TW201839140A

TW201839140A - 用於生產塔格糖的組成物及利用其生產塔格糖的方法

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Publication number: TW201839140A
Application number: TW107111508A
Authority: TW
Inventors: 梁成才; 趙顯國; 李英美; 金成俌
Original assignee: 南韓商Ｃｊ第一製糖股份有限公司
Priority date: 2017-03-31
Filing date: 2018-03-31
Publication date: 2018-11-01
Also published as: BR112019020229A2; US11795444B2; EP3604513A4; CA3058586A1; WO2018182345A1; US20220177936A1; BR112019020229B1; CN111094563A; EP3604515A4; KR20180111667A; TWI695888B; TWI682998B; MX2019011778A; TW201839139A; US11512301B2; CL2019002793A1; KR102074957B1; EP3604515A1; MX2019011759A; BR112019020230A2

Abstract

本申請案是有關於一種包括果糖-6-磷酸-4-差向異構酶的用於生產塔格糖的組成物及利用其生產塔格糖的方法。

Description

製備塔格糖組成物與使用其生產塔格糖之方法

塔格糖是少量存在於牛奶、乳酪、可可等食品、以及如蘋果與柑橘般具有甜味的天然水果的天然甜味料，塔格糖的物理性質亦與砂糖相似。塔格糖的卡路里為1.5 kcal/g（即砂糖的卡路里的1/3），血糖指數（Glycemic index，GI）為3（即砂糖的血糖指數的5%），然而，其具有與砂糖相似的甜味，並且具有各種健康功能性，故而可用作可同時滿足健康與口感的替代甜味料而應用至多種製品。

先前公知的塔格糖的製備方法有以半乳糖為主原料的化學（觸媒反應）方法與生物學（異構酶反應）方法（參照PCT WO 2006/058092、韓國註冊專利第10-0964091號及韓國註冊專利第10-1368731號）。然而，於上述先前的製備方法中，作為半乳糖的基礎原料的乳糖因國際市場中的生乳（raw milk）及乳糖的生產量、供需量等而價格存在不穩定性，導致塔格糖生產原料的穩定供需存在極限。因此，需要一種能夠以普遍的糖（砂糖、葡萄糖、果糖等）為原料來製備塔格糖的新的方法而對此進行了研究，上述文獻中揭示有分別自葡萄糖、半乳糖及果糖生產半乳糖、阿洛酮糖及塔格糖的方法（韓國註冊專利第10-744479號、韓國註冊專利第10-1057873號及韓國註冊專利第10-1550796號）。

另一方面，已知塔格糖-6-磷酸激酶（Tagatose-6-phosphate kinase，酶學委員會（Enzyme Commission，EC）2.7.1.144）如下述[反應式1]般以三磷酸腺苷（Adenosine Triphosphate，ATP）與D-塔格糖6-磷酸（D-tagatose 6-phosphate）為基質而生產二磷酸腺苷（Adenosine Diphosphate，ADP）與D-塔格糖1,6-二磷酸（D-tagatose 1,6-biphosphate），但並無針對上述塔格糖-6-磷酸激酶是否具有將果糖-6-磷酸轉化成塔格糖-6-磷酸的活性的研究。

[反應式1] ATP＋D-塔格糖6-磷酸＜＝＞ADP＋D-塔格糖1,6-二磷酸

於此種背景下，本發明者等人為了開發一種利用經濟性原料且可提高向塔格糖的轉化率的方法而進行銳意研究，結果確認到塔格糖-6-磷酸激酶（Tagatose-6-phosphate kinase，EC 2.7.1.144）具有將果糖-6-磷酸轉化成塔格糖-6-磷酸的功能，藉此完成本申請案。

因此，可於以葡萄糖或澱粉為原料而依次製備葡萄糖-1-磷酸及葡萄糖-6-磷酸（glucose-6-phosphate）後，利用本申請案的塔格糖-6-磷酸激酶將葡萄糖-6-磷酸（glucose-6-phosphate）轉化成塔格糖-6-磷酸（tagatose-6-phosphate），利用執行不可逆反應路徑的塔格糖-6-磷酸磷酸酶（tagatose-6-phosphate phosphatase）生產塔格糖，並且可明顯提高自葡萄糖或澱粉向塔格糖的轉化率。

[發明欲解決的課題]

本申請案的一目的在於提供一種有效製備塔格糖-6-磷酸的組成物，上述組成物包括塔格糖-6-磷酸激酶、表現上述酶的微生物或上述微生物的培養物。

本申請案的另一目的在於提供一種有效製備塔格糖的組成物，上述組成物包括：塔格糖-6-磷酸激酶、表現上述酶的微生物或上述微生物的培養物；及塔格糖-6-磷酸磷酸酶（tagatose-6-phosphate phosphatase）、表現上述塔格糖-6-磷酸磷酸酶的微生物或上述微生物的培養物。

本申請案的另一目的在於提供一種塔格糖-6-磷酸的製備方法，其包括使塔格糖-6-磷酸激酶、表現上述塔格糖-6-磷酸激酶的微生物或上述微生物的培養物與果糖-6-磷酸接觸而將上述果糖-6-磷酸轉化成塔格糖-6-磷酸的步驟。上述方法可更包括使上述塔格糖-6-磷酸與塔格糖-6-磷酸磷酸酶、表現上述塔格糖-6-磷酸磷酸酶的微生物或上述微生物的培養物接觸而轉化成塔格糖的步驟。

本申請案的其他目的及優點藉由隨附的發明申請專利範圍、圖式及下述詳細說明而變得更加明確。本說明書中未記載的內容可由在本申請案的技術領域或相似領域內具有常識者充分地認知、推導，因此省略其說明。

[解決課題的手段]

以下，具體地對本申請案的內容進行說明。另一方面，本申請案中揭示的一實施方式的說明及實施形態中的共通事項亦可應用於其他實施方式的說明及實施形態。另外，本申請案中所揭示的各種要素的所有組合均屬於本申請案的範疇。而且，本申請案的範疇並不限制於以下具體的記述。

為了達成本申請案的一目的，本申請案的一實施方式提供一種包括塔格糖-6-磷酸激酶、表現上述塔格糖-6-磷酸激酶的微生物或上述微生物的培養物的用於生產塔格糖-6-磷酸的組成物。

已知上述塔格糖-6-磷酸激酶（Tagatose-6-phosphate kinase，EC 2.7.1.144）是以ATP與D-塔格糖6-磷酸（D-tagatose 6-phosphate）為基質而生產ADP與D-塔格糖1,6-二磷酸（D-tagatose 1,6-biphosphate）者，例如可無限制地包括其他能夠以果糖-6-磷酸為基質而生產塔格糖的物質。

上述塔格糖-6-磷酸激酶可包括由序列號1、序列號3或序列號5的胺基酸序列構成的多肽、或與序列號1、序列號3或序列號5的胺基酸序列具有至少80%、90%、95%、97%或99%的同源性的多肽。另外，只要為具有上述同源性且具有表現出與由上述序列號1、序列號3或序列號5的胺基酸序列構成的蛋白質相應的功效（即，將果糖-6-磷酸的果糖的第4碳位置差向異構化而轉化成塔格糖-6-磷酸的果糖-6-磷酸C4-差向異構化活性）的胺基酸序列的多肽，則即便具有一部分序列缺失、經修飾、經取代或經添加的胺基酸序列，亦當然包括於本申請案的範圍內。而且，作為由可根據公知的基因序列製備的探針、例如於嚴格的條件下與編碼上述多肽的鹼基序列的全部或一部分的互補序列雜交（hybridization）的聚核苷酸編碼的多肽，亦可無限制地包括具有果糖-6-磷酸C4-差向異構化活性的多肽。

於本申請案中，揭示了“塔格糖-6-磷酸激酶”表現出將果糖-6-磷酸的第4碳位置差向異構化而將果糖-6-磷酸轉化成塔格糖-6-磷酸的果糖-6-磷酸4-差向異構化活性，因此於本申請案中，“塔格糖-6-磷酸激酶”可與“果糖-6-磷酸-4-差向異構酶（Fructose-6-phosphate C4-epimerase）”互換使用。

於本申請案中，用語“嚴格的條件”是指可實現聚核苷酸間的特異性雜交的條件。此種條件依存於聚核苷酸的長度及互補性程度，這些參數為本技術領域所熟知，諸如具體記載在文獻（例如，J. Sambrook等人，同源）中。例如，可列舉如下條件：同源性較高的基因彼此雜交、具有80%以上、90%以上、95%以上、97%以上或99%以上的同源性的基因彼此雜交、同源性低於上述的基因彼此不雜交化的條件；或於通常的南方雜交的清洗條件，即於60℃、1×鹽水檸檬酸鈉（Saline Sodium Citrate，SSC）、0.1%十二烷基硫酸鈉（Sodium Dodecyl Sulfate，SDS）、具體而言60℃、0.1×SSC、0.1% SDS、更具體而言68℃、0.1×SSC、0.1% SDS對應的鹽濃度及溫度下清洗1次、具體而言2次至3次的條件。上述雜交中所使用的探針可為鹼基序列的互補序列的一部分。此種探針能夠以根據公知序列製成的寡核苷酸為引子而藉由以包括此種鹼基序列的基因片段為模板的聚合酶鏈反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）製作。另外，業者可視需要而根據如探針長度的要素調節溫度及清洗溶液的鹽濃度。

於本申請案中，用語“同源性”是指兩個多肽部分（moiety）間的一致性的百分比。自一個部分至另一部分為止的序列間的一致性可藉由公知的相應技術而確定。例如，可藉由如下方式確定同源性：對序列資訊進行整列，利用可容易地獲得的電腦程式直接對兩個多肽分子間的序列資訊（例如分值（score）、一致性（identity）及相似度（similarity）等參數（parameter））進行整列（例如基礎局部比對檢索工具（Basic Local Alignment Search Tool，BLAST）2.0）。另外，聚核苷酸間同源性可藉由如下方式確定：於在構成同源區域間的穩定雙鏈的條件下將聚核苷酸雜交後，分解成單鏈特異性核酸酶而確定所分解的片段的尺寸。

作為一實施例，本申請案的塔格糖-6-磷酸激酶可為來自耐熱性微生物的酶，例如可為來自厭氧繩菌屬的酶或其變異體、來自網團菌屬（The genus of Dictyoglomus）的酶或其變異體，具體而言，可為來自嗜熱厭氧繩菌（Anaerolinea thermophila）、厭氧繩菌細菌（Anaerolineae bacterium）或嗜熱網團菌（Dictyoglomus thermophilum）的酶或其變異體，但並不限制於此。

本申請案的果糖-6-磷酸-4-差向異構酶或其變異體具有將D-果糖（fructose）-6-磷酸的第4碳位置差向異構化而轉化成D-塔格糖-6-磷酸的特徵。作為本申請案的果糖-6-磷酸-4-差向異構酶，可使用已知具有塔格糖-6-磷酸激酶（tagatose-6-phosphate kinase）活性的酶，已知塔格糖-6-磷酸激酶是以D-塔格糖6-磷酸（D-tagatose 6-phosphate）為基質而生產D-塔格糖1,6-二磷酸（D-tagatose 1,6-biphosphate）者。於本申請案中，首次揭示上述塔格糖-6-磷酸激酶具有果糖-6-磷酸-4-差向異構酶活性。因此，本申請案的一實施例是有關於一種包括於自果糖-6-磷酸製備塔格糖-6-磷酸時將塔格糖-6-磷酸激酶用作果糖-6-磷酸-4-差向異構酶的塔格糖-6-磷酸激酶的新的用途。另外，本申請案的一實施例是有關於一種將塔格糖-6-磷酸激酶用作果糖-6-磷酸-4-差向異構酶而自果糖-6-磷酸製備塔格糖-6-磷酸的方法。

作為一實施例，本申請案的果糖-6-磷酸-4-差向異構酶可為耐熱性較高的酶。具體而言，本申請案的果糖-6-磷酸-4-差向異構酶可於50℃至70℃下表現出最大活性的50%至100%、60%至100%、70%至100%或75%至100%的活性。更具體而言，本申請案的果糖-6-磷酸-4-差向異構酶可於55℃至65℃、60℃至70℃、55℃、60℃或70℃下表現出最大活性的80%至100%或85%至100%的活性。

進而，由序列號1、序列號3或序列號5的胺基酸序列構成的上述果糖-6-磷酸-4-差向異構酶可分別依次由序列號2、序列號4或序列號6的核苷酸序列編碼，但並不限制於此。

本申請案的果糖-6-磷酸-4-差向異構酶或其變異體可為藉由如下方式獲得者：於以表現本申請案的上述酶或其變異體的脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid，DNA）（例如序列號2、序列號4或序列號6的核苷酸）轉形至大腸桿菌（E. coli）等菌株後，對其進行培養而獲得培養物，對上述培養物進行粉碎而藉由管柱等進行精製。除大腸桿菌（Escherichia coli）以外，上述轉形用菌株還可為麩胺酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）、米麴菌（Aspergillus oryzae）或枯草桿菌（Bacillus subtilis）等。於具體例中，作為此種轉形的菌株，微生物可為大腸桿菌BL21（DE3）/pBT7-C-His-an1、大腸桿菌BL21（DE3）/pBT7-C-His-CJ_AB_F6P4E或大腸桿菌BL21（DE3）/pBT7-C-His-CJ_DT_F6P4E，上述大腸桿菌BL21（DE3）/pBT7-C-His-an1於2017年3月20日以寄存編號KCCM11996P寄存至韓國微生物保存中心（Korean Culture Center of Microorganisms），上述大腸桿菌BL21（DE3）/pBT7-C-His-CJ_DT_F6P4E於2017年9月13日以寄存編號KCCM12110P寄存，上述大腸桿菌BL21（DE3）/pBT7-C-His-CJ_AB_F6P4E於2017年8月11日以寄存編號KCCM12093P寄存。

本申請案中使用的果糖-6-磷酸-4-差向異構酶可利用編碼上述果糖-6-磷酸-4-差向異構酶的核酸提供。

於本申請案中，用語“核酸”具有總括DNA分子或核糖核酸（Ribonucleic Acid，RNA）分子的含義，作為核酸的基本構成單元的核苷酸不僅可包括天然核苷酸，而且亦包括糖或鹼基位點經修飾的類似物（參照文獻：Scheit，核苷酸類似物（Nucleotide Analogs），John Wiley，New York (1980）；Uhlman及Peyman，化學綜述（Chemical Reviews），90: 543-584 (1990)）。

