CN109609530B

CN109609530B - 一种海藻糖合成酶及其在海藻糖生产中的应用

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Publication number: CN109609530B
Application number: CN201910078599.3A
Authority: CN
Inventors: 饶志明; 吴傲; 张显; 徐美娟; 杨套伟; 邵明龙
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2019-01-28
Filing date: 2019-01-28
Publication date: 2020-08-04
Anticipated expiration: 2039-01-28
Also published as: CN111378631B; CN111500566A; CN111378631A; CN109609530A; CN111500566B

Abstract

本发明公开了一种海藻糖合成酶及其在海藻糖生产中的应用，属于酶工程技术领域。本发明海藻糖合成酶的酶活较高，将携带本发明海藻糖合成酶的大肠杆菌诱导培养12h，即可使粗酶液中海藻糖合成酶的比酶活高达35.2U/mg，将携带本发明海藻糖合成酶的谷氨酸棒杆菌诱导培养12h，即可使粗酶液中海藻糖合成酶的比酶活高达33.5U/mg；本发明海藻糖合成酶突变体的比酶活与海藻糖转化率均较野生型海藻糖合成酶有了较为明显的提高，其中，海藻糖合成酶突变体K246A的比酶活较野生型酶提高了1.43倍，海藻糖转化率较野生型酶提高了约15％。

Description

一种海藻糖合成酶及其在海藻糖生产中的应用

技术领域

本发明涉及一种海藻糖合成酶及其在海藻糖生产中的应用，属于酶工程技术领域。

背景技术

海藻糖(Trehalose)是一种自然界中广泛存在的二糖，由两个葡萄糖通过α,α-1,1-糖苷键连接而成，最初被Wiggers从黑麦麦角菌中分离出来，广泛存在于细菌、真菌、酵母、低等蕨类植物、藻类、昆虫以及无脊椎动物中。

海藻糖在生物体内除作为结构成分以及提供能量以外，最重要的作用是作为一种典型的应激代谢物，在干燥、低温、高渗等许多环境条件下保护生物体细胞内的蛋白质、脂类、糖类、核酸等组分不受破坏，进而保护细胞免受伤害，因此，海藻糖已成为疫苗、酶、活体组织和细胞的生物活性保存的重要保护剂；同时，海藻糖对酸和热具有高度稳定性，可防止淀粉老化和蛋白质变性，可抑制脂肪酸败，具有矫味矫臭功能，具有高玻璃化转变温度、低吸湿性、低甜度，这些特性均使它在食品加工业、医药业、农业、生化制品业和化妆品产业得到广泛应用，成为上万种产品的添加剂。

可以说，海藻糖已成为世界上最重要的低聚糖资源之一。

海藻糖有多种生产方法，包括直接提取法、发酵法、基因重组法、化学合成法和酶转化法。其中，酶转化法由于具有转化率高、专一性强、作用温和、无污染等优点，被认为是最有发展潜力的工业生产方法。

目前，酶转化法使用的酶主要有三种，包括海藻糖磷酸化酶、麦芽寡糖基海藻糖合成酶以及海藻糖合成酶。其中，海藻糖磷酸化酶需消耗价格昂贵的高能磷酸化合物UDP-葡萄糖和6-磷酸葡萄糖，在生产成本上很难有竞争优势；麦芽寡糖基海藻糖合成酶和海藻糖合成酶可分别以淀粉的水解产物麦芽糊精和者麦芽糖为底物生产海藻糖，具有较强的竞争优势。

然而，使用麦芽寡糖基海藻糖合成酶生产海藻糖最终会积累大量的麦芽三糖等低聚糖，进而对海藻糖纯度造成影响；海藻糖合成酶则由于酶活和海藻糖转化率较低难以进行大规模工业生产。

因此，急需找到酶活和海藻糖转化率高的海藻糖合成酶以解决其难以进行大规模工业生产的问题。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提高海藻糖合成酶的酶活和海藻糖的产量。

[技术方案]

为解决上述问题，本发明提供了一种海藻糖合成酶，所述海藻糖合成酶的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述海藻糖合成酶来源于天蓝色链霉菌(Streptomyces_coelicolorm)。

本发明还提供了一种海藻糖合成酶突变体，所述突变体是通过将上述海藻糖合成酶的第246位赖氨酸和/或第165位丙氨酸和/或第178位苯丙氨酸进行突变得到的。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是通过将上述海藻糖合成酶的第246位赖氨酸突变为丙氨酸得到的，此突变体命名为K246A；

或所述突变体是通过将上述海藻糖合成酶的第165位丙氨酸突变为苏氨酸得到的，此突变体命名为A165T；

或所述突变体是通过将上述海藻糖合成酶的第178位苯丙氨酸突变为酪氨酸得到的，此突变体命名为F178Y。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体的氨基酸序列为SEQ ID No.2、SEQ IDNo.3或SEQ ID No.4。

本发明还提供了编码上述海藻糖合成酶或上述海藻糖合成酶突变体的基因。

本发明还提供了携带上述基因的重组质粒。

在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒载体为pET-28a质粒、pET-22b质粒、pET-Duet质粒或pXMJ19质粒。

本发明还提供了携带上述基因或上述重组质粒的宿主细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌。

本发明还提供了上述海藻糖合成酶的制备方法，所述方法为使用上述宿主细胞，先将上述宿主细胞接种至发酵培养基中进行发酵，然后将发酵液进行离心收集菌体，最后将菌体进行破碎获得海藻糖合成酶。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基可为LB培养基、TY培养基或TB培养基。

本发明还提供了上述海藻糖合成酶突变体的制备方法，所述方法为使用上述宿主细胞，先将上述宿主细胞接种至发酵培养基中进行发酵，然后将发酵液进行离心收集菌体，最后将菌体进行破碎获得海藻糖合成酶突变体。

本发明还提供了一种生产海藻糖的方法，所述方法为使用上述海藻糖合成酶或上述海藻糖合成酶突变体或上述宿主细胞，将上述海藻糖合成酶或上述海藻糖合成酶突变体或上述宿主细胞添加入含有麦芽糖的反应体系中进行反应。

在本发明的一种实施方式中，所述方法为使用上述宿主细胞，将上述宿主细胞在含有50μg/mL卡那霉素的LB平板上划线后于37℃培养10～12h，得到活化后的宿主细胞单菌落；将得到的宿主细胞单菌落接入LB液体培养基中，于37℃、180rpm的条件下培养10h，得到一级种子液；将得到的一级种子液以1％～2％的接种量转接到LB液体培养基中，于37℃、180rpm的条件下培养至OD₆₀₀为1.0～1.5，得到二级种子液；将得到的二级种子液转接入TY培养基中，于37℃、200rpm～400rpm的条件下培养至菌体浓度OD₆₀₀达到18～20，得到培养液；在得到的培养液中添加0.2mmol/L的IPTG，于28℃、转速600rpm下继续培养12～14h，得到发酵液；将得到的发酵液在6000r/min的条件下离心20min，去除上清，收集菌体；将得到的菌体用pH 7.0的缓冲液洗涤2～3次后用上述缓冲液配制的100～800g/L麦芽糖反应液进行悬浮，于35℃、200rpm的条件下进行全细胞转化反应24h，得到海藻糖。

