BR112019020230A2 - Composição para produzir tagatose e método de produzir tagatose com o uso da mesma - Google Patents

Composição para produzir tagatose e método de produzir tagatose com o uso da mesma Download PDF

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Abstract

trata-se de uma composição para produzir tagatose que compreende frutose-6-fosfato 4-epimerase e um método para produzir tagatose com o uso da mesma.

Description

PARA PRODUZIR TAGATOSE E MÉTODO DE PRODUZIR TAGATOSE COM O
USO DA MESMA
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
1. CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente divulgação refere-se a uma composição para produzir tagatose, que compreende frutose-6-fosfato epimerase, e um método para produzir tagatose com o uso da mesma.
2. DESCRIÇÃO DA TÉCNICA RELACIONADA
[002] A tagatose é um adoçante natural, presente em pequena quantidade em alimentos tais como leite, queijo, cacau, etc., e em frutas doces, como maçãs e tangerina, e possui propriedades fisicas semelhantes à sacarose. A tagatose possui um valor calórico de 1,5 kcal/g, que é um terço do valor da sacarose, e um índice glicêmico (IG) de 3, que é 5% do valor da sacarose. A tagatose tem um sabor doce semelhante ao da sacarose e vários benefícios para a saúde. A. este respeito, a tagatose pode ser utilizada como um adoçante alternativo, capaz de satisfazer o paladar e a saúde, quando aplicado a uma ampla variedade de produtos.
[003] Os métodos convencionalmente conhecidos de produção de tagatose incluem um método químico (uma reação catalítica) e um método biológico (uma reação de enzima de isomerização; do uso da galactose como principal matéria-prima (ver
Petição 870190103780, de 15/10/2019, pág. 57/116
2/50 documento PCT WO 2006/058092, Patentes Coreanas, números 100964091 e 10-1368731). No entanto, o preço da lactose, que é uma matéria-prima básica da. galactose nos métodos de produção conhecidos, é instável, e depende das quantidades produzidas, oferta e demanda de leite cru e actose nos mercados globais, etc. Assim, há uma limitação fornecimento estável de matéria-prima para a produção de tagatose. Portanto um novo método capaz de produzir tagatose a partir de um açúcar comumente usado (sacarose, glicose, frutose, etc.) como matéria-prima foi necessário e estudado, e os documentos mencionados acima divulgam um método de produção de galactose, psicose e tagatose de glicose, galactose e frutose, respectivamente (Patentes Coreanas, lúmeros 10-744479, 10-1057873 e 10-1550796).
[004] Enquanto isso, a tagatose-6-fostato quinase (EC
2.7.1.144) é conhecida por produzir ADP e D-tagatose 1,6-bifosfato a partir de ATP e D-tagatose-6-fosfato como substrato, como a seguir [Esquema de reação 1]. No entanto, ão existem estudos sobre se a tagatose-6-fosfato quinase tem atividade para converter frutose-6-fosfato em tagatose6-fosfato.
REAÇAO DO ESQUEMA 1
ATP + D-TAGATOSE 6-FOSFATO <=> ADP + D-TAGATOSE 1,6BIFOSFATO
[005] Sob estes antecedentes, os presentes inventores
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3/50 realizaram extensos estudos para desenvolver um método capaz de aumentar a taxa de conversão em tagatose enquanto se usa uma. matéria-prima econômica e, como resultado, descobriram que a tagatose-6-fosfato quinase (EC 2.7.1.144) tem a capacidade de converter frutose-6-fosfato em tagatose-6fosfato completando, assim, a. presente divulgação.
[006] Consequentemente, glicose ou amido podem ser usados como matéria-prima para produzir sequencialmente glicose-1fosfato e glicose-6-fosfato e, em seguida, a tagatose-6fosfato quinase da presente divulgação pode ser usada para converter glicose-6 -fostato em tagatose-6-fostato tagatose-6-fosfato fosfatase, que executa uma via de reação irreversível, podem ser usados para produzir tagatose enquanto aumentam notavelmente uma taxa de conversão de glicose ou amido em tagatose.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[007] Um objetivo da presente divulgação é fornecer uma composição útil para a produção de tagatose-6-fosfato, que compreenda tagatose-6-fosfato quinase, um microrganismo que expressa a tagatose-6-fosfato quinase ou uma cultura do microrganismo.
[008] Outro objetivo da presente divulgação é fornecer uma composição útil para a produção de tagatose, que compreenda tagatose-6-fosfato quinase, um microrganismo que expressa a tagatose-6-fosfato quinase ou uma cultura do microrganismo;
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4/50 e tagatose-6-fosfato fosfatase, o microrganismo que expressa a tagatose-6-fosfato fosfatase ou uma cultura do microrganismo.
[009] Outro objetivo da presente divulgação é fornecer um método de produção de tagatose-6-fosfato, que compreenda a conversão de frutose-6-fosfato em tagatose-6-fosfato ao entrar em contato com frutose-6-fosfato e com tagatose-6fosfato quinase, um microrganismo que expressa a tagatose6-fosfato quinase, ou uma cultura do microrganismo. O método compreende ainda a conversão de tagatose-6-fosfato em tagatose ao entrar em contato com tagatose-6-fosfato e com tagatose-6-fosfato fosfatase, um microrganismo que expressa a tagatose-6-fosfato fosfatase ou uma cultura do microrganismo.
[010] Outros objetos e vantagens da presente divulgação serão descritos em mais detalhes com referência à descrição a seguir, juntamente com as reivindicações e desenhos anexos. Uma vez que o conteúdo que não é descrito na presente especificação pode ser suficientemente reconhecido e inferido por aqueles versados na técnica ou em técnica similar, uma descrição do mesmo será omitida.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A Figura 1 é um resultado da eletroforese de proteínas (SDS-PAGE) para analisar pesos moleculares de enzimas usadas nas vias de produção de tagatose a partir de
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5/50 amido, sacarose ou glicose, em que M representa uma escada de tamanho de proteína (marcador de tamanho, Bio-RAD, EUA);
A Figura 2 é um resultado da cromatografia por HPLC que mostra que CJ AN1 F6P4E, que é uma enzima de uma modalidade da presente divulgação, tem atividade de frutose6-fosfato 4-epimerase;
A Figura 3 é um resultado de cromatografia por HPLC que mostra que CJ DT F6P4E que é uma enzima de uma modalidade da presente divulgação, tem atividade de frutose-6-fosfato 4-epimerase;
A Figura 4 é um resultado de cromatografia por HPLC que mostra que CJ AB F6P4E que é uma. enzima de uma modalidade da presente divulgação, tem atividade de frutose-6-fosfato 4-epimerase;
A Figura 5 é um resultado da cromatografia por HPLC que mostra que o tratamento de frutose-6-fosfato com tagatose-6-fosfato quinase (CJ' DT F6P4E) e CJ T4 T6PP converte frutose-6-fosfato em tagatose em uma modalidade da p r e s e n t e d. i v u 1 g a ç ã o;
A Figura 6 é um resultado da cromatografia por HPLC que mostra que quando todas as enzimas envolvidas na. via. de produção de tagatose a partir de maltodextrina foram adicionadas ao mesmo tempo, a tagatose foi produzida por reações enzimáticas complexas, em. que CJ AN1 F6P4E foi usado como tagatose-6-fosfato quinase; e
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A Figura 7 é um resultado de cromatografia por HPLC que mostra que T4 que é uma enzima da presente divulgação, possui atividade da. tagatose-6-fosfato fosfatase.
DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES PREFERENCIAIS
[011] Doravante, a divulgação presente será descrita em detalhes a seguir. Enquanto isso, cada descrição e modalidade divulgada nesta divulgação pode ser aplicada a outras descrições e modalidades de coisas comuns. Além disso, todas as combinações de vários elementos divulgados nesta divulgação se enquadram no escopo da presente divulgação. Além disso, o escopo da presente divulgação não é limitado pela descrição especifica descrita abaixo.
[012] Para alcançar um objetivo da presente divulgação, um aspecto da presente divulgação fornece uma composição para a produção de tagatose-6-fosfato, que compreende tagatose6-fosfato quinase, um microrganismo que expressa a tagatose6-fosfato quinase ou uma cultura do microrganismo.
[013] A tagatose-6-fosfato quinase (EC 2.7.1.144) é conhecida, por produzir ADP e D-tagatose 1,6-bifosfato a partir de ATP e D-tagatose-6-fosfato como substrato. Por exemplo, a tagatose-6-fosfato quinase pode ser qualquer uma sem limitação, desde que seja capaz de produzir tagatose-6fosfato a partir de frutose-6-fosfato como substrato.
[014] A tagatose-6-fosfato quinase pode ser um polipeptldio que consiste em uma sequência de aminoácidos da
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SEQ ID NO: 1, 3 ou 5, ou compreende urn polipeptidio com pelo menos 80%, 90%, 95%, 97% ou 99% de homologia com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, 3 ou 5. É aparente que um polipeptidio com a homologia e uma sequência de aminoácidos que exiba a eficácia (isto é, epimerização por frutose-6fosfato C4 atividade para converter frutose-6-fosfato em tagatose-6-fosfato por epimerização de frutose-6-fosfato na posição C4 da frutose) correspondente à proteína que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, 3 ou 5 também é incluído no escopo da presente divulgação, embora tenha uma sequência de aminoácidos, da qual uma sequência parcial é excluída, modificada, substituída ou adicionada. Além disso, uma sonda, que pode ser produzida a partir da sequência conhecida de nucleotideos, por exemplo, um polipeptidio codificado por um. polinucleotideo que é hibridável com uma sequência complementar a toda ou parte de uma sequência de nucleotideos que codifica o polipeptidio em condições rigorosas também pode ser incluída sem limitação, desde que possua a atividade de epimerização da. frutose-6fosfato C4. Além disso, a composição pode compreender uma ou mais da tagatose-6-fosfato quinase que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, 3 ou 5.
