CN111705048B - 新壳聚糖酶chi2、其编码基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了新壳聚糖酶CHI2、其编码基因及其应用，所述新壳聚糖酶具有如Seq ID No:1或具有与Seq ID No:1所示的氨基酸序列至少95％的序列同一性且具有基本相同酶活的氨基酸序列所示的氨基酸序列，属于壳聚糖酶GH8家族。所述新型壳聚糖酶来源于海鲜市场污泥宏基因组。上述新型壳聚糖酶的编码基因，该编码基因具有如Seq ID No:2所示的核苷酸序列。生产上述新型壳聚糖酶的方法包括以下步骤：在适合所述新型壳聚糖酶生产的条件下，对上述能表达新型壳聚糖酶的培养物进行发酵，并对发酵产物进行分离和纯化，得到壳聚糖酶。本发明提供的新型壳聚糖酶的活性高、稳定性高，可通过工程菌发酵进行该酶的大批量生产，以便于将该壳聚糖酶应用于工业化寡聚糖生产中。

Description

新壳聚糖酶CHI2、其编码基因及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种新壳聚糖酶CHI2、其编码基因及其应用。

背景技术

壳聚糖(chitosan)，又名甲壳胺、脱乙酰甲壳素等，化学名称为β-(1,4)-2- 氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖，它是一种由几丁质脱乙酰化得到的天然高分子化合物，由氨基葡萄糖或少量乙酰氨基葡萄糖残基通过β-(1,4)-糖苷键连接而成，相对分子质量从几十万至几百万不等，分子式为(C6H11NO4)n。甲壳素的主要来源是节肢动物的表皮和软体动物的壳，也存在于真菌、细菌、低等藻类的细胞壁中。几丁质还是除蛋白质外含氮量最高的有机再生资源，其储量的丰富程度仅次于纤维素。但是由于甲壳素分子量大、不溶于水而不能被有效开发利用，造成了巨大的资源浪费。

壳寡糖(oligochitosan)是壳聚糖经过物理、化学降解或酶法降解生成的聚合度为2-20的低聚糖，由乙酰氨基葡萄糖或者氨基葡萄糖通过β-1，4-糖苷键连接而成。与壳聚糖相比，壳寡糖分子量低，作为一种功能性低聚糖在医药、食品、化妆品和农业等领域有着非常广泛的应用。在医药方面，如：降低胆固醇、抗肿瘤、降血压、治疗烧、烫伤、止血、免疫调节、调节肠道菌群等；在食品应用方面，如：抑菌作用，直接作为保健食品、功能性食品添加剂、食品保鲜剂和防腐剂等；在化妆品应用方面，如：具有保湿性、消除人体氧负离子自由基、延缓衰老等功能；在农业方面，如：含氮高的氮肥、活化植物细胞、诱导植物内产生植物防御素、提高植物的抗病能力，还能抑制病源微生物的生长，增强植物的广谱抗病能力。

由于壳聚糖的许多独特功能只有被降解为壳寡糖才会显现出来。因此，选择高效降解壳聚糖的方法十分关键。目前，甲壳低聚糖和壳低聚糖的制备大致分为化学法、生物法和物理法。由于物理法、化学法在生产过程中会产生大量废水、废物，还会消耗大量水资源，不符合国家节能减排的政策针。从环保、节能、高效的角度出发，生物酶法降解壳聚糖制备壳寡糖具有物理法和化学法无法比拟的优点酶法降解条件温和，且水解过程和产物分布容易控制，无污染，已经成为人们研究的热点。

壳聚糖酶的来源广泛，在细菌、真菌、蓝细菌、病毒和植物中都有发现，并且研究者们相继从多种微生物中分离得到壳聚糖酶，如WangS，ChaoC等人于2009年筛选出的Bacillus cereus TKU006产几丁质酶活力仅为0.14U/mL，夏祥在《产壳聚糖酶/甲壳素酶菌株的选育、发酵及壳聚糖酶分离纯化与酶学性质研究》中利用透明圈法从污水处理厂废水中筛选出活力最高的菌株 Bacillus cereus HMX-21，其活力仅为0.56U/mL，WangS,TsengW等于2011年筛选出的产壳聚糖酶菌株Acinetobacter calcoaceticus TKU024，粗酶液最大活力为0.39U/mL。胡远亮等《产壳聚糖酶菌株的筛选与鉴定》公开了一种从土壤样品中筛选出的酶活力最高的一株Mitsraria，其酶活力仅为0.729μ/mL。

由于常规的菌株筛选不仅工作量极大，并且该方法会漏掉大量的基因信息，难以获得新颖度高的壳聚糖酶基因，而宏基因组方法，从新的角度更全面的进行基因筛选，有望获得新颖的、活力更高的壳聚糖酶，基于宏基因组的文库筛选可以避免常规方法的不足，有利于挖掘新基因和产生新的蛋白质。

