐 분해 방법. - 제17항에 있어서,
상기 콜라겐은 소뼈 또는 생선 껍질로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 콜라겐 분해 방법. - 제17항에 있어서,
콜라게나제로 콜라겐을 분해하는 단계는,
콜라겐에 콜라게나제 용액을 첨가하고, 45~55℃ 조건에서 2~3 h 동안 반응시켜 원심분리한 후 침전물을 제거하여 콜라게나제 분해액인 상층액을 얻는 것을 특징으로 하는 콜라겐 분해 방법. - 제17항에 있어서,
원심분리 속도는 6000~8000 r/min이고, 원심분리 시간은 8~12 min인 것을 특징으로 하는 콜라겐 분해 방법. - 제17항에 있어서,
콜라게나제 용액의 첨가량은 효소 대 물질 비율(E/S)이 1300~1700 U/g인 것을 특징으로 하는 콜라겐 분해 방법.
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