[015] A presente divulgação revelou que a ’tagatose-6fosfato quinase’ exibe a atividade de epimerização da frutose-6-fosfato 4 para converter frutose-6-fosfato em.
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8/50 tagatose-6--fosfato pela epimerização da frutose-6-fosfato em C4 posição. Na presente divulgação, portanto, a ’tagatose6-fosfato quina.se' pode ser usada de forma intercambiável com a 'frutose-6-fosfato C4 epimerase'.
[016] Como usado no presente documento, o termo condições rígidas significa condições sob as quais é permitida a hibridação especifica entre polinucleotídeos. Essas condições dependem do comprimento do polinucleotídeo e do grau de complementação, e as variáveis são bem conhecidas na técnica e especificamente descritas em uma literatura (por exemplo, J. Sambrook e outros, Infra). As condições rígidas podem incluir, por exemplo, condições sob as quais os genes com alta homologia, homologia de 80% ou superior homologia ie 90% ou superior, homologia de 95% ou superior, homologia de 95% ou superior homologia de 97% ou superior, homologia de 99% ou superior são hibridados com cada outro e genes com homologia menor que a homologia acima não são hibridizados entre si, ou condições de lavagem comuns da hibridação
Southern, ou seja, lavar uma vez, especificamente, duas ou três vezes em uma concentração de sal e uma temperatura correspondente a 60 °C, 1*SSC, 0,1% SDS, especiticamente, 60 UC, O,1*SSC, 0,1% SDS, e mais especificamente 68 cC, 0,l.xSSC,
0,1% SDS. A sonda utilizada na hibridação pode fazer parte de uma sequência complementar da sequência, de nucleotídeos. Tal sonda. pode ser produzida por PCR ao usar
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oligonucleot .ideos produzidos com base na sequência conhecida
como iniciadores e um fragmento de DNA que compreende essas
sequências d. e nucleotídeos como um. molde. Além disso, aqueles
versados na técnica podem ajustar a temperatura e a
concentração de sal da solução de lavagem de acordo com fatores como o comprimento da. sonda, se necessário.
[017] Como usado no presente documento, o termo homologia refere-se a uma porcentagem de identidade entre duas porções polipeptidicas. A correspondência de sequência de uma porção para outra pode ser determinada por uma técnica
- U. J- _
conhecida. I ?or exemplo, a homologia pode ser determinada
alinhando d..i Lretamente as informações de sequência de duas
léculas polipeptídicas, por exemplo, parâmetros como
pontuação, ' identidade e semelhança, etc., com uso de um
programa de computador que está prontamente disponível e
capaz de ali· dhar informações de sequência (por exemplo, BLAST
2.0). Além disso, a homologia entre polinucleotídeos pode
ser determir iada por hibridização dos polinucleotídeos sob
ondição para, formar uma fita dupla estável nas regiões
homólogas, ε seguida pela digestão da fita hibridada por uma
nuclease específica de fita única para determinar o tamanho
dos fragment os digeridos.
[018] Em o tma modalidade, a tagatose-6-fosfato quinase da
presente di‘ vulgação pode ser uma enzima derivada de um
microrganismo resistente ao calor, por exemplo, uma enz
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10/50 derivada de Anaeroiinea sp. ou uma variante da mesma, ou uma enzima derivada do gênero Dictyoglomus ou uma variante do mesmo, e especificamente, uma enzima, derivada das espécies Anaeroiinea thermophila, Ãnaerolineae bacterium, ou Dictyoglomus thermophilum, uma. variação das mesmas, mas não limitadas a elas.
[019] A frutose-6-fosfato 4-epimerase cia presente divulgação, ou uma variante da mesma, é caracterizada pela conversão de D-frutose-6-fosfato em. D-tagatose-6-fosfato pela epimerização de D-frutose-6-fosfato na posição C4 . Uma enzima que se sabe ter atividade de tagatose-6-fosfato quinase pode ser usada, como a frutose-6-fosfato 4-epimerase da presente divulgação, e a tagatose-6-fosfato quinase produz D-tagatose 1,6-bifosfato de D-tagatose-6-fosfato como substrato. A presente divulgação revelou recentemente que a tagatose-6-fosfato quinase possui a atividade frutose-6fosfato-4-epimerase. Consequentemente, uma modalidade da presente divulgação refere-se ao novo uso da tagatose-6fosfato quinase, que inclui o uso da tagatose-6-fosfato quinase como a frutose-6-fosfato-4-epimerase na produção de tagatose-6-fosfato de frutose-6-fosfato. Além disso, uma modalidade da. presente divulgação refere-se a. um método de produção de tagatose-6-fosfato a partir de frutose-6-fosfato com. uso da taga.tose-6-fosfa.to quinase como a frutose-6fosfa.to-4-epimera.se.
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[020] Em uma modalidade, a frutose-6-fosfato 4-epimerase da presente divulgação pode ser uma. enzima, com alta resistência, ao calor. Especificamente, a frutose-6-fosfato4-epimerase da presente divulgação pode exibir 50% a 100%, 60% a 10 0%, 70% a. 100% ou 75% a 100% de sua atividade máxima a. 50 °C a 70 °C. Mais especificamente, a frutose-6-fosfato4-epimerase da presente divulgação pode exibir 80% a 100% ou 85% a 100% de sua atividade máxima de 55 °C a 65 °C, 60 °C a 70 °C, 55 °C, 60 °C ou 70 °C.
[021] Além disso, a frutose-6-fosfato-4-epimerase que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, 3 ou 5 pode ser, mas sem limitação, codificada por uma sequência de nucleotídeos da SEO ID NO: 2, 4 ou 6, respectivamente.
[022] A frutose-6-fosfato 4-epimerase da presente divulgação ou uma variante da. mesma, pode ser obtida pela transformação de um microrganismo, tal como Escherichia coli com DNA que expressa a enzima da presente divulgação ou a sua variante, por exemplo, SEQ ID NO: 2, 4 ou 6, cultivando o microrganismo para obter uma cultura, interrompendo a cultura e, em seguida, realizando a purificação usando uma coluna, etc. O microrganismo para transformação pode incluir Corynebacterium glutamicum, Aspergillus oryzae, ou Bacillus subtilis, etc., além da Escherichia coli. EM uma modalidade específica, a transformação do microrganismo pode ser E.coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-anl, E.coli BL21ÍDE3)/pBT7-C~His
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CJ AB F6P4E, ou E.coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ DT F6P4E. E.coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-anl fol depositado era 20 de março de 2017 com o número de acesso KCCM11996P, E.coli BL21 (DE3) /pBT7~C”HiS”CJ__DT__F6P4E foi depositado 13 de setembro de 2017 com número de acesso KCCM12110P, e E.coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_AB_F6P4E foi depositado em 11 de agosto de 2017 com número de acesso KCCM12093P no Centro de Cultura Coreana de Microrganismos.
[023] A frutose-6-fosfato-4-epimerase usada na presente divulgação pode ser fornecida usando um ácido nucleico que codifica o mesmo.
[024] Como usado no presente documento, o termo ácido nucleico significa que ele abrange moléculas de DNA ou RNA, em que os nucleotídeos que são unidades constituintes básicas no ácido nucleico podem, incluir não apenas nucleotídeos naturais, mas também análogos com modificação de açúcar ou base (ver: Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York (1980); Uhlm.au and Peyman, Chemical Reviews, 90:543584(1990) ) .
[025] O ácido nucleico da presente divulgação pode ser um ácido nucleico que codifica o polipeptídio que consiste na sequência de aminoácidos da SEO ID NO: 1, 3 ou 5 da presente divulgação ou um ácido nucleico que codifica um polipeptídio com. pelo menos 80 %, 90%, 95%, 97% ou 99% de homologia com a. frutose-6-fosfato-4-epimerase da presente divulgação e a
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13/50 atividade da frutose~6”fosfato-4-epiinerase. Por exemplo, o ácido nucleico que codifica a frutose-6-fosfato-4-epimerase que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 pode ser um ácido nucleico que possui pelo menos 80%, 90%, 95%, 97%, 99 % ou 100% de homologia com a sequência de nucleotldeos da SEQ ID NO: 2. Além disso, o ácido nucleico que codifica a frutose-6-fosfato-4-epimerase que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 ou 5 pode ser um nucleico ácido possuindo pelo menos 80%, 90%, 95%, 97%, 99%; ou 100% de homologia com a sequência de nucleotldeos da SEQ ID NO: 4 ou 6 correspondente a ela, respectivamente. Também é aparente que o ácido nucleico da. presente divulgação pode incluir um ácido nucleico que é traduzido na frutose-6fosfato-4-epimerase da presente divulgação devido à degeneração do códon e um ácido nucleico que hibrida com um ácido nucleico que consiste de uma sequência de nucleotldeos complementar à sequência de nucleotldeos da SEQ ID NO: 2, 4 ou 6 sob condições rígidas e codifica o polipeptidio que possui a atividade frutose-6-fosfato-4-epimerase da presente Cl í VU1CJ cL ç ã o .
[026] O microrganismo que expressa a frutose-6-fosfato-4epim.era.se que pode ser usada na. presente divulgação pode ser um microrganismo que compreende um vetor recombinante que compreende o ácido nucleico.
