ES2867958T3 - Producción enzimática de D-tagatosa - Google Patents

Abstract

Un proceso enzimático para preparar tagatosa, comprendiendo el proceso las etapas de: (i) convertir fructosa 6-fosfato (F6P) en tagatosa 6-fosfato (T6P) catalizado por una fructosa 6-fosfato epimerasa (F6PE); y (ii) convertir la T6P producida en tagatosa catalizado por una tagatosa 6-fosfato fosfatasa (T6PP), en el que las etapas del proceso (i) y (ii) se llevan a cabo en un solo recipiente de reacción, y en el que las etapas del proceso están libres de ATP.

Description

DESCRIPCIÓN

Producción enzimática de D-tagatosa

Campo de la invención

La invención se refiere a la preparación del azúcar D-tagatosa. Más específicamente, la invención se refiere a métodos de preparación de D-tagatosa mediante la conversión enzimática de fructosa-6-fosfato (F6P) en tagatosa-6-fosfato (T6P) y la conversión de T6P en D-tagatosa, en la que las etapas se llevan a cabo en una recipiente de reacción único, y en la que las etapas del proceso están libres de ATP.

Antecedentes de la invención

La D-tagatosa (en lo sucesivo tagatosa) es un edulcorante natural bajo en calorías que tiene un 92% del dulzor de la sacarosa, pero solo el 38% de las calorías. Es una hexosa monosacárido de origen natural que está presente solo en pequeñas cantidades en frutas, cacao y productos lácteos. La tagatosa fue aprobada como aditivo alimentario por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) en 2003, que la designó como generalmente reconocida como segura (GRAS). Sin embargo, debido a los altos precios de venta de la tagatosa, su uso como edulcorante ha sido limitado. La tagatosa cuenta con una gran variedad de beneficios para la salud: no es cariogénica; es baja en calorías; tiene un índice glucémico muy bajo de 3; atenúa el índice glucémico de la glucosa en un 20%; puede reducir los niveles medios de glucosa en sangre; ayuda a prevenir enfermedades cardiovasculares, accidentes cerebrovasculares y otras enfermedades vasculares al aumentar el colesterol de lipoproteínas de alta densidad (HDL); y es un prebiótico y antioxidante verificado. Lu et al., Tagatose, a New Antidiabetic and Obesity Control Drug, Diabetes Obes. Metab. 10(2): 109-34 (2008). Como tal, la tagatosa tiene claramente una variedad de aplicaciones en las industrias farmacéutica, biotecnológica, académica, alimentaria, de bebidas, de suplementos dietéticos y de abarrotes.

Actualmente, la tagatosa se produce predominantemente a través de la hidrólisis de lactosa por lactasa o hidrólisis ácida para formar D-glucosa y D-galactosa (documentos WO 2011150556, CN 103025894, US 5002612, US 6057135 y US 8802843). A continuación, la D-galactosa se isomeriza hasta D-tagatosa químicamente mediante hidróxido de calcio en condiciones alcalinas o enzimáticamente mediante L-arabinosa isomerasa en condiciones de pH neutro. El producto final se aísla mediante una combinación de filtración y cromatografía de intercambio iónico. Este proceso se realiza en varios tanques o biorreactores. En general, el método sufre debido a la costosa separación de otros azúcares (por ejemplo, D-glucosa, D-galactosa y lactosa no hidrolizada) y los bajos rendimientos de producto. Se están desarrollando varios métodos a través de la fermentación de células microbianas, pero ninguno ha demostrado ser una alternativa práctica debido a su dependencia de materia prima costosa (por ejemplo, galactitol y D-psicosa), bajos rendimientos de producto y costosa separación.

Existe la necesidad de desarrollar una ruta sintética rentable para la producción de tagatosa con alto rendimiento en la que al menos una etapa del proceso implica una reacción química energéticamente favorable. Además, existe la necesidad de un proceso de producción de tagatosa en el que las etapas del proceso se puedan realizar en un tanque o biorreactor. También existe la necesidad de un proceso de producción de tagatosa que pueda realizarse a una concentración relativamente baja de fosfato, en la que el fosfato pueda reciclarse y/o el proceso no requiera el uso de trifosfato de adenosina (ATP) como fuente de fosfato. También existe la necesidad de una ruta de producción de tagatosa que no requiera el uso de la costosa coenzima nicotinamida adenosina dinucleótido (NAD(H)) en ninguna de las etapas de reacción.

El documento KR101480422 (B1) describe un proceso para preparar tagatosa a partir de fructosa mediante la ruta fructosa-6-fosfato y tagatosa-6-fosfato, que implica el uso de ATP.

El documento CA 2912 540 (CJ CHEILJEDANG), 2014, describe un método de producción de tagatosa en el que la fructosa se convierte en tagatosa con una cetohexosa C4-epimerasa.

Bosshart et al., ChemBioChem; 2015, páginas 592-601, describen la conversión de sorbosa en tagatosa usando una epimerasa de Pseudomonas cichorii.

Xu et al., Biochemical Engineering Journal; Diciembre de 2015, páginas 28-34, describen la isomerización de galactosa a tagatosa.