发明内容

针对上述问题，本发明以海鲜市场污泥微生物为研究对象，提取总DNA 构建宏基因组文库，进行基于功能为导向的筛选获得了活性高且稳定性高的壳聚糖酶CHI2的基因；这种壳聚糖酶的稳定性高，可广泛应用于寡聚糖生产中。本发明还提供了可大量表达这种壳聚糖酶的工程菌和该酶的生产方法，可利用该类工程菌进行工业发酵，大批量的生产壳聚糖酶CHI2。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了新型壳聚糖酶，该酶具有如Seq ID No:1所示的氨基酸序列或具有与Seq ID No:1所示的氨基酸序列至少95％的序列同一性且具有基本相同酶活的氨基酸序列。上述酶不仅包括序列为Seq ID No:1的酶，还包括在这条酶序列上进行进一步的修饰，但是依然具有基本相同酶活的其他酶。所述酶修饰包括酶的用于提高酶稳定性的分子内交联、以及侧链基团修饰、或者序列两端添加纯化标签等。

由于上述新型壳聚糖酶基因在随着微生物基因组的复制过程中是容易发生突变，因而上述壳聚糖酶的突变体也在本申请请求保护的范围内。保留相同活性的壳聚糖酶突变体至少具有与Seq ID No:1所示的氨基酸序列95％以上的同源性，更优选的，突变体有92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％与各自对应的上述壳聚糖酶的天然序列相同。上述酶突变体可为点突变、缺失突变或添加突变，相对于最初的蛋白序列，有1个、2个、3个、4个、5 个、6个、7个、8个、9个、10个或更多氨基酸可发生变化。

本申请中序列如Seq ID No:1所示壳聚糖酶被命名为CHI2。这种酶是申请人从海鲜市场淤泥宏基因组文库中筛选得到，与现有序列进行比对，比对相似度仅为57％，这说明这种基因与现有基因的亲缘关系较远，新颖度很高。

将上述壳聚糖酶的编码基因CHI2(长度为954bp)克隆并进行生物信息学分析以及电泳检测得到：CHI2的分子量为35.88kDa，属于糖苷水解酶GH8 家族，具有较好亲水性和稳定性。Mn2+促使这种酶的活力得到显著提高。壳聚糖酶CHI2的最适胶体壳聚糖浓度为1％。壳聚糖酶CHI2的Km值为3.15 mg/mL，Vmax值为0.55μmol/min，比活力为3.34U/mg，为内切型壳聚糖酶。

优选地，所述新型壳聚糖酶的编码基因来源于海鲜市场淤泥宏基因组。

本发明还提供上述新型壳聚糖酶的编码基因，该编码基因具有如 SeqIDNo:2所示的核苷酸序列或具有与Seq ID No:2所示的核苷酸序列至少 95％的序列同一性的序列。所述具有的涵义为：所述编码基因可以是序列仅为如SeqIDNo:2所示的核苷酸序列，还可以是在SeqIDNo:2所示的核苷酸序列的基础上进行修饰加工得到的衍生序列，如在基因序列两端添加酶切位点、或增强子等。

上述新型壳聚糖酶的编码基因不仅包括具有如SeqIDNo:2所示的核苷酸序列，还包括与Seq ID No:2序列同源性至少达到95％的突变序列。更优选的，所述突变序列有92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％与各自对应的上述壳聚糖酶的天然序列相同。上述突变序列可为点突变、缺失突变或添加突变，相对于最初的核苷酸序列，有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7 个、8个、9个、10个或更多核苷酸可发生变化。

本发明还提供一种重组表达载体，该重组表达载体是通过将所述的新型壳聚糖酶编码基因连接到表达载体所形成。可用于转化宿主表达菌株，用于生产新型壳聚糖酶。

优选地，所述表达载体为pEASY系列载体、pET系列载体或pGEM系列载体。

一种工程菌，该工程菌是通过将上述的重组表达载体转化表达载体(宿主菌)得到，能高效表达上述的新型壳聚糖酶。

本发明还提供一种生产上述新型壳聚糖酶的方法，其包括以下步骤：在适合与所述新型壳聚糖酶生产的条件下，对上述能表达新型壳聚糖酶的培养物进行发酵，并对发酵产物进行分离和纯化，最终得到壳聚糖酶。

优选地，利用所述工程菌生产壳聚糖酶的方法包括以下步骤：

(1)工程菌的构建：利用特异引物扩增壳聚糖酶目的基因，并回收目的基因后将其连接到表达载体上，构建形成重组表达载体，将重组表达载体转化到宿主菌后，得到生产高活性壳聚糖酶的工程菌。

其中，扩增采用的模板是携带有所述壳聚糖酶的编码序列的重组载体。

优选地，用于扩增壳聚糖酶CHI2编码基因特异引物为：

CHI2-F:ATGGTCAAGCGTATCTTCCACGGTCTG；

CHI2-R:TTCAACCGCGCGCATGCCC。

(2)工程菌的发酵：将筛选出的工程菌培养成种子液，以1％接种量接种于含氨苄青霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中，37℃，250r/min振摇培养至 OD600＝0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG，20℃低温诱导，250r/min振摇培养16小时，进行菌体沉淀，或者进一步的扩大培养。