[027] O vetor pode estar operacionalmente ligado ao ácido
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14/50 nucleico da presente divulgação. Como usado no presente documento, o termo operacionalmente ligado significa que uma. sequência reguladora da expressão de nucleotideos e uma sequência de nucleotideos que codifica uma proteína alvo estão operacionalmente ligadas uma. à outra, para executar as funções gerais, o que afeta, assim, a expressão da sequência de nucleotideos codificadora. A ligação operável ao vetor pode ser produzida usando uma tecnologia de recombinação genética conhecida na técnica, e a divagem e ligação de DNA específicas do local podem ser produzidas com uso de enzimas de restrição e ligases conhecidas na técnica.
[028] Como usado no presente documento, o termo vetor refere-se a qualquer mediador para clonagem e/ou transferência de bases para um organismo, como uma célula hospedeira. O vetor pode ser um replicon que é capaz de trazer a replicação de fragmentos combinados nos quais diferentes fragmentos de DNA são combinados. Aqui, o termo replicon refere-se a qualquer unidade genética (por exemplo, plasmídeo, fago, cosmídeo, cromossomo, vírus) que funciona como uma autounidade de replicação de DNA in vivo, ou seja, que pode ser replicada por autorregulação. Como usado no presente documento, o termo vetor pode incluir mediadores virais e não virais para introduzir as bases no organismo, por exemplo, uma célula, hospedeira, in vitro, ex vivo, ou in vivo, e pode também incluir um DNA. ntinicircular,
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15/50 urn transposon tal como a Bela Adormecida (Izsvak e outros J. Mol. Biol. 302:93-102 (2000)), ou um cromossomo artificial. Exemplos do vetor comumerite usado podem incluir plasmldeos naturais ou recombinantes, cosmideos, vírus e bacteriófagos. Por exemplo, como um. vetor fágico ou vetor cosmídeo, podem ser utilizados pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, A.SHII, APII, APII, tlO, tll, Charon4A e CharonllA, etc.; e como vetor plasmídico, podem ser utilizados aqueles baseados em pBR, pUC, pBluescriptII, pGEM, pTZ, pCL e pET, etc. Gs vetores que podem ser utilizados na presente divulgação não são particularmente limitados, mas qualquer vetor de expressão conhecido pode ser usado. Além disso, o vetor pode ser um vetor recombinante caracterizado por compreender ainda vários genes de resistência a antibióticos. Como usado no presente documento, o termo gene de resistência. a antibióticos'' refere-se a um gene com resistência a um antibiótico, e uma célula com esse gene sobrevive em um ambiente tratado com o antibiótico correspondente. Assim, o gene de resistência a antibióticos é usado como um marcador selecionável durante a produção de uma grande quantidade de plasmldeos em E.colí. O gene de resistência a antibióticos na presente divulgação não é um fator que influencia bastante a eficiência da expressão de acordo com combinações ótimas de vetores, que é uma tecnologia-chave da presente divulgação e, portanto, um gene de resistência a antibióticos que
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16/50 geralmente é usado como marcador selecionável pode ser usado sem limitação. Exemplos específicos podem incluir um gene de resistência, contra ampicilina, tetraciclina, canamicina, cloranfenicoi, estreptomicina ou neomicina, etc.
[029] O microrganismo que expressa a. frutose-6-fosfato-4epimerase que pode ser usada na presente divulgação, pode ser obtido por um método de introdução do vetor que compreende o ácido nucleico que codifica a enzima em uma célula hospedeira e um método de transformar o vetor pode ser incluído, desde que seja capaz de introduzir o ácido nucleico dento da célula. Uma técnica padrão apropriada, conhecida, por aqueles versados técnica, pode ser selecionada e realizada. Eletroporação, coprecipitação de fosfato de cálcio, infecção retroviral, micro injeção, um método DEAEdextrano, um método lipossômico catiônico e um método de choque térmico podem ser incluídos, mas não estão limitados cL 1 S S O *>
[030] Desde que o gene transformado possa ser expresso na célula hospedeira, ele pode ser inserido no cromossomo da célula hospedeira e pode existir de forma extra cromossômica. Além disso, o gene inclui DNA e RUA como um polinucleotídeo que codifica um polipeptídio, e qualquer forma pode ser usada sem limitação, desde que possa ser introduzida na célula hospedeira e expressa nela. Por exemplo, o gene pode ser introduzido na célula hospedeira na forma de um cassete de
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17/50 expressão, que é uma construção polinucleotídica que compreende todos os elementos necessários para sua expressão autônoma. Comumente, o cassete de expressão pode compreender um promotor operacionalmente ligado ao gene, sinais de terminação transcricional, locais de ligação ao ribossomo e sinais de terminação da tradução. O cassete de expressão pode estar na forma de um vetor de expressão auto replicável. Também, o gene tal como é ou na forma de uma construção polinucleotídica pode ser introduzido na célula hospedeira e operacionalmente ligado às sequências necessárias para a expressão na célula hospedeira.
[031] O microrganismo da presente divulgação pode incluir tanto um microrganismo procariótico quanto um microrganismo eucariótico, desde que seja um microrganismo capaz de produzir a. f rutose-6-fosfato-4-epimerase da. presente divulgação porque compreende o ácido nucleico da presente divulgação ou o vetor recombinante da presente divulgação. Por exemplo, o microrganismo pode incluir cepas de microrganismos pertencentes ao gênero Escherichia, ao gênero Erwinia, ao gênero Serratia, ao gênero Providencia, ao gênero Corynebacterium, e ao gênero Brevibacterium, e, especificamente, pode ser E.coli ou Corynebacterium glutainicuin, mas não limitado a esses. Exemplos específicos do microrganismo podem incluir E.coli BL21(DE3)/pBT7-C-Hisanl, E. coll BLzl [DE3] /pBT C~His~Cu AB F6P4E, ou E. coli
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BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ DT F6P4E, etc.
[032] O microrganismo da presente divulgação pode incluir qualquer microrganismo capaz de expressar a frutose-· 6fosfato-4-epimerase da presente divulgação, ou enzimas relacionadas de acordo com vários métodos conhecidos, além da introdução do ácido nucleico ou do vetor.
[033] A cultura do microrganismo da presente divulgação pode ser produzida por cultivo, em um meio, do microrganismo que expressa a tagatose-6-fosfato quinase da presente divulgação ou enzimas relacionadas.
[034] Como usado no presente documento, o termo cultura significa que o microrganismo pode crescer sob condições ambientais controladas adequadamente. O processo· de cultura da presente divulgação pode ser realizado de acordo com um meio e condições de cultura apropriados conhecidos na técnica. O processo de cultura pode ser facilmente ajustado por aqueles versados na técnica, de acordo com a cepa a ser selecionada. A etapa de cultivar o microrganismo pode ser realizada, por um processo em lote conhecido, um processo contínuo, um processo em lote alimentado etc, mas não está particularmente limitada a isso. Em relação às condições da cultura, um pH adequado (por exemplo, pH 5 a. 9, especificamente pH 7 a 9) pode ser ajustado com uso de um composto básico (por exemplo, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio ou amônia) ou um composto ácido (por exemplo,
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19/50 ácido fosfórico ou ácido sulfúrico), mas não é particularmente limitado a estes. Além disso, um agente antiespuma, tal como o éster de poliglicol de ácidos graxos, pode ser adicionado durante o processo de cultura para impedir a geração de espuma. Além disso, oxigênio ou um gás contendo oxigênio pode ser injetado na cultura, a fim de manter um estado de aerobiose da cultura; ou gás nitrogênio, hidrogênio ou dióxido de carbono pode ser injetado sem a injeção de um gás, a fim de manter um. estado de anaerobiose ou microarobiose, da cultura. A temperatura da cultura pode ser mantida de 25 °C a 40 °C e, especificamente, de 30 °C a 37 °C, mas não está limitada, a ela. A cultura pode ser continuada até que a quantidade desejada de materiais úteis seja obtida e, especificamente, por cerca de 0,5 horas a cerca de 60 horas, mas não se limita a. isso. Além disso, o meio de cultura a ser usado pode compreender, como fontes de carbono, açúcares e carboidratos (por exemplo, glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, melaço, amido e celulose), óleos e gorduras (por exemplo, óleo de soja, óleo de girassol , óleo de amendoim e óleo de coco), ácidos graxos (por exemplo, ácido palmitico, ácido esteárico e ácido linoleico), álcoois (por exemplo, glicerol e etanol) e ácidos orgânicos (por exemplo, ácido acético) etc. Essas substâncias podem ser usadas individualmente ou em uma mistura, mas não estão limitados a isso. As fontes de
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20/50 nitrogênio podem incluir compostos orgânicos que contém nitrogênio (por exemplo, peptona, extrato de levedura, extrato de carne, extrato de malte, álcool de milho, farelo de soja e ureia) ou compostos inorgânicos (por exemplo, sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio e nitrato de amônio) etc. Essas fontes de nitrogênio também podem ser usadas individualmente ou em uma mistura, mas não estão limitadas a elas. As fontes de fósforo podem incluir di-hidrogênio fosfato de potássio, hidrogênio fosfato de dipotássio, os sais correspondentes que contêm sódio, etc. Essas fontes de nitrogênio também podem ser usadas individualmente ou em uma. mistura, mas não estão limitadas a elas. O meio de cultura pode incluir estimuladores de crescimento essenciais, como sais de metais (por exemplo, sulfato de magnésio ou sulfato de ferro), aminoácidos e vitaminas.
[035] A composição para a produção de tagatose-6-fosfato da presente divulgação pode compreender, ainda, frutose-6fosfato, e a frutose-6-fosfato pode ser convertida em tagatose-6-fosfato pela frutose-6-fosfato-4-epimerase da p r e s e n t e d i vu1ga ç ã o.