本申請案的核酸可為編碼本申請案的由序列號1、序列號3或序列號5的胺基酸序列構成的多肽的核酸、或編碼與本申請案的果糖-6-磷酸-4-差向異構酶具有至少80%、90%、95%、97%或99%的遺傳同源性且具有果糖-6-磷酸-4-差向異構酶活性的多肽的核酸。例如，編碼由序列號1的胺基酸序列構成的上述果糖-6-磷酸-4-差向異構酶的核酸可為與序列號2的鹼基序列具有至少80%、90%、95%、97%、99%或100%的遺傳同源性的核酸。另外，編碼由序列號3或序列號5的胺基酸序列構成的上述果糖-6-磷酸-4-差向異構酶的各核酸可為與對應於其的序列號4或序列號6的鹼基序列具有至少80%、90%、95%、97%、99%或100%的遺傳同源性的核酸。而且，本申請案的核酸可包括可藉由密碼簡並性（codon degeneracy）而轉譯成本申請案的果糖-6-磷酸-4-差向異構酶的核酸，當然亦可包括如下核酸：於嚴格的條件下與由相對於序列號2、序列號4或序列號6的鹼基序列為互補性的鹼基序列構成的核酸雜交，且編碼具有本申請案的果糖-6-磷酸-4-差向異構酶活性的多肽。

可使用於本申請案的表現果糖-6-磷酸-4-差向異構酶的微生物可為包括包含上述核酸的重組載體的微生物。上述載體可為以可使本申請案的核酸發揮作用的方式連接的形態。於本申請案中，用語“以可發揮作用的方式連接”通常是為了執行功能而鹼基表現調節序列與編碼靶蛋白的鹼基序列以可發揮作用的方式連接，從而可對編碼的鹼基序列的表現產生影響。可利用業界公知的基因重組技術以可發揮作用的方式與載體連接，可使用業界的剪切及連接酶等實現位點特異性DNA剪切及連接。

於本申請案中，用語“載體”是指用以將鹼基選殖及/或轉移至有機體、例如宿主細胞的任意的介質。載體可為不同的DNA片段結合而可導入所結合的片段的複製的複製單元（replicon）。此處，“複製單元”是指於生物體內作為DNA自複製單元發揮功能、即可藉由自調節而實現複製的任意的遺傳單元（例如，質體、噬菌體、黏質體、染色體、病毒）。本申請案的用語“載體”可包括用以於試管內、生物體外或生物體內將鹼基導入至有機體（例如宿主細胞）的病毒介質及非病毒介質，可包括微環DNA、如睡美人（Sleeping Beauty）的轉位子（Izsvak等人，分子生物學雜誌（J. MoI. Biol.）302: 93-102 (2000)）或人工染色體。作為通常使用的載體的示例，可列舉天然狀態或重組狀態的質體、黏質體、病毒及細菌噬菌體。例如，可使用pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A及Charon21A等作為噬菌體載體或黏質體載體，可使用pBR類、pUC類、pBluescriptII類、pGEM類、pTZ類、pCL類及pET類等作為質體載體。可使用於本申請案的載體並無特別限制，可使用公知的表現載體。另外，上述載體可為以更包括各種抗生素抗性基因為特徵的重組載體。於本申請案中，用語“抗生素抗性基因”是對抗生素具有抗性的基因，具有該基因的細胞可存活於以相應的抗生素進行處理過的環境中，因此於在大腸桿菌中獲得大量質體的過程中有效地用作篩選標誌。於本申請案中，抗生素抗性基因並非為對本申請案的核心技術（即由載體的最佳組合實現的表現效率）產生較大影響的要素，因此可無限制地使用通常使用的抗生素抗性基因作為篩選標誌。作為具體的示例，可使用針對胺苄青黴素（ampicilin）、四環素（tetracyclin）、康黴素（kanamycin）、氯黴素（chloroamphenicol）、鏈黴素（streptomycin）或新黴素（neomycin）的抗性基因等。

可利用於本申請案的表現果糖-6-磷酸-4-差向異構酶的微生物可利用將包括編碼上述酶的核酸的載體導入至宿主細胞內的方法，使上述載體轉形的方法可包括將核酸導入至細胞內的任一方法可選擇如於本技術領域內公知的適當的標準技術而執行。可包括電致孔（electroporation）、磷酸鈣共沉澱（calcium phosphate co-precipitation）、反轉錄病毒感染（retroviral infection）、顯微注射法（microinjection）、二乙胺乙基（Dicthylaminoethyl，DEAE）-葡聚糖（DEAE-dextran）、陽離子脂質體（cationic liposome）法及熱衝擊法等，但並不限制於此。

轉形的基因只要可於宿主細胞內表現，則可包括所有插入於宿主細胞的染色體內的形態及位於染色體外的形態。並且，上述基因只要為包括DNA及RNA作為可編碼多肽的聚核苷酸且可導入至宿主細胞內而表現者即可，因此可無限制地使用具有上述特徵者。例如，上述基因能夠以作為包括自表現所需的所有要素的聚核苷酸結構體的表現盒（expression cassette）形態導入至宿主細胞。上述表現盒通常可包括以可發揮作用的方式連接於上述基因的啟動子（promoter）、轉錄終止訊號、核糖體結合位點及轉譯終止訊號。上述表現盒可呈可實現自複製的表現載體形態。另外，上述基因亦可為如下者：以其本身的形態或聚核苷酸結構體的形態導入至宿主細胞而於宿主細胞內以可發揮作用的方式與表現所需的序列連接。

本申請案的微生物只要為包括本申請案的核酸或本申請案的重組載體而可生產本申請案的果糖-6-磷酸-4-差向異構酶的微生物即可，因此可包括原核微生物及真核微生物中的任一種。例如，可包括屬於埃希氏菌（Escherichia）屬、歐文氏桿菌（Erwinia）屬、沙雷氏菌（Serratia）屬、普羅威登菌（Providencia）屬、棒狀桿菌（Corynebacterium）屬及短桿菌（Brevibacterium）屬的微生物菌株，具體而言，可為大腸桿菌（E. coli）或麩胺酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum），但並不限制於此。作為此種微生物的具體例，可為大腸桿菌BL21（DE3）/pBT7-C-His-an1、大腸桿菌BL21（DE3）/pBT7-C-His-CJ_AB_F6P4E或大腸桿菌BL21（DE3）/pBT7-C-His-CJ_DT_F6P4E等。

本申請案的微生物可包括除上述核酸導入或載體導入以外可藉由各種公知方法表現本申請案的果糖-6-磷酸-4-差向異構酶或相關酶的所有微生物。

本申請案的微生物的培養物可為於培養基中培養表現本申請案的塔格糖-6-磷酸激酶或相關酶的微生物而製備者。

於本申請案中，用語“培養”是指使上述微生物於適當地調節的環境條件下生長。本申請案的培養過程可利用業界熟知的適當的培養基與培養條件實現。此種培養過程可根據選擇的菌株而由業者容易地調整來使用。培養微生物的上述步驟並無特別限制，可藉由公知的批式培養方法、連續式培養方法、流加式培養方法等執行。此時，培養條件並無特別限制，可使用鹼性化合物（例如，氫氧化鈉、氫氧化鉀或氨）或酸性化合物（例如，磷酸或硫酸）調節最適pH值（例如，pH5至pH9，具體而言為pH7至pH9）。另外，可於培養中使用如脂肪酸聚二醇酯的消泡劑來抑制氣泡的產生，另外，為了保持培養物的好氧狀態而可向培養物中注入氧氣或含氧氣體、或為了保持厭氧狀態及微好氧狀態而可不注入氣體或注入氮氣、氫氣或二氧化碳氣體。培養溫度可保持為25℃至40℃、具體而言為30℃至37℃，但並不限制於此。培養時間可持續至獲得所期望的有用物質的生產量為止，具體而言，可培養約0.5小時至60小時，但並不限制於此。而且，使用的培養用培養基作為碳供給源可單獨或混合糖及碳水化合物（例如，葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、澱粉及纖維素）、油脂及脂肪（例如，大豆油、葵花籽油、花生油及椰子油）、脂肪酸（例如，棕櫚酸、硬脂酸及亞麻油酸）、醇（例如，甘油及乙醇）與有機酸（例如，乙酸）等而使用，但並不限制於此。作為氮供給源，可單獨或混合含氮的有機化合物（例如，蛋白腖、酵母萃取液、肉汁、麥芽萃取液、玉米漿、大豆粕粉及尿素）或無機化合物（例如，硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨及硝酸銨）等而使用，但並不限制於此。作為磷供給源，可單獨或混合磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、與其對應的含鈉的鹽等而使用，但並不限制於此。另外，於培養基中可包括如金屬鹽（例如，硫酸鎂或硫酸鐵）、胺基酸及維生素的其他必需生長促進物質。

本申請案的用於生產塔格糖-6-磷酸的組成物可更包括果糖-6-磷酸，上述果糖-6-磷酸可藉由本申請案的果糖-6-磷酸-4-差向異構酶而轉化成塔格糖-6-磷酸。

本申請案的另一實施方式是有關於一種用於生產塔格糖的組成物，其包括：塔格糖-6-磷酸激酶、表現上述塔格糖-6-磷酸激酶的微生物或上述微生物的培養物；及塔格糖-6-磷酸磷酸酶（tagatose-6-phosphate phosphatase）、表現上述塔格糖-6-磷酸磷酸酶的微生物或上述微生物的培養物。於本實施方式中，對塔格糖-6-磷酸激酶、表現上述塔格糖-6-磷酸激酶的微生物或上述微生物的培養物的說明與上述實施方式相同。

本申請案的塔格糖-6-磷酸磷酸酶只要為具有去除塔格糖-6-磷酸的磷酸基而轉化成塔格糖的活性的蛋白質即可，因此可無限制地包括上述蛋白質。本申請案的塔格糖-6-磷酸磷酸酶可為來自耐熱性微生物的酶，例如可為來自棲熱袍菌屬的酶或其變異體，具體而言，可為來自海棲熱袍菌（Thermotoga maritima）的酶或其變異體。

根據本申請案的一實施例，本申請案的塔格糖-6-磷酸磷酸酶可為如下蛋白質：由序列號7的胺基酸序列構成的蛋白質；或由與上述序列號7的胺基酸序列具有70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或100%的遺傳同源性或由上述任意兩個數值定義的範圍內的遺傳同源性的序列構成的蛋白質。根據本申請案的一實施例，本申請案的由序列號7的胺基酸序列構成的塔格糖-6-磷酸磷酸酶可藉序列號8的核苷酸序列編碼。

本申請案的用於生產塔格糖的組成物可更包括葡萄糖-6-磷酸異構酶（glucose-6-phosphate isomerase）、表現上述葡萄糖-6-磷酸異構酶的微生物或上述微生物的培養物，可於存在上述酶的條件下將葡萄糖-6-磷酸異構化而生成果糖-6-磷酸。本申請案的葡萄糖-6-磷酸-異構酶只要為具有將葡萄糖-6-磷酸異構化成果糖-6-磷酸的活性的蛋白質即可，因此可無限制地包括上述蛋白質。本申請案的葡萄糖-6-磷酸-異構酶可為來自耐熱性微生物的酶，例如可為來自棲熱袍菌屬的酶或其變異體，具體而言，可為來自海棲熱袍菌的酶或其變異體。根據本申請案的一實施例，本申請案的葡萄糖-6-磷酸-異構酶可為如下蛋白質：由序列號9的胺基酸序列構成的蛋白質；或由與上述序列號9的胺基酸序列具有70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或100%的遺傳同源性或由上述任意兩個數值定義的範圍內的遺傳同源性的序列構成的蛋白質。根據本申請案的一實施例，本申請案的由序列號9的胺基酸序列構成的葡萄糖-6-磷酸-異構酶可由序列號10的核苷酸序列編碼。

本申請案的用於生產塔格糖的組成物可更包括葡萄糖磷酸變位酶（phosphoglucomutase）、表現上述葡萄糖磷酸變位酶的微生物或上述微生物的培養物，上述酶促進將葡萄糖-1-磷酸轉化成葡萄糖-6-磷酸、或將葡萄糖-6-磷酸轉化成葡萄糖-1-磷酸的可逆反應。本申請案的葡萄糖磷酸變位酶（phosphoglucomutase）只要為具有可將葡萄糖-1-磷酸轉化成葡萄糖-6-磷酸或相反地轉化的活性的蛋白質即可，因此可無限制地包括上述蛋白質。本申請案的葡萄糖磷酸變位酶可為來自耐熱性微生物的酶，例如可為來自棲熱袍菌屬的酶或其變異體，具體而言，可為來自新阿波羅棲熱袍菌的酶或其變異體。根據本申請案的一實施例，本申請案的葡萄糖磷酸變位酶可為如下蛋白質：由序列號11的胺基酸序列構成的蛋白質；或由與上述序列號11的胺基酸序列具有70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或100%的遺傳同源性或由上述任意兩個數值定義的範圍內的遺傳同源性的序列構成的蛋白質。根據本申請案的一實施例，本申請案的由序列號11的胺基酸序列構成的葡萄糖磷酸變位酶可由序列號12的核苷酸序列編碼。

本申請案的用於生產塔格糖的組成物可更包括葡萄糖激酶（glucokinase）、表現上述葡萄糖激酶的微生物或上述微生物的培養物。本申請案的葡萄糖激酶只要為具有將葡萄糖磷酸化的活性的蛋白質即可，因此可無限制地包括上述蛋白質。本申請案的葡萄糖激酶可為來自耐熱性微生物的酶，例如可為來自異常球菌屬或厭氧繩菌屬的酶或其變異體，具體而言，可為來自異常球菌屬中度嗜熱菌（Deinococcus geothermalis）、嗜熱厭氧繩菌（Anaerolinea thermophila）的酶或其變異體。本申請案的葡萄糖激酶只要為具有可將葡萄糖轉化成葡萄糖-6-磷酸的活性的蛋白質即可，因此可無限制地包括上述蛋白質。具體而言，本申請案的葡萄糖激酶可為磷酸依存型葡萄糖激酶。根據本申請案的一實施例，本申請案的葡萄糖激酶可為如下蛋白質：由序列號13或序列號15的胺基酸序列構成的蛋白質；或由與上述序列號13或序列號15的胺基酸序列具有70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或100%的遺傳同源性或由上述任意兩個數值定義的範圍內的遺傳同源性的序列構成的蛋白質。根據本申請案的一實施例，本申請案的由序列號13的胺基酸序列構成的葡萄糖激酶可由序列號14的核苷酸序列編碼，本申請案的由序列號15的胺基酸序列構成的葡萄糖激酶可由序列號16的核苷酸序列編碼。

本申請案的用於生產塔格糖的組成物可更包括α-葡聚糖磷酸化酶（α-glucan phosphorylase）、澱粉磷酸化酶（starch phosphorylase）、麥芽糊精磷酸化酶（maltodextrin phosphorylase）或蔗糖磷酸化酶（sucrose phosphorylase）、表現上述α-葡聚糖磷酸化酶、澱粉磷酸化酶、麥芽糊精磷酸化酶或蔗糖磷酸化酶的微生物或上述微生物的培養物。上述磷酸化酶只要為具有可將澱粉、麥芽糊精或蔗糖轉化成葡萄糖-1-磷酸的活性的蛋白質即可，因此可無限制地包括上述蛋白質。磷酸化酶可為來自耐熱性微生物的酶，例如可為來自棲熱袍菌屬的酶或其變異體，具體而言，可為來自新阿波羅棲熱袍菌的酶或其變異體。本申請案的磷酸化酶可為如下蛋白質：由序列號17的胺基酸序列構成的蛋白質；或由與上述序列號17的胺基酸序列具有70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或100%的遺傳同源性或由上述任意兩個數值定義的範圍內的遺傳同源性的序列構成的蛋白質。根據本申請案的一實施例，本申請案的由序列號17的胺基酸序列構成的磷酸化酶可由序列號18的核苷酸序列編碼。