本发明还提供了一种可用于生产海藻糖的制剂，所述制剂的成分包含上述海藻糖合成酶或上述海藻糖合成酶突变体或上述宿主细胞。

[有益效果]

(1)本发明海藻糖合成酶的酶活较高，将携带本发明海藻糖合成酶的大肠杆菌诱导培养12h，即可使粗酶液中海藻糖合成酶的比酶活高达35.2U/mg；将携带本发明海藻糖合成酶的谷氨酸棒杆菌诱导培养12h，即可使粗酶液中海藻糖合成酶的比酶活高达33.5U/mg；

(2)本发明海藻糖合成酶的最适反应温度为35℃，适应温度较高，因此，在工业生产中具有生产成本低以及对生产条件要求低的优势；

(3)本发明海藻糖合成酶突变体的比酶活与海藻糖转化率均较野生型海藻糖合成酶有了较为明显的提高，其中，海藻糖合成酶突变体K246A的比酶活较野生型酶提高了1.43倍，海藻糖转化率较野生型酶提高了约15％；海藻糖合成酶突变体A165T的比酶活较野生型酶提高了1.39倍，海藻糖转化率较野生型酶提高了约10％；海藻糖合成酶突变体F178Y的比酶活较野生型酶提高了1.18倍，海藻糖转化率较野生型酶提高了约5％；

(4)将携带本发明海藻糖合成酶突变体的重组大肠杆菌全细胞作为催化剂加入含有麦芽糖的反应体系中，可在24h内将反应体系中的浓度为800g/L的麦芽糖转化为浓度为560g/L的海藻糖。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明进行进一步的阐述。

下述实施例中涉及的大肠杆菌BL21(DE3)购自北纳生物；下述实施例中涉及的Corynebacterium glutamicum ATCC13032购自美国模式培养物集存库(American typeculture collection)，保藏编号为ATCC13032；下述实施例中涉及的Streptomyces_coelicolor(GDM 4.65)购自广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDM 4.65；下述实施例中涉及的pET28a质粒、pXMJ19质粒、pET-Duet质粒、pET-22b质粒购自普如汀生物技术(北京)有限公司；下述实施例中涉及的麦芽糖一水、葡萄糖、海藻糖二水均购自国药集团化学试剂有限公司；下述实施例中涉及的BHI液体培养基购自青岛海博生物(上述菌株大肠杆菌BL21(DE3)、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、Streptomyces_coelicolor(GDM4.65)均可以购买得到，不需要进行用于专利程序的保藏)。

下述实施例中涉及的培养基如下：

LB液体培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L。

LB固体培养基(LB平板)：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L、2％琼脂粉(v/v)。

高氏合成一号培养基：可溶性淀粉20g/L、KNO₃ 1g/L、K₂HPO₄ 0.5g/L、MgSO₄·7H₂O0.5g/L、NaCl 0.5g/L、FeSO₄ 0.01g/L，pH 7.2～7.4。

TY培养基：酵母粉8.0g/L、甘油10.0g/L、胰蛋白胨12.0g/L、K₃PO₄ 4.02g/L、NaCl3g/L、一水合柠檬酸2.1g/L、柠檬酸铁铵0.3g/L、(NH₄)₂SO₄ 2.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，pH 7.2。

BHI固体培养基：在BHI液体培养基中加入1.5％-2％的琼脂粉(v/v)。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

海藻糖合成酶比酶活的测定方法：

1、海藻糖合成酶酶活的测定

将粗酶液用0.2μm的滤膜过滤处理后通过Ni-NTA亲和层析，利用咪唑进行洗脱获得纯化后的酶；反应体系包含100g/L麦芽糖、50mmol/L pH 7.0的磷酸钠缓冲液、30μg纯化后的酶，35℃水浴反应1h，沸水浴10min终止反应；使用HPLC法检测酶活；

HPLC分析：采用HPLC示差法测定底物与产物浓度；其中，色谱条件：色谱柱：NH2柱(5μm，250mm×4.6mm)，流动相：乙腈-水(V/V＝75:25)，检测器：RID Detector，柱温：40℃，进样量：10μL，流速：1.0mL/min；

酶活定义为：每1min生成1μmol的海藻糖的酶量为1个酶活力单位；

2、海藻糖合成酶比酶活的测定

海藻糖合成酶比酶活＝海藻糖合成酶酶活(U)/酶浓度(μg/mL)。

海藻糖转化率的测定方法：

海藻糖转化率＝海藻糖浓度(g/L)/麦芽糖底物浓度(g/L)×100％。

实施例1：编码海藻糖合成酶的基因的提取以及含有编码海藻糖合成酶的基因的重组菌的构建

具体步骤如下：

(1)Streptomyces_coelicolor(GDM 4.65)基因组DNA的提取

使用上海捷瑞生物工程有限公司购买的细菌DNA基因组提取试剂盒进行Streptomyces_coelicolor(GDM 4.65)基因组DNA的提取；

挑取Streptomyces_coelicolor(GDM 4.65)单菌落接种至高氏合成一号液体培养基中，于30℃、180rpm的条件下振荡培养5天后，于8000rpm的条件下离心2分钟，收集菌体；用去离子水洗涤菌体后，再次离心并收集菌体并将收集的菌体悬浮于150μL TE buffer中，得到重悬液；在重悬液中先加入20μL溶菌酶，于37℃下保温30min，然后加入300μLDigestion Solution混匀，加入4μL RnaseA混匀，于55℃下保温10min，再加入4μL蛋白酶K，于55℃下保温30min，获得裂解液；如获得的裂解液粘稠度较低，则直接在裂解液中添加300μL PB Solution，充分摇动混匀，12000rpm室温离心5分钟，得到上清；将上清全部转移到套放于2mL收集管内的GenClean柱中，8000rpm室温离心1分钟后取下GenClean柱，弃去收集管中的废液，将GenClean柱放回收集管中，加入500μL Wash Solution，8000rpm室温离心1分钟后取下GenClean柱，弃去收集管中的废液，重复上述步骤一次，将GenClean柱放回收集管中，12000rpm室温离心1分钟以去除残留的Wash Solution，将GenClean柱放入新的洁净的1.5mL离心管中，在GenClean柱中央加入50～100μL Elution Buffer，室温或37℃放置2分钟后12000rpm室温离心1分钟，离心管中的液体即为Streptomyces_coelicolor(GDM 4.65)基因组DNA；