[036] Outro aspecto da presente divulgação fornece uma composição para a produção de tagatose, que compreende tagatose-6-fosfato quinase, um microrganismo que expressa a tagatose-6-fosfato quinase, ou uma. cultura do microrganismo;
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21/50 e tagatose~6~fosfato fosfatase, o microrganismo que expressa a tagatose-6-fosfato fosfatase ou uma cultura do microrganismo. A descrição acima da tagatose-6-fosfato quinase, o microrganismo que expressa a tagatose-6-fosfato quinase ou a cultura do microrganismo nesse aspecto também podem ser aplicadas aos aspectos descritos acima.
[037] A tagatose-6-fosfato fosfatase da presente divulgação pode compreender qualquer proteína sem limitação, desde que tenha atividade para converter tagatose-6-fosfato em tagatose, pela eliminação de um grupo fosfato da tagatose6-fosfato. A tagatose-6-fosfato fosfatase da presente divulgação pode ser uma enzima derivada de um microrganismo resistente ao calor, por exemplo, uma enzima derivada de Thermotoga sp. ou uma variante sua, especificamente, uma enzima derivada de Thermotoaa marítima ou uma variante sua.
[038] De acordo com uma modalidade da presente divulgação, a tagatose-6-fosfato fosfatase da presente divulgação pode ser uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7, ou consiste em uma. sequência com. uma homologia genética de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% ou 100%, ou uma sequência com uma homologia genética dentro do intervalo determinado por quaisquer dois valores dos valores acima. De acordo com uma modalidade da presente divulgação, a tagatose-6-fosfato fosfatase que consiste na sequência, de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 da. presente
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22/50 divulgação pode ser codificada por uma sequência de nucleotideos da SEQ ID NO: 8.
[039] A composição para a produção de tagatose da presente divulgação pode compreender, ainda, glicose-6-fosfato isomerase, um microrganismo que expressa, a glicose-6-fosfato isomerase, ou uma. cultura do microrganismo. Na presença, da enzima, a glicose-6-fosfato pode ser isomerizada para produzir frutose-6-fosfato. A glicose-6-fosfato-isomerase da presente divulgação pode incluir qualquer proteína sem limitação, desde que tenha atividade para isomerizar glicose-6-fosfato em frutose-6-fosfato. A glicose-6-fosfatoisomerase da presente divulgação pode ser uma enzima, derivada de um microrganismo resistente ao calor, por exemplo, uma enzima derivada de Thermotoga sp. ou uma variante sua, especificamente, uma enzima, derivada, de Thermotoga marítima ou uma variante sua. De acordo com uma modalidade da presente divulgação, a glicose-6-fosfato-isomerase da presente divulgação pode ser uma proteína que consiste em uma sequência, de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, ou consiste em uma sequência com uma homologia genética de 70 %, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% ou 100%, ou uma sequência, com. uma homologia dentro do intervalo determinado por quaisquer dois valores dos valores acima. De acordo com uma modalidade da presente divulgação, a glicose-6-fosfa.to-isomerase que consiste na. sequência, de aminoácidos da SEQ ID NO: 9 da
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23/50 presente divulgação pode ser codificada por uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 10.
[040] A composição para a produção de tagatose da presente divulgação pode compreender ainda fosfoglucomutase, um microrganismo que expressa a fosfoglucomutase, ou uma cultura do microrganismo, e a enzima pode catalisar uma reação reversível da conversão da glicose-l-fosfato em glicose-6- fosfato ou conversão de glicose-6-fosfato em glicose-l-fosfato. A fosfoglucomutase da presente divulgação pode incluir qualquer proteína sem limitação, desde que tenha atividade para converter glicose-l-fosfato em glicose-6fosfato ou converter glicose-6-fosfato em glicose-l-fosfato. A fosfoglucomutase da presente divulgação pode ser uma enzima derivada de um microrganismo resistente ao calor, por exemplo, uma enzima derivada de Thermo toga sp. ou uma variante sua, especificamente, uma enzima derivada de Thermotoga neapolitana ou uma variante sua. De acordo com uma modalidade da presente divulgação, a fosfoglucomutase da presente divulgação pode ser uma proteína que consiste em. uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, ou consiste em uma sequência com uma. homologia genética de 70%, 75%, 80 %, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% ou 100%, ou dentro do intervalo determinado por quaisquer dois valores dos valores acima. De acordo com uma modalidade da presente divulgação, a fosfoglucomutase que consiste na sequência de aminoácidos da
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SEQ ID NO: 11 da presente divulgação pode ser codificada por uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 12.
[041] A composição para a produção de tagatose da presente divulgação pode compreender ainda glucoquinase, um microrganismo que expressa a glucoquinase ou uma cultura do microrganismo. A glucoquinase da presente divulgação pode incluir qualquer proteína sem limitação, desde que tenha atividade para fosforilar a glicose. A glucoquinase da presente divulgação pode ser uma enzima derivada, de um microrganismo resistente ao calor, por exemplo, uma enzima derivada de Deinococcus sp. ou Anaerolinea sp., ou uma variante sua, especificamente, uma enzima derivada de Deinococcus geothermal!s, Anaerolinea thermopnila, ou uma variante das mesmas. A glicocinase da presente divulgação pode incluir qualquer proteína sem limitação, desde que tenha atividade para converter glicose em glicose-6-fosfato. Especificamente, a glucoquinase da presente divulgação pode ser uma glucoquinase dependente de fosfato. De acordo com um modalidade da presente divulgação, a glucoquinase da presente divulgação pode ser uma proteína que consiste em uma sequência, de aminoácidos da SEQ ID NO: 13 ou 15, ou consiste em. uma sequência com um homologia genética, de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% ou 100%, ou dentro do intervalo determinado por quaisquer dois valores dos valores acima. De acordo com um modalidade da presente divulgação,
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25/50 a glucoquinase consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13 da presente divulgação pode ser codificada por uma. sequência de nucleotídeos da SEO ID NO: 14, e a glucoquinase que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15 da. presente divulgação, pode ser codificada por uma sequência, de nucleotídeos da SEQ ID NO: 16.
[042] A composição para a produção de tagatose da presente divulgação pode ainda compreender α-glucana fosforilase.
amido fosforilase, maltodextrina fosforilase ou sacarose fosforilase, um microrganismo que expressa a a-glucana fosforilase, fosforilase de amido, maltodextrina fosforilase, sacarose fosforilase ou uma cultura do microrganismo. A fosforilase pode incluir qualquer proteína sem limitação, desde que tenha atividade para converter amido, maltodextrina ou sacarose em glicose-l-fosfato. A fosforilase pode ser uma enzima derivada de um microrganismo resistente ao calor, por exemplo, uma enzima derivada de Thermotoga sp. ou uma. variante sua, especificamente, uma enzima derivada de Thermotoga neapolitana ou uma variante sua. A fosforilase da presente divulgação pode ser uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17 ou consiste em uma sequência com uma homologia genética de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95 %, 97%, 99% ou 100%, ou dentro do intervalo determinado por quaisquer dois valores dos valores acima. De acordo com uma modalidade da. presente
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26/50 divulgação, a fosforilase composta da sequência de aminoácidos da. SEQ ID NO: 17 da. presente divulgação pode ser codificada por uma sequência de nucleotideos da SEQ ID NO: IS .
[043] A. composição para a. produção de tagatose da presente divulgação pode compreender ainda «--amilase, pululanase, glucoamilase, sacarase ou isoamilase; um microrganismo que expressa a amilase, pululanase, glucoamilase, sacarase ou isoamilase; ou uma cultura do microrganismo que expressa a amilase, pululanase, glucoamilase, sacarase ou isoamilase.
[044] A composição para a produção de tagatose da presente divulgação pode compreender duas ou mais enzimas das enzimas acima descritas, que podem ser usadas na produção de tagatose ou de seus trans formantes individualmente ou de um tra.nsform.ante transformado com nucleotideos que codificam, as duas enzimas ou mais.
[045] A composição para a produção de tagatose da presente divulgação pode compreender ainda. 4-a-glucanotransfera.se, um microrganismo que expressa a 4-a~glucanotransfera.se, ou uma cultura do microrganismo que expressa a 4-oíglucanotransferase. A. 4-a-glucanotransferase da presente divulgação pode incluir qualquer proteína sem limitação, desde que tenha atividade para converter glicose em amido, maltodextrina ou sacarose. A 4-a~gluca.notransf erase da presente divulgação pode ser uma enzima derivada de um.
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27/50 microrganismo resistente ao calor, por exemplo, uma enzima derivada de Thermotoga sp. ou uma variante sua, especificamente, uma enzima, derivada de Thermotoga marítima ou uma variante sua. De acordo com uma modalidade da presente divulgação, a. 4-a-glucanotransferase da presente divulgação pode ser uma proteína que consiste em. uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19, ou consiste em uma sequência com uma homologia genética de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% ou 100%, ou dentro da faixa determinada por quaisquer dois valores dos valores acima. De acordo com uma modalidade da presente divulgação, a 4-a-glucanotransferase que consiste na. sequência, de aminoácidos da SEQ ID NO: 19 da presente divulgação pode ser codificada por uma sequência de nucleotldeos da SEQ ID NO: 20.
[046] Exemplos dos microrganismos que podem ser utilizados nas modalidades descritas acima podem incluir E.coii BL21(DE3)/pET21a-CJ ctl, E.coii BL21(DE3)/pET21a-CJ ct2, E. coii BL21 (DE3; /pET2 la-C J__tnl, E. coii BL21 (DE3; /pET21aCJ__tn2, e E.coii BL21 (DE3) /pET21a-CJ_t4, etc. Os microrganismos recombinantes foram depositados no Centro de Cultura. Coreana de Microrganismos em 20 de março de 2017 com adesão números KCCM11990P (E.coii BL21(DE3)/pET21a-CJ_ctl), KCCM11991P (E.coii BL21(DE3)/pET2la-CJ ct2), KCCM11992P (E.coii BL21 (DE3)/pET21a-CJ_tnl), KCCM11993P (E.coii BL21(DE3)/pET21a-CJ_tn2), KCCM11994P (E.coii
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BL21(DE3)/pET21a-CJ t4), respectivamente.