(3)壳聚糖酶的分离和纯化：将菌体沉淀进行破壁处理，迅速将细胞破壁液于4℃，12000r/min离心20分钟，收集上清液。采用过Ni-NTA柱的方法对上清液进行纯化，再进行透析后，得到高纯度的重组壳聚糖酶液。

其中，所述细胞破壁采用超声破壁，超声波仪参数设定为：功率400W，工作5秒，间隔5秒，工作60次。

透析袋采用截留分子量为20kDa。

优选地，上述方法中采用的表达载体为pEASY系列载体、pET系列载体或pGEM系列载体。具体实施例中，以pEASY系列载体为例。

作为表达菌株的宿主菌为大肠杆菌BL21或大肠杆菌Rosetta。由于这种大肠杆菌为模式菌株，高密度发酵条件成熟，产酶周期短，被广泛应用于微生物发酵工业领域，通过上述表达载体和宿主菌的配合，便于对目标壳聚糖酶进行高效表达，提高产量，达到工业生产的要求。

本发明还提供上述新型壳聚糖酶在寡聚糖制备、水产品下脚料处理的应用。由于本发明提供的壳聚糖酶的活性高，可利用上述工程菌进行新型壳聚糖酶的大批量生产后，便于将该壳聚糖酶应用于寡聚糖生产过程中，提高将壳聚糖的应用价值，化费为宝。

此外，所述壳聚糖酶还可用于制备真菌原生质体，便于将制备的真菌原生质体直接应用于菌种的遗传学杂交实验，特别对那些细胞壁成分是脱乙酰几丁质的接合菌更有效。所述壳聚糖酶还可以应用于抑制植物病原菌，由于大多数植物病原真菌的细胞壁主要成分是壳聚糖，可通过利用壳聚糖酶降解植物病原真菌的细胞壁，应用于致病菌危害的防治研究。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供的新型壳聚糖酶CHI2，酶活性高，比活力为3.34U/mg，普遍高于现有的壳聚糖酶活性；该酶具有较好的温度稳定性和pH稳定性，这种酶的最适pH约为5，但是其pH稳定性较高，pH的小幅度变化对其酶活影响较小，当pH下降至4.0时，其剩余活力为90％左右；即使当缓冲液pH升高至10，CHI2酶仍然未完全失活。所述新型壳聚糖酶的较高的pH稳定性在生产中具有应用优势。CHI2对几丁质、胶体几丁质、酪蛋白都具有一定的水解能力，具有多种底物水解能力，应用范围更广。

2、通过重组表达以及工程菌的构建，使目标酶基因在工程菌中进行大量表达，不仅产量高，并且酶活性高，满足工业化生产的需要。

附图说明

图1为海鲜市场淤泥宏基因组DNA纯化后的电泳图；

图2为基因CHI2的PCR扩增产物的电泳结果；

其中，M，Marker；2，CHI2基因PCR产物；

图3为CHI2与GH8家族壳聚糖酶多序列比对结果；

图4为壳聚糖酶CHI2疏水性预测结果；

图5为壳聚糖酶CHI2的三维结构模型；

图6为CHI2的诱导表达和纯化的SDS-PAGE电泳结果；其中，(A)M, Marker；1和2，CHI2未诱导结果；3和4，CHI2诱导表达结果；(B)M,Marker； 1，平衡缓冲液洗脱结果；2，CHI2纯化结果；

图7为CHI2的最适pH的测定结果；

图8为CHI2的最适温度的测定结果；

图9为不同金属离子处理对CHI2活力的影响；

图10为CHI2的底物特异性测试结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。在本发明中，若非特指，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例1海鲜市场淤泥宏基因组文库的构建

1.1海鲜市场淤泥宏基因组DNA的提取

(1)样品前处理和DNA提取

选取青岛城阳区海产品批发市场为取样地点，抽取下水道污泥样品，去除上层污水，将沉淀物4℃下运回实验室。称取污泥样品10g置于50mL离心管中，加入1g玻璃珠和30mL生理盐水中，以最大转速漩涡震荡10分钟。随后在500rpm转速下离心10分钟，取上清液。将沉淀用生理盐水分3次重悬后离心，合并所有上清液。将上清液置于12000转速下离心20分钟，收集沉淀。

所得的微生物菌体细胞沉淀用生理盐水溶液重悬清洗3次，离心取沉淀，将沉淀重悬于PBS(pH8.0)溶液中。

将上述沉淀加入200μL溶菌酶(50mg/mL)和20μL蛋白酶K(30mg/mL)， 37℃水浴1小时，加入1mL 200g/L SDS,65℃水浴1小时。

反应完成后使用等体积的苯酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)抽提一次，4℃, 12000rpm离心10分钟取上清。