(2)编码海藻糖合成酶的基因的提取

设计如下引物：

ScT-F：5’-tgggtcgcggatccgaattcATGATCGTCAACGAGCCCGT-3’(SEQ ID No.5)，

ScT-R：5’-tcgagtgcggccgcaagcttTCAGGCGGCGTCCTTGCGCA-3’(SEQ ID No.6)，

19/ScT-F：5’-aaacagaattaattaagcttAAAGGAGGGAAATCATGATCGTCAACGAGCCCGTGC-3’(SEQ ID No.7)，

19/ScT-R：5’-acctgcaggcatgcaagcttTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGGCGGCGTCCTTGCGCAGG-3’(SEQ ID No.8)；

以Streptomyces_coelicolor(GDM 4.65)的基因组为模板，根据预先设计好的引物进行PCR扩增后回收扩增产物，得到编码海藻糖合成酶的基因；

(3)含有编码海藻糖合成酶的基因的重组菌的构建

用EcoR I和Hind III对载体pET28a于37℃条件下水浴1h进行双酶切，用Hind III对载体pXMJ19于37℃条件下水浴1h进行进行单酶切，分别回收酶切产物；将回收得到的酶切产物与(2)中回收得到的扩增产物混匀后于37℃保持30min进行连接，得到连接产物；

将连接产物转化E.coli BL21感受态细胞后冷激热激将转化产物加入800μL LB液体培养基中，于37℃、180r/min条件下培养1～1.5h，离心，弃上清；将沉淀在含有50μg/mL卡那霉素的平板上涂布并置于37℃培养箱中培养12h；分别挑取阳性克隆子加入10mL含有50μg/mL卡那霉素和10μg/mL卡氯霉素的LB液体培养基中，置于37℃培养箱中振荡培养10h；提取质粒进行酶切验证，得到验证成功的重组质粒pET28a-ScTreS和pXMJ19-ScTreS以及重组菌株E.coli BL21 pET28a-ScTreS；

在超净工作台中取5μL pXMJ19-ScTreS质粒与90μL C.glutamicum ATCC13032感受态细胞轻轻混匀，然后将其转移至预冷无菌电极杯中，放入电击仪中电击，电压为1850V，Tc＝5ms；在超净工作台中，向电极杯中加入800μL BHI液体培养基，轻轻对着电击杯中缝隙中菌液吹吸几次，将电极杯中的菌液转移至无菌1.5mL EP管中，46℃水浴6min；将其置于30℃培养箱中振荡培养1～2h；8000rpm离心1min，用移液枪吸700μL上清液丢掉，用移液枪轻轻混匀剩下的液体；将混匀的菌液吸到含有10μg/mL氯霉素的BHI固体培养基上涂布均匀，倒置30℃培养箱中培养16～24h；挑取阳性克隆子于加入10mL含有10μg/mL氯霉素的的BHI液体培养基中，并置于30℃培养箱中振荡培养16～24h；提取质粒进行酶切验证，得到验证成功的重组菌C.glutamicum pXMJ19-ScTreS。

对比例1：含有编码其他来源海藻糖合成酶的基因的重组菌的构建

具体步骤如下：

从NCBI上获取不同来源海藻糖合成酶(分别为核苷酸序列如SEQ ID No.9所示的来源于Corynebacterium glutamicum ATCC 13032的海藻糖合成酶、核苷酸序列如SEQ IDNo.10所示的来源于Pseudomonas stutzeri的海藻糖合成酶)的核苷酸序列，通过人工合成得到这些序列后，然后将得到的序列分别连接到pET28a载体上并转化宿主细胞E.coliBL21，得到重组菌BL21/pET28a-CgTreS以及BL21/pET28a-PsTreS；

其中，来源于Corynebacterium glutamicum ATCC 13032的海藻糖合成酶基因与pET28a载体是经Nde I和Hind III酶切后进行连接的，来源于Pseudomonas stutzeri的海藻糖合成酶基因与pET28a载体是经BamH I和Hind III酶切后进行连接的。

实施例2：海藻糖合成酶在大肠杆菌宿主中的表达

将实施例1得到的重组菌E.coli BL21 pET28a-ScTreS与对比例1得到的重组菌BL21/pET28a-CgTreS以及BL21/pET28a-PsTreS分别加入10mL LB培养基中，于37℃、180rpm的条件下培养10h后，以1％的接种量转接到50mL LB液体培养基中，于37℃、180rpm的条件下培养2～3h后，加入终浓度0.5mM的IPTG于16℃的条件下继续诱导培养12h，得到发酵液。

将发酵液离心收集菌体并用pH 7.0 50mM的磷酸钠缓冲液洗涤并悬浮，超声破碎离心取上清得到粗酶液后检测粗酶液中的海藻糖合成酶酶活。

检测结果为：重组菌E.coli BL21 pET28a-ScTreS发酵得到的粗酶液中的海藻糖合成酶比酶活为35.2U/mg、重组菌BL21/pET28a-CgTreS发酵得到的粗酶液中的海藻糖合成酶比酶活为31.3U/mg、重组菌BL21/pET28a-PsTreS发酵得到的粗酶液中的海藻糖合成酶酶活为28.1U/mg。可见，与其他来源的海藻糖合成酶相比，实施例1的海藻糖合成酶更具生产潜力。

实施例3：海藻糖合成酶在谷氨酸棒杆菌宿主中的表达

将实施例1得到的重组菌C.glutamicum pXMJ19-ScTreS加入10mL BHI液体培养基中，于30℃、180rpm的条件下培养16h后，以1％的接种量转接入含有10μg/mL氯霉素的50mLBHI液体培养基中，于30℃、180rpm的条件下继续培养5～8h后加入终浓度0.5mM的IPTG于16℃的条件下继续诱导培养12h，得到发酵液。

将发酵液离心收集菌体并用pH7.0 50mM磷酸钠缓冲液洗涤并悬浮，加入20μL0.2mg/mL的溶菌酶在冰上静置2h，超声破碎离心取上清得到粗酶液后检测粗酶液中的海藻糖合成酶酶活。

检测结果为：重组菌C.glutamicum pXMJ19-ScTreS发酵得到的粗酶液中的海藻糖合成酶比酶活为33.5U/mg。可见，实施例1的海藻糖合成酶可在谷氨酸棒杆菌宿主中表达。