本申請案的用於生產塔格糖的組成物可更包括：α-澱粉酶（α-amylase）、支鏈澱粉酶（pullulanase）、葡萄糖澱粉酶（glucoamylase）、蔗糖酶（sucrase）或異澱粉酶（isoamylase）；表現上述澱粉酶、支鏈澱粉酶、葡萄糖澱粉酶、蔗糖酶或異澱粉酶的微生物；或表現上述澱粉酶、支鏈澱粉酶、葡萄糖澱粉酶、蔗糖酶或異澱粉酶的微生物的培養物。

本申請案的用於生產塔格糖的組成物可單獨包括可用於生產本申請案中所記載的塔格糖的兩種以上的酶或其轉形體、或包括藉由編碼兩種以上的酶的核苷酸而轉形的轉形體。

本申請案的用於生產塔格糖的組成物可更包括4-α-葡聚糖轉移酶（4-α-glucanotransferase）、表現上述4-α-葡聚糖轉移酶的微生物或表現上述4-α-葡聚糖轉移酶的微生物的培養物。本申請案的4-α-葡聚糖轉移酶只要為具有將葡萄糖轉化成澱粉、麥芽糊精或蔗糖的活性的蛋白質即可，因此可無限制地包括上述蛋白質。本申請案的4-α-葡聚糖轉移酶可為來自耐熱性微生物的酶，例如可為來自棲熱袍菌屬的酶或其變異體，具體而言，可為來自海棲熱袍菌的酶或其變異體。根據本申請案的一實施例，本申請案的4-α-葡聚糖轉移酶可為如下蛋白質：由序列號19的胺基酸序列構成的蛋白質；或由與上述序列號19的胺基酸序列具有70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或100%的遺傳同源性或由上述任意兩個數值定義的範圍內的遺傳同源性的序列構成的蛋白質。根據本申請案的一實施例，本申請案的由序列號19的胺基酸序列構成的4-α-葡聚糖轉移酶可由序列號20的核苷酸序列編碼。

作為可使用於上述實施例的微生物的示例，可列舉大腸桿菌BL21（DE3）/pET21a-CJ_ct1、大腸桿菌BL21（DE3）/pET21a-CJ_ct2、大腸桿菌BL21（DE3）/pET21a-CJ_tn1、大腸桿菌BL21（DE3）/pET21a-CJ_tn2及大腸桿菌BL21（DE3）/pET21a-CJ_t4等。上述重組微生物分別於2017年3月20日以寄存編號KCCM11990P（大腸桿菌BL21（DE3）/pET21a-CJ_ct1）、KCCM11991P（大腸桿菌BL21（DE3）/pET21a-CJ_ct2）、KCCM11992P（大腸桿菌BL21（DE3）/pET21a-CJ_tn1）、KCCM11993P（大腸桿菌BL21（DE3）/pET21a-CJ_tn2）、KCCM11994P（大腸桿菌BL21（DE3）/pET21a-CJ_t4）寄存至韓國微生物保存中心（Korean Culture Center of Microorganisms）。

本申請案的用於生產塔格糖的組成物可更包括與上述酶的各基質對應的物質、成分或組成物。

本申請案的用於生產塔格糖的組成物可更包括通常使用於上述用於生產塔格糖的組成物的任意適當的賦形劑。作為此種賦形劑，例如可為保存劑、潤濕劑、分散劑、懸浮劑、緩衝劑、穩定劑或等張劑等，但並不限定於此。

本申請案的用於生產塔格糖的組成物可更包括金屬。於一實施例中，本申請案的金屬可為包括2價陽離子的金屬。具體而言，本申請案的金屬可為選自由鎳、鈷、鋁、鎂（Mg）及錳（Mn）所組成的族群中的一種以上。更具體而言，本申請案的金屬可為金屬離子或金屬鹽，更進一步具體而言，上述金屬鹽可為選自由NiSO₄ 、MgSO₄ 、MgCl₂ 、NiCl₂ 、CoCl₂ 、CoSO₄ 、MnCl₂ 及MnSO₄ 所組成的族群中的一種以上。

本申請案的另一實施方式是有關於一種塔格糖-6-磷酸的製備方法，其包括使果糖-6-磷酸與塔格糖-二磷酸醛縮酶、表現上述塔格糖-二磷酸醛縮酶的微生物或上述微生物的培養物接觸而將上述果糖-6-磷酸轉化成塔格糖-6-磷酸的步驟。

與上述用於生產塔格糖-6-磷酸的組成物相關的事項可相同地適用於用於生產塔格糖的組成物。

本申請案的另一實施方式是有關於一種塔格糖-6-磷酸的製備方法，其包括使果糖-6-磷酸與塔格糖-6-磷酸激酶、表現上述塔格糖-6-磷酸激酶的微生物或上述微生物的培養物接觸而將上述果糖-6-磷酸轉化成塔格糖-6-磷酸的步驟。上述方法可更包括使上述塔格糖-6-磷酸與塔格糖-6-磷酸磷酸酶、表現上述塔格糖-6-磷酸磷酸酶的微生物或上述微生物的培養物接觸而轉化成塔格糖的步驟。

本申請案的方法可更包括使如本申請案所述的葡萄糖-6-磷酸-異構酶、表現上述葡萄糖-6-磷酸-異構酶的微生物或表現上述葡萄糖-6-磷酸-異構酶的微生物的培養物與葡萄糖-6-磷酸（Glucose-6-phosphate）接觸而將上述葡萄糖-6-磷酸轉化成果糖-6-磷酸的步驟。

本申請案的方法可更包括使如本申請案所述的葡萄糖磷酸變位酶、表現上述葡萄糖磷酸變位酶的微生物或表現上述葡萄糖磷酸變位酶的微生物的培養物與葡萄糖-1-磷酸（Glucose-1-phosphate）接觸而將上述葡萄糖-1-磷酸轉化成葡萄糖-6-磷酸的步驟。

本申請案的方法可更包括使如本申請案所述的葡萄糖磷酸化酶、表現上述葡萄糖磷酸化酶的微生物或表現上述葡萄糖磷酸化酶的微生物的培養物與葡萄糖接觸而將上述葡萄糖轉化成葡萄糖-6-磷酸的步驟。

本申請案的方法可更包括使如本申請案所述的α-葡聚糖磷酸化酶、澱粉磷酸化酶、麥芽糊精磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、表現上述磷酸化酶的微生物或表現上述磷酸化酶的微生物的培養物與澱粉、麥芽糊精、蔗糖或其組合接觸而將上述澱粉、麥芽糊精或蔗糖轉化成葡萄糖-1-磷酸的步驟。

本申請案的方法可更包括使α-澱粉酶、支鏈澱粉酶、葡萄糖澱粉酶、蔗糖酶或異澱粉酶、表現上述α-澱粉酶、支鏈澱粉酶、葡萄糖澱粉酶、蔗糖酶或異澱粉酶的微生物或表現上述α-澱粉酶、支鏈澱粉酶、葡萄糖澱粉酶、蔗糖酶或異澱粉酶的微生物的培養物與澱粉、麥芽糊精、蔗糖或其組合接觸而將上述澱粉、麥芽糊精或蔗糖轉化成葡萄糖的步驟。

本申請案的方法可更包括使如本申請案所述的4-α-葡聚糖轉移酶、表現上述4-α-葡聚糖轉移酶的微生物或表現上述4-α-葡聚糖轉移酶的微生物的培養物與葡萄糖接觸而將上述葡萄糖轉化成澱粉、麥芽糊精或蔗糖的步驟。

於本申請案的方法中，能夠以pH5.0至pH9.0的條件、30℃至80℃的溫度條件及/或0.5小時至48小時的條件執行各接觸。具體而言，本申請案的接觸可於pH6.0至pH9.0的條件或pH7.0至pH9.0的條件下執行。另外，本申請案的接觸可於35℃至80℃、40℃至80℃、45℃至80℃、50℃至80℃、55℃至80℃、60℃至80℃、30℃至70℃、35℃至70℃、40℃至70℃、45℃至70℃、50℃至70℃、55℃至70℃、60℃至70℃、30℃至65℃、35℃至65℃、40℃至65℃、45℃至65℃、50℃至65℃、55℃至65℃、30℃至60℃、35℃至60℃、40℃至60℃、45℃至60℃、50℃至60℃或55℃至60℃的溫度條件下執行。而且，本申請案的接觸可執行0.5小時至36小時、0.5小時至24小時、0.5小時至12小時、0.5小時至6小時、1小時至36小時、1小時至24小時、1小時至12小時、1小時至6小時、3小時至36小時、3小時至24小時、3小時至12小時、3小時至6小時、12小時至36小時或18小時至30小時。

於一實施例中，本申請案的接觸可於存在金屬、金屬離子或金屬鹽的條件下執行。

本申請案的又一實施方式是有關於一種塔格糖的製備方法，其包括使本申請案所述的用於生產塔格糖的組成物與澱粉、麥芽糊精、蔗糖或其組合及聚磷酸鹽（polyphosphate）接觸的步驟。

於本申請案的一具體例中，提供一種塔格糖的製備方法，其包括：使如本申請案所述的葡萄糖磷酸化酶、表現上述葡萄糖磷酸化酶的微生物或上述微生物的培養物與葡萄糖接觸而將上述葡萄糖轉化成葡萄糖-6-磷酸的步驟；使如本申請案所述的葡萄糖-6-磷酸-異構酶、表現上述葡萄糖-6-磷酸-異構酶的微生物或上述微生物的培養物與上述葡萄糖-6-磷酸（Glucose-6-phosphate）接觸而將上述葡萄糖-6-磷酸轉化成果糖-6-磷酸的步驟；使本申請案中所記載的果糖-6-磷酸-4-差向異構酶、表現上述果糖-6-磷酸-4-差向異構酶的微生物或上述微生物的培養物與上述果糖-6-磷酸（fructose-6-phosphate）接觸而將上述果糖-6-磷酸轉化成塔格糖-6-磷酸的步驟；使如本申請案所述的塔格糖-6-磷酸磷酸酶、表現上述塔格糖-6-磷酸磷酸酶的微生物或上述微生物的培養物與上述塔格糖-6-磷酸（tagatose-6-phosphate）接觸而將上述塔格糖-6-磷酸轉化成塔格糖的步驟。

上述各轉化反應可依序實施或以同一反應系統的原位（in situ）反應實施。於上述方法中，藉由上述磷酸磷酸酶自塔格糖-6-磷酸游離的磷酸被用作葡萄糖激酶的基質而用於生成葡萄糖-6-磷酸，因此磷酸不會堆積而可獲得較高的轉化率。

於上述方法的一例中，葡萄糖可藉由如下方式製備：使如本申請案所述的α-葡聚糖磷酸化酶、澱粉磷酸化酶、麥芽糊精磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、表現上述磷酸化酶的微生物或表現上述磷酸化酶的微生物的培養物與澱粉、麥芽糊精、蔗糖或其組合接觸而將上述澱粉、麥芽糊精或蔗糖轉化成葡萄糖。因此，上述具體例的方法可更包括將上述澱粉、麥芽糊精或蔗糖轉化成葡萄糖的步驟。

於本申請案的另一具體例中，提供一種塔格糖的製備方法，其包括如下：使如本申請案所述的葡萄糖磷酸變位酶、表現上述葡萄糖磷酸變位酶的微生物或上述微生物的培養物與葡萄糖-1-磷酸（Glucose-1-phosphate）接觸而將上述葡萄糖-1-磷酸轉化成葡萄糖-6-磷酸的步驟；使如本申請案所述的葡萄糖-6-磷酸-異構酶、表現上述葡萄糖-6-磷酸-異構酶的微生物或上述微生物的培養物與上述葡萄糖-6-磷酸（Glucose-6-phosphate）接觸而將上述葡萄糖-6-磷酸轉化成果糖-6-磷酸的步驟；使本申請案中所記載的果糖-6-磷酸-4-差向異構酶、表現上述果糖-6-磷酸-4-差向異構酶的微生物或上述微生物的培養物與上述果糖-6-磷酸（fructose-6-phosphate）接觸而將上述果糖-6-磷酸轉化成塔格糖-6-磷酸的步驟；使如本申請案所述的塔格糖-6-磷酸磷酸酶、表現上述塔格糖-6-磷酸磷酸酶的微生物或上述微生物的培養物與上述塔格糖-6-磷酸（tagatose-6-phosphate）接觸而將上述塔格糖-6-磷酸轉化成塔格糖的步驟。

上述各轉化反應可依序實施或以同一反應系統的原位反應實施。

於上述方法的一例中，葡萄糖-1-磷酸可藉由如下方式製備：使如本申請案所述的α-葡聚糖磷酸化酶、澱粉磷酸化酶、麥芽糊精磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、表現上述磷酸化酶的微生物或表現上述磷酸化酶的微生物的培養物與澱粉、麥芽糊精、蔗糖或其組合接觸而將上述澱粉、麥芽糊精或蔗糖轉化成葡萄糖-1-磷酸。因此，上述具體例的方法可更包括將上述澱粉、麥芽糊精或蔗糖轉化成葡萄糖-1-磷酸的步驟。此時，藉由磷酸磷酸酶自塔格糖-6-磷酸游離的磷酸被用作磷酸化酶的基質而用於生成葡萄糖-1-磷酸，因此磷酸不會堆積而可獲得較高的轉化率。

上述方法可更包括對所製備的塔格糖進行精製的步驟。上述精製並無特別限制，可使用於本申請案的技術領域內通常使用的方法。作為非限制性的示例，可列舉層析法、分步結晶及離子精製等。上述精製方法可僅實施一種方法，亦可一併實施兩種以上的方法。例如，可藉由層析法對塔格糖生成反應物進行精製，可利用欲分離的糖與附著於離子樹脂的金屬離子之間的弱結合力的差異執行藉由上述層析法進行的糖的分離。

另外，本申請案可更包括於本申請案的精製步驟前或精製步驟後實施脫色、脫鹽、或既實施脫色又實施脫鹽的步驟。藉由實施上述脫色及/或脫鹽，可無雜質地獲得更純淨的塔格糖反應物。

[發明效果]

本申請案的塔格糖製備方法因將葡萄糖或澱粉用作原料而較為經濟，因磷酸不會堆積而可獲得較高的轉化率，且因包括不可逆反應路徑的塔格糖-6-磷酸磷酸酶（tagatose-6-phosphate phosphatase）反應而可明顯地提高向塔格糖的轉化率。