将上清使用等体积的氯仿-异戊醇(24:1)抽提一次，4℃12000rpm离心 10分钟取上清。

将上清中加入0.6倍体积的异丙醇-20℃下沉淀DNA 1小时。4℃12000rpm 离心10分钟取沉淀。

使用70％乙醇清洗沉淀。

使用TE缓冲溶液溶解土壤总DNA。并对提取的宏基因组DNA进行电泳检测，结果见图1。

(2)DNA浓度和质量检测

提取DNA通过电泳检测纯化后的DNA质量，电泳检测结果见图2。对 DNA样品的检测主要包括2个方面：

①琼脂糖凝胶电泳分析DNA的纯度和完整性；

②Nanodrop检测DNA的纯度(OD260/280、OD230/280比值)和浓度。

实验结果：从图1的结果可知，所提的基因组略有降解，主要原因在于海鲜市场淤泥成分复杂，残余杂质不利于DNA的提取和保存。提取的DNA经纯化后，其电泳条带单一清晰、无弥散，测定OD260/OD280比值为1.87，这说明受RNA、蛋白质、酚等杂质的污染较少；OD260/OD230比值为1.72，小于2.0，表明样品具有一定小分子、盐类存在；用仪器测定核酸浓度为471.6ng/μL。提取DNA的质量满足宏基因组文库构建的需要。

1.2DNA酶切及回收

(1)按照以下酶切反应体系对提取的鱼肠道内容物DNA进行酶切处理。酶切反应体系为：鱼肠道内容物DNA 88μL；Sau3AI 2μL；10×Sau3AI Buffer10 μL。

酶切反应条件：37℃，2小时，75℃灭活5分钟。再用电泳检测酶切效果。

(2)酶切后DNA回收：使用胶回收试剂盒切胶回收1000-4000bp的片段。

1.3载体的酶切

同时对载体也进行相应的酶切处理，其中，酶切反应体系为：

pUC198 6μL；BamHI 2μL；10×BamHI Buffer 10μL。酶切反应条件：37℃， 2小时，75℃灭活5分钟。电泳检测。

1.4载体的CIAP处理

为了去除载体DNA片段的末端的磷酸基团，减少载体自连，进行CIAP 处理，具体操作如下：

(1)在微量离心管中配制下列反应液，定容至50μL，其中，

DNA Fragment 15pmol，

10×Alkaline Phosphatase Buffer 5μL；

CIAP(10-30units/μL)1-2μL；

加ddH₂O补足至50μL。

(2)先于37℃反应15分钟，再于50℃反应15分钟。最后于75℃进行 10分钟处理，以灭活酶。

1.5DNA与质粒载体的连接

将BamH I酶切去磷酸化的克隆载体和不完全酶切的基因组片段用T4 DNA Ligase进行连接处理，16℃过夜。

50μL的连接反应体系为：单酶切后的DNA 30μL；酶切后pUC19载体3 μL；10×T4DNA Ligase Buffer 5μL；T4DNALigase2.5μL；ddH₂O 9.5μL。

1.6转化大肠杆菌E.coil Blue2菌株

将上述连接产物转化大肠杆菌E.coil Blue2菌株，并涂布相应的平板，构建宏基因组文库。建库检测发现共得到库容为1891的宏基因组文库，随机挑去其中的15个进行菌落PCR扩增其中成功获得13个阳性克隆，平均插入片段长度为1460bp。

实施例2海鲜市场淤泥宏基因组文库壳聚糖酶的筛选

筛选方法：从文库的众多克隆中，挑选白色阳性菌落，并将且点接到含1％胶体壳聚糖的LB(Amp+IPTG+X-gal)培养基平板上，37℃培养1-2d，观察菌落周围是否有水解圈。当长出菌落后，将用1mg/mL的刚果红溶液静置染色10-15分钟后脱色，出现透明圈的菌落即为目标菌落，将目标菌落通过划线纯化，得到目标菌的单菌落。将上述具有水解圈的克隆子，提质粒，质粒测序由上海生工生物工程有限公司完成。

实验结果：经过大量筛选后，发现有多个不同的文库克隆子能产生透明圈，效果最好的1株，具有壳聚糖降解能力，将这个文库克隆子所编码基因命名为CHI2，基因CHI2的序列信息具体见序列表中的Seq ID No:2。

实施例3壳聚糖酶基因CHI2的生物信息学分析

按照下表1中的不同工具进行壳聚糖酶基因CHI2的各种生物学信息分析：

表1生物信息学分析工具

3.1多序列比对结果

将CHI2与8家族壳聚糖酶的多序列进行序列比对，比对结果具体见图3。对比结果显示，壳聚糖酶CHI2蛋白序列信息依次见序列表中的 SEQIDNo.1，这种酶都属于糖苷水解酶8家族，壳聚糖酶CHI2的一级结构比较发现，最为相近的序列为WP-014999595.1，是来自Tenacibaculum sp. KUL152的内切葡聚糖酶，相似度为97％，是一新的壳聚糖酶基因。