[047] A composição para a produção de tagatose da. presente divulgação pode ainda compreender uma substância, um componente ou uma composição que corresponde a cada substrato das enzimas descritas acima.
[048] A. composição para a produção de tagatose da presente divulgação pode compreender ainda qualquer excipiente adequado, comumente usado na composição correspondente para a produção de tagatose. O excipiente pode incluir, por exemplo, um conservante, um agente umectante, um agente dispersante, um agente de suspensão, um tampão, um agente estabilizante ou um agente isotônico, etc., mas não está limitado a estes
[049] A composição para a produção de tagatose da presente divulgação pode compreender, ainda, um metal. Em. uma modalidade, o metal da presente divulgação pode ser um metal que compreende um cátion divalente. Especificamente, o metal da presente divulgação pode ser um ou mais, selecionado do grupo que consiste em níquel, cobalto, alumínio, magnésio (Mg) e manganês (Μη) . Mais especificamente, o metal da presente divulgação pode ser um íon metálico ou um sal metálico, e muito mais especificamente, o sal metálico pode ser um ou mais selecionados do grupo que consiste em N1SO4, MgSOo MgCl?, NiCl2, C0CI2, C0SO4, MnClz e MnSCu.
[050] Outro aspecto da. presente divulgação refere-se a um.
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29/50 método de produção de tagatose-6-fosfato, que compreende a conversão de frutose-6-fosfato em tagatose-6-fosfato ao entrar em. contato com frutose-6-fosfato e com tagatosebifosfato aldolase, o microrganismo expressai a tagatosebifosfato aldolase, ou a cultura do microrganismo.
[051] A descrição da. composição para a. produção de tagatose-6-fosfato também pode ser aplicada à composição para a produção de tagatose.
[052] Outro aspecto da presente divulgação refere-se a um método de produção· de tagatose-6-fosfato, que compreende a conversão de frutose-6-fosfato em tagatose-6-fosfato, ao entrar em contato com frutose-6-fosfato e com. tagatose-6fosfato quinase, o microrganismo que expressa a tagatose-6fosfato quinase, ou a cultura do microrganismo. O método pode compreender ainda a. conversão de tagatose-6-fosfato em tagatose, ao entrar em contato com tagatose-6-fosfato e com tagatose-6-fosfato fosfatase, o microrganismo que expressa
a. tagatose-6-fosfato fosfatase ou a cultura microraanismo.
[053] O método da presente divulgação pode compreender.
ainda, a conversão de qlicose-6-fosfato em frutose-6-íosfato ao entrar em. contato com glicose-6-fosfato e com glicose-6fosfato-isomerase da presente divulgação, o microrganismo que expressa a glicose-6-fosfato-isomerase, ou a cultura do microrganismo que expressa a glicose-6-fosfato-isomerase.
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[054] O metoao aa presente divulgação pode compreenoer, ainda, a conversão de glicose-l-fosfato em glicose-6-fosfato ao entrar em contato com glicose-l-fosfato com fosfoglucomutase da presente divulgação, o microrganismo que expressa a fosfoglucomutase, ou a cultura do microrganismo que expressa a fosfoglucomutase.
[055] O método da presente divulgação pode compreender, ainda, a conversão de glicose em glicose-6-fosfato ao entrar em contato com glicose com. a. glucoquinase da presente divulgação, o microrganismo que expressa a glucoquinase, ou a cultura do microrganismo que [056] O método de presente ainda, uma conversão de amido, glicose-l-fosfato, ao entra ma 11 o d e x t r i n a, s a o a. r o s e o u uma α-glucana fosforilase, amido fosforilase, sacarose fosforile microrganismo que mostra uma í microrganismo que expressa uma [057] O método de presente ainda, uma conversão de amido, expressa a glucoquinase. divulgação pode compreender, maltodextrina ou sacarose em r em contato com amido, combinação dos mesmos, com a fosforilase, maltodextrina ise da presente divulgação, ou 'osforilase ou uma cultura de i o s i o r 11 a s e .
divulgação pode compreender, maltodextrina. ou sacarose em glicose ao entrar em contato com amido, maltodextrina.
sacarose ou uma combinação dos mesmos com a-amilase, pululanase, glucoamilase, sacarase ou isoamilase; c microrganismo que expressa a α-amilase, pululanase,
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31/50 glucoamilase, sacarase ou isoamilase; ou uma cultura de microrganismo que expressa uma. α-amilase, pulu.lana.se, glucoamilase, sacarase ou isoamilase.
[058] O método da presente divulgação pode compreender, ainda, a conversão de glicose em amido, maltodextrina ou sacarose, ao entrar em contato com glicose com a 4-aglucanotransf erase da presente divulgação, o microrganismo que expressa a 4-a-glucanotransferase, ou a cultura do microrganismo que expressa a 4-a-glucanotransferase.
[059] Cada contato no método da presente divulgação pode ser realizado em condições de pH 5,0 a pH 9,0, 30 °C a 80 °C e/ou 0,5 horas a 48 horas. Especificamente, o contato da presente divulgação pode ser realizado sob uma condição de pH 6,0 a pH 9,0 ou pH 7,0 a pH 9,0. Além disso, o contato da
p r e s ente d1vu1ga ç ão pode ser r e a 1 izac io < 5 Ο Ό 1. ima condição de
temperatura de 35 °C a 80 °C, 40 °C a 80 °C, 45 °C a 80 °C,
5 0 ° C a 8 0 °C, 5 5 °C a 80 °C, 6 0 °C a 80 °C, 3 0 °C a 70 °C,
35 °C a 70 °C, 40 °C a 70 °C, 4 5 °C a 70 °r --· f 50 °C a 70 °C,
55 °C a 70 °C, 60 °C a 70 °C, 30 °C a 65 °C, 3 5 °C a 65 °C,
4 0 C a 65 C, 4 5 ° C a 65 ° C, 50 L a 65 °C, 5 C a 65 C,
3 0 C a. 6 0 C, 3 5 °C a 60 °C, 4 0 ° C a 60 ° c, 4 5 C a. 6 0 C,
50 °C a 60 cC ou 55 °C a 60 O . Alé m c 11. s s o / contato da
presente divulgaç ão pode ser í? Θ c 311, z a í ao por u Λ o horas a 36
horas, 0,5 horas í i 24 horas, 0 f O horas ; a. 12 h? s, 0,5 horas
a. 6 horas, 1 hora a 36 horas, 1 hora a 24 horas, 1 hora a 12
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32/50 horas, 1 hora a 6 horas, 3 horas a 36 horas, 3 horas a 24 horas, 3 horas a 12 horas, 3 horas a. 6 horas, 12 horas a. 3 6 horas ou 18 horas a. 30 horas.
[060] Em uma modalidade, o contato da presente divulgação pode ser realizado na presença, de um metal, um ion metálico ou um sal metálico.
[061] Outro aspecto da presente divulgação refere-se a um método de produção de tagatose, que compreende entrar em contato com a composição para produzir a tagatose descrita no presente documento com amido, maltodextrina, sacarose ou uma combinação dos mesmos; e fosfato.
[062] Em uma modalidade especifica da presente divulgação, é fornecido um método de produção de tagatose, que compreende:
converter glicose em. glicose-6-fosfato ao entrar em contato com glicose com a glucoquinase da presente divulgação, o microrganismo que expressa a glucoquinase, ou a cultura do microrganismo, converter glicose-6-fosfato em. frutose-6-fosfato ao entrar em contato com glicose-6-fosfato com a glicose-6fosfato-isomera.se da presente divulgação, o microrganismo que expressa a glicose-6-fosfato-isomerase, ou a cultura do microrganismo, converter frutose-6-fosfato em tagatose-6-fosfato ao entrar em. contato com frutose-6-fosfato com a frutose-6
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33/50 fosfato-4-epimerase da presente divulgação, o microrganismo que expressa a frutose-6-fosfato-4-epimerase, ou a cultura do microrganismo, e converter tagatose-6-fosfato em tagatose ao entrar em contato com tagatose-6-fosfato com a tagatose-6-fosfato fosfatase da. presente divulgação, o microrganismo que expressa a tagatose-6-fosfato fosfatase, ou a cultura do microrganismo.
[063] Cada reação de conversão pode ser realizada sequencialmente ou in situ no mesmo sistema de reação. No método, o fosfato liberado da tagatose-6-fosfato pela fosfatase pode ser usado como um substrato da glucoquinase para produzir glicose-6-fosfato. Portanto, o fosfato não é acumulado e, como resultado, uma alta taxa de conversão pode ser obtida.
[064] No método, a glicose pode ser, por exemplo, produzida pela conversão de amido, maltodextrina ou sacarose em glicose, ao entrar em. contato com amido, maltodextrina, sacarose ou uma combinação dos mesmos com a-glucana fosforilase, amido fosforilase, maltodextrina fosforilase, sacarose fosforilase da presente divulgação, ou microrganismo que expressa uma. fosforilase, ou uma cultura do microrganismo que expressa uma fosforilase. Portanto, o método de acordo com uma modalidade especifica pode compreender, ainda, uma conversão de amido, maltodextrina. ou
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34/50 sacarose em glicose.