Sumario de la invención

Las invenciones descritas en este documento se refieren a procesos para preparar tagatosa. En varios aspectos, los procesos implican convertir fructosa 6-fosfato (F6P) en tagatosa 6-fosfato (T6P), catalizado por una epimerasa; y convertir la T6P en tagatosa, catalizado por una fosfatasa, en los que las etapas del proceso se llevan a cabo en un solo recipiente de reacción y en los que las etapas del proceso están libres de ATP.

En algunas realizaciones de la invención, un proceso para preparar tagatosa también implica la etapa de convertir glucosa 6-fosfato (G6P) en F6P, en el que la etapa es catalizado por fosfoglucosa isomerasa (PGI). En otros aspectos, un proceso para la síntesis de tagatosa también incluye la etapa de convertir glucosa 1-fosfato (G1P) en G6P, y esta etapa de conversión es catalizado por fosfoglucomutasa (PGM).

En diversas realizaciones, un proceso para preparar tagatosa puede implicar convertir un sacárido en la G1P, catalizado por al menos una enzima; convertir G1P en G6P, catalizado por fosfoglucomutasa (PGM); convertir G6P en F6P, catalizado por fosfoglucosa isomerasa (PGI); convertir F6P en tagatosa 6-fosfato (T6P), catalizado por una epimerasa; y convertir la T6P producida en tagatosa, catalizado por una fosfatasa.

Los sacáridos usados en cualquiera de los procesos pueden seleccionarse del grupo que consiste en almidón o su derivado, celulosa o su derivado y sacarosa. El almidón o su derivado puede ser amilosa, amilopectina, almidón soluble, amilodextrina, maltodextrina, maltosa o glucosa. En algunas realizaciones de la invención, un proceso para preparar tagatosa implica convertir almidón en un derivado de almidón por hidrólisis enzimática o por hidrólisis ácida del almidón. En otros aspectos, se puede preparar un derivado de almidón mediante hidrólisis enzimática de almidón catalizado por isoamilasa, pululanasa, alfa-amilasa o una combinación de dos o más de estas enzimas. Un proceso para preparar tagatosa, en ciertos aspectos, también puede implicar la adición de 4-glucano transferasa (4GT).

El proceso para preparar tagatosa implica convertir fructosa en la F6P, catalizado por al menos una enzima; convertir F6P en tagatosa 6-fosfato (T6P) catalizado por una epimerasa; y convertir la T6P producida en tagatosa, catalizado por una fosfatasa. En otras realizaciones, un proceso de producción de tagatosa implica convertir sacarosa en fructosa, catalizado por al menos una enzima; convertir fructosa en la F6P, catalizado por al menos una enzima; convertir F6P en tagatosa 6-fosfato (T6P) catalizado por una epimerasa; y convertir la T6P producida en tagatosa, catalizado por una fosfatasa.

En otros aspectos de la invención, la G6P que se utilizará en un proceso para preparar tagatosa se puede generar convirtiendo glucosa en la G6P, catalizado por al menos una enzima. La glucosa, a su vez, puede producirse convirtiendo sacarosa en glucosa, catalizado por al menos una enzima.

En el proceso de la invención, la epimerasa usada para convertir F6P en T6P es fructosa 6-fosfato epimerasa. La fructosa 6-fosfato epimerasa puede estar codificada por un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 97%, al menos 99% o 100% de identidad de secuencia con las SEQ ID NOS.: 1, 3, 5, 7, 9 o 10. En varios aspectos, la fructosa 6-fosfato epimerasa comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 97%, al menos 99% o 100% de identidad de secuencia con las SEQ ID NOS.: 2, 4, 6, 8 u 11.

En el proceso de la invención, la fosfatasa usada para convertir T6P en tagatosa es tagatosa 6-fosfato fosfatasa. La tagatosa 6-fosfato fosfatasa puede estar codificada por un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 97 %, al menos 99% o 100% de identidad de secuencia con las SEQ ID NOS.: 12, 14 o 16. En algunos aspectos del proceso, la tagatosa 6-fosfato fosfatasa comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 97%, al menos 99% o 100% de identidad de secuencia con las SEQ ID NOS.: 13, 15, o 17.

En varios aspectos, un proceso de la invención se lleva a cabo a una temperatura que varía de aproximadamente 40 °C a aproximadamente 70 °C, a un pH que varía de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 8,0 y/o durante aproximadamente 8 horas a aproximadamente 48 horas. En algunos aspectos, las etapas de un proceso para preparar tagatosa se llevan a cabo en un biorreactor. En otros aspectos, las etapas se llevan a cabo en una pluralidad de biorreactores dispuestos en serie.

En otros aspectos de la invención, las etapas de un proceso para preparar tagatosa se llevan a cabo sin NAD(H), a una concentración de fosfato de aproximadamente 0 mM a aproximadamente 150 mM, el fosfato se recicla y/o al menos una etapa del proceso implica una reacción química energéticamente favorable.

Breve descripción de las Figuras

Estos dibujos ilustran ciertos aspectos de algunas de las realizaciones de la invención y no deben usarse para limitar o definir la invención.

