CN111876399B - 北极来源的β-葡萄糖苷酶基因、及其编码的蛋白和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种北极来源的β‑葡萄糖苷酶基因、及其编码的蛋白和应用，属于生物技术领域。所述β‑葡萄糖苷酶基因编码的蛋白能水解多种糖苷类底物，具有乙醇耐受特性，该β‑葡萄糖苷酶在木质纤维素同步糖化发酵制备生物乙醇领域具有广阔的应用前景。

Description

北极来源的β-葡萄糖苷酶基因、及其编码的蛋白和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种北极来源的β-葡萄糖苷酶基因、及其编码的蛋白和应用。

背景技术

β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)能水解寡糖中结合于末端的非还原性β-D-葡萄糖键，释放出糖基β-D-葡萄糖和相应的配基。β-葡萄糖苷酶是内源性酶，广泛分布于不同的生物体内。按照底物特异性可以将其分为三类：芳基-β-葡萄糖苷酶，主要活性是水解芳基β-葡萄糖苷；纤维二糖酶，只水解寡糖类底物；广泛底物特异性β-葡萄糖苷酶，水解多种底物。

β-葡萄糖苷酶是纤维素复合酶系的三个酶之一，催化木质纤维素水解的最后一步：纤维二糖水解为葡萄糖。产物葡萄糖的积累可能会抑制β-葡萄糖苷酶的活性，降低纤维素水解率。为了降低葡萄糖对酶活的影响，可以通过提高β-葡萄糖苷酶的葡萄糖耐受性或降低体系中葡萄糖的浓度来实现。木质纤维同步糖化发酵制备生物乙醇的方法，是合并了木质纤维素水解和乙醇生物转化两个过程。木质纤维素水解产生的葡萄糖直接转化为乙醇，降低了反应体系中的葡萄糖的浓度，从而降低产物抑制。因此，具有乙醇耐受性的β-葡萄糖苷酶有利于木质纤维素同步糖化发酵制备生物乙醇的过程。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于克服现有的β-葡萄糖苷酶乙醇耐受性差的问题，提供了一种乙醇耐受β-葡萄糖苷酶的编码基因、酶和应用，该β-葡萄糖苷酶在木质纤维同步糖化发酵制备生物乙醇中具有广阔的应用前景。

本发明是通过如下技术方案来实现的：

本发明提供了一种北极来源的β-葡萄糖苷酶的核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQID No:1所示。

一种上述核苷酸序列编码的β-葡萄糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。

一种重组表达载体，它包含了SEQ ID No:1所示核苷酸序列；重组表达载体为pET-bglu。

一种重组菌，它包含了SEQ ID No:1所示核苷酸序列，所述的菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。

利用上述β-葡萄糖苷酶的核苷酸序列制备重组β-葡萄糖苷酶的方法，步骤如下：

(1)将β-葡萄糖苷酶的基因序列SEQ ID No:1克隆到大肠杆菌表达载体pET-24a中，构建重组表达载体pET-bglu，将表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，用卡那霉素抗性筛选出含β-葡萄糖苷酶重组菌株；

(2)将步骤(1)筛选出的菌株接种于LB液体培养基中，37℃过夜培养，获得种子液；将种子液以体积比1％-2％的量接种于LB液体培养基中，待生长到OD₆₀₀为0.6-0.8时，加入终浓度0.1-1mmol/L的IPTG诱导，诱导温度为16-37℃，诱导时间为3-16小时；

(3)收集步骤(2)诱导后获得的菌体，超声破碎后，使用镍亲和层析柱对重组β-葡萄糖苷酶进行纯化，获得纯的重组β-葡萄糖苷酶。

本发明还提供上述重组β-葡萄糖苷酶在纤维二糖水解体系中的应用。

上述重组β-葡萄糖苷酶具有如下酶学性质:

(1)以化学底物pNPG作为底物时，重组β-葡萄糖苷酶的最适温度为55℃，在温度范围50-60℃时酶活力最高。在反应温度超过65℃时，酶的活力迅速下降。

(2)在以pNPG为底物时，重组β-葡萄糖苷酶的最适pH为7。

(3)重组β-葡萄糖苷酶在4-40℃温度范围，表现出高稳定性；温度50℃作用20分钟，重组β-葡萄糖苷酶的活力丧失。

(4)重组β-葡萄糖苷酶在pH范围6-10之间具有高稳定性。

(5)金属离子Li⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Fe³⁺以及表面活性剂吐温80、还原剂DTT对该重组β-葡萄糖苷酶有一定的激活作用；K⁺、Co²⁺、Mn²⁺、Ba²⁺对重组β-葡萄糖苷酶的酶活有弱抑制作用；Zn²⁺，Cu²⁺以及表面活性剂SDS对重组β-葡萄糖苷酶有强抑制作用；反应体系中金属螯合剂EDTA的加入对重组β-葡萄糖苷酶有一定的激活作用，说明重组β-葡萄糖苷酶不属于金属结合蛋白。

(6)重组β-葡萄糖苷酶具有耐盐特性；在1mol/L NaCl中酶活保持在90％以上。

(7)重组β-葡萄糖苷酶具有乙醇耐受性；在30℃和40℃对体系中乙醇的半数抑制浓度IC50分别为26.9％和20.3％。

(8)重组β-葡萄糖苷酶对底物pNPG的Km值为5.7mmol/L，最大反应速率为398.6U/mg，对底物纤维二糖的Km值为5.1mmol/L，最大反应速率为748U/mg。

(9)重组β-葡萄糖苷酶专一性水解β型糖苷键底物，对α型糖苷键无活性。对葡萄糖苷类底物水解活力最高，对半乳糖苷类底物有水解活力，对木糖苷类底物无活性。

(10)重组β-葡萄糖苷酶具有一定的葡萄糖耐受性。在400mmol/L葡萄糖存在时活性保持最高活力的51.4％。

本发明所述葡萄糖耐受β-葡萄糖苷酶在纤维二糖水解体系中的应用是指：

重组β-葡萄糖苷酶水解高浓度的纤维二糖(100g/L)，在40℃反应1小时，水解率超过50％；反应8小时，纤维二糖水解率接近100％。

本发明与现有技术相比的有益效果：

本发明提供一种β-葡萄糖苷酶的基因序列，利用所述基因表达的重组β-葡萄糖苷酶与已知的酶相比具有较强的乙醇耐受性，在木质纤维素同步糖化发酵制备生物乙醇的反应中具有广阔的应用前景。

附图说明

图1、纯化后的重组β-葡萄糖苷酶电泳图；泳道1，蛋白Marker；泳道2，纯化后的重组β-葡萄糖苷酶；

图2、不同温度下重组β-葡萄糖苷酶水解pNPG的相对活性；

图3、不同pH下重组β-葡萄糖苷酶水解pNPG的相对活性；标记：方块，最适pH；圆形，pH稳定性；

图4、重组β-葡萄糖苷酶的热稳定性；

图5、盐浓度对重组β-葡萄糖苷酶的影响；

图6、重组β-葡萄糖苷酶对乙醇的耐受性；

图7、重组β-葡萄糖苷酶对葡萄糖的耐受性；

图8、重组β-葡萄糖苷酶水解高浓度纤维二糖。

具体实施方式

下面通过实施例来对本发明的技术方案作进一步解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。

实施例1β-葡萄糖苷酶基因表达载体的构建

挑取R2A平板上生长的北极细菌Arc12单克隆接种到R2A液体培养基中，25℃培养3天。取新鲜菌液提取基因组DNA，提取的DNA通过引物1(5'-CGGGATCCATGTTCTCGATCGACC-3')和引物2(5'-CCCAAGCTTCCTTGTGTTGTGCAGC-3')进行PCR(划线部分为限制性酶切位点BamHI和Hind Ⅲ)，获得β-葡萄糖苷酶基因。