实施例4：温度对海藻糖合成酶的影响

具体步骤如下：

用100mL pH 7.0 50mM的磷酸钠缓冲液配置的200g/L的麦芽糖溶液悬浮适量BL21/pET28a-ScTreS菌体，使其OD₆₀₀＝15，控制摇床转速150rpm，分别在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃下进行全细胞转化合成海藻糖。

检测转化24h后的海藻糖转化，检测结果为：反应温度为35℃时，转化率最高，达到58.5％，同时伴随生成15.1％的葡萄糖，其余温度下的转化率均低于35℃时，其中，在45℃时，转化率仅有42.7％，并伴随生成18.5％的葡萄糖。

实施例5：海藻糖合成酶突变体以及含有编码海藻糖合成酶突变体的基因的重组菌的构建构建

具体步骤如下：

设计如下引物：

引入K246A突变的定点突变引物：

K246A-F：CTCAAGCGGGTCCGCGCAGAGATCGACGCCCACTA(SEQ ID No.11)；

引入A165T突变的定点突变引物：

A165T-F：TTCGTCGACACCGAGACGTCCAACTGGACCTTCGA(SEQ ID No.12)；

引入F178Y突变的定点突变引物：

F178Y-F：GTCCGCAAGCAGTACTACTTCCACCGCTTCTTCTC(SEQ ID No.13)；

引入F179W突变的定点突变引物：

F179W-F：CGCAAGCAGTACTTCTGGCACCGCTTCTTCTCCCA(SEQ ID No.14)；

引入突变的载体通用引物：

pET28a-2254-R：GCCTTACTGGTTAGCAGAATG(SEQ ID No.15)；

以重组质粒pET-28a-ScTreS为模板进行PCR，得到PCR产物，将PCR产物转化E.coliBL21感受态细胞后将转化产物加入800μL LB液体培养基中，于37℃、180r/min条件下培养2h，离心，弃上清；将沉淀在含有含有50μg/mL卡那霉素的平板上涂布并置于37℃培养箱中培养12h；挑取阳性克隆子加入10mL含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，置于37℃培养箱中振荡培养10h；提取质粒进行酶切验证，得到验证成功的重组质粒pET-28a-ScTreS(K246A)、pET-28a-ScTreS(A165T)、pET-28a-ScTreS(F178Y)、pET-28a-ScTreS(F179W)以及重组菌E.coli BL21 pET28a-ScTreS(K246A)、E.coli BL21 pET28a-ScTreS(A165T)、E.coli BL21 pET28a-ScTreS(F178Y)、E.coli BL21 pET28a-ScTreS(F179W)；

其中，PCR反应体系为：0.2μL的突变引物，0.2μL通用引物，0.25μL质粒模板，11.85μL的双蒸水，12.5μL 2×高保真聚合酶预混液，共25μL体系；

PCR条件为：95℃预变性3min，95℃变性30S，55℃退火1min，72℃延伸3min，5个循环；95℃变性30s，68℃延伸6min，20个循环，68℃充分延伸12min；反应结束加入1μL Dpn I37℃保持1h消化PCR产物中的模板。

实施例6：海藻糖合成酶突变体的表达

具体步骤如下：

将实施例1得到的重组菌E.coli BL21 pET28a-ScTreS以及实施例5得到的重组菌E.coli BL21 pET28a-ScTreS(K246A)、E.coli BL21 pET28a-ScTreS(A165T)、E.coli BL21pET28a-ScTreS(F178Y)、E.coli BL21 pET28a-ScTreS(F179W)加入10mL LB培养基中，于37℃、180rpm的条件下培养10h后，以1％的接种量转接到50mL LB液体培养基中，于37℃、180rpm的条件下培养2～3h，加入终浓度0.5mM的IPTG于16℃的条件下继续诱导培养12h，得到发酵液。

检测结果为：重组菌E.coli BL21 pET28a-ScTreS发酵得到的粗酶液中的海藻糖合成酶的比酶活为35.2U/mg、重组菌E.coli BL21 pET28a-ScTreS(K246A)发酵得到的粗酶液中的海藻糖合成酶的比酶活为50.3U/mg、重组菌E.coli BL21 pET28a-ScTreS(A165T)发酵得到的粗酶液中的海藻糖合成酶的比酶活为48.9U/mg、重组菌E.coli BL21 pET28a-ScTreS(F178Y)发酵得到的粗酶液中的海藻糖合成酶的比酶活为41.5U/mg、重组菌E.coliBL21 pET28a-ScTreS(F179W)发酵得到的粗酶液中的海藻糖合成酶的比酶活为36.1U/mg。可见，与野生型海藻糖合成酶相比，海藻糖合成酶突变体K246A、A165T、F178Y的比酶活有了较为明显的提高，其中，海藻糖合成酶突变体K246A的比酶活较野生型酶提高了1.43倍、海藻糖合成酶突变体A165T的比酶活较野生型酶提高了1.39倍、海藻糖合成酶突变体F178Y的比酶活较野生型酶提高了1.18倍，而海藻糖合成酶突变体F179W基本上变化幅度不大。

实施例7：海藻糖合成酶及海藻糖合成酶突变体在海藻糖生产方面的应用

具体步骤如下：

将实施例1得到的重组菌E.coli BL21 pET28a-ScTreS以及实施例4得到的重组菌E.coli BL21 pET28a-ScTreS(K246A)、E.coli BL21 pET28a-ScTreS(A165T)、E.coli BL21pET28a-ScTreS(F178Y)单菌落接入LB液体培养基中，于37℃、180rpm的条件下培养10h，得到一级种子液；将得到的一级种子液以1％～2％的接种量转接到LB液体培养基中，于37℃、180rpm的条件下培养至OD₆₀₀为1.0～1.5，得到二级种子液；将得到的二级种子液转接入TY培养基中，于37℃、200rpm～400rpm的条件下培养至菌体浓度OD₆₀₀达到18～20，得到培养液；在得到的培养液中添加0.2mmol/L的IPTG，于28℃、转速600rpm下继续培养12～14h，得到发酵液；将得到的发酵液在6000r/min的条件下离心20min，去除上清，收集菌体；将得到的菌体用pH 7.0的50mM磷酸钠缓冲液洗涤2～3次后用上述缓冲液配制的100～800g/L麦芽糖溶液作为反应体系进行悬浮，于35℃、200rpm的条件下进行全细胞转化反应制备海藻糖。