另外，能夠以葡萄糖或澱粉為原料而藉由複合酶反應生產塔格糖，從而具有製備方法簡單、經濟且改善產率的優點。

以下，列舉實施例而詳細地對本申請案進行說明，但上述實施例僅為有助於理解本申請案者，本申請案並不限定於此。

實施例 1 ： 各酶的重 組表現 載體及 轉 形體的製 備

為了提供本申請案的作為塔格糖製備路徑中所需的耐熱性酶的α-葡聚糖磷酸化酶（α-glucan phosphorylase）、葡萄糖磷酸變位酶（phosphoglucomutase）、葡萄糖-6-磷酸-異構酶（glucose-6-phosphate-isomerase）、4-α-葡聚糖轉移酶（4-α-glucanotransferase），以作為嗜熱微生物的新阿波羅棲熱袍菌（Thermotoga neapolitana）或海棲熱袍菌的註冊於基因庫（Genbank）的基因序列為對象而選擇推測為上述酶的基因序列[按照上述酶的記載順序分別為序列號18（CT1）、序列號12（CT2）、序列號10（TN1）、序列號20（TN2）]。

基於所選擇的上述基因序列製作正向引子（forward primer，序列號21：CT1-Fp、序列號23：CT2-Fp、序列號25：TN1-Fp、序列號27：TN2-Fp）及反向引子（reverse primer，序列號22：CT1-Rp、序列號24：CT2-Rp、序列號26：TN1-Rp、序列號28：TN2-Rp）而進行合成，利用其而以新阿波羅棲熱袍菌的染色體DNA（基因組（genomic）DNA）為模板來藉由聚合酶鏈反應（PCR）擴增各酶的基因。使用限制酶NdeI及XhoI或SalI將擴增的各酶的基因插入至大腸桿菌表現用質體載體pET21a（Novagen公司）而製備分別命名為pET21a-CJ_ct1、pET21a-CJ_ct2、pET21a-CJ_tn1及pET21a-CJ_tn2的重組表現載體。

利用通常的轉形方法[參照Sambrook等人，1989]將上述表現載體轉形至大腸桿菌BL21（DE3）菌株而製備分別命名為大腸桿菌BL21（DE3）/pET21a-CJ_ct1、大腸桿菌BL21（DE3）/pET21a-CJ_ct2、大腸桿菌BL21（DE3）/pET21a-CJ_tn1及大腸桿菌BL21（DE3）/pET21a-CJ_tn2的轉形體（轉形微生物），並於2017年3月20日按照布達佩斯條約將上述轉形體分別以寄存編號KCCM11990P（大腸桿菌BL21（DE3）/pET21a-CJ_ct1）、KCCM11991P（大腸桿菌BL21（DE3）/pET21a-CJ_ct2）、KCCM11992P（大腸桿菌BL21（DE3）/pET21a-CJ_tn1）及KCCM11993P（大腸桿菌BL21（DE3）/pET21a-CJ_tn2）寄存至韓國微生物保存中心（Korean Culture Center of Microorganisms）。

實施例 2 ：重組 酶的製 備

將於實施例1中製備的表現各酶的大腸桿菌BL21（DE3）/pET21a-CJ_ct1、大腸桿菌BL21（DE3）/pET21a-CJ_ct2、大腸桿菌BL21（DE3）/pET21a-CJ_tn1及大腸桿菌BL21（DE3）/pET21a-CJ_tn2接種至裝有5 ml的溶菌酶肉湯（Lysozyme Broth，LB）液體培養基的培養管，於37℃的振盪培養器中進行種菌培養直至600 nm的吸光度成為2.0。

將種菌培養的該培養液接種至裝有LB液體培養基的培養燒瓶而進行正式培養。於600 nm的吸光度成為2.0時，添加1 mM的異丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside，IPTG）而誘導重組酶表現。上述培養過程中的攪拌速度為180 rpm，且培養溫度保持為37℃。於在4℃下以8,000×g對培養液進行20分鐘的離心分離後回收菌體。利用50 mM的Tris-HCl（pH值為8.0）緩衝溶液將所回收的菌體清洗2次，並利用相同的緩衝溶液進行懸浮，之後利用超音波細胞粉碎機對細胞進行粉碎。於在4℃下以13,000×g對細胞粉碎物進行20分鐘的離心分離後僅取出上清液，使用多聚組胺酸標籤（His-tag）親和層析法精製各酶。於利用50 mM的Tris-HCl（pH值為8.0）緩衝溶液對精製的重組酶液進行透析後用於反應。

藉由SDS-PAGE分析確認精製的各酶的分子量，根據結果，確認到CT1（α-葡聚糖磷酸化酶）為約96 kDa、CT2（葡萄糖磷酸變位酶）為約53 kDa、TN1（葡萄糖-6-磷酸-異構酶）為約51 kDa（參照圖1）。

實施例 3 ： 塔格糖 -6- 磷酸激 酶的果糖 -6- 磷酸 -4- 差向異構酶活性 的確認

3-1. 包括塔格糖 -6- 磷酸激 酶基因的重 組表現 載體及重 組 微生物的製 備 1

為了發掘新的耐熱性果糖-6-磷酸-4-差向異構酶（Fructose-6-phosphate-4-epimerase），以作為嗜熱微生物的嗜熱厭氧繩菌（Anaerolinea thermophila）的註冊於基因庫的基因序列為對象而選擇推測為上述酶的基因序列，基於上述微生物的胺基酸序列（序列號1）與鹼基序列（序列號2）資訊而插入至包括上述酶的鹼基序列的可表現於大腸桿菌中的重組載體pBT7-C-His（Bioneer公司）來製作命名為pBT7-C-His-an1的重組表現載體。藉由通常的轉形方法[參照Sambrook等人，1989]將上述表現載體轉形至大腸桿菌BL21（DE3）菌株而製備命名為大腸桿菌BL21（DE3）/pBT7-C-His-an1的轉形體（轉形微生物），並於2017年3月20日按照布達佩斯條約將上述轉形體以寄存編號KCCM11996P（大腸桿菌BL21（DE3）/pBT7-C-His-an1）寄存至韓國微生物保存中心（Korean Culture Center of Microorganisms）。

3-2. 包括塔格糖 -6- 磷酸激 酶基因的重 組表現 載體及重 組 微生物的製 備 2

為了提供果糖-6-磷酸-4-差向異構酶（Fructose-6-phosphate-4-epimerase），分別獲得來自作為嗜熱微生物的厭氧繩菌細菌（Anaerolineae bacterium）SG8_19或嗜熱圓錐網團菌（Dictyoglomus turgidum）的塔格糖-6-磷酸激酶基因資訊而製備可表現於大腸桿菌中的重組載體及轉形微生物。

具體而言，以註冊於基因庫及京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）的厭氧繩菌細菌SG8_19或嗜熱圓錐網團菌基因序列為對象而選擇塔格糖-6-磷酸激酶基因序列，基於上述兩種微生物的胺基酸序列（序列號3及序列號5）與鹼基序列（序列號4及序列號6）資訊而製備包括上述酶的鹼基序列的可表現於大腸桿菌中的重組載體pBT7-C-His-CJ_AB_F6P4E及pBT7-C-His-CJ_DT_F6P4E（Bioneer（股份有限公司），韓國）。

所製備的上述表現載體藉由通常的轉形方法[參照Sambrook等人，1989]轉形至大腸桿菌BL21（DE3）菌株而製備分別命名為大腸桿菌BL21（DE3）/pBT7-C-His-CJ_AB_F6P4E及大腸桿菌BL21（DE3）/pBT7-C-His-CJ_DT_F6P4E的轉形體（重組微生物），並於布達佩斯條約下將上述轉形體依次寄存至寄存機關（韓國微生物保存中心：Korean Culture Center of Microorganisms，KCCM）而被賦予寄存編號KCCM12093P（寄存日期2017年8月11日）及KCCM12110P（寄存日期2017年9月13日）。

3-3. 重組 塔格糖 -6- 磷酸激 酶的製 備

為了自所製備的上述重組微生物製備重組酶CJ_DT_F6P4E、CJ_AB_F6P4E及CJ_AN1_F6P4E，將各重組微生物接種至裝有包括有胺苄青黴素（ampicillin）抗生素的5 ml的LB液體培養基的培養管，於37℃的振盪培養器中進行種菌培養直至600 nm的吸光度成為2.0。將種菌培養的該培養液接種至裝有LB液體培養基的培養燒瓶而進行正式培養。於600 nm的吸光度成為2.0時，添加1 mM的IPTG（異丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷）而誘導重組酶表現。於180 rpm及37℃的條件下執行上述種菌培養及正式培養。於在4℃下以8,000×g對正式培養的培養液進行20分鐘的離心分離後回收菌體。利用25 mM的Tris-HCl（pH值為7.0）緩衝溶液將所回收的菌體清洗2次，並利用相同的緩衝溶液進行懸浮，之後利用超音波細胞粉碎機對細胞進行粉碎。於在4℃下以13,000×g對細胞粉碎物進行20分鐘的離心分離後僅取出上清液。於使用多聚組胺酸標籤親和層析法對上述上清液進行精製後，以填充劑的10倍的液量流加含有20 mM的咪唑及300 mM的NaCl的50 mM的NaH₂ PO₄ （pH值為8.0）緩衝溶液而去除可實現非特異性結合的蛋白質。其次，更流加含有250 mM的咪唑及300 mM的NaCl的50 mM的NaH₂ PO₄ （pH值為8.0）緩衝溶液進行溶出精製後，使用25 mM的Tris-HCl（pH值為7.0）緩衝溶液進行透析而獲得用以進行酶特性分析的精製酶CJ_DT_F6P4E、CJ_AB_F6P4E及CJ_AN1_F6P4E。

3-4. 重組 塔格糖 -6- 磷酸激 酶的果糖 -6- 磷酸 -4- 差向異構酶活性分析

對在上述實施例3-3中獲得的重組塔格糖-6-磷酸激酶的果糖-6-磷酸-4-差向異構化活性進行分析。具體而言，將1重量%的作為基質的果糖-6-磷酸懸浮至25 mM的Tris-HCl（pH值為7.0）緩衝溶液，添加精製的1 unit/ml的CJ_DT_F6P4E、CJ_AB_F6P4E及CJ_AN1_F6P4E而於60℃下反應1小時，之後為了去除磷酸，添加1 unit/ml的磷酸酶（NEB公司，鹼性磷酸酶（Alkaline phosphatase）、小牛場（Calf Intestinal））而於37℃下處理1小時。利用HPLC對反應產物進行分析，以使用SP0810（Shodex公司）管柱於80℃下以1 ml/min的流速流加流動相（水）的條件執行HPLC分析，利用示差折射率檢測器（Refractive Index Detector）對產物進行分析。

根據結果，可確認到CJ_DT_F6P4E、CJ_AB_F6P4E及CJ_AN1_F6P4E均具有將果糖-6-磷酸轉化成塔格糖-6-磷酸的活性（圖2至圖4）。

實施例 4 ： 塔格糖 -6- 磷酸磷酸酶（ D-tagatose-6-phosphate phosphatase ）的發掘

為了於本申請案的塔格糖製備路徑中藉由同步聚合酶反應自果糖-6-磷酸生產塔格糖而發掘可與塔格糖-6-磷酸激酶同時進行酶反應的塔格糖-6-磷酸磷酸酶。

4-1. 包括塔格糖 -6- 磷酸磷酸酶 基因的重 組表現 載體及重 組 微生物的製 備

以註冊於基因庫的海棲熱袍菌（Thermotoga maritima）基因序列為對象而選擇推測為塔格糖-6-磷酸磷酸酶的基因（序列號8，以下記載為t4）及胺基酸序列（序列號7），基於所選擇的上述基因序列製作正向引子（forward primer，序列號29）及反向引子（reverse primer，序列號30）而進行合成。利用上述引子以海棲熱袍菌的染色體DNA（基因組DNA）為模板而藉由聚合酶鏈反應（PCR）擴增t4基因。使用限制酶NdeI及XhoI將擴增的各酶基因插入至大腸桿菌表現用質體載體pET21a（Novagen公司）而製備重組表現載體，並命名為pET21a-CJ_t4。藉由熱衝擊（heat shock transformation，Sambrook與Russell：分子選殖（Molecular cloning），2001）將所製備的上述表現載體轉形至大腸桿菌BL21（DE3）菌株而製備重組微生物後，冷凍保管於50%甘油中待使用。將上述重組微生物命名為大腸桿菌BL21（DE3）/pET21a-CJ_t4，於2017年3月20日寄存至作為布達佩斯條約下的國際寄存機關的韓國微生物保存中心（Korean Culture Center of Microorganisms，KCCM）而被賦予寄存編號KCCM11994P。

4-2. 重組 塔格糖 -6- 磷酸磷酸酶的 製備

將大腸桿菌BL21（DE3）/pET21a-CJ_t4接種至裝有5 ml的LB液體培養基的培養管，於37℃的振盪培養器中進行種菌培養直至600 nm的吸光度成為2.0。將種菌培養的該培養液接種至裝有LB液體培養基的培養燒瓶而進行正式培養。於600 nm的吸光度成為2.0時，添加1 mM的IPTG而誘導重組酶表現。於180 rpm的攪拌速度及37℃下執行上述種菌培養及正式培養。於在4℃下以8,000×g對正式培養的培養液進行20分鐘的離心分離後回收菌體。利用50 mM的Tris-HCl（pH值為8.0）緩衝溶液將所回收的菌體清洗2次，利用相同的緩衝溶液進行懸浮，之後利用超音波細胞粉碎機對細胞進行粉碎。於在4℃下以13,000×g對細胞粉碎物進行20分鐘的離心分離後僅取出上清液，利用多聚組胺酸標籤親和層析法精製酶，之後於利用50 mM的Tris-HCl（pH值為8.0）緩衝溶液進行透析而使用，將精製的上述重組酶命名為CJ_T4。

4-3.CJ_T4 的塔格糖 -6- 磷酸磷酸酶 活性的分析

為了分析CJ_T4的活性，於將塔格糖-6-磷酸懸浮至50 mM的Tris-HCl（pH值為7.5）緩衝溶液後，添加精製的0.1 unit/ml的CJ_T4與10 mM的MgCl₂ 而於70℃下反應10分鐘，之後利用HPLC對反應產物進行分析。以使用HPX-87H（Bio-Rad公司）管柱於60℃下以0.6 ml/min的流速流加流動相（水）的條件執行HPLC分析，利用示差折射率檢測器對塔格糖與塔格糖-6-磷酸進行分析。

結果顯示，於反應產物中生成塔格糖，於在磷酸及塔格糖反應物中添加上述CJ_T4後進行相同的反應，結果未形成塔格糖。因此，可確認到CJ_T4具有不可逆的塔格糖-6-磷酸磷酸酶活性（圖7）。