La FIG. 1 es un diagrama esquemático que ilustra una ruta enzimática que convierte fructosa 6-fosfato en tagatosa 6-fosfato y luego en D-tagatosa (tagatosa).

La FIG. 2 es un diagrama esquemático que ilustra una ruta enzimática que convierte el almidón o sus productos derivados en tagatosa. Se utilizan las siguientes abreviaturas: aGP, alfa-glucano fosforilasa o almidón fosforilasa; PGM, fosfoglucomutasa; PGI, fosfoglucoisomerasa; F6PE, fructosa 6-fosfato epimerasa; T6PP, tagatosa 6-fosfato fosfatasa; IA, isoamilasa; PA, pululanasa; MP, maltosa fosforilasa; PPGK, polifosfato glucoquinasa.

La FIG. 3 muestra una ruta enzimática que convierte la celulosa o sus productos derivados en tagatosa. CDP, celodextrina fosforilasa; CBP, celobiosa fosforilasa; PPGK, polifosfato glucoquinasa; PGM, fosfoglucomutasa; PGI, fosfoglucoisomerasa; F6PE, fructosa 6-fosfato epimerasa; T6PP, tagatosa 6-fosfato fosfatasa.

La FIG. 4 es un diagrama esquemático que ilustra una ruta enzimática que convierte fructosa en tagatosa. PPFK, polifosfato fructoquinasa; F6PE, fructosa 6-fosfato epimerasa; T6PP, tagatosa 6-fosfato fosfatasa.

La FIG. 5 es un diagrama esquemático que ilustra una ruta enzimática que convierte glucosa en tagatosa. PPGK, polifosfato glucoquinasa; PGI, fosfoglucoisomerasa; F6PE, fructosa 6-fosfato epimerasa; T6PP, tagatosa 6-fosfato fosfatasa.

La FIG. 6 muestra una ruta enzimática que convierte la sacarosa o sus productos derivados en tagatosa. SP, sacarosa fosforilasa; PPFK, polifosfato fructoquinasa; PGM, fosfoglucomutasa; PGI, fosfoglucoisomerasa; F6PE, fructosa 6-fosfato epimerasa; T6PP, tagatosa 6-fosfato fosfatasa.

La FIG. 7 muestra la energía de Gibbs de reacción entre compuestos intermedios basada en la energía de Gibbs de formación para la conversión de glucosa 1-fosfato en tagatosa.

Descripción detallada de la invención

La invención proporciona rutas o procesos enzimáticos para sintetizar tagatosa con un alto rendimiento de producto, al tiempo que se reducen en gran medida los costes de separación del producto y los costes de producción de tagatosa.

La invención se refiere a un proceso para preparar tagatosa en el que el proceso implica convertir fructosa 6-fosfato (F6P) en tagatosa 6-fosfato (T6P) catalizado por una epimerasa y convertir la T6P producida en tagatosa catalizado por una fosfatasa (por ejemplo, tagatosa 6-fosfato fosfatasa, T6PP). Este proceso se muestra generalmente en la FIG.

1. La epimerasa que cataliza la conversión de F6P en T6P es fructosa 6-fosfato epimerasa (F6PE).

En algunas realizaciones de la invención, las epimerasas adecuadas para su uso en los procesos para convertir F6P en T6P comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad con la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOS.: 2, 4, 6, 8, u 11 (mostradas a continuación), de al menos 60%, preferiblemente al menos 65%, más preferiblemente al menos 70%, más preferiblemente al menos 75%, más preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 85%, incluso más preferiblemente al menos 90%, lo más preferiblemente al menos 95%, e incluso lo más preferiblemente al menos 96%, 97%, 98%, 99% o 100%. Las epimerasas adecuadas están codificadas por un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene un grado de identidad con la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID NOS.: 1, 3, 5, 7, 9 o 10 (que se muestran a continuación), de al menos 60%, preferiblemente al menos 65%, más preferiblemente al menos 70%, más preferiblemente al menos 75%, más preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 85%, incluso más preferiblemente al menos 90%, lo más preferiblemente al menos 95%, e incluso más preferiblemente al menos 96%, 97%, 98%, 99% o 100%.

La divulgación también se refiere a epimerasas que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad con la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOS.: 2, 4, 6, 8 u 11, de al menos 60%, preferiblemente al menos 65%, más preferiblemente al menos 70%, más preferiblemente al menos 75%, más preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 85%, incluso más preferiblemente al menos 90%, lo más preferiblemente al menos 95%, e incluso lo más preferiblemente al menos 96%, 97%, 98%, 99% o 100%. En otros aspectos, la divulgación se refiere a epimerasas que están codificadas por un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene un grado de identidad con la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID NOS.: 1, 3, 5, 7, 9 o 10, de al menos 60%, preferiblemente al menos 65%, más preferiblemente al menos 70%, más preferiblemente al menos 75%, más preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 85%, incluso más preferiblemente al menos 90%, lo más preferiblemente al menos 95%, e incluso lo más preferiblemente al menos 96%, 97%, 98%, 99% o 100%.