在转化反应24h后，检测反应体系中的海藻糖转化率。

底物浓度为300g/L时的检测结果为：重组菌E.coli BL21 pET28a-ScTreS的海藻糖转化率为58.3％、重组菌E.coli BL21 pET28a-ScTreS(K246A)的海藻糖转化率为73.7％、重组菌E.coli BL21 pET28a-ScTreS(A165T)的海藻糖转化率为67.8％、重组菌E.coli BL21 pET28a-ScTreS(F178Y)的海藻糖转化率为63.1％。可见，与野生型海藻糖合成酶相比，海藻糖合成酶突变体K246A、A165T、F178Y的海藻糖转化率有了较为明显的提高，其中，海藻糖合成酶突变体K246A的海藻糖转化率较野生型酶提高了约15％、海藻糖合成酶突变体A165T的海藻糖转化率较野生型酶提高了约10％、海藻糖合成酶突变体F178Y的海藻糖转化率较野生型酶提高了约5％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种海藻糖合成酶及其在海藻糖生产中的应用

<160> 15

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1701

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgatcgtca acgagcccgt tcaggacacc ttcgaggaca cgcctgccaa ggatcgtgac 60

ccggattggt tcaagcgcgc cgtcttctac gaggtcctgg tccgctcctt ccaggacagc 120

aacggcgacg gcgtcggcga cctcaaaggc ctgacggcca aactcgacta tctgcaatgg 180

ctcggcgtcg actgcctgtg gctgccgccc ttcttcaagt caccgctgag ggacggcggc 240

tacgacgtct ccgactacac ctccgtactc cccgaattcg gcgacctcgc cgacttcgtg 300

gaattcgtgg actccgccca ccagcgcggt atgcgggtca tcatcgactt cgtcatgaac 360

cacaccagcg accagcaccc gtggttccag gagtcgagga aagaccccga cggcccctac 420

ggcgactact acgtgtgggc cgacgacgac aaggcatacg gcgacgcgcg catcatcttc 480

gtcgacaccg aggcctccaa ctggaccttc gacccggtcc gcaagcagta cttcttccac 540

cgcttcttct cccaccagcc ggatctcaac tacgagaacc cgaccgtgca ggaggagatc 600

atctccgccc tgcggttctg gctggacctg ggaatcgacg gcttccggct cgatgccgtg 660

ccgtatctgt atgcgcagga gggcaccaac tgcgagaacc tgccggcgac ccatgagttc 720

ctcaagcggg tccgcaagga gatcgacgcc cactacccgg acacggtgct gctggcggag 780

gccaaccagt ggccggagga cgtcgtcgac tatttcggcg acttccgcag cggcggcgac 840

gagtgccaca tggccttcca cttcccggtg atgccgcgga tcttcatggc cgtacggcgg 900

gaatcccgct acccggtctc ggaaatcctc gccaagacac cggccatccc ctccggctgc 960

caatggggca tcttcctgcg caaccacgac gagctgaccc tcgaaatggt caccgacgag 1020

gaacgcgact acatgtacgc ggagtacgcg aaggacccgc gtatgcgcgc caacatcggt 1080

atccgcaggc gcctcgcccc gctcctcgac aacgaccgca accagatcga gctgttcacc 1140

gccttgctgc tgtcgctccc cggctcgccg atcctctact acggcgacga gatcggcatg 1200

ggcgacaaca tctggctcgg cgaccgcgac gccgtccgca cgcccatgca gtggaccccg 1260

gaccgcaacg cgggcttctc gtccagtgac ccggggcggc tgttcctgcc ggcgatcatg 1320

gacccggtct acggctacca ggtgaccaac gtcgaggcgt cgatggcctc cccgtcctca 1380

ctcctgcact ggacgcgccg gatgatcgag atccgcaagc agaaccccgc tttcggactc 1440

ggcacctaca cggaactcca gtcgtcgaat ccggccgtga tcgccttcct gcgggaatac 1500

gaggacgatc tcgtcctgtg cgtgaacaac ttctcccggt tcgcccagcc gacggagttg 1560

gacctgcgca ggttcaacgg acgacatccg gtggagctgt tcggcggggt gcgattcccg 1620

gccatcggtg agctgccgta cttgctgacg ctcggtggtc acggcttcta ctggttccgg 1680

ctgcgcaagg acgccgcctg a 1701

<210> 2

<211> 566

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Ile Val Asn Glu Pro Val Gln Asp Thr Phe Glu Asp Thr Pro Ala

1 5 10 15

Lys Asp Arg Asp Pro Asp Trp Phe Lys Arg Ala Val Phe Tyr Glu Val

20 25 30

Leu Val Arg Ser Phe Gln Asp Ser Asn Gly Asp Gly Val Gly Asp Leu

35 40 45

Lys Gly Leu Thr Ala Lys Leu Asp Tyr Leu Gln Trp Leu Gly Val Asp

50 55 60

Cys Leu Trp Leu Pro Pro Phe Phe Lys Ser Pro Leu Arg Asp Gly Gly

65 70 75 80

Tyr Asp Val Ser Asp Tyr Thr Ser Val Leu Pro Glu Phe Gly Asp Leu

85 90 95

Ala Asp Phe Val Glu Phe Val Asp Ser Ala His Gln Arg Gly Met Arg

100 105 110

Val Ile Ile Asp Phe Val Met Asn His Thr Ser Asp Gln His Pro Trp

115 120 125

Phe Gln Glu Ser Arg Lys Asp Pro Asp Gly Pro Tyr Gly Asp Tyr Tyr

130 135 140

Val Trp Ala Asp Asp Asp Lys Ala Tyr Gly Asp Ala Arg Ile Ile Phe

145 150 155 160

Val Asp Thr Glu Ala Ser Asn Trp Thr Phe Asp Pro Val Arg Lys Gln

165 170 175

Tyr Phe Phe His Arg Phe Phe Ser His Gln Pro Asp Leu Asn Tyr Glu

180 185 190

Asn Pro Thr Val Gln Glu Glu Ile Ile Ser Ala Leu Arg Phe Trp Leu

195 200 205

Asp Leu Gly Ile Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Pro Tyr Leu Tyr