實施例 5 ：藉由 同步聚合酶反應進行的塔格糖生 產

為了對藉由複合酶自果糖-6-磷酸生產塔格糖的活性進行分析，於包括1 unit/ml的CJ_t4（寄存編號：KCCM11994P）、1unit/ml的CJ_DT_F6P4E及25 mM的Tris-HCl（pH值為7.0）緩衝溶液的反應液中添加0.1%（w/v）果糖-6-磷酸而於60℃的溫度下反應1小時，之後利用HPLC對反應產物進行分析。以使用SP0810（Shodex公司）管柱於80℃下以1 ml/min的流速流加流動相的條件執行HPLC分析，利用示差折射率檢測器檢測塔格糖。

根據結果，確認到生成塔格糖，且可確認到藉由塔格糖-6-磷酸激酶與塔格糖-6-磷酸磷酸酶的同步聚合酶反應而可自果糖-6-磷酸生產塔格糖（圖5）。

實施例 6 ：藉由 同步聚合酶反應而自 麥 芽糊精生 產 塔格糖

為了對藉由複合酶而自麥芽糊精生產塔格糖的活性進行分析，於包括1 unit/ml的CT1、1 unit/ml的CT2、1 unit/ml的TN1、1 unit/ml的T4、1 unit/ml的CJ_AN1_F6P4E及20 mM至50 mM的磷酸鈉（sodium phosphate，pH值為7.0）的反應液中添加5%（w/v）麥芽糊精而於60℃的溫度下反應1小時，之後利用HPLC對反應產物進行分析。以使用SP0810（Shodex公司）管柱於80℃下以0.6 ml/min的流速流加流動相的條件執行HPLC分析，利用示差折射率檢測器檢測塔格糖。

根據結果，可確認到藉由所添加的CT1、CT2、TN1、T4及AN1的複合酶反應而自麥芽糊精生成塔格糖（圖6）。

無

圖1是表示藉由蛋白質電泳（十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis，SDS-PAGE））對使用於自澱粉、蔗糖或葡萄糖製備塔格糖的反應路徑的酶的分子量進行分析的結果。M為蛋白質大小測定標記（size marker，Bio-RAD，USA）。圖2是表示作為本申請案的一實施例的酶的CJ_AN1_F6P4E具有果糖-6-磷酸-4-差向異構酶活性的高效液相層析法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）的層析結果。圖3是表示作為本申請案的一實施例的酶的CJ_DT_F6P4E具有果糖-6-磷酸-4-差向異構酶活性的HPLC層析結果。圖4是表示作為本申請案的一實施例的酶的CJ_AB_F6P4E具有果糖-6-磷酸-4-差向異構酶活性的HPLC層析結果。圖5是表示於本申請案的一實施例中利用塔格糖-6-磷酸激酶（CJ_DT_F6P4E）及CJ_T4_T6PP對果糖-6-磷酸進行處理時轉化成塔格糖的HPLC層析結果。圖6是表示於同時添加本申請案的參與自麥芽糊精製備塔格糖的路徑的所有酶的情形時藉由複合酶反應生成塔格糖的HPLC層析結果，其中將CJ_AN1_F6P4E用作塔格糖-6-磷酸激酶。圖7是表示作為本申請案的酶的T4具有塔格糖-6-磷酸磷酸酶活性的HPLC層析結果。

[國外寄存資訊] 寄存編號：KCCM11990P 寄存日期：2017年3月20日寄存機關名：韓國微生物保存中心寄存編號：KCCM11991P 寄存日期：2017年3月20日寄存機關名：韓國微生物保存中心寄存編號：KCCM11992P 寄存日期：2017年3月20日寄存機關名：韓國微生物保存中心寄存編號：KCCM11993P 寄存日期：2017年3月20日寄存機關名：韓國微生物保存中心寄存編號：KCCM11994P 寄存日期：2017年3月20日寄存機關名稱：韓國微生物保存中心寄存編號：KCCM11996P 寄存日期：2017年3月20日寄存機關名：韓國微生物保存中心寄存編號：KCCM12093P 寄存日期：2017年8月11日寄存機關名：韓國微生物保存中心寄存編號：KCCM12110P 寄存日期：2017年9月13日寄存機關名：韓國微生物保存中心