Se pueden usar fosfatasas que convierten T6P en tagatosa (D-tagatosa) en un proceso de la invención. En algunos aspectos de la invención, las fosfatasas que pueden usarse para convertir T6P en tagatosa (D-tagatosa) comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad con la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOS.: 12, 14 o 16 (mostradas a continuación), de al menos 60%, preferiblemente al menos 65%, más preferiblemente al menos 70%, más preferiblemente al menos 75%, más preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 85%, incluso más preferiblemente al menos 90%, lo más preferiblemente al menos 95%, e incluso lo más preferiblemente al menos 96%, 97%, 98%, 99% o 100%. Las tagatosa fosfatasas están codificadas por un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene un grado de identidad con la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID NOS.: 13, 15 o 17 (que se muestran a continuación), de al menos 60%, preferiblemente al menos 65%, más preferiblemente al menos 70%, más preferiblemente al menos 75%, más preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 85%, incluso más preferiblemente al menos 90%, lo más preferiblemente al menos 95%, e incluso lo más preferiblemente al menos 96%, 97%, 98%, 99% o 100%.

Se describen además fosfatasas que convierten T6P en tagatosa (D-tagatosa) y comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad con la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOS.: 12, 14 o 16, de al menos 60%, preferiblemente al menos 65%, más preferiblemente al menos 70%, más preferiblemente al menos 75%, más preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 85%, incluso más preferiblemente al menos 90%, lo más preferiblemente al menos 95%, e incluso lo más preferiblemente al menos 96%, 97%, 98%, 99% o 100%. En varios aspectos, la divulgación se refiere a fosfatasas que convierten T6P en tagatosa (D-tagatosa) y están codificadas por un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene un grado de identidad con la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID NOS.: 13, 15 o 17, de al menos 60%, preferiblemente al menos 65%, más preferiblemente al menos 70%, más preferiblemente al menos 75%, más preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 85%, incluso más preferiblemente al menos 90%, lo más preferiblemente al menos el 95%, e incluso lo más preferiblemente al menos el 96%, 97%, 98%, 99% o 100%.

En algunas realizaciones, un proceso para preparar tagatosa de acuerdo con la invención también incluye la etapa de convertir enzimáticamente glucosa 6-fosfato (G6P) en la F6P, y esta etapa es catalizada por fosfoglucosa isomerasa (PGI). En otras realizaciones, el proceso para preparar tagatosa incluye adicionalmente la etapa de convertir glucosa 1-fosfato (G1P) en la G6P, en el que la etapa es catalizada por fosfoglucomutasa (PGM). En otras realizaciones más, el proceso de producción de tagatosa también incluye la etapa de convertir un sacárido en la G1P que está catalizado por al menos una enzima.

Por lo tanto, un proceso para preparar tagatosa de acuerdo con la invención puede incluir, por ejemplo, las siguientes etapas: (i) convertir un sacárido en glucosa 1-fosfato (G1P) usando una o más enzimas; (ii) convertir G1P en G6P usando fosfoglucomutasa (PGM, EC 5.4.2.2); (iii) convertir G6P en F6P usando fosfoglucoisomerasa (PGI, EC 5.3.1.9); (iv) convertir F6P en T6P mediante fructosa 6-fosfato epimerasa (F6PE), y (v) convertir T6P en tagatosa mediante tagatosa 6-fosfato fosfatasa (T6PP). Un ejemplo del proceso en el que el sacárido es almidón se muestra en la FIG.

2.

Normalmente, las proporciones de unidades enzimáticas utilizadas en el proceso descrito son 1:1:1:1:1 (aGP:PGM: PGI:F6PE:T6PP). Para optimizar los rendimientos del producto, estas proporciones se pueden ajustar en cualquier número de combinaciones. Por ejemplo, se puede usar una proporción de 3:1:1:1:1 para maximizar la concentración de compuestos intermedios fosforilados, lo que dará como resultado un aumento de la actividad de las reacciones posteriores. Por el contrario, se puede usar una proporción de 1:1:1:1:3 para mantener un suministro sólido de fosfato para aGP, lo que dará como resultado una escisión fosforolítica más eficiente de los enlaces alfa-1,4-glicosídicos. Se puede usar una proporción de enzimas, por ejemplo, 3:1:1:1:3 para aumentar aún más la velocidad de reacción. Por lo tanto, las proporciones de enzimas, incluidas otras enzimas opcionales que se analizan a continuación, se pueden variar para aumentar la eficacia de la producción de tagatosa. Por ejemplo, una enzima particular puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 2x, 3x, 4x, 5x, etc. en relación con la cantidad de otras enzimas.

Una de las ventajas importantes de los procesos es que las etapas del proceso se pueden realizar en un biorreactor o recipiente de reacción. Alternativamente, pero no como parte de la invención, las etapas también se pueden realizar en una pluralidad de biorreactores, o recipientes de reacción, que están dispuestos en serie.

Los iones fosfato producidos por la desfosforilación de T6PP de T6P pueden luego reciclarse en la etapa del proceso de convertir un sacárido en G1P, particularmente cuando todas las etapas del proceso se llevan a cabo en un solo biorreactor o recipiente de reacción. La capacidad de reciclar fosfato en los procesos descritos permite utilizar cantidades no estequiométricas de fosfato, lo que mantiene bajas las concentraciones de fosfato en la reacción. Esto afecta la ruta general y la velocidad general de los procesos, pero no limita la actividad de las enzimas individuales y permite la eficiencia general de los procesos de producción de tagatosa.