210 215 220

Ala Gln Glu Gly Thr Asn Cys Glu Asn Leu Pro Ala Thr His Glu Phe

225 230 235 240

Leu Lys Arg Val Arg Ala Glu Ile Asp Ala His Tyr Pro Asp Thr Val

245 250 255

Leu Leu Ala Glu Ala Asn Gln Trp Pro Glu Asp Val Val Asp Tyr Phe

260 265 270

Gly Asp Phe Arg Ser Gly Gly Asp Glu Cys His Met Ala Phe His Phe

275 280 285

Pro Val Met Pro Arg Ile Phe Met Ala Val Arg Arg Glu Ser Arg Tyr

290 295 300

Pro Val Ser Glu Ile Leu Ala Lys Thr Pro Ala Ile Pro Ser Gly Cys

305 310 315 320

Gln Trp Gly Ile Phe Leu Arg Asn His Asp Glu Leu Thr Leu Glu Met

325 330 335

Val Thr Asp Glu Glu Arg Asp Tyr Met Tyr Ala Glu Tyr Ala Lys Asp

340 345 350

Pro Arg Met Arg Ala Asn Ile Gly Ile Arg Arg Arg Leu Ala Pro Leu

355 360 365

Leu Asp Asn Asp Arg Asn Gln Ile Glu Leu Phe Thr Ala Leu Leu Leu

370 375 380

Ser Leu Pro Gly Ser Pro Ile Leu Tyr Tyr Gly Asp Glu Ile Gly Met

385 390 395 400

Gly Asp Asn Ile Trp Leu Gly Asp Arg Asp Ala Val Arg Thr Pro Met

405 410 415

Gln Trp Thr Pro Asp Arg Asn Ala Gly Phe Ser Ser Ser Asp Pro Gly

420 425 430

Arg Leu Phe Leu Pro Ala Ile Met Asp Pro Val Tyr Gly Tyr Gln Val

435 440 445

Thr Asn Val Glu Ala Ser Met Ala Ser Pro Ser Ser Leu Leu His Trp

450 455 460

Thr Arg Arg Met Ile Glu Ile Arg Lys Gln Asn Pro Ala Phe Gly Leu

465 470 475 480

Gly Thr Tyr Thr Glu Leu Gln Ser Ser Asn Pro Ala Val Ile Ala Phe

485 490 495

Leu Arg Glu Tyr Glu Asp Asp Leu Val Leu Cys Val Asn Asn Phe Ser

500 505 510

Arg Phe Ala Gln Pro Thr Glu Leu Asp Leu Arg Arg Phe Asn Gly Arg

515 520 525

His Pro Val Glu Leu Phe Gly Gly Val Arg Phe Pro Ala Ile Gly Glu

530 535 540

Leu Pro Tyr Leu Leu Thr Leu Gly Gly His Gly Phe Tyr Trp Phe Arg

545 550 555 560

Leu Arg Lys Asp Ala Ala

565

<210> 3

<211> 566

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Ile Val Asn Glu Pro Val Gln Asp Thr Phe Glu Asp Thr Pro Ala

1 5 10 15

Lys Asp Arg Asp Pro Asp Trp Phe Lys Arg Ala Val Phe Tyr Glu Val

20 25 30

Leu Val Arg Ser Phe Gln Asp Ser Asn Gly Asp Gly Val Gly Asp Leu

35 40 45

Lys Gly Leu Thr Ala Lys Leu Asp Tyr Leu Gln Trp Leu Gly Val Asp

50 55 60

Cys Leu Trp Leu Pro Pro Phe Phe Lys Ser Pro Leu Arg Asp Gly Gly

65 70 75 80

Tyr Asp Val Ser Asp Tyr Thr Ser Val Leu Pro Glu Phe Gly Asp Leu

85 90 95

Ala Asp Phe Val Glu Phe Val Asp Ser Ala His Gln Arg Gly Met Arg

100 105 110

Val Ile Ile Asp Phe Val Met Asn His Thr Ser Asp Gln His Pro Trp

115 120 125

Phe Gln Glu Ser Arg Lys Asp Pro Asp Gly Pro Tyr Gly Asp Tyr Tyr

130 135 140

Val Trp Ala Asp Asp Asp Lys Ala Tyr Gly Asp Ala Arg Ile Ile Phe

145 150 155 160

Val Asp Thr Glu Thr Ser Asn Trp Thr Phe Asp Pro Val Arg Lys Gln

165 170 175

Tyr Phe Phe His Arg Phe Phe Ser His Gln Pro Asp Leu Asn Tyr Glu

180 185 190

Asn Pro Thr Val Gln Glu Glu Ile Ile Ser Ala Leu Arg Phe Trp Leu

195 200 205

Asp Leu Gly Ile Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Pro Tyr Leu Tyr

210 215 220

Ala Gln Glu Gly Thr Asn Cys Glu Asn Leu Pro Ala Thr His Glu Phe

225 230 235 240

Leu Lys Arg Val Arg Lys Glu Ile Asp Ala His Tyr Pro Asp Thr Val

245 250 255

Leu Leu Ala Glu Ala Asn Gln Trp Pro Glu Asp Val Val Asp Tyr Phe

260 265 270

Gly Asp Phe Arg Ser Gly Gly Asp Glu Cys His Met Ala Phe His Phe

275 280 285

Pro Val Met Pro Arg Ile Phe Met Ala Val Arg Arg Glu Ser Arg Tyr

290 295 300

Pro Val Ser Glu Ile Leu Ala Lys Thr Pro Ala Ile Pro Ser Gly Cys

305 310 315 320

Gln Trp Gly Ile Phe Leu Arg Asn His Asp Glu Leu Thr Leu Glu Met

325 330 335

Val Thr Asp Glu Glu Arg Asp Tyr Met Tyr Ala Glu Tyr Ala Lys Asp

340 345 350

Pro Arg Met Arg Ala Asn Ile Gly Ile Arg Arg Arg Leu Ala Pro Leu

355 360 365

Leu Asp Asn Asp Arg Asn Gln Ile Glu Leu Phe Thr Ala Leu Leu Leu

370 375 380

Ser Leu Pro Gly Ser Pro Ile Leu Tyr Tyr Gly Asp Glu Ile Gly Met

385 390 395 400

Gly Asp Asn Ile Trp Leu Gly Asp Arg Asp Ala Val Arg Thr Pro Met

405 410 415

Gln Trp Thr Pro Asp Arg Asn Ala Gly Phe Ser Ser Ser Asp Pro Gly

420 425 430

Arg Leu Phe Leu Pro Ala Ile Met Asp Pro Val Tyr Gly Tyr Gln Val

435 440 445

Thr Asn Val Glu Ala Ser Met Ala Ser Pro Ser Ser Leu Leu His Trp

450 455 460

Thr Arg Arg Met Ile Glu Ile Arg Lys Gln Asn Pro Ala Phe Gly Leu

465 470 475 480

Gly Thr Tyr Thr Glu Leu Gln Ser Ser Asn Pro Ala Val Ile Ala Phe

485 490 495

Leu Arg Glu Tyr Glu Asp Asp Leu Val Leu Cys Val Asn Asn Phe Ser

500 505 510

Arg Phe Ala Gln Pro Thr Glu Leu Asp Leu Arg Arg Phe Asn Gly Arg

515 520 525

His Pro Val Glu Leu Phe Gly Gly Val Arg Phe Pro Ala Ile Gly Glu

530 535 540

Leu Pro Tyr Leu Leu Thr Leu Gly Gly His Gly Phe Tyr Trp Phe Arg

545 550 555 560

Leu Arg Lys Asp Ala Ala

565

<210> 4

<211> 566

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Met Ile Val Asn Glu Pro Val Gln Asp Thr Phe Glu Asp Thr Pro Ala