[065] Em outra modalidade específica da presente divulgação, é fornecido um método de produção de tagatose, que compreende:
converter glicose-l-fosfato em glicose-6-fosfato ao entrar em contato com glicose-l-fosfato com a fosfoglucomutase da presente divulgação, o microrganismo que expressa a fosfoglucomutase, ou a cultura do microrganismo, converter glicose-6-fosfato em frutose-6-fosfato ao entrar em contato com glicose-6-fosfato com a glicose-6fosfato-isomerase da presente divulgação, o microrganismo que expressa a glicose-6-fosfato-isomerase, ou a cultura do microrganismo, converter frutose-6-fosfato em tagatose-6-fosfato ao entrar em contato com frutose-6-fosfato com a frutose-6fosfato-4-epimerase da presente divulgação, o microrganismo que expressa a frutose-6-fosfato-4-epimerase, ou a cultura do microrganismo, e converter tagatose-6-fosfato em tagatose ao entrar em contato com tagatose-6-fosfato com a tagatose-6-fosfato fosfatase da presente divulgação, o microrganismo que expressa a tagatose-6-fosfato fosfatase, ou a cultura do microrganismo.
[066] Cada reação de conversão pode ser realizada sequencialmente ou in situ, no mesmo sistema de reação.
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[067] No método, a glicose-l-fosfato pode ser, por exemplo, produzida pela conversão de amido, maltodextrina ou sacarose em glicose-l-fosfato, ao entrar em contato com amido, maltodextrina, sacarose ou uma combinação dos mesmos, com. α-glucana. fosforilase, amido fosforilase, maltodextrina fosforilase, sacarose fosforilase da presente divulgação, ou microrganismo que expressa a fosforilase ou uma cultura de microrganismo que expressa a fosforilase. Portanto, o método de acordo com uma modalidade específica pode compreender, ainda, uma conversão de amido, maltodextrina ou sacarose em glicose-l-fosfato. A este respeito, o fosfato libertado da tagatose-6-fosfato pela fosfatase pode ser utilizado como um substrato da fosforilase para produzir glicose-l-fosfato. Portanto, o fosfato não é acumulado e, como resultado, uma alta taxa de conversão pode ser obtida.
[068] O método pode ainda compreender a purificação da tagatose produzida. A purificação no método não é particularmente limitada e um. método comumente usado na técnica a que a presente divulgação se refere, pode ser usado. Exemplos não limitativos podem incluir cromatografia, cristalização fracionária e purificação de ions, etc. O método de purificação pode ser realizado apenas por um único método, por dois ou mais métodos. Por exemplo, o produto tagatose pode ser purificado por cromatografia, e a separação do açúcar pela, cromatografia pode ser realizada com o uso de
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36/50 uma diferença de força de ligação fraca entre o açúcar a ser separado e um ion metálico ligado a uma resina de ions.
[069] Além disso, a. presente divulgação pode ainda compreender realizações de descoloração, dessalinização ou ambas descoloração e dessalinização antes ou após a etapa, de purificação da. presente divulgação. Ao realizar a descoloração e/ou dessalinização, é possível obter um produto de tagatose mais puro, sem impurezas.
[070] Doravante, a presente divulgação será descrita em mais detalhes com referência aos Exemplos. No entanto, esses exemplos são fornecidos para melhor entendimento, e a divulgação não se destina, a. ser limitada, por esses Exemplos.
EXEMPLO 1: PRODUÇÃO DE VETOR DE EXPRESSÃO RECOMBINANTE E TRANSFORMANTE DE CADA ENZIMA
[071] Para fornecer a-glucana fosforila.se, fosfoglucomutase, glicose-6-fosfato-isomerase e 4-aglucanotransferase, que são enzimas resistentes ao calor necessárias no caminho de produção da tagatose da presente divulgação, sequências de nucleotídeos esperadas como enzimas [as enzimas acima são representadas por SEQ ID NO: 18(CT1), SEQ ID NO: 12(CT2), SEQ ID NO: 1O(TN1), SEQ ID NO: 20(TN2), respectivamente] foram selecionadas a partir de uma sequência de nucleotídeos de um microrganismo, Thermotoga neapolitana ou Thermotoga marítima, que está registrado no G e η B a. n. k .
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[072] Com base nas sequências de nucleotideos selecionadas, iniciadores diretos (SEQ ID NO: 21: CTl-Fp, SEQ ID NO: 23: CT2-Fp, SEQ ID NO: 25: TNl-Fp, SEQ ID NO: 27: TN2~Fp) e iniciadores reversos (SEO ID NO: 22: CTl-Rp, SEQ 1D No: 24: Cl2-Rp, SEQ iD No: 26: TNI-Rp, SEQ 1D No: 28: TN2-Rp) foram projetados e sintetizado, e o gene de cada enzima foi amplificado por PCR, com uso dos iniciadores acima e um DNA genômico de Thermotoga neapolítana como molde. Cada gene amplificado das enzimas foi inserido no pET21a (Novagen que é um vetor de plasmideo para expressão de E.coll com uso das enzimas de restrição, Ndel e Xhol ou Sail, assim produzindo vetores de expressão recombinantes, designados como pET21a-CJ ctl, pET21a~CJ ct2, pET21a-CJ tnl, pET21a~ CJ tn2, respectivamente.
[073] Cada um dos vetores de expressão foi transformado em E.coli BL21(DE3) de acordo com um método comum de transformação [ver Sambrook e outros 1989], produzindo assim transformantes (microrganismos transformados) designados como E.coli BL21(DE3)/pET21a-CJ ctl, E.coli BL21(DE3)/pET21a-CJ ct2, E.coli BL21(DE3)/pET21a-CJ tnl, E.coli BL21(DE3)/pET21a-CJ tn2, respectivamente. Esses transformantes foram depositados no Centro de Cultura de Microrganismos da Coréia, de acordo com as disposições do Tratado de Budapeste, em 20 de março de 2017 com os números de acesso KCCM11990P iE.coli BL21(DE3)/pET21a-CJ ctl),
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KCCM11991P (E.coii BL21(DE3)/pET2la-CJ ct2), KCCM11992P (E.coii BL21(DE3)/pET21a-CJ_tnl), e KCCM11993P (E.coii BL21(DE3)/pET21a~CJ tn2), respectivamente.
EXEMPLO 2: PRODUÇÃO DE ENZIMAS RECOMBINANTES
[074] E.coii BL21 [Dj?j3,i /pET2ia~CJ cti, E.coii BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct2, E.coii BL21(DE3)/pET21a-CJ_tnl, e E.coii BL21 (DE3)/pET21a-CJ tn2 que expressam cada uma das enzimas produzidas no Exemplo 1, foram semeadas em um tubo de cultura contendo 5 ml de meio liquido LB e, em seguida, a cultura semeada foi realizada em uma incubadora com agitação a 37 °C até que a absorvância a 600 nm atingisse
[075] Cada uma das culturas obtidas pela cultura semeada foi semeada em um balão de cultura contendo um meio líquido LB e, em seguida, a cultura principal foi realizada. Quando a absorvância a 600 nm atingiu 2,0, foi adicionado 1 mM de 1PTG para induzir a expressão e produção das enzimas recombinantes. Durante a cultura, uma velocidade de agitação foi mantida a 180 rpm. e uma temperatura de cultura foi mantida a 37 °C. Cada cultura foi centrifugada a 8.000 pg e 4 °C por 20 minutos para recuperar as células. As células recuperadas foram lavadas com tampão 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) duas vezes e suspensas no mesmo tampão, seguidas de rompimento celular, com a utilização de um sonicador. Os lisados celulares foram centrifugados a 13.000 pg e 4 °C por
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39/50 minutos para obter apenas os sobrenadantes. Cada enzima foi purificada pelo uso de cromatografia de afinidade Histag. A solução purificada enzimática recombinante foi dialisada contra tampão 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) e utilizada para a reação.
[076] Um peso molecular de cada enzima, purificada foi examinado ao SDS-PAGE e, como resultado, foi confirmado que CT1 (α-glucana fosforilase) tem um peso molecular de cerca de 96 kDa, CT2 (fosfoglucomuta.se) tem. um peso molecular de cerca de 53 kDa, e TN1 (glicose-6-fosfato-isomerase) tem um peso molecular de cerca de 51 kDa (ver Figura 1).
EXEMPLO 3: EXAME DA ATIVIDADE DE FRUTOSE-6-FOSFATO
4-EPIMERASE DA TAGATOSE-6-FOSFATO QUINASE
3-1. PRODUÇÃO DE VETOR DE EXPRESSÃO RECOMBINANTE E
MICRORGANISMO RECOMBINANTE QUE COMPREENDE O GENE 1 TAGATOSE6-FOSFATO QUINASE
[077] Para identificar uma nova frut.ose-6-fosfat.o-4epimerase resistente ao calor, uma sequência de nucleotideos esperada como enzima foi selecionada a partir de uma sequência de nucleotideos de uma Anaerolinea thermophila termofilica, que está registrada no GenBank, e com base em informações de uma sequência, de aminoácidos (SEQ ID NO: 1) e uma sequência de nucleotideos (SEQ ID NO: 2) do microrganismo, o gene foi inserido no pBT7-C-His (Bioneer Corp.), que é um vetor recombinante expressável em E.colí
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40/50 para produzir um vetor de expressão recombinante designado como pBT7-C-His-anl. O vetor de expressão foi transformado em uma cepa de E. coli BL21 (DE3) por um método comum de transformação [ver Sambrook e outros 1989] para produzir um transformante (microrganismo transformado) designado como E.coli BL21 (DE3)/pBT7-C-His-anl, e esse transformante foi depositado no Centro de Cultura de Microrganismos da Coréia (KCCM) sob as disposições do Tratado de Budapeste em 20 de março de 2017 com o número de acesso KCCM11996P (E.coli
BL21(DE3)/pBT7~C”His-anl).