Por ejemplo, las concentraciones de fosfato en la reacción pueden variar de aproximadamente 0 mM a aproximadamente 300 mM, de aproximadamente 0 mM a aproximadamente 150 mM, de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM, preferiblemente de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 50 mM, o más preferiblemente de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM. Por ejemplo, la concentración de fosfato en la reacción puede ser de aproximadamente 0,1 mM, aproximadamente 0,5 mM, aproximadamente 1 mM aproximadamente 1,5 mM, aproximadamente 2 mM, aproximadamente 2,5 mM, aproximadamente 5 mM, aproximadamente 6 mM, aproximadamente 7 mM, aproximadamente 8 mM, aproximadamente 9 mM, aproximadamente 10 mM, aproximadamente 15 mM, aproximadamente 20 mM, aproximadamente 25 mM aproximadamente 30 mM, aproximadamente 35 mM, aproximadamente 40 mM, aproximadamente 45 mM, aproximadamente 50 mM o aproximadamente 55 mM.

Por lo tanto, una concentración baja de fosfato da como resultado costes de producción reducidos debido al fosfato total bajo y, por lo tanto, coste reducido de eliminación de fosfato. También previene la inhibición de T6PP por altas concentraciones de fosfato libre y disminuye el potencial de contaminación por fosfato.

Además, los procesos de la invención se llevan a cabo sin ATP añadido como fuente de fosfato, es decir, sin ATP. Los procesos también se pueden realizar sin tener que añadir NAD(H), es decir, sin NAD(H). Otras ventajas también incluyen el hecho de que al menos una etapa de los procesos descritos para preparar tagatosa implica una reacción química energéticamente favorable (FIG. 7).

Los ejemplos de las enzimas utilizadas para convertir un sacárido en G1P incluyen alfa-glucano fosforilasa (aGP, EC 2.4.1.1), maltosa fosforilasa (MP, EC 2.4.1.8), celodextrina fosforilasa (CDP, EC 2.4.1.49), celobiosa fosforilasa (CBP, EC 2.4.1.20), celulosa fosforilasa, sacarosa fosforilasa (SP, EC 2.4.1.7) y una combinación de las mismas. La elección de la enzima o combinación de enzimas depende del sacárido utilizado en el proceso.

Los sacáridos usados para generar G1P pueden ser polisacáridos, oligosacáridos y/o disacáridos. Por ejemplo, el sacárido puede ser almidón, uno o más derivados de almidón, celulosa, uno o más derivados de celulosa, sacarosa, uno o más derivados de sacarosa o una combinación de los mismos.

El almidón es el compuesto de almacenamiento de energía más ampliamente utilizado en la naturaleza y se almacena principalmente en semillas de plantas. El almidón natural contiene amilosa lineal y amilopectina ramificada. Los ejemplos de derivados de almidón incluyen amilosa, amilopectina, almidón soluble, amilodextrina, maltodextrina, maltosa, fructosa y glucosa. Los ejemplos de derivados de celulosa incluyen biomasa pretratada, celulosa amorfa regenerada, celodextrina, celobiosa, fructosa y glucosa. Los derivados de sacarosa incluyen fructosa y glucosa.

Los derivados del almidón se pueden preparar mediante hidrólisis enzimática del almidón o mediante hidrólisis ácida del almidón. Específicamente, la hidrólisis enzimática del almidón puede ser catalizada o potenciada por isoamilasa (IA, EC. 3.2.1.68), que hidroliza enlaces a-1,6-glucosídicos; pululanasa (PA, EC. 3.2.1.41), que hidroliza enlaces a-1,6-glucosídicos; 4-a-glucanotransferasa (4GT, EC. 2.4.1.25), que cataliza la transglicosilación de maltooligosacáridos cortos, produciendo maltooligosacáridos más largos; o alfa-amilasa (EC 3.2.1.1), que escinde enlaces a-1,4-glucosídicos.

Además, se pueden preparar derivados de celulosa mediante hidrólisis enzimática de celulosa catalizada por mezclas de celulasa, por ácidos o por pretratamiento de biomasa.

En determinadas realizaciones, las enzimas utilizadas para convertir un sacárido en G1P contienen aGP. En esta etapa, cuando los sacáridos incluyen almidón, la G1P se genera a partir del almidón mediante aGP; cuando los sacáridos contienen almidón soluble, amilodextrina o maltodextrina, la G1P se produce a partir de almidón soluble, amilodextrina o maltodextrina por aGP.

Cuando los sacáridos incluyen maltosa y las enzimas contienen maltosa fosforilasa, la G1P se genera a partir de maltosa mediante maltosa fosforilasa. Si los sacáridos incluyen sacarosa y las enzimas contienen sacarosa fosforilasa, la G1P se genera a partir de sacarosa por la sacarosa fosforilasa.

En otra realización más, cuando los sacáridos incluyen celobiosa y las enzimas contienen celobiosa fosforilasa, la G1P se genera a partir de celobiosa mediante celobiosa fosforilasa.