PCR体系(LA Taq酶购于TaKaRa)

PCR条件

1. 94℃，5min

2. 94℃，1min

60℃，30s

72℃，1min 30s

循环25次

3. 72℃，5min

将PCR产物连接到T载体，进行基因测序。分析测序结果其开放阅读框，发现β-葡萄糖苷酶基因具有1311个碱基，编码437个氨基酸。理论相对分子质量为49KDa，理论等电点为5.36。其氨基酸序列在NCBI数据库中比对，与其相似度最高的是Devosia psychrophila来源的β-葡萄糖苷酶基因，相似度为88.33％。根据NCBI氨基酸序列保守性分析，将该β-葡萄糖苷酶归属于糖基水解酶GH1家族。

将PCR产物和质粒pET-24a分别用BamH I和Hind Ⅲ进行酶切，通过T4连接酶进行连接，连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，涂布到含有50μg/mL的卡那霉素平板上，筛选出阳性克隆，挑取单菌落进行测序分析，获得含有β-葡萄糖苷酶基因的重组表达载体pET-bglu。

实施例2重组β-葡萄糖苷酶的制备方法

将实例1所述重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，获得β-葡萄糖苷酶的基因工程菌株。将菌株分别接种到含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃过夜培养。取1％培养液接种，培养至OD₆₀₀值0.6-0.8，加入IPTG至终浓度0.2mM，20℃诱导16小时。4℃，8000rpm离心10min收集菌体，菌体用50mM磷酸盐缓冲液(pH 7)重悬。超声破碎细胞，破碎液在4℃，12000rpm离心10min，收集上清液，获得粗酶液。用平衡缓冲液(50mM磷酸盐缓冲液,500mM NaCl,pH 7)冲洗亲和层析柱HisTrap HP，粗酶液经过0.22μm滤膜过滤后进入柱子，随后用平衡缓冲液冲洗5个柱体积，非特异性条带通过含有10mM咪唑的平衡液冲洗5个柱体积来去除。用含10-250mM咪唑的平衡液进行梯度洗脱，获得纯的重组β-葡萄糖苷酶。获得的酶溶液通过超滤离心置换到磷酸盐缓冲液中储存。BCA法测定蛋白浓度，SDS-PAGE检测蛋白纯度，其结果如图1所示。

实施例3重组β-葡萄糖苷酶的酶学性质

重组β-葡萄糖苷酶的最适反应温度是在温度范围4-80℃内测定的，对于化学底物4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)，其温度与酶活的关系如图2所示，重组β-葡萄糖苷酶的最适反应温度为55℃。测定了重组β-葡萄糖苷酶在pH范围3-12的Britton–Robinson缓冲液中的酶活。对于底物pNPG，其pH与酶活的关系图3所示，重组β-葡萄糖苷酶的最适pH分别为7。重组β-葡萄糖苷酶的热稳定性在温度范围4-55℃内作用2小时，每20分钟测定其残余酶活来实现的，重组β-葡萄糖苷酶的热稳定性实验结果如图4所示。重组β-葡萄糖苷酶在0-40℃时，表现出良好的稳定性。温度高于50℃作用超过20分钟，重组β-葡萄糖苷酶的活力全部丧失。重组β-葡萄糖苷酶pH稳定性实验是通过将酶置于pH范围3-12的Britton–Robinson缓冲液中作用1小时后，测定其残余酶活来实现的。实验结果如图3所示。重组β-葡萄糖苷酶在pH范围6-10的缓冲体系中，保持90％以上的酶活。