3.2蛋白理化性质分析结果

CHI2的理化性质见表2，其预测分子量为35.88kDa，预测等电点为 4.98。CHI2氨基酸组成中常见氨基酸都含有，含量最高的为亮氨酸L达， 11.0％，其次是丙氨酸A，含量为10.1％。含有42个酸性氨基酸(D+E)，29 个碱性氨基酸(R+K)，脂肪族氨基酸指数为91.45。原子组成为 C1619H2476O479N432S7氨基酸序列的不稳定系数为25.81，说明此蛋白是稳定的；亲水性指数为-0.204，表明其为亲水性蛋白。

表2壳聚糖酶CHI2的理化性质

3.3疏水性分析结果

蛋白质的疏水性在保持蛋白质三级结构的形成和稳定中起着重要作用。利用ProtScale分析壳聚糖酶序列，预测结果见图4，正负值表示疏水性和亲水性。整体来看，CHI2亲水性氨基酸分布比较均匀，且数量比例明显多于疏水氨基酸，表明该蛋白亲水性较好，可以进一步推测该酶属于可溶性蛋白，与理化性质分析结果一致。

3.4亚细胞结构预测结果

表3 CHI2壳聚糖酶亚细胞结构

亚细胞结构预测是通过对已知的序列N端前导链中的线粒体靶标肽段 (mTP)，叶绿体转运肽段(cTP)和具有分泌途径的信号肽(SP)进行预测分析，确认该蛋白序列是否具有信号肽分泌途径。根据表3的壳聚糖酶亚细胞结构分析，具有分泌途径的信号肽指数达到0.942和0.936，表明 CHI2壳聚糖酶有分泌途径的信号肽，与信号肽预测结果一致。

3.5蛋白质二级和三级结构预测结果

该壳聚糖酶CHI2主要由α螺旋和无规则卷曲组成。9个α螺旋结构的总残基数百分比为42.23％，8个β折叠的残基数百分比是9.46％；无规则卷曲的百分比是48.31％。分子对接结果见图5，结果表明：参与底物结合的氨基酸残基为：Glu35、Trp73、ALA92、Gly95、Trp203、Arg240、Leu224、Trp70、 Glu31、Ala86、Asp88。

实施例4壳聚糖酶基因CHI2克隆和表达载体构建

4.1引物设计

根据上述测序得到的壳聚糖酶序列，使用PrimerPremier5.0软件，设计引物CHI2-F、CHI2-R，以阳性克隆子的质粒为模板，利用上述引物和高保真pfu 酶，特异性扩增壳聚糖酶基因CHI2。扩增条件的摸索设置具体见下表5。扩增产物的电泳结果见图2。

CHI2-F:ATGGTCAAGCGTATCTTCCACGGTCTG；

CHI2-R:TTCAACCGCGCGCATGCCC。

表5 PCR反应程序

根据凝胶成像的扩增结果，选择最合适的退火温度进行PCR反应。

4.2壳聚糖酶基因表达载体的构建

(1)PCR产物纯化：参照凝胶DNA回收试剂盒说明书对PCR产物进行回收。

(2)PCR产物与载体连接

将以下试剂加入0.2mL的EP小管中，PCR仪控温37℃反应10分钟。

表6连接反应体系

(3)阳性克隆的筛选

将5μL连接产物加入50μL大肠杆菌感受态TransT1中，冰浴30分钟， 42℃热激30秒，立即置于冰上2分钟。加入250μL平衡至室温的LB液体培养基，200r/分钟，37℃孵育1h。取40μL均匀涂于含氨苄青霉素的固体培养基(终浓度为30μg/mL)，37℃培养8-10小时。挑取白色纯菌落作为模板，引物为T7 Promoter Primer和T7 Terminator Primer，按照如下程序进行扩增 94℃预变性，94℃变性2分钟，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，进行35个循环；72℃延伸10分钟，4℃保存，扩增产物进行电泳分析，以进一步确定阳性克隆，阳性克隆送上海生工生物工程有限公司测序。

(4)转化表达载体筛选正确的克隆，参照质量提取试剂盒提取质粒并转化至大肠杆菌感受态E.coli BL21(DE3)中。

实施例5重组壳聚糖酶CHI2的诱导表达和纯化

5.1重组壳聚糖酶的诱导过程

5.1.1实验方法：

(1)挑取转化有正确表达载体的单菌落接种于10mL含氨苄青霉素(50 μg/mL)的LB液体培养基中，37℃，250r/min振摇培养过夜。

(2)次日将培养过夜的菌液按照1％接种量，接种于100mL含氨苄青霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中，37℃，250r/min振摇培养至OD600＝0.6 时，取出10mL样本作为未诱导样品，10000r/min离心1分钟收集菌体沉淀后立即进行细胞破碎和蛋白提取，防冷胁迫对基因表达的诱导。

(3)在剩余菌液中加入终浓度为1mM的IPTG，20℃低温诱导，250r/min 振摇培养16小时，此菌液作为诱导后样本，同(2)法收集菌体沉淀，20℃冻存备用。