En una realización adicional, cuando los sacáridos contienen celodextrinas y las enzimas incluyen celodextrina fosforilasa, la G1P se genera a partir de celodextrinas mediante celodextrina fosforilasa.

En una realización alternativa de convertir un sacárido en G1P, cuando los sacáridos incluyen celulosa y las enzimas contienen celulosa fosforilasa, la G1P se genera a partir de celulosa por celulosa fosforilasa.

De acuerdo con la invención, la tagatosa también se puede producir a partir de fructosa. Un ejemplo del proceso se muestra en la FIG. 4. Por ejemplo, el proceso implica generar F6P a partir de fructosa y polifosfato catalizados por polifosfato fructoquinasa (PPFK); convertir F6P en T6P catalizado por F6PE; y convertir T6P en tagatosa catalizado por T6PP. La fructosa se puede producir, por ejemplo, mediante una conversión enzimática de sacarosa.

En otras realizaciones, la tagatosa se puede producir a partir de sacarosa. Un ejemplo de tal proceso se muestra en la FIG. 6. El proceso proporciona una ruta sintética in vitro que incluye las siguientes etapas enzimáticas: generar G1P a partir de sacarosa y fosfato libre catalizado por sacarosa fosforilasa (SP); convertir G1P en G6P catalizado por PGM; convertir G6P en F6P catalizado por PGI; convertir F6P en T6P catalizado por F6PE; y convertir T6P en tagatosa catalizado por T6PP.

Los iones fosfato generados cuando T6P se convierte en tagatosa se pueden reciclar en la etapa de conversión de sacarosa en G1P. Además, como se muestra en la FIG. 6, PPFK y polifosfato pueden usarse para aumentar los rendimientos de tagatosa produciendo F6P a partir de fructosa generada por la escisión fosforolítica de sacarosa por SP.

En algunas realizaciones, un proceso para preparar tagatosa incluye las siguientes etapas: generar glucosa a partir de polisacáridos y oligosacáridos por hidrólisis enzimática o hidrólisis ácida, convertir glucosa en G6P catalizado por al menos una enzima, generar fructosa a partir de polisacáridos y oligosacáridos por hidrólisis enzimática o hidrólisis ácida y conversión de fructosa en G6P catalizado por al menos una enzima. Los ejemplos de polisacáridos y oligosacáridos se enumeraron anteriormente.

En otras realizaciones, G6P se produce a partir de glucosa y polifosfato de sodio mediante polifosfato glucoquinasa.

La presente divulgación proporciona procesos para convertir sacáridos, tales como polisacáridos y oligosacáridos en almidón, celulosa, sacarosa y sus productos derivados, en tagatosa. En las realizaciones de la invención, se proporcionan rutas enzimáticas libres de ATP artificiales (no naturales) para convertir almidón, celulosa, sacarosa y sus productos derivados en tagatosa usando cócteles de enzimas libres de células.

Como se mostró anteriormente, se pueden usar varias enzimas para hidrolizar almidón para aumentar el rendimiento de G1P. Tales enzimas incluyen isoamilasa, pululanasa y alfa-amilasa. El almidón de maíz contiene muchas ramas que impiden la acción de aGP. Se puede usar isoamilasa para desramificar el almidón, pro duciendo amilodextrina lineal. El almidón pretratado con isoamilasa puede resultar en una mayor concentración de F6P en el producto final. La isoamilasa y la pululanasa rompen los enlaces alfa-1,6-glicosídicos, lo que permite una degradación más completa del almidón por la alfa-glucano fosforilasa. La alfa-amilasa escinde los enlaces alfa-1,4-glicosídicos, por lo tanto, la alfa-amilasa se usa para degradar el almidón en fragmentos para una conversión más rápida en tagatosa.

Como se muestra en la FIG. 2, la maltosa fosforilasa (MP) se puede utilizar para aumentar los rendimientos de tagatosa escindiendo fosforolíticamente el producto de degradación maltosa en G1P y glucosa. Alternativamente, se puede usar 4-glucano transferasa (4GT) para aumentar los rendimientos de tagatosa reciclando los productos de degradación glucosa, maltosa y maltotriosa en maltooligosacáridos más largos; que se pueden escindir fosforolíticamente por aGP para producir G1P.

Además, la celulosa es el recurso biológico más abundante y es el componente principal de las paredes celulares de las plantas. La biomasa lignocelulósica no alimentaria contiene celulosa, hemicelulosa y lignina, así como otros componentes menores. La celulosa pura, que incluye Avicel (celulosa microcristalina), celulosa amorfa regenerada, celulosa bacteriana, papel de filtro, etc., se puede preparar mediante una serie de tratamientos. Los sustratos celulósicos parcialmente hidrolizados incluyen celodextrinas insolubles en agua cuyo grado de polimerización es superior a 7, celodextrinas solubles en agua con un grado de polimerización de 3-6, celobiosa, glucosa y fructosa.