＜110＞ CJ 第一製糖＜120＞製備塔格糖組成物與使用其生產塔格糖之方法＜130＞ P18-6045 ＜150＞ KR 17/0042165 ＜151＞ 2017-03-31 ＜160＞ 30 ＜170＞ KoPatentIn 3.0 ＜210＞ 1 ＜211＞ 429 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞果糖-6-磷酸 C4-差向異構酶(AN1),來自Anaerolinea thermophila ＜400＞ 1 Met Met Phe Gly Ser Pro Ala Pro Leu Leu Asp Met Val Thr Ala Gln 1 5 10 15 Lys Gln Gly Met Ala Arg Gly Ile Pro Ser Ile Cys Ser Ala His Pro 20 25 30 Val Val Leu Ser Ala Ala Cys His Leu Ala Arg Arg Ser Gly Ala Pro 35 40 45 Leu Leu Ile Glu Thr Thr Cys Asn Gln Val Asn His Gln Gly Gly Tyr 50 55 60 Ser Gly Met Thr Pro Ala Asp Phe Val Arg Phe Leu Arg Glu Ile Leu 65 70 75 80 Glu Arg Glu Gly Ile Pro Pro Gln Gln Val Ile Leu Gly Gly Asp His 85 90 95 Leu Gly Pro Tyr Pro Trp Arg Lys Glu Pro Ala Glu Thr Ala Ile Ala 100 105 110 Gln Ala Leu Glu Met Val Arg Ala Tyr Val Gln Ala Gly Tyr Thr Lys 115 120 125 Ile His Leu Asp Ala Ser Met Pro Cys Ala Asp Asp Asp Pro Glu Arg 130 135 140 Pro Leu Pro Leu Glu Arg Ile Ala Arg Arg Ala Ala Gln Leu Cys Ala 145 150 155 160 Ala Ala Glu Ala Ala Ala Gly Ala Val Gln Pro Val Tyr Val Ile Gly 165 170 175 Ser Glu Val Pro Pro Pro Gly Gly Ala Gln Gly Gln Glu Ala Arg Leu 180 185 190 His Val Thr Thr Pro Gln Glu Ala Gln Ala Ala Leu Asp Ala Phe Arg 195 200 205 Glu Ala Phe Leu Gln Ala Gly Leu Thr Pro Val Trp Glu Arg Val Ile 210 215 220 Ala Leu Val Val Gln Pro Gly Val Glu Phe Gly Val Asp Ser Ile His 225 230 235 240 Ala Tyr Gln Arg Glu Ala Ala Arg Pro Leu Lys Thr Phe Ile Glu Gly 245 250 255 Val Pro Gly Met Val Tyr Glu Ala His Ser Thr Asp Tyr Gln Thr Arg 260 265 270 Ala Ser Leu Arg Ala Leu Val Glu Asp His Phe Ser Ile Leu Lys Val 275 280 285 Gly Pro Ala Leu Thr Phe Ala Tyr Arg Glu Ala Val Phe Ala Leu Glu 290 295 300 His Ile Glu Arg Glu Ile Leu Gly Arg Gln Asp Met Pro Leu Ser Arg 305 310 315 320 Leu Ser Glu Val Leu Asp Glu Val Met Leu Asn Asp Pro Arg His Trp 325 330 335 Gln Gly Tyr Phe Ala Gly Ala Pro Ala Glu Gln Ala Leu Ala Arg Arg 340 345 350 Tyr Ser Phe Ser Asp Arg Ile Arg Tyr Tyr Trp His His Pro Ala Ala 355 360 365 Gln Glu Ala Val Arg Arg Leu Leu Ala Asn Leu Ile Glu Thr Pro Pro 370 375 380 Pro Leu Ser Leu Leu Ser Gln Tyr Leu Pro Arg Glu Tyr Glu Met Val 385 390 395 400 Arg Ala Gly Glu Ile Ser Ser His Pro Gln Asp Leu Ile Arg Ala His 405 410 415 Ile Gln His Thr Leu Glu Asp Tyr Ala Ala Ala Cys Gly 420 425 ＜210＞ 2 ＜211＞ 1278 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞果糖-6-磷酸-C4-差向異構酶(AN1)的DNA序列,來自Anaerolinea thermophila ＜400＞ 2 atgaccgcca ttttggaaaa tctcgccgcc gcgcgccgcg ccggcaaacc tgcgggcatc 60 acttcggtct gctcggccca ccccgttgtc ctgcgcgccg caatccgccg cgccgccgcc 120 agtcaaacgg ccgtactgat cgaggccacc tgcaatcagg tcaatcatct cggtggttat 180 accggcatga caccgcgtga cttcgttgcc ttcgtcaaca gcatcgccgc ggaagaagga 240 ctgcccgccg aactgctgat ctttggcggc gatcatctcg gccccaatcc ctggcgcagg 300 gagaaggccg aggacgcgct gacaaaagcc gccgccatgg tcgacgccta tgtcacagct 360 ggttttcgca agatccacct tgatgcatcg atgggctgcg ccggtgagcc ggcagccctg 420 gatgacgtca ccatcgccca ccgcgccgcg aaactcacag ccgttgccga aaaggcagcc 480 actgaggctg gcctgccaaa accgctttat attctgggca ccgaagtgcc ggtgcccggc 540 ggtgccgacc atgtgcttga gaccgtcgca ccgaccgaac cgcaggcggc gcgcaacacc 600 atcgatcttc atcgcgaaat ctttgcgcag cacggtcttt ccgatgcgtt cgaacgggtc 660 atcgcctttg tcgtgcagcc gggtgtggaa ttcggcagcg acaatgtcgt cgcttatgat 720 ccgcaggcag cgcagagcct gagcgccgtg ctggatggcg aaccgcgact ggtcttcgaa 780 gcccattcga ccgattacca gaccgagcct gcccttgcgg cactggtacg cgacggatat 840 ccgatcctca aagttggacc gggcctcacc ttcgcttacc gggaagcgct ttatgcactc 900 gacatgatcg cctccgaaat ggtcggcacc tatggcgacc gaccgctggc gcggactatg 960 gaaaaattga tgttaagcgc gccgggcgac tggcagggcc attaccatgg cgacgacatc 1020 acgctccgat tgcaacgcca ttacagctac agcgaccgca tccgttacta ctggacgcga 1080 ccggaagcgc tcgcggccgt ttccaccttg cataaggcac tggatgggaa gacaattccc 1140 gaaaccctgc tgcgccaata tctcggcgaa ttgccgctcg cggcggttgc gggaaaggaa 1200 ccggaggagg ttctggtcgc ggcggtggat caggtgctgg cgacctatca cgcggcgacg 1260 ggcgaaggcc gccactga 1278 ＜210＞ 3 ＜211＞ 443 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ CJ_AB_F6P4E的胺基酸序列,來自Anaerolineae bacterium ＜400＞ 3 Met Thr Arg Asn Ser Pro Leu Ser Glu Val Ile Ala Ala Gln Lys Arg 1 5 10 15 Gly Glu Ser Arg Gly Ile Ala Ser Ile Cys Ser Ala Asn Pro Trp Val 20 25 30 Ile Glu Ala Met Leu Gln Gln Ala Arg Ala Thr Gly Glu Pro Val Leu 35 40 45 Ile Glu Ser Thr Cys Asn Gln Val Asn Gln Phe Gly Gly Tyr Thr Gly 50 55 60 Trp Thr Pro Asp Gln Phe Met Ala Tyr Leu Arg Asp Leu Ala Pro Arg 65 70 75 80 Gln Glu Phe Pro Phe Asp His Ile Ile Val Gly Gly Asp His Leu Gly 85 90 95 Pro Ser Pro Trp Gln Asp Glu Pro Ala Ala Ile Ala Met Asp Lys Ala 100 105 110 Lys Ile Leu Ile Arg Asp Cys Val Arg Ala Gly Tyr Thr Lys Ile His 115 120 125 Leu Asp Ala Ser Met Lys Cys Ala Asp Asp Asp Pro His Arg Pro Leu 130 135 140 Asp Thr Arg Ile Ser Ala Ala Arg Ala Ala Glu Leu Ala Gln Val Ala 145 150 155 160 Glu Lys Ala Phe Ser Glu His Pro Pro Gly Gly Ala Pro Pro Tyr Tyr 165 170 175 Val Ile Gly Thr Glu Val Pro Leu Pro Gly Gly Val Gln Glu Gln Glu 180 185 190 Glu Gly Leu Ser Val Thr Ser Ile Gly Asp Val Ala Gly Thr Ile Glu 195 200 205 Ser Thr Lys Glu Ala Phe Phe Ala Arg Gly Leu Glu Arg Ala Trp Glu 210 215 220 Arg Val Ile Ala Val Val Val Gln Pro Gly Val Glu Tyr Gly Asp Ala 225 230 235 240 Thr Leu Phe Glu Tyr Asp Arg Ala Arg Ala Ala Asp Leu Ala Arg Phe 245 250 255 Ile Glu Gly Tyr Asp Gly Leu Ile Tyr Glu Ala His Ser Thr Asp Tyr 260 265 270 Gln Leu Ala Glu Ala Leu Arg Gln Leu Val Glu Asp His Phe Ala Ile 275 280 285 Leu Lys Val Gly Pro Ala Leu Thr Phe Ser Phe Arg Glu Gly Val Phe 290 295 300 Ala Leu Ala Ala Ile Glu Glu Glu Leu Leu Ala Gly Arg Gln Asp Val 305 310 315 320 Glu Pro Ser Arg Val Arg Glu Val Leu Asp Lys Thr Met Leu Ala Asn 325 330 335 Pro Ile Tyr Trp Gln Lys Tyr Tyr Gln Gly Asp Asp Gln Ala Val His 340 345 350 Leu Lys Arg Lys Tyr Ser Phe Ser Asp Arg Ser Arg Tyr Tyr Trp Pro 355 360 365 Val Pro Glu Val Gln Phe Ser Leu Ser Arg Leu Ile Gln Asn Leu Gly 370 375 380 Glu Gln Pro Leu Pro Leu Thr Leu Leu Ser Gln Tyr Leu Pro Val Gln 385 390 395 400 Tyr Ala Arg Ile Arg Gly Gly Glu Ile Ala Asn Val Pro Arg Ala Ile 405 410 415 Leu Leu Asp Lys Val Arg Ser Val Leu Ser Asp Tyr Ser Tyr Ala Cys 420 425 430 Gly Tyr Leu Thr Gly Pro Ala Arg Arg Asn Arg 435 440 ＜210＞ 4 ＜211＞ 1332 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ CJ_AB_F6P4E的核苷酸序列＜400＞ 4 atgactcgga actcgccctt atcagaggtg atcgctgccc agaaacgcgg cgagagcaga 60 gggatcgctt ccatatgctc ggccaatccc tgggtcatcg aggccatgct gcaacaggcc 120 cgcgcgaccg gcgaacctgt cctgatcgag tcgacctgca accaggtcaa tcaattcggc 180 ggctacaccg gttggacgcc ggatcaattc atggcctatc ttcgagattt ggcgccccgg 240 caagaatttc cctttgacca catcatcgtc ggcggcgatc atctcgggcc tagcccctgg 300 caagacgagc cggccgcgat agcgatggat aaggccaaga tcctgatccg ggattgcgtc 360 cgggcaggtt acaccaagat tcacctggac gccagcatga agtgcgccga cgacgatccc 420 catcggccgc tagataccag gatatctgcg gcccgggcgg ccgagctggc ccaggtggcc 480 gaaaaagcat tctccgagca cccaccaggc ggtgcgccgc cttattatgt gatcggcacc 540 gaggtgccct tgcccggtgg ggttcaggaa caggaggagg gattgagtgt taccagtata 600 ggcgacgtgg ccggaaccat tgaatcgacc aaagaagcct tttttgcacg aggcttagaa 660 agggcttggg aacgggtcat agccgtcgtg gtgcaacccg gcgtggagta tggtgatgcc 720 acgttatttg 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Ala Thr Pro His Gln Val Asn 35 40 45 Gln Phe Gly Gly Tyr Ser Gly Met Thr Pro Glu Asp Phe Lys Asn Phe 50 55 60 Val Met Lys Ile Ala Lys Glu Lys Gly Leu Glu Glu Asp Lys Ile Ile 65 70 75 80 Leu Gly Gly Asp His Leu Gly Pro Leu Pro Trp Gln Asp Glu Pro Ser 85 90 95 Pro Thr Ala Met Asn Lys Ala Lys Asp Leu Ile Arg Ala Phe Val Glu 100 105 110 Ser Gly Tyr Lys Lys Ile His Ile Asp Cys Ser Met Pro Leu Ser Asp 115 120 125 Asp Pro Lys Val Leu Pro Tyr Glu Lys Ile Ala Glu Arg Thr Arg Glu 130 135 140 Leu Phe Glu Ile Ala Glu Glu Thr Ala Arg Lys Tyr Asn Phe Gln Pro 145 150 155 160 Val Tyr Val Val Gly Thr Asp Val Pro Ile Ala Gly Gly Gly Glu Glu 165 170 175 Glu Gly Val Thr Ser Val Glu Asp Phe Arg Ser Ala Ile Ser Ser Leu 180 185 190 Lys Lys Tyr Phe Asn Asp Val Pro Asn Ile Trp Asp Arg Val Val Gly 195 200 205 Phe Val Ile Met Leu Gly Ile Gly Phe Ser Tyr Asp Lys Val Phe Glu 210 215 220 Tyr Asp Arg Asp Lys Val Arg Gly Ile Leu Glu Glu Val Lys Arg Glu 225 230 235 240 Asp Leu Phe Val Glu Gly His Ser Thr Asp Tyr Gln Ala Arg Tyr Ala 245 250 255 Leu Arg Asn Met Val Glu Asp Gly Val Arg Ile Leu Lys Val Gly Pro 260 265 270 Ala Leu Thr Ala Ala Phe Arg Arg Gly Val Phe Leu Leu Ser Asn Ile 275 280 285 Glu Asp Glu Ile Ile Pro Glu Arg Glu Arg Ser Asn Ile Lys Arg Val 290 295 300 Ile Leu Glu Thr Met Leu Arg Asp Asp Arg Tyr Trp Arg Lys Tyr Tyr 305 310 315 320 Lys Asp Ser Lys Arg Leu Glu Leu Asp Ile Trp Tyr Asn Leu Leu Asp 325 330 335 Arg Ile Arg Tyr Tyr Trp Glu Tyr Glu Asp Val Lys Met Val Leu Asn 340 345 350 Lys Leu Phe Glu Asn Phe Ser Glu Gly Val Asp Ile Lys Phe Ile Tyr 355 360 365 Gln Tyr Phe Tyr Asp Ser Tyr Phe Asp Val Arg Glu Gly Lys Met Lys 370 375 380 Asn Asp Pro Arg Glu Leu Ile Lys Lys Glu Ile Lys Arg Val Leu Glu 385 390 395 400 Asp Tyr Ser Tyr Ala Ile Asn Leu 405 ＜210＞ 6 ＜211＞ 1227 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ CJ_DT_F6P4E的核苷酸序列,來自Dictyoglomus thermophilum ＜400＞ 6 atgtggctaa gcaaagatta ccttaggaaa aagggagttt attctatatg cagttctaat 60 tcttatgtga ttgaggcaag tattgaattt gctaaggaaa aaggtgatta tatcctgatt 120 gaagcaactc ctcatcaagt gaatcagttt ggtggatatt caggaatgac tcctgaagat 180 tttaaaaatt ttgtaatgaa gatagcaaag gaaaagggtt tggaagaaga taagataatt 240 cttggggggg atcatttagg tccccttcct tggcaagatg aaccttcacc aacagcaatg 300 aataaggcga aggatcttat cagggctttc gtggaaagtg gctataagaa gatacatatt 360 gattgtagta tgcctctttc cgatgatcct aaagtgcttc cttatgaaaa aatagcagaa 420 agaacaagag agctttttga aattgccgaa gagactgcaa gaaaatataa ttttcagcct 480 gtatatgtgg taggaactga tgtgcctata gcaggaggtg gtgaagaaga aggagtaact 540 tctgtagagg attttagatc tgcaatctct tcattaaaga aatattttaa tgatgtccct 600 aatatatggg atagagtagt aggttttgta ataatgcttg gtataggatt tagttatgat 660 aaagtatttg aatatgatag ggataaagtg agaggtatat tggaagaggt gaaaagagaa 720 gacttatttg tagagggtca ttctaccgat taccaagcaa gatatgcatt aagaaatatg 780 gtagaagatg gagtaagaat tctgaaggtg ggtcctgctt taactgcagc ctttagaaga 840 ggagttttct tgcttagtaa tattgaggat gaaattatac ctgaaaggga aagatctaat 900 ataaagagag tcatacttga gacaatgcta agggatgata gatattggag aaagtattat 960 aaggattcga agaggttaga attagacatt tggtataact tattggatag aattaggtat 1020 tattgggagt atgaggatgt aaaaatggtt ttaaacaagc tttttgaaaa cttttcagag 1080 ggtgttgata ttaagtttat atatcaatat ttttatgatt catattttga tgtgagagaa 1140 ggaaaaatga agaatgatcc aagagaactt ataaaaaaag agataaaaag agttttggag 1200 gattatagct atgctataaa cttataa 1227 ＜210＞ 7 ＜211＞ 263 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞塔格糖-6-磷酸磷酸酶(T4),來自Thermotoga maritima ＜400＞ 7 Met Glu Gly Gly Ile Glu Leu Asp Arg Leu Asp Phe Ser Ile Lys Leu 1 5 10 15 Leu Arg Arg Val Gly His Phe Leu Met Leu His Trp Gly Lys Val Asp 20 25 30 Ser Val Glu Lys Lys Thr Gly Phe Lys Asp Ile Val Thr Glu Ile Asp 35 40 45 Lys Lys Ala Gln Glu Met Ile Val Glu Glu Ile Arg Lys Val Phe Pro 50 55 60 Asp Glu Asn Ile Ile Ala Glu Glu Gly Ile Ser Glu Asn Gly Lys Lys 65 70 75 80 Leu Trp Ile Ile Asp Pro Ile Asp Gly Thr Ile Asn Phe Val His Gly 85 90 95 Leu Pro Asn Phe Ser Ile Ser Ile Ala Tyr Val Glu Asn Gly Glu Val 100 105 110 Lys Met Gly Val Val His Ala Pro Ala Leu Asn Glu Thr Leu Tyr Ala 115 120 125 Glu 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tctcggagaa cggaaaaaaa 240 ctctggataa tagatcccat agacgggacg ataaacttcg ttcatggact tcccaacttt 300 tccatctcca tcgcttacgt ggagaatgga gaggtgaaga tgggagttgt gcacgctcct 360 gcactcaacg aaacactcta cgccgaagaa aacgggggtg cttttttgaa cggtgaaagg 420 atcagggtgt ctggaaacac aagtcttgaa gagtgcgtgg gatcaacggg aagctatgtg 480 gatttcaccg gaaagtttat cgagaagatg gaaaagaaaa caaggagagt gagaattctg 540 gggagtgcgg cgctgaacgc ctgctacgtg ggagcaggga gggtggattt cttcgtcact 600 tggaggatca atccgtggga catcgcagca ggcctgatag ttgtgaaaga ggcgggagga 660 acggtgacag attttgccgg aaaagaggca aacgttttct cgaagaattt tgtcttctcc 720 aacggactcg ttcacgaaga agttctcgaa gtggtgaacg aggttctgaa agagatagga 780 gaggggaagt ga 792 ＜210＞ 9 ＜211＞ 451 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞葡萄糖-6-磷酸異構酶(TN1),來自Thermotoga maritima ＜400＞ 9 Met Lys Lys Met Ala Leu Lys Phe Asp Phe Ser Asn Leu Phe Glu Pro 1 5 10 15 Asn Ile Ser Gly Gly Leu Arg Glu Glu Asp Leu Glu Ser Thr Lys Glu 20 25 30 Lys Val Ile Glu Ala Ile Lys Asn Phe Thr Glu Asn Thr Pro Asp Phe 35 40 45 Ala Arg Leu 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maritima ＜400＞ 10 atgaaaaaga tggctttgaa atttgatttt tcaaatcttt ttgaaccgaa catctccggt 60 ggactgagag aggaagatct ggaaagcaca aaagaaaagg tgatagaggc gataaagaat 120 ttcactgaga acacaccgga ttttgccaga ctggacagaa aatggatcga ttcggtgaag 180 gaactcgagg agtgggtggt gaacttcgac acggtggtcg ttctgggaat tgggggatcc 240 ggtcttggaa accttgccct tcattattcg ttgagaccac tgaactggaa cgagatgtcg 300 agagaggaaa gaaacggtta tgcgagagtc ttcgtggtgg acaacgtaga tcccgatctc 360 atggcctccg tccttgatag gatagatctg aagacaacgc tgttcaacgt gatctcaaaa 420 tctggatcca cggctgaggt tatggcgaat tactcgatcg caaggggaat cctggaggct 480 aatggtctgg acccgaaaga acacatcctc atcacaacag atccagagaa gggctttttg 540 agaaaagtag tgaaagaaga gggcttcaga agtcttgagg tccctcccgg cgttggagga 600 aggttcagcg tgctgacgcc cgttggcctc ttctctgcca tggcggaggg tatcgacata 660 gaagaactcc acgacggtgc ccgggatgcg ttcgagagat gcaagaagga agacctgttc 720 gaaaatccag cggcgatgat cgccctcaca cactatctct atctgaagag aggaaagagc 780 atctccgtca tgatggccta ctccaacagg atgacctacc tcgtggactg gtacagacag 840 ctgtgggcag aaagtctggg aaagagatac aacctgaaag gagaggaggt cttcacgggt 900 cagaccccgg tgaaggcaat aggagccacc gatcagcact ctcagataca gctttacaac 960 gagggcccaa acgacaaagt gataacgttt ttgcggttgg aaaacttcga tagagagatc 1020 ataataccgg acaccggaag agaagagctc aaataccttg caagaaaaag actctctgaa 1080 cttctccttg cagaacagac aggaacagag gaagccctaa ggaaaaacga cagaccgaac 1140 atgaaggtga tcttcgacag actcacctct tacaatgtgg gccagttctt cgcttattat 1200 gaagccgcaa ctgctttcat ggggtatctc ctcgagatca acccgtttga tcagccgggt 1260 gtggaacttg gaaagaagat cacgtttgcc ctcatgggaa gggaaggtta cgaatacgaa 1320 ataaaagatc gcaccaagaa ggtgatcata gaatga 1356 ＜210＞ 11 ＜211＞ 471 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞磷酸變位酶(CT2),來自Thermotoga neapolitana ＜400＞ 11 Met Ile Leu Phe Gly Thr Gly Gly Ile Arg Gly Val Met Arg Lys Gly 1 5 10 15 Glu Phe Asp Glu Asp Thr Val Lys Arg Ala Ser Leu Ser Val Ala Phe 20 25 30 Trp Met Lys Gln Arg Lys Leu Lys Ser Val Val Ile Ala Tyr Asp Thr 35 40 45 Arg Lys Asn Ser Arg Glu Phe Ala Glu Leu Ala Gly Arg Val Phe Ala 50 55 60 Gly 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＜213＞人工序列＜220＞＜223＞磷酸變位酶(CT2)的DNA序列,來自Thermotoga neapolitana ＜400＞ 12 atgatcctgt ttggaacggg tggaattcga ggtgtgatga gaaagggaga gttcgatgag 60 gacacggtga agagggcttc actgagcgtc gccttctgga tgaaacagag aaaactgaaa 120 agcgttgtga tcgcctacga cacgagaaaa aactccagag agttcgcaga gcttgccgga 180 agggtcttcg caggtgaagg aatagaagcc tacgtgtttc cagaaccaac gccaacaccg 240 gttctctctt tcgcagtgag gcacatgaag gccggtgccg gtgttgtcat aacagcgagt 300 cacaatcctc cagaatacaa cggatacaag gtttacacct gggatggcgt tcaggcaata 360 ccagagtaca cggacgagat caccgaaata tacaaaaagg tcgatatctc cggagtgagg 420 gagggaggtt tcaaacacgt accttccgag gtgaaggaga gttacataga gaaagtggtt 480 gagatagtct cgaaccttcc aagaagaacg gaccttgacg ttgcctactc tccactccat 540 ggaacgggag caaactatgt tccggaggtt ttgagaagac tcggtttcaa agtgagacct 600 gtggaagaac agatgaaacc cgatccaaac ttctccacag tcccaactcc aaatcccgaa 660 gaagatgaag cgctcgtttt gctgaacaaa aaggaagcga cccttggact tgcaaccgac 720 ccggactgcg acagggtggg agtggtgtac agaggaagaa ggctcacagg aaaccaggtt 780 ggagtgctcc ttacggactt tctcctcgaa cacgtgaagg tagaaaaccc tctcgtgata 840 aaaacgatcg tcaccacgga catggtgagg cccatctgtg aggaaagggg tgcctatctc 900 gaagaaacac caacaggttt caaattcatc ggtcatttga tagaagaaca cacaaagaaa 960 ggtgacagaa acttcgtctt