(4)将诱导后沉淀用一定量的PBS(pH8.0)重悬，加入等体积的2×SDS上样缓冲液，加热煮沸10分钟，SDS-PAGE电泳分离，考马斯亮染色3h后脱色观察诱导结果。

(5)选取诱导表达成功的细菌克降，扩大培养收集菌体沉淀，于20℃保存，准备做下一步分析及纯化。

5.1.2实验结果

诱导表达产物的电泳检测结果：CHI2的SDS-PAGE分析见图6，其条带在30kDa与40kDa条带之间，约为35kDa，与预测大小相似。

5.2目标壳聚糖酶的提取、纯化和检测

5.2.1重组菌的破壁和胞内蛋白的提取

(1)将重组菌的培养液(100mL)，5000r/min，常温离心20分钟，收集菌体，在重组菌中加入4mL平衡缓冲液(pH8.0)，涡旋混匀。

(2)将上述菌体悬浮液盛放在10mL小烧杯中，在冰浴条件下，用超声波仪进行细胞破壁，超声波仪参数设定：功率400W，工作5s，间隔5s，工作 60次。

(3)迅速将细胞破壁液于4℃，12000r/min离心20分钟，取上清液验证酶活后于-20℃保存。

5.2.2重组蛋白质的纯化

采用过Ni-NTA柱的方法纯化重组壳聚糖酶，多次制备大量含目的蛋白质的细胞破壁液上清，上Ni-NTA柱，经洗涤、洗脱等方式，最终获得高纯度的目的蛋白质，具体操作如下：

(1)装柱：重悬介质，根据待纯化蛋白量，将适量介质加入层析柱，静置。

(2)平衡：用5-10倍柱体积平衡缓冲液平衡层析柱。对于结合能力强的 His标签重组蛋白，或为了提高特异性结合平衡缓冲液中可加入低浓度咪唑 (10-20mM)。

(3)上样：样品缓冲液与平衡缓冲液一致。样品经离心或使用0.45μm过滤器过滤，避免堵塞层析柱。

(4)洗涤：上样完毕后，用5-10倍柱体积平衡缓冲液洗涤层析柱，收集流出液。

(5)洗脱：用不同浓度的咪唑洗脱目的蛋白。用平衡缓冲液配制不同浓度的咪唑，进行梯度洗脱。

5.2.3透析处理

由于过柱后的蛋白质洗脱液中含有高浓度咪唑，通过透析去除咪唑，具体操作如下：

(1)将透析袋剪成适当长度(10-20cm)的小段。在大体积2％(W/V)碳酸氢钠和10mMEDTA(pH8.0)中将透析袋煮沸10分钟。

(2)用蒸馏水彻底清洗透析袋。放在1mM EDTA(pH8.0)中煮沸10分钟后用蒸馏水清洗干净。冷却后，存放于4℃，必须确保透析袋始终浸没在溶液内。从此时起取用透析袋必须戴手套。

(3)将待蛋白溶液转入到袋子中，用透析袋夹夹紧置于纯水或缓冲溶液中进行4℃透析。每1小时更换溶液一次。

5.2.4重组壳聚糖酶CHI2表达产物的SDS-PAGE检测

实验方法：对诱导前的表达产物、诱导后的表达产物、以及纯化后的表达产物一同进行常规的SDS-PAGE检测，分析各种情况下表达产物的产量和纯度。

实验结果：将上述纯化和透析处理后的壳聚糖酶CHI2的纯化产物进行电泳检测，结果也见图6。CHI2的纯化蛋白条带清晰、无拖尾等现象，说明这种酶的纯化效果良好，为下一步测定酶学性质提高了良好的基础。

实施例7重组壳聚糖酶CHI2酶学性质的研究

9.1最适pH值和pH稳定性

(1)实验方法：

①最适pH值的测定：取0.1mL前述分离纯化的酶液和0.9mL胶体壳聚糖混合均匀，测定反应体系在不同pH(3-11)值下对壳聚糖酶活的影响，按照实施例1中的方法测酶活力。将最高酶活定为100％，计算不同pH值条件下壳聚糖酶的相对酶活。

②pH值稳定的测定：将壳聚糖酶和不同pH的缓冲液混合放置1h后，测定残余壳聚糖活力，将最高酶活力作为100％，计算壳聚糖酶的相对酶活。

(2)实验结果：

如图7所示，重组壳聚糖酶CHI2的最适pH约为5，但是其pH稳定性较高；当pH下降至4.0时，其剩余活力为90％左右；即使当缓冲液pH升高至 10，CHI2酶仍然未完全失活，其活力保持为最适pH条件下的19.73％；这说明重组壳聚糖酶CHI2的pH稳定性好。