在酶活测定体系中加入终浓度为1mM的金属离子(K⁺、Li⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺、Cu²⁺、Co^{2 +}、Mn²⁺、Ba²⁺或Fe³⁺)，以及表面活性剂SDS或吐温80，金属螯合剂EDTA，还原剂DTT，测定其残余酶活，其实验结果如表1所示。金属离子Li⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Fe³⁺以及表面活性剂吐温80、金属螯合剂EDTA、还原剂DTT对重组β-葡萄糖苷酶的活性有一定的激活作用；K⁺、Co²⁺、Mn²⁺、Ba²⁺对重组β-葡萄糖苷酶的酶活有弱抑制作用；对重组β-葡萄糖苷酶有一定的抑制作用；Zn²⁺，Cu²⁺以及表面活性剂SDS对重组β-葡萄糖苷酶有强抑制作用。

表1化学试剂对重组β-葡萄糖苷酶活性的影响

重组β-葡萄糖苷酶对盐的耐受性是通过在测活体系中加入0-5mol/L的NaCl，测定其酶活来实现的，其结果如图5所示，重组β-葡萄糖苷酶具有较强的耐盐特性，在1mol/LNaCl中酶活保持在90％以上。

重组β-葡萄糖苷酶对乙醇的耐受性通过在测活体系中加入0-50％(v/v)的乙醇，在温度范围30-55℃内测定其酶活来实现的，其结果如图6所示。随着反应温度的降低，重组β-葡萄糖苷酶对乙醇的耐受性增加，在反应温度30℃，20％乙醇反应体系中，重组β-葡萄糖苷酶的活力保持在80％以上。在30℃和40℃对体系中乙醇的半数抑制浓度IC50分别为26.9％和20.3％。这一特性有益于木质纤维素同步糖化发酵制备生物乙醇的反应过程。

重组β-葡萄糖苷酶对不同底物的水解特性如表2所示。重组β-葡萄糖苷酶专一性水解β型糖苷键底物，对α型糖苷键无活性。对葡萄糖苷类底物水解活力最高，对半乳糖苷类底物有水解活力，对木糖苷类底物无活性。

表2重组β-葡萄糖苷酶的底物特异性

重组β-葡萄糖苷酶对化学底物pNPG和天然底物纤维二糖的动力学参数如表3所示。重组β-葡萄糖苷酶动力学测定缓冲液为50mM的磷酸盐缓冲液(pH7)，其中pNPG浓度范围为0-40mM，纤维二糖浓度范围为0-40mM，温度为55℃，通过Origin 8.0非线性回归计算K_m，V_max，k_cat和k_cat/K_m等动力学参数。重组β-葡萄糖苷酶对底物pNPG和纤维二糖的均有较高的反应活力。

表3重组β-葡萄糖苷酶的动力学参数

实施例5重组β-葡萄糖苷酶的葡萄糖耐受性

重组β-葡萄糖苷酶的葡萄糖耐受性是通过在测活体系中加入0-2000mmol/L的葡萄糖，测定其酶活来实现的，其结果如图7所示。重组β-葡萄糖苷酶的酶活随着葡萄糖浓度增加而下降，在400mM葡萄糖存在时，能保持51.4％的酶活。因此，重组β-葡萄糖苷酶对产物葡萄糖具有一定的耐受性。这一特性对重组β-葡萄糖苷酶在纤维素复合酶系中的应用具有重要的意义。

实施例6重组β-葡萄糖苷酶在纤维二糖水解体系中的应用

反应体系为终浓度为100g/L的纤维二糖，50mM磷酸盐缓冲液(pH 7)和50μg/mL的重组β-葡萄糖苷酶，在40℃，转速180rpm的恒温摇床中反应8小时，每小时取出反应液，测定其水解率。实验结果如图8所示，重组β-葡萄糖苷酶在反应的第一个小时，水解率超过了50％；反应进行8小时后，重组β-葡萄糖苷酶对纤维二糖的水解率接近100％。重组β-葡萄糖苷酶能水解高浓度的纤维二糖，在纤维素复合酶系中具有具有较高的应用前景。

序列表

<110> 中国水产科学研究院黄海水产研究所

<120> 北极来源的β-葡萄糖苷酶基因、及其编码的蛋白和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1314

<212> DNA

<213> β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)