En determinadas realizaciones, la celulosa y sus productos derivados se pueden convertir en tagatosa mediante una serie de etapas. Un ejemplo de tal proceso se muestra en la FIG. 3. El proceso proporciona una ruta de síntesis in vitro que implica las siguientes etapas: generar G1P a partir de celodextrina y celobiosa y fosfato libre catalizado por celodextrina fosforilasa (CDP) y celobiosa fosforilasa (CBP), respectivamente; convertir G1P en G6P catalizado por PGM; convertir G6P en F6P catalizado por PGI; convertir F6P en T6P catalizado por F6PE; y convertir T6P en tagatosa catalizado por T6PP. En este proceso, los iones fosfato se pueden reciclar mediante la etapa de convertir celodextrina y celobiosa en G1P.

Pueden usarse varias enzimas para hidrolizar celulosa sólida a celodextrinas solubles en agua y celobiosa. Tales enzimas incluyen endoglucanasa y celobiohidrolasa, pero no incluyen beta-glucosidasa (celobiosa).

Antes de la hidrólisis de celulosa y la generación de G1P, la celulosa y la biomasa se pueden pretratar para aumentar su reactividad y disminuir el grado de polimerización de las cadenas de celulosa. Los métodos de pretratamiento de celulosa y biomasa incluyen pretratamiento con ácido diluido, fraccionamiento de lignocelulosa a base de solvente de celulosa, expansión de fibra de amoníaco, remojo acuoso de amoníaco, tratamiento con líquido iónico y parcialmente hidrolizado mediante el uso de ácidos concentrados, incluidos ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico y sus combinaciones.

En algunas realizaciones, se puede añadir polifosfato y polifosfato glucoquinasa (PPGK) al proceso, aumentando así los rendimientos de tagatosa al fosforilar el producto de degradación glucosa a G6P, como se muestra en la FIG. 3.

En otras realizaciones, la tagatosa se puede generar a partir de glucosa. Un ejemplo de tal proceso se muestra en la FIG. 5. El proceso involucra las etapas de generar G6P a partir de glucosa y polifosfato catalizados por polifosfato glucoquinasa (PPGK); convertir G6P en F6P catalizado por PGI; convertir F6P en T6P catalizado por F6PE; y convertir T6P en tagatosa catalizado por T6PP.

Se puede usar cualquier tampón biológico adecuado conocido en la técnica en un proceso de la invención, tal como HEPES, PBS, BIS-TRIS, MOPS, DIPSO, Trizma, etc. El tampón de reacción para todas las realizaciones puede tener un intervalo de pH desde 5,0-8,0. Más preferiblemente, el pH del tampón de reacción puede oscilar entre aproximadamente 6,0 y aproximadamente 7,3. Por ejemplo, el pH del tampón de reacción puede ser 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2 o 7,3.

El tampón de reacción también puede contener cationes metálicos clave. Los ejemplos de iones metálicos incluyen Mg2+ y Zn2+.

La temperatura de reacción a la que se llevan a cabo las etapas del proceso puede oscilar entre 37 y 85 °C. Más preferiblemente, las etapas se pueden realizar a una temperatura que varía de aproximadamente 40 °C a aproximadamente 70 °C. La temperatura puede ser, por ejemplo, aproximadamente 40 °C, aproximadamente 45 °C, aproximadamente 50 °C, aproximadamente 55 °C o aproximadamente 60 °C. Preferiblemente, la temperatura de reacción es de aproximadamente 50 °C.

El tiempo de reacción de los procesos descritos se puede ajustar según sea necesario y puede oscilar entre aproximadamente 8 horas y aproximadamente 48 horas. Por ejemplo, el tiempo de reacción puede ser de aproximadamente 16 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 22 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 26 horas, aproximadamente 28 horas, aproximadamente 30 horas, aproximadamente 32 horas, aproximadamente 34 horas, aproximadamente 36 horas. horas, alrededor de 38 horas, alrededor de 40 horas, alrededor de 42 horas, alrededor de 44 horas, alrededor de 46 horas o alrededor de 48 horas. Más preferiblemente, el tiempo de reacción es de aproximadamente 24 horas.

Los procesos de acuerdo con la invención pueden lograr altos rendimientos debido a la constante de equilibrio muy favorable para la reacción global. Por ejemplo, la FIG. 7 muestra la energía de Gibbs de reacción entre compuestos intermedios con base en la energía de formación de Gibbs para la conversión de glucosa 1-fosfato en tagatosa. Las energías de reacción de Gibbs se generaron utilizando http://equilibrator.weizmann.ac.il/. Teóricamente, se pueden lograr rendimientos de hasta el 99% si el material de partida se convierte completamente en un compuesto intermedio.

Los procesos de la invención usan materiales de partida de bajo coste y reducen los costes de producción al disminuir los costes asociados con la materia prima y la separación del producto. El almidón, la celulosa, la sacarosa y sus derivados son materias primas menos costosas que, por ejemplo, la lactosa. Cuando la tagatosa se produce a partir de lactosa, la glucosa, la galactosa y la tagatosa se separan mediante cromatografía, lo que conduce a mayores costes de producción.

Además, la etapa de convertir T6P en tagatosa de acuerdo con la invención es una reacción de fosfatasa irreversible, independientemente de la materia prima. Por lo tanto, la tagatosa se produce con un rendimiento muy alto y, al mismo tiempo, minimiza eficazmente los costes posteriores de separación del producto.