而其他现有大部分壳聚糖酶在pH值变化很大的情况下，基本失活，如Zhou 等(于2015年《Extra cellular Over expression of Chitosanase from Bacillus sp.TS inEscherichia coli》中公开)通过大肠杆菌感受态表达的Bacillus sp.TS壳聚糖酶，其最适pH也为5.0，但是当pH下降至4.0，和上升至7.5，其活力显著降低，几乎丧失活力。本研究CHI2在pH值5.0条件下1h后剩余酶活力为 61.59％和43.55％，在pH值6.0条件下1h后剩余酶活力为63.25％和44.21％，说明其pH稳定性较好。

9.2最适反应温度和温度稳定性

(1)实验方法：

①最适反应温度的测定：取0.1mL酶液和0.9mL胶体壳聚糖混合均匀，于30-80℃不同温度下测定酶活，以最适温度的壳聚糖酶活作为100％，计算不同温度条件下壳聚糖酶的相对酶活。

②温度稳定性测定：将酶液于最适温度下放置1小时，测定剩余酶活力，将原来酶活力作为100％，计算壳聚糖酶的相对酶活。

(2)实验结果：

如图8的测定结果可知，重组壳聚糖酶CHI2最适温度均为60℃，不同温度对壳聚糖酶的影响较大，当温度升高至80℃，所得CHI2壳聚糖酶活力约为最适条件下的30.81％。

9.3金属离子和表面活性剂

(1)实验方法：将酶液与浓度为0.5M不同金属离子缓冲液(Mg²⁺、Zn²⁺、 Mn²⁺、K⁺、Na⁺、Li⁺、Ca²⁺、Cu²⁺、Fe³⁺)混合，空白为灭活的酶液，以不含金属离子的缓冲液作为对照组。表面活性剂选取SDS和EDTA，浓度为0.5M。计算不同处理下壳聚糖酶的相对酶活。

(2)实验结果：如图9所示，Mn²⁺能显著提高酶活力，提高了近2倍； EDTA和SDS都明显抑制酶活力，Li⁺和K⁺可轻微提高CHI2的酶活力。

9.4底物特异性

(1)实验方法：将0.9mL不同底物，和0.1mL壳聚糖酶液混合测定壳聚糖酶活力，不同底物包括胶体壳聚糖、胶体几丁质、粉末壳聚糖、粉末几丁质、羧甲基纤维素钠(CMC)、酪蛋白。将最高的酶活作为100％，计算不同底物下壳聚糖酶的相对酶活。

(2)实验结果：底物特异性测定结果见图10，CHI2对胶体几丁质、酪蛋白都有一定水解能力，当胶体壳聚糖为底物时，其最适底物浓度为1％。

9.5重组壳聚糖酶动力学常数

利用双倒数作图法测定动力学常数，以1/S(mg/ml)为横坐标，1/V(min/μmol) 为纵坐标做出Lineweaver-Burk双倒数图，根据双倒数图计算相应的动力学常数。

按照双倒数法计算壳聚糖酶CHI2的Km值为3.15mg/mL，Vmax值为0.55 μmol/分钟，比活力为3.34U/mg。TLC(薄层色谱分析)结果显示水解24h后，产物没有单糖存在，说明CHI2为内切型壳聚糖酶。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 新壳聚糖酶CHI2、其编码基因及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 318

<212> PRT

<213> 壳聚糖酶CHI 2(chitosanase 2)