<400> 1

atgttctcga tcgaccgcaa ggacttcggt ccccagttca cctttggcgt cgccactgct 60

gcctatcaga ttgaaggcgg gcagcgcgac gggcgcggtc cttccatatg ggatagcttt 120

tcgaacacgc ccggcaatgt gcataatggc gacaccggcg cggtggcctg caaccattat 180

gaactctggc cgcaggacct cgatctgatc cgtgacggcg gttttgacgc ttatcgtttt 240

tcgttttcct ggccccgcct gatcccggag ggtactggcg ccgtcaatca ggccggtctc 300

gatttttatg atcgccttgt cgatggcatg ctcgaacgcg gcatcaagcc ctatgccacg 360

ctctaccact gggatcttcc ttcggcattg caggacaagg gcggctggat gaaccgcgat 420

atcgccggct ggtttggcga ttatgccgcg ttgatcgccc agaaattcgg cgatcgcctc 480

gaggccaccg ccaccatcaa tgagccgtgg tgcgtcgcct tcctcagcca ttatctgggc 540

gcccacgccc ccggctatcg tgacaagcgg gccgcagccc gcgccatgca tcatgtgctc 600

tatgcccatg gcacggccat tgatgcgctg cgcgccaatg gtgcgaaaaa cctgggcatc 660

gtgctcaatc tcgaaaaggc cgaaccggct tccgacaagc cagaggatct ggctgctgcc 720

gatttcgggg acgcggtgtt caatcgctgg tatctcggtg gcgtgctcaa ggggcagtat 780

cccgaacgca tgaccgagtg gctggccgac tatctccccg ccaattatca ggacgacatg 840

gccgtggtgt cgcgcccgct cgactggctc ggcatcaact actacacccg tggcctctat 900

caggcgtcca acacccctgg cgtgcccgcc gagcaggtca aggggccgct cgaaaagacc 960

gatatcggct gggagatcta ccccaagggc ctcagcgatc tgctggtgcg cgtgtccaat 1020

gagtacacca agctgcccat ctacgttacc gagaacggca tggccgaggt cgagggcaat 1080

gacgatccgc gccgcgtgaa atactatgag gagcacctca aggcggtgct caatgcccgt 1140

gcccagggcg ccgatgtgcg cggctatttt gcctggtcgc tgctggataa ttatgaatgg 1200

gccgaaggct acaacaagcg cttcggcatc gttcatgtcg actaccagac gcaggagcgt 1260

acccccaagt ccagctaccg cgccttccag ggattgctgc acaacacaag gtga 1314

<210> 2

<211> 437

<212> PRT

<213> β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)