tggtttcgag gaaagctgtg gatacctcgc aggagaccac 1020 gcaagggaca aagatggtgt tgtgggaagt gtcctctctg cgatagcctt cagcaactac 1080 gacccgtacg aaaaactcga agaactctac agaaagtacg gttactacat ggaaaaactc 1140 atcaacttca agttcgaaga cgtcagcaaa gcgatagaaa tatacaactc cctgaaagag 1200 tacgatggaa taatcgatta ctccagaggt tacaaaggaa taattccaaa cgaaaccata 1260 gccttcgtgt tcgaaaaatc cagaatcttc gtcagaccat ctggaacaga accgaagctc 1320 aaggtgtaca tccacgtgag aggggacaca agggaagagt cagagaatct gatgaaggaa 1380 agtgaaagaa agatcaggga gatcctgaaa ctgtga 1416 ＜210＞ 13 ＜211＞ 270 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞多磷酸依賴型葡萄糖激酶CJ dg ppgk ＜400＞ 13 Met Leu Ala Ala Ser Asp Ser Ser Gln His Gly Gly Lys Ala Val Thr 1 5 10 15 Leu Ser Pro Met Ser Val Ile Leu Gly Ile Asp Ile Gly Gly Ser Gly 20 25 30 Ile Lys Gly Ala Pro Val Asp Thr Ala Thr Gly 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cgtcgcaaca 720 acacgtaccc gcctggtgcc cgctgccctc cagaacgagg ccggaatcgt gggggccgcg 780 atggtggcgg cgcagcggtc acagggggac taa 813 ＜210＞ 15 ＜211＞ 253 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞多磷酸依賴型葡萄糖激酶CJ at ppgk ＜400＞ 15 Met Gly Arg Gln Gly Met Glu Ile Leu Gly Ile Asp Ile Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Ile Lys Gly Ala Pro Val Asp Val Glu Thr Gly Gln Leu Thr Ala 20 25 30 Glu Arg Tyr Arg Leu Pro Thr Pro Glu Asn Ala Leu Pro Glu Glu Val 35 40 45 Ala Leu Val Val Ala Gln Ile Val Glu His Phe Gln Trp Lys Gly Arg 50 55 60 Val Gly Ala Gly Phe Pro Ala Ala Ile Lys His Gly Val Ala Gln Thr 65 70 75 80 Ala Ala Asn Ile His Pro Thr Trp Ile Gly Leu His Ala Gly Asn Leu 85 90 95 Phe Ser Glu Lys Cys Gly Cys Pro Val Ser Val Leu Asn Asp Ala Asp 100 105 110 Ala Ala Gly Leu Ala Glu Met Ile Phe Gly Ala Gly Lys Gly Gln Lys 115 120 125 Gly Val Val Leu Met Ile Thr Ile Gly Thr Gly Ile Gly Thr Ala Leu 130 135 140 Phe Thr Asp Gly Ile Leu Val Pro Asn Thr Glu Leu Gly His Ile Glu 145 150 155 160 Ile Arg Gly Lys Asp Ala Glu Gln Arg Ser Ser Glu Ala Ala Arg Gln 165 170 175 Arg Lys Asp Trp Thr Trp Gln Gln Trp Ala Lys Arg Leu Asn Glu His 180 185 190 Leu Glu Arg Leu Glu Ala Leu Phe Trp Pro Asp Leu Phe Ile Leu Gly 195 200 205 Gly Gly Ala Val Lys Asn His Glu Lys Phe Phe Pro Tyr Leu Lys Leu 210 215 220 Arg Thr Pro Phe Val Ala Ala Lys Leu Gly Asn Leu Ala Gly Ile Val 225 230 235 240 Gly Ala Ala Trp Tyr Ala His Thr Gln Glu Thr Gln Ala 245 250 ＜210＞ 16 ＜211＞ 762 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞多磷酸依賴型葡萄糖激酶CJ at ppgk的DNA序列＜400＞ 16 atggggaggc agggcatgga aattttaggg attgatatcg gaggatccgg catcaaaggg 60 gctccggtgg atgtagaaac cggccagtta accgccgagc gataccgctt acccaccccc 120 gaaaatgcct tacctgaaga agtggctctg gtagttgccc aaattgtcga acactttcag 180 tggaaaggtc gtgtaggggc aggatttcct gctgccatca agcacggcgt ggcacagacg 240 gccgcaaaca tccaccctac atggattgga cttcatgctg gcaacctttt cagcgaaaaa 300 tgcggatgtc ctgtctcagt gttgaatgat gcggatgctg ccggactggc ggaaatgatc 360 tttggggcag gaaaaggcca gaaaggggtg gtgctgatga ttaccattgg cactggcatc 420 gggacagccc tgttcaccga tgggatattg gtccctaata ccgagttggg acatattgaa 480 attcggggca aagatgccga acagcgctct tcggaagccg cccgccagcg gaaggattgg 540 acctggcaac aatgggcaaa gcgtctgaat gagcatttgg agcgcctgga agccctgttc 600 tggcccgatt tattcatcct tggtggaggg gcagtaaaaa atcatgaaaa gttcttccct 660 tatctaaaac tgcgtactcc ctttgttgca gcaaaattgg ggaatctggc tgggattgta 720 ggcgcagcgt ggtatgctca cacccaggaa acgcaagcct ga 762 ＜210＞ 17 ＜211＞ 823 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ α-葡聚糖磷酸化酶(CT1),來自Thermotoga neapolitana ＜400＞ 17 Met Leu Lys Lys Leu Pro Glu Asn Leu Glu His Leu Glu Glu Leu Ala 1 5 10 15 Tyr Asn Leu Trp Trp Ser Trp Ser Arg Pro Ala Gln Arg Leu Trp Arg 20 25 30 Lys Ile Asp Pro Glu Gly Trp Glu Glu His Arg Asn Pro Val Lys Ile 35 40 45 Leu Lys Glu Val Ser Asp Glu Arg Leu Glu Glu Leu Ser Lys Asp Asp 50 55 60 Asp Phe Ile Ser Leu Tyr Glu Leu Thr Ile Glu Arg Phe Lys Asp Tyr 65 70 75 80 Met Glu Lys Glu Asp Thr Trp Phe Asn Val Asn Tyr Pro Glu Trp Asp 85 90 95 Glu Lys Ile Val Tyr Met Cys Met Glu Tyr Gly Leu Thr Lys Ala Leu 100 105 110 Pro Ile Tyr Ser Gly Gly Leu Gly Ile Leu Ala Gly Asp His Leu Lys 115 120 125 Ser Ala Ser Asp Leu Gly Leu Pro Leu Ile Ala Ile Gly Leu Leu Tyr 130 135 140 Lys His Gly Tyr Phe Thr Gln Gln Ile Asp Arg Asp Gly Lys Gln Ile 145 150 155 160 Glu Ile Phe Pro Asp Tyr Asn Pro Glu Asp Leu Pro Met Lys Pro Leu 165 170 175 Lys Asp Glu Lys Gly Asn Gln Val Ile Val Glu Val Pro Leu Asp Ser 180 185 190 Thr Val Val Lys Ala Arg Val Phe Glu Val Lys Val Gly Arg Val Ser 195 200 205 Leu Tyr Leu Leu Asp Pro Asp Ile Glu Glu Asn Glu Glu Arg Tyr Arg 210 215 220 Lys Ile Cys Asn Tyr Leu Tyr Asn Pro Glu Pro Asp Val Arg Val Ser 225 230 235 240 Gln Glu Ile Leu Leu Gly Ile Gly Gly Met Lys Leu Leu Arg Ala Leu 245 250 255 Asn Leu Lys Pro Gly Val Ile His Leu Asn Glu Gly His Pro Ala Phe 260 265 270 Ser Ser Leu Glu Arg Ile Lys Asn Tyr Met Glu Glu Gly Tyr Ser Phe 275 280 285 Thr Glu Ala Leu Glu Ile Val Arg Gln Thr Ser Val Phe Thr Thr His 290 295 300 Thr Pro Val Pro Ala Gly His Asp Arg Phe Pro Phe Asp Leu Val Glu 305 310 315 320 Lys Lys Leu Ser Lys Phe Phe Glu Gly Phe Glu Lys Arg Asn Leu Leu 325 330 335 Met Asp Leu Gly Lys Asp Glu Thr Gly Ser Phe Asn Met Thr Tyr Leu 340 345 350 Ala Leu Arg Thr Ser Ser Phe Ile Asn Gly Val Ser Lys Leu His Ala 355 360 365 Glu Val Ser Arg Arg Met Phe Lys Asn Val Trp Gln Gly Val Pro Val 370 375 380 Glu Glu Ile Pro Ile Glu Gly Ile Thr Asn Gly Val His Met Gly Thr 385 390 395 400 Trp Ile Asn Arg Glu Met Arg Lys Leu Tyr Asp Arg Tyr Leu Gly Arg 405 410 415 Val Trp Arg Asp His Thr Asp Leu Glu Gly Ile Trp Tyr Gly Val Asp 420 425 430 Arg Ile Pro Asp Glu Glu Leu Trp Gln Ala His Leu Arg Ala Lys Lys 435 440 445 Arg Phe Ile Glu Tyr Ile Lys Glu Ser Val Arg Arg Arg Asn Glu Arg 450 455 460 Leu Gly Ile Asp Glu Asp Val Pro Asn Ile Asp Glu Asn Ser Leu Ile 465 470 475 480 Ile Gly Phe Ala Arg Arg Phe Ala Thr Tyr Lys Arg Ala Val Leu Leu 485 490 495 Leu Ser Asp Leu Glu Arg Leu Lys Lys Ile Leu Asn Asp Pro Glu Arg 500 505 510 Pro Val Tyr Val Val Tyr Ala Gly Lys Ala His Pro Arg Asp Asp Ala 515 520 525 Gly Lys Glu Phe Leu Lys Arg Ile Tyr Glu Val Ser Gln Met Pro Glu 530 535 540 Phe Lys Asn Arg Ile Ile Val Leu Glu Asn Tyr Asp Ile Gly Met Ala 545 550 555 560 Arg Leu Met Val Ser Gly Val Asp Val Trp Leu Asn Asn Pro Arg Arg 565 570 575 Pro Met Glu Ala Ser Gly Thr Ser Gly Met Lys Ala Ala Ala Asn Gly 580 585 590 Val Leu Asn Ala Ser Val Tyr Asp Gly Trp Trp Val Glu Gly Tyr Asn 595 600 605 Gly Arg Asn Gly Trp Val Ile Gly Asp Glu Ser Val Leu Pro Glu Thr 610 615 620 Glu Val Asp Asp Pro Arg Asp Ala Glu Ala Leu Tyr Asp Leu Leu Glu 625 630 635 640 Asn Glu Ile Ile Pro Thr Tyr Tyr Glu Asn Lys Glu Lys Trp Ile Phe 645 650 655 Met Met Lys Glu Ser Ile Lys Ser Val Ala Pro Arg Phe Ser Thr Thr 660 665 670 Arg Met Leu Lys Glu Tyr Thr Glu Lys Phe Tyr Ile Lys Gly Leu Val 675 680 685 Asn Lys Glu Trp Leu Glu Arg Lys Glu Asn Ala Glu Arg Phe Gly Ala 690 695 700 Trp Lys Glu Arg Ile Leu Arg Asn Trp Ser Ser Val Ser Ile Glu Arg 705 710 715 720 Ile Val Leu Glu Asp Thr Arg Ser Val Glu Val Thr Val Lys Leu Gly 725 730 735 Asp Leu Ser Pro Asp Asp Val Leu Val Glu Leu Leu Ile Gly Arg Gly 740 745 750 Glu Ser Met Glu Asp Leu Glu Ile Trp Lys Val Ile Gln Ile Arg Lys 755 760 765 His Arg Arg Glu Gly Asp Leu Phe Ile Tyr Ser Tyr Val Asn Gly Ala 770 775 780 Leu Gly His Leu Gly Ser Pro Gly Trp Phe Tyr Ala Val Arg Val Leu 785 790 795 800 Pro Tyr His Pro Lys Leu Pro Thr Arg Phe Leu Pro Glu Ile Pro Val 805 810 815 Val Trp Lys Lys Val Leu Gly 820 ＜210＞ 18 ＜211＞ 2472 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ α-葡聚糖磷酸化酶(CT1)的DNA序列,來自Thermotoga neapolitana ＜400＞ 18 atgctgaaga aactcccgga gaatctggag catctggaag aactcgccta caacctctgg 60 tggagctggt ctaggcccgc tcagagactc tggagaaaga tagatccgga aggctgggag 120 gaacacagaa accccgttaa aatactgaaa gaagtttctg atgaaaggct cgaagaactt 180 tcaaaagatg atgatttcat atccctctac gaactcacca ttgaaaggtt caaggattac 240 atggagaaag aagacacctg gttcaacgtg aactaccccg aatgggacga gaagatcgtc 300 tacatgtgta tggagtacgg tttgaccaaa gcccttccga tctactccgg tggtcttgga 360 atcctcgcgg gagaccatct caaatccgca agcgatcttg gacttcctct catagcgatc 420 ggacttctct acaaacatgg atatttcacc cagcagatcg acagagatgg aaaacagata 480 gagattttcc ctgattacaa cccagaggac ttacccatga agcccctgaa ggatgaaaag 540 ggaaaccagg tgatcgtgga ggttcctctc gacagtaccg tggtgaaggc acgtgttttt 600 gaagtgaagg taggaagggt gagtctgtac ctgctcgatc cggacatcga ggaaaacgag 660 gaacgataca gaaagatctg caactacctt tacaacccgg aacccgatgt gagggtctcc 720 caggagatac tcctcggaat tgggggaatg aagcttctca gggctctgaa cctgaaacca 780 ggagtcatcc atctgaacga aggacatccg gcgttctctt ccctcgaaag gataaagaac 840 tacatggaag aaggatattc cttcacagag gcccttgaga tcgtgagaca gacgagtgtg 900 tttacaaccc acacacccgt tcccgctgga cacgacagat ttccctttga cctcgtggaa 960 aagaaacttt cgaaattctt cgaaggattc gaaaagagaa atcttctcat ggatcttggg 1020 aaagatgaaa caggcagttt caacatgacg tatcttgccc tgagaacgtc ctctttcata 1080 aacggcgtga gcaaactgca tgcggaagtt tccagaagga tgttcaaaaa cgtgtggcag 1140 ggtgttcccg tggaggaaat accgatcgaa gggataacga acggcgttca catgggaacc 1200 tggatcaacc gtgagatgag aaaactgtac gacagatatc tcggaagggt atggagagat 1260 cacaccgacc ttgagggtat ctggtacggt gttgacagga ttccagatga agaactctgg 1320 caggctcacc tgagggcaaa gaagagattc atcgagtaca taaaagaatc ggtaagaaga 1380 agaaacgaga gactgggaat cgacgaagat gtgccgaaca tcgatgaaaa ttcgctcatc 1440 ataggttttg caagaaggtt tgccacttac aagagggcag ttctcctgct cagcgatctg 1500 gagagactca agaagatcct caacgatcca gaaagacccg tttacgtggt ctatgcgggg 1560 aaggcccatc caagggacga tgcggggaag gaatttttga aacgcatcta cgaagtctcg 1620 cagatgcctg agttcaaaaa caggatcatc gtactggaaa actacgacat tggaatggca 1680 cggctcatgg tgtcgggagt ggatgtgtgg ctgaacaacc cgagaagacc catggaagca 1740 agtggaacaa gcggaatgaa ggcagcagcc aacggagttc ttaacgcgag tgtttacgat 1800 ggatggtggg ttgaagggta caacggcaga aacggctggg tcataggcga tgaaagcgtt 1860 cttccagaga cggaagtgga cgatcccagg gacgcagaag cactctacga tctcctcgaa 1920 aacgaaatca tcccaaccta ctacgaaaac aaagaaaagt ggatcttcat gatgaaagag 1980 agcataaaga gtgttgctcc aagattcagc accaccagaa tgctcaaaga atacacggag 2040 aagttctaca taaagggact tgtgaacaaa gaatggcttg aaagaaaaga aaacgccgaa 2100 aggtttggtg catggaagga aaggatcctc agaaactgga gcagcgtttc catagaaaga 2160 atcgtccttg aggacacaag gagtgttgag gtgacggtga aactgggaga cctttcacct 2220 gatgatgtac tggttgaact tttgattgga agaggagaaa gcatggaaga tctggagatc 2280 tggaaggtga tacagataag aaagcacaga agggaagggg atctgttcat ctacagttat 2340 gtcaacggtg ccctcggtca tcttggctct ccgggatggt tctacgcggt gagggtgcta 2400 ccttatcatc cgaaacttcc caccagattc ttgccggaga tacctgtggt gtggaaaaag 2460 gttctcgggt ga 2472 ＜210＞ 19 ＜211＞ 441 ＜212＞ PRT ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ 4-α-葡聚糖轉移酶(TN2),來自Thermotoga maritima ＜400＞ 19 Met Ile Gly Tyr Gln Ile Tyr Val Arg Ser Phe Arg Asp Gly Asn Phe 1 5 10 15 Asp Gly Val Gly Asp Phe Lys Gly Leu Lys Gly Ala Ile Ser Tyr Leu 20 25 30 Lys Glu Leu Gly Val Asp Phe Val Trp Leu Met Pro Val Phe Ser Ser 35 40 45 Ile Ser Phe His Gly Tyr Asp Val Val Asp Phe Tyr Ser Phe Lys Ala 50 55 60 Glu Tyr Gly Asp Glu Lys Asp Phe Arg Glu Met Ile Glu Ala Phe His 65 70 75 80 Asp Asn Gly Ile Lys Val Val Leu Asp Leu Pro Ile His His Thr Gly 85 90 95 Phe Leu His Val Trp Phe Gln Lys Ala Leu Lys Gly Asp Pro His Tyr 100 105 110 Arg Asp Tyr Tyr Val Trp Ala Ser Glu Lys Thr Asp Leu Asp Glu Arg 115 120 125 Arg Glu Trp Asp Asn Glu Arg Ile Trp His Pro Leu Glu Asp Gly Arg 130 135 140 Phe Tyr Arg Gly Leu Phe Gly Pro Leu Ser Pro Asp Leu Asn Tyr Asp 145 150 155 160 Asn Pro Gln Val Phe Glu Glu Met Lys Lys Val Val Tyr His Leu Leu 165 170 175 Glu Met Gly Val Asp Gly Phe Arg Phe Asp Ala Ala Lys His Met Arg 180 185 190 Asp Thr Leu Glu Gln Asn Val Arg Phe Trp Arg Tyr Phe Leu Ser Asp 195 200 205 Ile Glu Gly Ile Phe Leu Ala Glu Ile Trp Ala Glu Ser Lys Val Val 210 215 220 Asp Glu His Gly Arg Ile Phe Gly Tyr Met Leu Asn Phe Asp Thr Ser 225 230 235 240 His Cys Ile Lys Glu Ala Val Trp Lys Glu Asn Phe Lys Val Leu Ile 245 250 255 Glu Ser Ile Glu Arg Ala Leu Val Gly Lys Asp Tyr Leu Pro Val Asn 260 265 270 Phe Thr Ser Asn His Asp Met Ser Arg Leu Ala Ser Phe Glu Gly Gly 275 280 285 Leu Ser Glu Glu Lys Val Lys Leu Ser Leu Ser Ile Leu Phe Thr Leu 290 295 300 Pro Gly Val Pro Leu Ile Phe Tyr Gly Asp Glu Leu Gly Met Lys Gly 305 310 315 320 Ile Tyr Arg Lys Pro Asn Thr Glu Val Val Leu Asp Pro Phe Pro Trp 325 330 335 Ser Glu Asn Met Cys Val Glu Gly Gln Thr Phe Trp Lys Trp Pro Ala 340 345 350 Tyr Asn Asp Pro Phe Ser Gly Val Ser Val Glu Tyr Gln Arg Arg Asn 355 360 365 Arg Asp Ser Ile Leu Ser His Thr Met Arg Trp Ala Gly Phe Arg Gly 370 375 380 Glu Asn His Trp Leu Asp Arg Ala Asn Ile Glu Phe Leu Cys Lys Glu 385 390 395 400 Glu Lys Leu Leu Val Tyr Arg Leu Val Asp Glu Gly Arg Ser Leu Lys 405 410 415 Val Ile His Asn Leu Ser Asn Gly Glu Met Val Phe Glu Gly Val Arg 420 425 430 Val Gln Pro Tyr Ser Thr Glu Val Val 435 440 ＜210＞ 20 ＜211＞ 1326 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ 4-α-葡聚糖轉移酶(TN2)的DNA序列,來自Thermotoga maritima ＜400＞ 20 atgataggct accagatcta cgtgagatca ttcagggatg gaaacttcga tggtgtgggg 60 gatttcaaag gattgaaagg tgcgatttcc tacctgaaag aactgggtgt tgattttgtc 120 tggctcatgc ccgtcttttc ctccatttcc ttccacgggt atgacgtggt ggatttttat 180 tctttcaaag ccgagtacgg agacgagaaa gactttagag agatgatcga ggcgttccac 240 gacaacggta taaaagtcgt tctcgatctt cccatccatc atactggttt cctccatgtg 300 tggtttcaga aagccctgaa aggagatcca cactacaggg attattacgt atgggcgagt 360 gaaaaaacgg atctggacga aagaagagag tgggacaacg aaaggatctg gcatcctctg 420 gaggacggaa ggttctacag aggacttttc ggtcccctct cacccgatct gaactacgat 480 aacccgcagg tttttgaaga gatgaagaag gtggtttatc accttcttga aatgggagtg 540 gacggattca gattcgacgc agcaaagcac atgagagata ctctggaaca gaacgttcgc 600 ttttggaggt atttcctctc cgatattgag ggaatattcc ttgcggaaat ctgggcagaa 660 tccaaagttg tggatgaaca cggcaggata ttcggctaca tgctaaattt cgatacctca 720 cactgtatta aggaagcggt gtggaaggaa aacttcaaag tgttgatcga gtcgatcgaa 780 agggccctgg ttggaaaaga ttatctgccg gtgaacttca catcgaacca tgatatgtca 840 aggcttgcga gtttcgaagg agggttgagt gaagagaagg tgaaactctc actttccatt 900 ctgttcacgc ttcccggggt tcctctcata ttctacggag acgaactggg aatgaaagga 960 atctatcgaa aaccgaacac ggaagtcgtg ctggatccgt tcccctggag cgaaaacatg 1020 tgtgttgaag gccagacatt ttggaaatgg cccgcgtata acgatccatt ctccggtgtt 1080 tctgttgagt atcagaggag aaatcgtgat tcgattctct cacacacgat gaggtgggca 1140 ggattcagag gggaaaatca ctggctggac agggcaaaca tcgaatttct gtgcaaagaa 1200 gaaaaactgc tcgtgtacag actggtcgat gaagggcgtt ctctgaaagt gatacacaac 1260 ctgtcgaatg gtgaaatggt gtttgaggga gtgcgcgtac aaccctacag cacggaggtg 1320 gtttga 1326 ＜210＞ 21 ＜211＞ 34 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ CT1的正向引子DNA序列＜400＞ 21 aggagaaact catatgctga agaaactccc ggag 34 ＜210＞ 22 ＜211＞ 21 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ CT1的反向引子DNA序列＜400＞ 22 agccccctcg agcccgagaa c 21 ＜210＞ 23 ＜211＞ 26 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ CT2的正向引子DNA序列＜400＞ 23 aaagggcata tgatcctgtt tggaac 26 ＜210＞ 24 ＜211＞ 27 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ CT2的反向引子DNA序列＜400＞ 24 ataccagtct cgagcagttt caggatc 27 ＜210＞ 25 ＜211＞ 34 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ TN1的正向引子DNA序列＜400＞ 25 ttactgaggg catatgaaaa agatggcttt gaaa 34 ＜210＞ 26 ＜211＞ 30 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ TN1的反向引子DNA序列＜400＞ 26 aagacgcgtc gacttctatg atcaccttct 30 ＜210＞ 27 ＜211＞ 31 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ TN2的正向引子DNA序列＜400＞ 27 atagagggca tatgataggc taccagatct a 31 ＜210＞ 28 ＜211＞ 24 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ TN2的反向引子DNA序列＜400＞ 28 atcttcatct cgagaaccac ctcc 24 ＜210＞ 29 ＜211＞ 28 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ T4的正向引子DNA序列＜400＞ 29 ttttcatatg gagggaggga tcgaattg 28 ＜210＞ 30 ＜211＞ 27 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞ T4的反向引子DNA序列＜400＞ 30 catactcgag cttcccctct cctatct 27