<400> 1

Met Val Lys Arg Ile Phe His Gly Leu Val Val Ala Leu Val Val Leu

1 5 10 15

Leu Ala Ser Cys Ser Thr Gln Gln Asp Leu Thr Phe Val Lys Tyr Phe

20 25 30

Ala Ala Tyr Lys Ala Leu Phe Ile Asp Asp Gly Arg Val Leu Asp Thr

35 40 45

Gly Asn Gly Asn Val Ser His Ser Glu Gly Gln Gly Tyr Ala Met Leu

50 55 60

Phe Ala Val Gly Ala Asn Asp Lys Asp Thr Phe Asp Ala Leu Trp Gln

65 70 75 80

Trp Ser Gln Arg Val Leu Gln Arg Glu Asp Lys Leu Phe Ser Trp Arg

85 90 95

Tyr Arg Pro Cys Pro Thr His Asp Arg Ala Cys Ile Asp Asp Ile Asn

100 105 110

Asn Ala Ser Asp Gly Glu Ile Leu Ile Ala Trp Ala Leu Leu Arg Ala

115 120 125

Ala Asp Lys Trp Gly Asp Glu Asp Tyr Ala Ser Ala Ala Thr Ala Ile

130 135 140

Ile Asp Lys Val Glu Ser Thr Leu Ile Lys Asp Thr Glu Gln Leu Thr

145 150 155 160

Leu Leu Leu Pro Gly Glu Phe Gly Phe Glu Asp Asp Ser Ser Val Gln

165 170 175

Val Asn Leu Ser Tyr Trp Ile Phe Pro Ala Leu Lys Asp Ile Ala Gln

180 185 190

His Ala Asn Gln Pro Glu Lys Trp Asn Gln Leu Tyr Thr Ser Gly Leu

195 200 205

Ala Leu Leu Ala Lys Ser Gln Phe Ser Gln Tyr Gly Leu Pro Ser Asp

210 215 220

Trp Val Arg Val Glu Asn Arg Ile Gly Asn Arg Val Asp Asn Asn His

225 230 235 240

Arg Glu Glu Val Arg Leu Leu Leu Asp Lys Val Ile Ser Ala Glu Tyr

245 250 255

Gly Phe Asn Ala Val Arg Ile Pro Leu His Leu Ala Trp Ser Gly Ser

260 265 270

Ser Thr Ile Glu Gln His Ala Thr Leu Phe Glu Pro Phe Asn Ala Trp

275 280 285

Trp Glu Gln Pro Lys Thr Pro Ala Thr Val Asn Leu Leu Thr Gly Lys

290 295 300

Val Ala Asp Tyr Glu Met Thr Leu Gly Met Arg Ala Val Glu

305 310 315

<210> 2

<211> 954

<212> DNA

<213> 壳聚糖酶基因chi2(gene of chitosanase 2)

<400> 2

atggtcaagc gtatcttcca cggtctggtc gtagctctgg tagtcctgct ggcatcttgt 60

tccacgcaac aagacctgac gttcgtgaaa tacttcgcgg cgtacaaagc cctgtttatc 120

gacgacggcc gtgtgctgga cactggtaac ggtaacgtgt ctcactctga gggtcagggt 180

tacgcaatgc tgttcgcagt aggtgctaac gacaaagaca ccttcgacgc actgtggcag 240

tggtctcagc gtgttctgca gcgtgaagac aaactgttca gctggcgtta ccgcccttgc 300

ccaactcatg atcgtgcttg catcgatgac atcaacaacg cttccgacgg tgagatcctg 360

atcgcttggg ctctgctgcg tgcagctgac aaatggggcg atgaagatta cgcatctgcg 420

gcaactgcaa ttattgacaa agtggaatcc accctgatca aagataccga acagctgacc 480

ctgctgctgc cgggtgaatt tggcttcgaa gacgattcct ccgtgcaggt gaacctgagc 540

tactggatct tcccggctct gaaagatatc gcgcagcacg ctaaccagcc agagaaatgg 600

aaccagctgt acaccagcgg tctggcgctg ctggccaagt ctcagttctc tcagtatggt 660

ctgccgagcg attgggttcg tgttgagaac cgtatcggca atcgcgttga taacaaccac 720

cgcgaagaag tacgtctgct gctggataaa gttattagcg ccgaatatgg ctttaacgcg 780

gttcgcattc cgctgcacct ggcgtggtcc ggctctagca ctattgaaca acatgccacc 840

ctgtttgaac cgttcaatgc ctggtgggaa cagccgaaga ccccggcgac tgttaatctg 900

ctgaccggca aagttgcgga ttatgaaatg accctgggca tgcgcgcggt tgaa 954

Claims (9)

1.新壳聚糖酶CHI2，其特征在于，该酶的氨基酸序列为如Seq ID No:1所示的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的新壳聚糖酶CHI2的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列为如Seq ID No:2所示的核苷酸序列。

3.重组表达载体，其特征在于，是将权利要求2所述的编码基因或将权利要求1所述的氨基酸序列的编码基因连接到表达载体所形成。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述表达载体为pEASY系列载体、pET系列载体或pGEM系列载体。

5.工程菌，其特征在于，所述工程菌中转化有如权利要求3所述的重组表达载体，能表达权利要求1所述的新壳聚糖酶。

6.一种生产如权利要求1所述的新壳聚糖酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：在适合于所述新壳聚糖酶生产的条件下，对权利要求5所述的工程菌进行发酵，并对发酵产物进行分离和纯化，最终得到壳聚糖酶。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）工程菌的构建：利用特异引物扩增壳聚糖酶目的基因，并回收目的基因后将其连接到表达载体上，构建形成重组表达载体，将重组表达载体转化到宿主菌后，得到生产高活性壳聚糖酶的工程菌；

（2）工程菌的发酵：将工程菌种子液以1%接种量接种于含抗生素的LB液体培养基中，37℃，250 r/min振摇培养至OD600=0.6时，加入终浓度为1 mM的IPTG，20℃低温诱导，250 r/min振摇培养16小时，进行菌体沉淀，或者进一步的扩大培养，收集菌体沉淀；

（3）壳聚糖酶的分离和纯化：将菌体沉淀进行破壁处理，迅速将细胞破壁液于4℃，12000 r/min离心20分钟，收集上清液；采用过Ni-NTA柱的方法对上清液进行纯化，再进行透析后，得到高纯度的重组壳聚糖酶液。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述表达载体为pEASY系列载体、pET系列载体或pGEM系列载体；宿主菌为大肠杆菌BL21或大肠杆菌Rosetta。

9.如权利要求1所述的新壳聚糖酶在寡聚糖制备、水产品下脚料处理中的应用。

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