<400> 2

Met Phe Ser Ile Asp Arg Lys Asp Phe Gly Pro Gln Phe Thr Phe Gly

1 5 10 15

Val Ala Thr Ala Ala Tyr Gln Ile Glu Gly Gly Gln Arg Asp Gly Arg

20 25 30

Gly Pro Ser Ile Trp Asp Ser Phe Ser Asn Thr Pro Gly Asn Val His

35 40 45

Asn Gly Asp Thr Gly Ala Val Ala Cys Asn His Tyr Glu Leu Trp Pro

50 55 60

Gln Asp Leu Asp Leu Ile Arg Asp Gly Gly Phe Asp Ala Tyr Arg Phe

65 70 75 80

Ser Phe Ser Trp Pro Arg Leu Ile Pro Glu Gly Thr Gly Ala Val Asn

85 90 95

Gln Ala Gly Leu Asp Phe Tyr Asp Arg Leu Val Asp Gly Met Leu Glu

100 105 110

Arg Gly Ile Lys Pro Tyr Ala Thr Leu Tyr His Trp Asp Leu Pro Ser

115 120 125

Ala Leu Gln Asp Lys Gly Gly Trp Met Asn Arg Asp Ile Ala Gly Trp

130 135 140

Phe Gly Asp Tyr Ala Ala Leu Ile Ala Gln Lys Phe Gly Asp Arg Leu

145 150 155 160

Glu Ala Thr Ala Thr Ile Asn Glu Pro Trp Cys Val Ala Phe Leu Ser

165 170 175

His Tyr Leu Gly Ala His Ala Pro Gly Tyr Arg Asp Lys Arg Ala Ala

180 185 190

Ala Arg Ala Met His His Val Leu Tyr Ala His Gly Thr Ala Ile Asp

195 200 205

Ala Leu Arg Ala Asn Gly Ala Lys Asn Leu Gly Ile Val Leu Asn Leu

210 215 220

Glu Lys Ala Glu Pro Ala Ser Asp Lys Pro Glu Asp Leu Ala Ala Ala

225 230 235 240

Asp Phe Gly Asp Ala Val Phe Asn Arg Trp Tyr Leu Gly Gly Val Leu

245 250 255

Lys Gly Gln Tyr Pro Glu Arg Met Thr Glu Trp Leu Ala Asp Tyr Leu

260 265 270

Pro Ala Asn Tyr Gln Asp Asp Met Ala Val Val Ser Arg Pro Leu Asp

275 280 285

Trp Leu Gly Ile Asn Tyr Tyr Thr Arg Gly Leu Tyr Gln Ala Ser Asn

290 295 300

Thr Pro Gly Val Pro Ala Glu Gln Val Lys Gly Pro Leu Glu Lys Thr

305 310 315 320

Asp Ile Gly Trp Glu Ile Tyr Pro Lys Gly Leu Ser Asp Leu Leu Val

325 330 335

Arg Val Ser Asn Glu Tyr Thr Lys Leu Pro Ile Tyr Val Thr Glu Asn

340 345 350

Gly Met Ala Glu Val Glu Gly Asn Asp Asp Pro Arg Arg Val Lys Tyr

355 360 365

Tyr Glu Glu His Leu Lys Ala Val Leu Asn Ala Arg Ala Gln Gly Ala

370 375 380

Asp Val Arg Gly Tyr Phe Ala Trp Ser Leu Leu Asp Asn Tyr Glu Trp

385 390 395 400

Ala Glu Gly Tyr Asn Lys Arg Phe Gly Ile Val His Val Asp Tyr Gln

405 410 415

Thr Gln Glu Arg Thr Pro Lys Ser Ser Tyr Arg Ala Phe Gln Gly Leu

420 425 430

Leu His Asn Thr Arg

435

Claims (6)

1.一种北极来源的β-葡萄糖苷酶，其特征在于所述β-葡萄糖苷酶的核苷酸序列如SEQID No:1所示。

2.权利要求1所述核苷酸序列编码的β-葡萄糖苷酶，其特征在于所述β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。

3.一种重组表达载体，它包含了权利要求1所述的SEQ ID No:1核苷酸序列。

4.一种重组菌，它包含了权利要求3所述重组表达载体，菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。

5.利用权利要求1所述核苷酸序列制备重组β-葡萄糖苷酶的方法，步骤如下：

(1)将权利要求1所述核苷酸序列SEQ ID No:1克隆到大肠杆菌表达载体pET-24a中，构建重组表达载体pET-bglu；将表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，用卡那霉素抗性筛选出含β-葡萄糖苷酶基因的重组菌株；

(2)将步骤(1)筛选出的重组菌株接种于LB液体培养基中，37℃过夜培养，获得种子液；将种子液以体积比1％-2％的量接种于LB液体培养基中，待生长到OD₆₀₀为0.6-0.8时，加入终浓度0.1-1mmol/L的IPTG诱导，诱导温度为16-37℃，诱导时间为3-16小时；

(3)收集步骤(2)诱导后获得的菌体，超声破碎后，使用镍亲和层析柱对重组β-葡萄糖苷酶进行纯化，获得电泳纯的重组β-葡萄糖苷酶。

6.权利要求5所述方法制备的重组β-葡萄糖苷酶在纤维二糖水解体系中的应用。

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