3-2. PRODUÇÃO DE VETOR DE EXPRESSÃO RECOMBINANTE E
MICRORGANISMO RECOMBINANTE QUE COMPREENDE O GENE 2 TAGATOSE6-FOSFATO QUINASE
[078]
Para f rut ose-6-fosfa to-4-epime ra se, informações genéticas da tagatose-6-fosfato quinase derivada da bactéria Anaerolineae bacterium SG8 19 ou Dictyogiomus turgidum que é um microrganismo termofílico, foi adquirido para produzir vetores recombinantes expressáveis em E. coli e microrganismos transformados.
[079] Em detalhes, uma sequência de nucleotídeos da tagatose-6-fosfato quinase foi selecionada a partir de sequências de nucleotídeos da bactéria Anaerolineae bacterium SG8 19 ou Dictyogiomus turgidum, registrada no GenBank e KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and. Genomes), e com base em informações de sequências de aminoácidos (SEO ID
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NOS: 3 e 5) e sequências de nucleotídeos (SEO ID NOS: 4 e 6) dos dois microrganismos, pBT7-C-His-CJ_AB_F6P4E and pBT7-CHis-CJ DT F6P4E que são vetores recombinantes que compreendem a sequência de nucleotídeos da enzima e sendo expressável em E.coli foi produzida (Bioneer Corp., Coréia). [080] Cada um dos vetores de expressão produzidos foi transformado em E.coli BL21(DE3) por um método comum de transformação [ver: Sambrook e outros 1989] para produzir transformantes (microrganismos recombinantes) que foram designados como E.coli BL21(DE3)/pBT7-C~His~CJ AB F6P4E e E.coli BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ DT F6P4E, respectivamente. Os transformantes foram, depositados no Centro de Cultura de Microrganismos da Coréia (KCCM), que é uma autoridade depositária de acordo com as disposições do Tratado de Budapeste com os números de acesso KCCM12093P (data do depósito: 11 de agosto de 2017) e KCCM12110P (data do depósito: 13 de setembro de 2017), respectivamente.
3-3. PRODUÇÃO DE ENZIMA RECOMBINANTE DE TAGATOSE - δ FOSFATO QUINASE
[081] Para produzir enzimas recombinantes, CJ DT F6P4E, CJ_AB_F6P4E e CJ_AN1_F6P4E a partir dos microrganismos recombinantes produzidos, cada um dos microrganismos recombinantes foi semeado em um tubo de cultura contendo 5 ml de um. meio líquido LB com o antibiótico ampicilina e, então, foi realizada uma incubadora com agitação a 37 °C até
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42/50 a absorvância a 600 nm atingir 2,0. Cada uma das culturas obtidas pela cultura semeada, foi semeada, em um balão de cultura, contendo um meio líquido LB, e então a cultura principal foi realizada. Quando a absorvância a 600 nm atingiu 2,0, foi adicionado 1 mM de IPTG (isopropil β-D-ltiogalactopiranósido) para induzir a expressão e produção da enzima recombinante. A cultura semeada e a cultura principal foram realizadas sob condições de 180 rpm e 37 °C. Cada cultura, da cultura principal foi centrifugada a 8.000 pg e 4 °C por 20 minutos para recuperar as células. As células recuperadas foram lavadas com tampão 25 mM Tris-HCl (pH 7,0) duas vezes e suspensas no mesmo tampão, seguido de ruptura celular usando um sonicador. Cada lisado celular foi centrifugado a 13.000 ug e 4 °C por 20 minutos para levar apenas um sobrenadante. O sobrenadante foi purificado utilizando cromatografia de afinidade com His-tag e foram aplicados 10 volumes de coluna de tampão 50 mM NaibPOi (pH 8,0) contendo imidazol 20 mM e NaCl 300 mM para remover proteínas ligadas não especificamente. Em seguida, 50 mM NaH2PO< (pH 8,0) contendo imidazol 250 mM e NaCl 300 mM foi ainda aplicado, para realizar a eluição e a purificação. A diálise foi realizada usando tampão 25 mM Tris-HCl (pH 7,0) para obter CJ DT F6P4E, CJ AB F6P4E e CJ AN1 F6P4E, que são enzimas purificadas, para análise da caracterização enzimática.
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3-4. ANÁLISE DA ATIVIDADE DE FRUTOSE-6-FOSFATO 4EPIMERASE DA ENZIMA RECOMBINANTS TAGATOSE-δ-FOSFATO QUINASE
[082] As atividades de frutose-6-fosfato-4-epimerização das enzimas recombinantes tagatose-6-fosfato quinase obtidas no Exemplo 3-3 foram analisadas. Em detalhes, 1% em peso de frutose-6-fosfato como substrato foi suspenso em tampão 25 mM Tris-HCl (pH 7,0), e cada 1 unidade/ml dos purificados
CJ DT F6P4E, CJ AB F6P4E e CJ AN1 F bP4 E foi adicionado a
ele, e permi tido reagir a 60 °C por 1 r lora. Para, remover o
fosfato, 1 l midade/ml de fosfatase ( f O sfatase alcalina de
NEB, Calf In testinal) foi adicionadat deixada reagir at 37
°C por 1 nora. Os produtos da reação foram analisados por HPLC, e a análise por HPLC foi realizada sob condições de utilização de uma coluna SP0810 (Shodex) e aplicação de uma fase móvel (água) a 80 °C e uma taxa de fluxo de 1 ml/minuto, e os resultantes foram analisados com uso de um detector de índice de refração.
[083] Como resultado, foi confirmado que todos os CJ_DT_F6P4E, CJ_AB_F6P4E, and CJ_AN1_F6P4E têm a atividade de converter frutose-6-fosfato em tagatose-6-fosfato (Figuras 2 a 4) .
EXEMPLO 4: IDENTIFICAÇÃO DA ENZIMA TAGATOSE-δ[084] Para realizar a. produção de tagatose a partir da frutose-6-fosfato por reações enzimáticas complexas
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44/50 simultâneas na via de produção da tagatose da presente divulgação, a tagatose-6-fosfato fosfatase, que é capaz de exercer a reação enzimática simultânea com a taga.tose-6fosfato quinase, foi identificada.
4-1. PRODUÇÃO DE VETOR DE EXPRESSÃO RECOMBINANTE E
MICRORGANISMO RECOMBINANTE QUE COMPREENDE O GENE TAGATOSE
6-FOSFATO FOSFATASE
[085] Uma sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 8, doravante, denominada t4) e uma sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 7) esperada como tagatose-6-fosfato fosfatase, foram selecionadas a partir de uma sequência de nucleotídeos de Thermotoga marítima, que está registrada no Gen.Ba.nk, e com base na sequência de nucleotídeos selecionada, um iniciador direto (SEQ ID NO: 29) e um iniciador reverso (SEQ ID NO: 30) foram projetados e sintetizados. Ά reação de polimerase em cadeia (PCR) foi realizada com o uso dos iniciadores e o DNA genômico de Thermotoga marítima como molde para amplificar o gene t4. O gene amplificado de cada enzima foi inserido no pET21a (Novagen) , que é um vetor plasmídeo para expressão em E.coli com uso das enzimas de restrição Ndel e Xhol, produzindo assim um vetor de expressão recombinante que foi designado como pET21a-CJ t4. O vetor de expressão produzido foi transformado em E. coli BL21 (DE3) por transformação por choque térmico (Sambrook e Russell: Molecular cloning, 2001) para produzir um. microrganismo
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45/50 recombinante, o qual foi então usado apôs ser congelado e armazenado em glicerol 50%. O microrganismo recombinante foi designado como E.coii BL21 (DE3)/pET21a-CJ__t4, e depositado no Centro de Cultura de Microrganismos da Coréia (KCCM), que é uma Autoridade Depositária, internacional, de acordo com as disposições do Tratado de Budapeste, em. 20 de março de 2017 com o número de acesso KCCM11994P.
~2. PRODUÇÃO DE TAGATOSE- 6 -FOSFATO FOSFATASE RECOMBINANTE
[086] E.coii BL21(DE3)/pET21a~CJ t4 foi semeada em um tubo de cultura contendo 5 ml de meio liquido LB e, em seguida, foi realizada a cultura semeada, em uma incubadora com agitação a 37 °C até a absorbância a 600 nm atingir 2,0. A cultura obtida pela cultura semeada foi semeada em um balão de cultura contendo um. meio liquido LB, e então a cultura principal foi realizada. Quando a absorvância a 600 nm atingiu 2,0, foi adicionado 1 mM de 1PTG para induzir a expressão e produção das enzimas recombinantes. A cultura semeada e a cultura principal foram realizadas a uma velocidade de agitação de 180 rpm e 37 °C. A cultura obtida pela cultura principal foi centrifugada a 8.000 p.g e 4 °C por 20 minutos para recuperar as células. As células recuperadas foram lavadas com tampão 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) duas vezes e suspensas no mesmo tampão, seguidas de rompimento celular com uso de um sonicador. Um lisado celular
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46/50 foi centrifugado a 13
000 pg e 4
C por 20 minutos para obter apenas um sobrenadante.
enzima foi purificada com a utilização de cromatografia de afinidade His-tag. A enzim purificada foi usada após diálise tampão 50 mM Tris-HCl (pH e a enzima recombinante purificada foi de s i gnada como
4-3. ANÁLISE DA ATIVIDADE DE TAGATOSE-6-FOSFATO
ΤΆ QT? PiT? Γ* T T/l •C O £? zns. J. jRiís ISf U Lz U JL 4s
[087] Para analisar a atividade de CJ T4, a. tagatose-6fosfato foi suspensa em tampão 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), e 0, 1 unidade/ml de CJ T4 purificado e MgCla 10 mM foram adicionados a ela e deixados reagir a 70 °C por 10 minutos.