Claims

一種用於生產塔格糖-6-磷酸的組成物，其包括塔格糖-6-磷酸激酶、表現所述塔格糖-6-磷酸激酶的微生物或所述微生物的培養物。
如申請專利範圍第1項所述的用於生產塔格糖-6-磷酸的組成物，其更包括果糖-6-磷酸。
如申請專利範圍第1項所述的用於生產塔格糖-6-磷酸的組成物，其中所述塔格糖-6-磷酸激酶由序列號1、序列號3或序列號5的胺基酸序列構成。
一種用於生產塔格糖的組成物，其包括：塔格糖-6-磷酸激酶、表現所述塔格糖-6-磷酸激酶的微生物或所述微生物的培養物；及塔格糖-6-磷酸磷酸酶、表現所述塔格糖-6-磷酸磷酸酶的微生物或所述微生物的培養物。
如申請專利範圍第4項所述的用於生產塔格糖的組成物，其更包括果糖-6-磷酸。
如申請專利範圍第4項所述的用於生產塔格糖的組成物，其更包括葡萄糖-6-磷酸異構酶、表現所述葡萄糖-6-磷酸異構酶的微生物或所述微生物的培養物。
如申請專利範圍第6項所述的用於生產塔格糖的組成物，其更包括葡萄糖磷酸變位酶、表現所述葡萄糖磷酸變位酶的微生物或所述微生物的培養物。
如申請專利範圍第7項所述的用於生產塔格糖的組成物，其更包括α-葡聚糖磷酸化酶、澱粉磷酸化酶、麥芽糊精磷酸化酶或蔗糖磷酸化酶、表現所述α-葡聚糖磷酸化酶、澱粉磷酸化酶、麥芽糊精磷酸化酶或蔗糖磷酸化酶的微生物或所述微生物的培養物。
如申請專利範圍第6項所述的用於生產塔格糖的組成物，其更包括葡萄糖磷酸化酶、表現所述葡萄糖磷酸化酶的微生物或所述微生物的培養物。
如申請專利範圍第9項所述的用於生產塔格糖的組成物，其更包括α-澱粉酶、支鏈澱粉酶、異澱粉酶、葡萄糖澱粉酶、蔗糖酶、表現所述α-澱粉酶、支鏈澱粉酶、異澱粉酶、葡萄糖澱粉酶、蔗糖酶的微生物或所述微生物的培養物。
一種塔格糖的製備方法，其包括使果糖-6-磷酸與塔格糖-6-磷酸激酶、表現所述塔格糖-6-磷酸激酶的微生物或所述微生物的培養物接觸而製備塔格糖-6-磷酸的步驟。
如申請專利範圍第11項所述的塔格糖的製備方法，其更包括使所製備的所述塔格糖-6-磷酸與塔格糖-6-磷酸磷酸酶、表現所述塔格糖-6-磷酸磷酸酶的微生物或所述微生物的培養物接觸而製備塔格糖的步驟。
如申請專利範圍第11項或第12項所述的塔格糖的製備方法，其更包括使葡萄糖-6-磷酸-異構酶、表現所述葡萄糖-6-磷酸-異構酶的微生物或所述微生物的培養物與葡萄糖-6-磷酸接觸而將所述葡萄糖-6-磷酸轉化成果糖-6-磷酸的步驟。
如申請專利範圍第13項所述的塔格糖的製備方法，其更包括使葡萄糖磷酸變位酶、表現所述葡萄糖磷酸變位酶的微生物或所述微生物的培養物與葡萄糖-1-磷酸接觸而將所述葡萄糖-1-磷酸轉化成葡萄糖-6-磷酸的步驟。
如申請專利範圍第14項所述的塔格糖的製備方法，其更包括使α-葡聚糖磷酸化酶、澱粉磷酸化酶、麥芽糊精磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、表現所述α-葡聚糖磷酸化酶、澱粉磷酸化酶、麥芽糊精磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶的微生物或所述微生物的培養物與澱粉、麥芽糊精、蔗糖或其組合接觸而將所述澱粉、麥芽糊精或蔗糖轉化成葡萄糖-1-磷酸的步驟。
如申請專利範圍第13項所述的塔格糖的製備方法，其更包括使葡萄糖磷酸化酶、表現所述葡萄糖磷酸化酶的微生物或所述微生物的培養物與葡萄糖接觸而將所述葡萄糖轉化成葡萄糖-6-磷酸的步驟。
如申請專利範圍第16項所述的塔格糖的製備方法，其更包括使α-澱粉酶、支鏈澱粉酶、葡萄糖澱粉酶、蔗糖酶、異澱粉酶、表現所述α-澱粉酶、支鏈澱粉酶、葡萄糖澱粉酶、蔗糖酶、異澱粉酶的微生物或所述微生物的培養物與澱粉、麥芽糊精、蔗糖或其組合接觸而將所述澱粉、麥芽糊精或蔗糖轉化成葡萄糖的步驟。
如申請專利範圍第11項或第12項所述的塔格糖的製備方法，其中以pH5.0至pH9.0的條件、40℃至80℃的溫度條件及/或0.5小時至24小時的條件執行所述接觸。
如申請專利範圍第11項或第12項所述的塔格糖的製備方法，其中所述塔格糖-6-磷酸激酶由序列號1、序列號3或序列號5的胺基酸序列構成，所述塔格糖-6-磷酸磷酸酶由序列號7的胺基酸序列構成。
一種塔格糖的製備方法，其包括：使以下進行接觸的步驟：（a）澱粉、麥芽糊精、蔗糖或其組合；（b）（i）塔格糖-6-磷酸磷酸酶、（ii）塔格糖-6-磷酸激酶、（iii）葡萄糖-6-磷酸-異構酶、（iv）葡萄糖磷酸變位酶或葡萄糖磷酸化酶、（v）磷酸化酶及（vi）α-澱粉酶、支鏈澱粉酶、異澱粉酶、葡萄糖澱粉酶或蔗糖酶中的一種以上；及（c）磷酸。