1 5 10 15

Lys Asp Arg Asp Pro Asp Trp Phe Lys Arg Ala Val Phe Tyr Glu Val

20 25 30

Leu Val Arg Ser Phe Gln Asp Ser Asn Gly Asp Gly Val Gly Asp Leu

35 40 45

Lys Gly Leu Thr Ala Lys Leu Asp Tyr Leu Gln Trp Leu Gly Val Asp

50 55 60

Cys Leu Trp Leu Pro Pro Phe Phe Lys Ser Pro Leu Arg Asp Gly Gly

65 70 75 80

Tyr Asp Val Ser Asp Tyr Thr Ser Val Leu Pro Glu Phe Gly Asp Leu

85 90 95

Ala Asp Phe Val Glu Phe Val Asp Ser Ala His Gln Arg Gly Met Arg

100 105 110

Val Ile Ile Asp Phe Val Met Asn His Thr Ser Asp Gln His Pro Trp

115 120 125

Phe Gln Glu Ser Arg Lys Asp Pro Asp Gly Pro Tyr Gly Asp Tyr Tyr

130 135 140

Val Trp Ala Asp Asp Asp Lys Ala Tyr Gly Asp Ala Arg Ile Ile Phe

145 150 155 160

Val Asp Thr Glu Ala Ser Asn Trp Thr Phe Asp Pro Val Arg Lys Gln

165 170 175

Tyr Tyr Phe His Arg Phe Phe Ser His Gln Pro Asp Leu Asn Tyr Glu

180 185 190

Asn Pro Thr Val Gln Glu Glu Ile Ile Ser Ala Leu Arg Phe Trp Leu

195 200 205

Asp Leu Gly Ile Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Pro Tyr Leu Tyr

210 215 220

Ala Gln Glu Gly Thr Asn Cys Glu Asn Leu Pro Ala Thr His Glu Phe

225 230 235 240

Leu Lys Arg Val Arg Lys Glu Ile Asp Ala His Tyr Pro Asp Thr Val

245 250 255

Leu Leu Ala Glu Ala Asn Gln Trp Pro Glu Asp Val Val Asp Tyr Phe

260 265 270

Gly Asp Phe Arg Ser Gly Gly Asp Glu Cys His Met Ala Phe His Phe

275 280 285

Pro Val Met Pro Arg Ile Phe Met Ala Val Arg Arg Glu Ser Arg Tyr

290 295 300

Pro Val Ser Glu Ile Leu Ala Lys Thr Pro Ala Ile Pro Ser Gly Cys

305 310 315 320

Gln Trp Gly Ile Phe Leu Arg Asn His Asp Glu Leu Thr Leu Glu Met

325 330 335

Val Thr Asp Glu Glu Arg Asp Tyr Met Tyr Ala Glu Tyr Ala Lys Asp

340 345 350

Pro Arg Met Arg Ala Asn Ile Gly Ile Arg Arg Arg Leu Ala Pro Leu

355 360 365

Leu Asp Asn Asp Arg Asn Gln Ile Glu Leu Phe Thr Ala Leu Leu Leu

370 375 380

Ser Leu Pro Gly Ser Pro Ile Leu Tyr Tyr Gly Asp Glu Ile Gly Met

385 390 395 400

Gly Asp Asn Ile Trp Leu Gly Asp Arg Asp Ala Val Arg Thr Pro Met

405 410 415

Gln Trp Thr Pro Asp Arg Asn Ala Gly Phe Ser Ser Ser Asp Pro Gly

420 425 430

Arg Leu Phe Leu Pro Ala Ile Met Asp Pro Val Tyr Gly Tyr Gln Val

435 440 445

Thr Asn Val Glu Ala Ser Met Ala Ser Pro Ser Ser Leu Leu His Trp

450 455 460

Thr Arg Arg Met Ile Glu Ile Arg Lys Gln Asn Pro Ala Phe Gly Leu

465 470 475 480

Gly Thr Tyr Thr Glu Leu Gln Ser Ser Asn Pro Ala Val Ile Ala Phe

485 490 495

Leu Arg Glu Tyr Glu Asp Asp Leu Val Leu Cys Val Asn Asn Phe Ser

500 505 510

Arg Phe Ala Gln Pro Thr Glu Leu Asp Leu Arg Arg Phe Asn Gly Arg

515 520 525

His Pro Val Glu Leu Phe Gly Gly Val Arg Phe Pro Ala Ile Gly Glu

530 535 540

Leu Pro Tyr Leu Leu Thr Leu Gly Gly His Gly Phe Tyr Trp Phe Arg

545 550 555 560

Leu Arg Lys Asp Ala Ala

565

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tgggtcgcgg atccgaattc atgatcgtca acgagcccgt 40

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tcgagtgcgg ccgcaagctt tcaggcggcg tccttgcgca 40

<210> 7

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

aaacagaatt aattaagctt aaaggaggga aatcatgatc gtcaacgagc ccgtgc 56

<210> 8

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

acctgcaggc atgcaagctt ttagtggtgg tggtggtggt gggcggcgtc cttgcgcagg 60

<210> 9

<211> 1797

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atgaattctc agccgagtgc agatcaccac cctgatcacg cggctcgccc agttcttgat 60