Em seguida, o produto da reação foi analisado por HPLC. A análise por HPLC foi realizada sob condições de uso de uma coluna HPX-87H (Bio-Rad) e aplicação de uma fase móvel (água) a 60 °C e uma taxa de fluxo de 0,6 ml/minuto, e foram analisadas a tagatose e tagatose-6-fosfato com uso de um ietector de índice de refração.
[088] Como resultado, tagatose foi produzida no produto da reação. Como resultacio da realrzaçao cia mesma reaçao apos a adição de CJ_T4 aos reagentes fosfato e tagatose, não foi produzida tagatose, o que indica que CJ T4 possui atividade irreversível de tagatose-6-fosfato fosfatase (Figura 7).
EXEMPLO 5: PRODUÇÃO DE TAGATOSE POR REAÇÕES ENZIMÁTICAS COMPLEXAS SIMULTÂNEAS
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[089] Para analisar a atividade para produzir tagatose a partir de frutose-6-fosfato por enzimas complexas, 0,1% (p/v) de frutose-6-fosfato foi adicionada a uma. solução de reação contendo 1 unidade/ml de CJ t4 (número de acesso KCCM11994P), 1 unidade/ml de CJ_DT_F6P4E, tampão 25 mM TrisHCl (pH 7,0), e deixou-se reagir a 60 °C por 1 hora. e, em seguida, foi realizada HPLC para analisar o produto da reação. A análise por HPLC foi realizada sob condições para usar uma. coluna SP0810 (Shodex) e aplicar uma fase móvel (água) a 80 °C e uma taxa de fluxo de 1 ml/minuto, e a tagatose foi detectada com uso de um detector de índice de r e 1. r a. ç a o .
[090] Como um resultado, a produção de tagatose foi observada, o que indica que a tagatose pode ser produzida a partir de frutose-6-fosfato por reações enzimáticas complexas simultâneas de tagatose-6-fosfato quinase e tagatose-6-fosfato fosfatase (Figura 5).
EXEMPLO 6: PRODUÇÃO DE TAGATOSE A PARTIR DE MALTODEXTRINA POR REAÇÕES SIMULTÂNEAS DE ENZIMA COMPLEXA
[091] Para analisar a atividade de produzir tagatose a partir de maltodextrina por enzimas complexas, foi adicionada maltodextrina a 5% (p/v) a uma solução de reação contendo 1 unidade/ml de CT1, 1 unidade/ml de CT2, 1 unidade/ml de TNI, 1 unidade/ml de T4, 1 unidade/ml de CJ AN1 F6P4E e 20 mM a 50 mM de fosfato de sódio (pH 7,0) e
Petição 870190103780, de 15/10/2019, pág. 103/116
48/50 permitiu-se reagir a 60 “C por 1 hora, e então a HPLC foi realizada para analisar a produto de reação. A análise por HPLC foi realizada sob condições de utilização de uma coluna SP0810 (Shodex) e aplicação de uma fase móvel (água) a 80 °C e uma taxa de fluxo de 0, 6 mi/m.inuto, e a tagatose foi detectada, com uso de um detector de índice de refração.
[092] Como resultado, foi confirmado que a tagatose foi produzida a partir de maltodextrina pelas reações enzimáticas complexas dos CT1, CT2, TNI, T4 e AN1 adicionados (Figura 6).
EFEITOS DA INVENÇÃO
[093] Um método de produção de tagatose de acordo com a presente divulgação é econômico por usar glicose ou amido como matéria-prima, não acumula fosfato para obter uma alta taxa de conversão e compreende uma reação de tagatose-6fosfato fosfatase que é uma reação irreversível, o que aumenta notavelmente a taxa de conversão em tagatose.
[094] Além disso, a tagatose pode ser produzida a partir de glicose ou amido como matéria-prima por reações enzimáticas complexas e, portanto, há vantagens de que o método seja simples e econômico, e um rendimento seja melhorado.
Autoridade Depositária Internacional: Centro
Cultura de Microrganismos da Coréia (estrangeira)
Número de acesso: KCCM11996P
Petição 870190103780, de 15/10/2019, pág. 104/116
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Cultura, de Microrganismos da Coréia, (estrangeira)
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Cultura de Microrganismos da Coréia (estrangeira)
Número de acesso: KCCM11994P

Claims (5)

REIVINDICAÇÕES
1. Composição para produzir tagatose-6-fosfato caracterizada pelo fato de compreender tagatose-6-fosfato quinase, um microrganismo que expressa a tagatose-6-fosfato quinase ou uma cultura do microrganismo.
2/5
7. Composição, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de compreender ainda fosfoglicomutase, um microrganismo que expressa a fosfoglicomutase, ou uma cultura do microrganismo.
8. Composição, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de compreender ainda a-glucano fosforilase, amido fosforilase, maltodextrina fosforilase, ou sacarose fosforilase, um microrganismo que expressa a aglucano fosforilase, amido fosforilase, maltodextrina
fosforilase, ou sacarose fosforilase, ou uma cultura do microrganismo. 9. Composição, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de compreender ainda glicoquinase, um microrganismo que expressa a glicoquinase, ou uma cultura do microrganismo • 10. Composição, de acordo com a reivindicação 9,
caracterizada pelo fato de compreender ainda a-amilase, pululanase, isoamilase, glicoamilase, ou sacarase, um microrganismo que expressa a α-amilase, pululanase, isoamilase, glicoamilase, ou sacarase, ou uma cultura do microrganismo.
11. Método para produzir tagatose caracterizado pelo fato de compreender produzir tagatose-6-fosfato ao colocar em contato frutose-6-fosfato com tagatose-6-fosfato quinase, um microrganismo que expressa a tagatose-6-fosfato
Petição 870190096621, de 27/09/2019, pág. 21/27
2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de compreender ainda frutose-6fosfato.
3/5 quinase, ou uma cultura do microrganismo.
12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de compreender ainda produzir tagatose ao colocar em contato a tagatose-6-fosfato produzida com fosfatase de tagatose-6-fosfato, um microrganismo que expressa a fosfatase de tagatose-6fosfato, ou uma cultura do microrganismo.
13. Método, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado pelo fato de compreender ainda converter glicose-6-fosfato em frutose-6-fosfato ao colocar em contato glicose-6-fosfato com glicose-6-fosfato-isomerase, um microrganismo que expressa a glicose-6-fosfatoisomerase, ou uma cultura do microrganismo.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de compreender ainda converter glicose-l-fosfato em glicose-6-fosfato ao colocar em contato glicose-l-fosfato com fosfoglicomutase, um microrganismo que expressa a fosfoglicomutase, ou uma cultura do microrganismo.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de compreender ainda converter amido, maltodextrina, ou sacarose em glicose-l-fosfato ao colocar em contato amido, maltodextrina, sacarose, ou uma combinação das mesmas com α-glucano fosforilase, amido fosforilase, maltodextrina fosforilase, ou sacarose
Petição 870190096621, de 27/09/2019, pág. 22/27
3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de a tagatose-6-fosfato quinase consistir em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, 3 ou 5.
4/5 fosforilase, um microrganismo que expressa a a-glucano fosforilase, amido fosforilase, maltodextrina fosforilase, ou sacarose fosforilase, ou uma cultura do microrganismo.
16. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de compreender ainda converter glicose em glicose-6-fosfato ao colocar em contato glicose com glicoquinase, um microrganismo que expressa a glicoquinase, ou uma cultura do microrganismo.
17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de compreender ainda converter amido, maltodextrina ou sacarose em glicose ao colocar em contato amido, maltodextrina, sacarose, ou uma combinação das mesmas com α-amilase, pululanase, glicoamilase, sacarase, ou isoamilase, um microrganismo que expressa a aamilase, pululanase, glicoamilase, sacarase, ou isoamilase, ou uma cultura do microrganismo.
18. Método, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado pelo fato de o contato ser realizado em pH 5,0 a 9,0, 40 °C a 80 °C, e/ou por 0,5 horas a 24 horas.
19. Método, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado pelo fato de a tagatose-6-fosfato quinase consistir em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, 3, ou 5, e a fosfatase de tagatose-6-fosfato consistir em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7.
20. Método para produzir tagatose caracterizado
Petição 870190096621, de 27/09/2019, pág. 23/27
4. Composição para produzir tagatose caracterizada pelo fato de compreender tagatose-6-fosfato quinase, um microrganismo que expressa a tagatose-6-fosfato quinase, ou uma cultura do microrganismo; e fosfatase de tagatose-6fosfato, um microrganismo que expressa a fosfatase de tagatose-6-fosfato, ou uma cultura do microrganismo.
5. Composição, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de compreender ainda frutose-6fosfato.
6. Composição, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de compreender ainda glicose-6fosfato isomerase, um microrganismo que expressa a glicose6-fosfato isomerase, ou uma cultura do microrganismo.
Petição 870190096621, de 27/09/2019, pág. 20/27
5/5 pelo fato de compreender colocar em contato (a) amido, maltodextrina, sacarose, ou uma combinação das mesmas; com (b) (1) fosfatase de tagatose-6-fosfato, (11) tagatose-6fosfato quinase, (ill) glicose-6-fosfato-isomerase, (iv) fosfoglicomutase ou glicoquinase, (v) fosforilase, e (vi) uma ou mais dentre α-amilase, pululanase, isoamilase, glicoamilase, ou sacarase; e (c) fosfato.
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