gcccacggct tgatcgttga gcacgaatcg gaagagtttc cagtccccgc acccgctccc 120

ggtgaacagc cctgggagaa gaaaaaccgc gagtggtaca aagacgccgt tttctacgaa 180

gtgctggttc gtgccttcta cgatccagaa ggcaacggag tcggatcgtt gaaaggcctg 240

accgaaaaac tggattacat ccagtggctc ggcgtggatt gcatttggat cccaccgttt 300

tatgattccc cactgcgcga cggcggttac gatatccgca acttccgtga aatcctgccc 360

gaattcggca ccgtcgatga cttcgtggaa ctcgttgacc acgcccaccg ccgtggcctg 420

cgtgttatca ccgacttggt catgaatcac acctccgacc agcacgcatg gttccaagaa 480

tcccggcgcg acccaaccgg cccctacgga gatttctatg tgtggagcga tgatcccacc 540

ctgtacaacg aagcccgcat catctttgta gatacagaag aatccaactg gacctatgat 600

ccggtgcgtg gccagtactt ctggcaccgc ttcttctccc accaaccaga cctcaactac 660

gacaaccccg cagtccaaga ggccatgcta gatgtcttgc gtttctggct ggacctggga 720

cttgatggtt tccgactaga tgccgttcct tatctttttg aacgcgaagg caccaacggc 780

gaaaacctca aagaaaccca cgatttcctc aaactgtgtc gctctgtcat tgagaaggaa 840

taccccggcc gaatcctgct cgcagaagcc aaccaatggc cccaagatgt ggtcgaatac 900

ttcggtgaaa aagacaaagg cgatgaatgc cacatggcct tccacttccc tttgatgccg 960

cgcatcttca tgggagttcg ccaaggttca cgcaccccga tcagtgagat cctggccaac 1020

accccggaga ttcccaagac tgcccaatgg ggtattttcc tgcgtaatca tgatgagctc 1080

acccttgaaa tggtctccga tgaggaacgc agctacatgt actcccaatt cgcctccgaa 1140

cctcgcatgc gcgccaacgt aggaatccgc aggcgccttt ccccactgct tgaaggcgac 1200

cgcaaccagc tggaactcct tcacggtttg ttgctgtctc tacctggctc acccgtgttg 1260

tattacggtg atgaaattgg catgggcgac aatatctggc tccacgaccg cgacggagtg 1320

cgcaccccca tgcagtggtc caacgaccgc aacggtggtt tctccaaagc tgatcctgaa 1380

cgcctgtacc ttccagcgat ccaaaatgat caatacggct acgcccaagt aaacgtggaa 1440

agccaactca accgcgaaaa ctccctgctg cgctggctcc gaaaccaaat ccttatccgc 1500

aagcagtacc gcgcatttgg tgccggaacc taccgtgaag tgtcctccac caatgagtca 1560

gtgttgacat ttttacgaga acacaagggc caaaccattt tgtgtgtcaa caacatgagc 1620

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atgtcgggcg ggcagctgtt ccctaccatt gctgaacggg agtggattgt cactttagcc 1740

cctcacggat tcttctggtt tgatctcacc gccgatgaaa aggacgatat ggaatga 1797

<210> 10

<211> 2070

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

atgagcatcc cagacaacac ctatatcgaa tggctggtca gccagtccat gctgcatgcg 60

gcccgcgagc ggtcgcgtca ttacgccggc caggcgcgtc tctggcagcg gccttatgcc 120

caggcccgcc cgcgcgatgc cagcgccatc gcctcggtgt ggttcaccgc ctatccggcg 180

gccatcatca cgccggaagg cggcacggta ctcgaggccc tcggcgacga ccgcctctgg 240

agtgcgctct ccgaactcgg cgtgcagggc atccacaacg ggccgatgaa gcgttccggt 300

ggcctgcgcg gacgcgagtt caccccgacc atcgacggca acttcgaccg catcagcttc 360

gatatcgacc cgagcctggg gaccgaggag cagatgctgc agctcagccg ggtggccgcg 420

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ttccgcctcg cggaaatggc ctatggcgac taccccgggc tgtaccacat ggtggaaatc 540

cgcgaggagg actgggagct gctgcccgag gtgccggccg ggcgtgattc ggtcaacctg 600

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ggggtcgacg gcaaggtgcg tcgctgggtc tatctgcact acttcaagga gggccagccg 780

tcgctgaact ggctcgaccc gaccttcgcc gcgcagcagc tgatcatcgg cgatgcgctg 840

cacgccatcg acgtcaccgg cgcccgggtg ctgcgcctgg acgccaacgg cttcctcggc 900

gtggaacggc gcgccgaggg cacggcctgg tcggagggcc acccgctgtc cgtcaccggc 960

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atcacccgcc cggcctatca ccatgcgttg ctcaccggcg ataccgaatt cctgcgcatg 1140

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aaccatgacg agttgaccct ggagctggtg cacttctgga cgctgcacgc ctacgaccat 1260

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gtgtcctgca ccaccgccag cgtgatcgcc gcggcgctta acatccgtga tctggacgcc 1440

atcggcccgg ccgaggtgga gcagatccag cgtctgcata tcctgctggt gatgttcaat 1500

gccatgcagc ccggcgtgtt cgccctctcc ggctgggatc tggtcggcgc cctgccgctg 1560

gcgcccgagc aggtcgagca cctgatgggc gatggcgata cccgctggat caatcgcggc 1620

ggctatgacc tcgccgatct ggcgccggag gcgtcggtct ccgccgaagg cctgcccaag 1680

gcccgctcgc tgtacggcag cctggccgag cagctgcagc ggccaggctc cttcgcctgc 1740

cagctcaagc gcatcctcag cgtgcgccag gcctacgaca tcgctgccag caagcagatc 1800

ctgattccgg atgtgcaggc gccgggactc ctggtgatgg tccacgagct gcctgccggc 1860

aagggcgtgc agctcacggc actgaacttc agcgccgagc cggtcagcga gaccatctgc 1920

ctgcccggcg tggcgcccgg cccggtggtg gacatcattc acgagagtgt ggagggcgac 1980

ctcaccgaca actgcgagct gcagatcaac ctcgacccgt acgaggggct tgccctgcgt 2040

gtggtgagcg ccgcgccgcc ggtgatctga 2070

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ctcaagcggg tccgcgcaga gatcgacgcc cacta 35

<210> 12

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ttcgtcgaca ccgagacgtc caactggacc ttcga 35

<210> 13

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gtccgcaagc agtactactt ccaccgcttc ttctc 35

<210> 14

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

cgcaagcagt acttctggca ccgcttcttc tccca 35

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gccttactgg ttagcagaat g 21

Claims

1.一种海藻糖合成酶突变体，其特征在于，所述突变体与海藻糖合成酶相比，第246位赖氨酸突变为了丙氨酸；编码所述海藻糖合成酶的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.编码权利要求1所述海藻糖合成酶突变体的基因。

3.携带权利要求2所述基因的重组质粒。

4.携带权利要求2所述基因或权利要求3所述重组质粒的宿主细胞。

5.权利要求1所述海藻糖合成酶突变体的制备方法，其特征在于，所述方法为使用权利要求4所述的宿主细胞，先将权利要求4所述的宿主细胞接种至发酵培养基中进行发酵，然后将发酵液进行离心收集菌体，最后将菌体进行破碎获得海藻糖合成酶突变体。

6.一种生产海藻糖的方法，其特征在于，所述方法为使用权利要求1所述海藻糖合成酶突变体或权利要求4所述宿主细胞，将权利要求1所述海藻糖合成酶突变体或权利要求4所述宿主细胞添加入含有麦芽糖的反应体系中进行反应。

7.一种可用于生产海藻糖的制剂，其特征在于，所述制剂的成分包含权利要求1所述海藻糖合成酶突变体或权利要求4所述宿主细胞。