A diferencia de los métodos de fabricación basados en células, la invención implica una preparación de tagatosa libre de células, tiene velocidades de reacción relativamente altas debido a la eliminación de la membrana celular, que a menudo ralentiza el transporte de sustrato/producto hacia adentro y hacia afuera de la célula. También tiene un producto final libre de medios de fermentación ricos en nutrientes/metabolitos celulares.

Ejemplos

Materiales y métodos

Productos químicos

Todos los productos químicos, incluido el almidón de maíz, almidón soluble, maltodextrinas, maltosa, glucosa, papel de filtro fueron de grado reactivo o superior y se adquirieron a través de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.) O Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, EE. UU.), a menos que se indique lo contrario. Las enzimas de restricción, la ligasa T4 y la ADN polimerasa Phusion se adquirieron a través de New England Biolabs (Ipswich, MA, EE. UU.). Los oligonucleótidos se sintetizaron mediante Tecnologías integradas de ADN (Coralville, IA, EE. UU.), o un operón MWG de Eurofins (Huntsville, AL, EE. UU.). La celulosa amorfa regenerada utilizada en la purificación de enzimas se preparó a partir de Avicel PH105 (FMC BioPolymer, Filadelfia, PA, EE. UU.) mediante su disolución y regeneración, tal como se describe en: Fusion of a family 9 cellulose-binding module improves catalytic potential of Clostridium thermocellum cellodextrin phosphorylase on insoluble cellulose. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2011; 92:551-560. Se utilizó Escherichia coli Sig10 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) Como célula huésped para la manipulación del ADN y E. coli BL21 (DE3) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) célula huésped para la expresión de proteínas recombinantes. Se usó medio ZYM-5052 que incluía 100 mg L'1 de ampicilina o 50 mg L'1 de kanamicina para el crecimiento de células de E. coli y la expresión de proteínas recombinantes. La celulasa de Trichoderma reesei (número de catálogo: C2730) y la pululanasa (número de catálogo: P1067) se adquirieron a través de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.) y fueron producidas por Novozymes (Franklinton, NC, EE. UU.). La maltosa fosforilasa (número de catálogo: M8284) se adquirió a través de Sigma-Aldrich.

Producción y purificación de enzimas recombinantes.

La cepa de E. coli BL21 (DE3) que alberga un plásmido de expresión de proteínas se incubó en un matraz Erlenmeyer de 1 L con 100 ml de medio ZYM-5052 que contenía 100 mg L_1 de ampicilina o 50 mg L_1 de kanamicina. Las células se cultivaron a 37 °C con agitación rotatoria a 220 rpm durante 16-24 horas. Las células se recolectaron por centrifugación a 12 °C y se lavaron una vez con HEPES 20 mM (pH 7,5) que contenía NaCl 50 mM y MgCl² 5 mM (módulo de precipitación térmica y unión a celulosa) o HEPES 20 mM (pH 7,5) que contenía NaCl 300 mM e imidazol 5 mM (purificación por Ni). Los sedimentos celulares se resuspendieron en el mismo tampón y se lisaron por ultrasonido (Fisher Scientific Sonic Dismembrator Model 500; pulso de 5 s encendido y 10 s apagado, total 21 min al 50% de amplitud). Después de la centrifugación, se purificaron las proteínas diana en los sobrenadantes.

Se utilizaron tres enfoques para purificar las diversas proteínas recombinantes. Las proteínas marcadas con His se purificaron mediante la resina cargada con Ni Profinity IMAC (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.). Se purificaron proteínas de fusión que contenían un módulo de unión a celulosa (CBM) e inteína de autoescisión mediante adsorción de alta afinidad en una celulosa amorfa regenerada de gran superficie. Se usó precipitación con calor a 70-95 °C durante 5-30 min para purificar enzimas hipertermoestables. La pureza de las proteínas recombinantes se examinó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE).

Enzimas utilizadas y sus ensayos de actividad.

Se usó alfa-glucanfosforilasa (aGP) de Thermotoga marítima (Uniprot ID G4FEH8). La actividad se analizó en tampón de fosfato de sodio 50 mM (pH 7,2) que contenía MgCh 1 mM, DTT 5 mM y maltodextrina 30 mM a 50 °C. La reacción se detuvo mediante filtración de enzima con un concentrador Vivaspin 2 (MWCO 10.000) (Vivaproducts, Inc., Littleton, MA, EE. UU.). Se midió la glucosa 1-fosfato (G1P) usando un kit de ensayo de glucosa hexoquinasa/G6PDH (Sigma Aldrich, número de catálogo GAHK20-1KT) suplementado con 25 U/ml de fosfoglucomutasa. Una unidad (U) se describe como pmol/min.

Se usó fosfoglucomutasa (PGM) de Thermococcus kodakaraensis (Uniprot ID Q68BJ6). La actividad se midió en tampón HEPES 50 mM (pH 7,2) que contenía MgCh 5 mM y G1P 5 mM a 50 °C. La reacción se detuvo mediante filtración de enzima con un concentrador Vivaspin 2 (Corte de peso molecular 10.000). El producto glucosa 6-fosfato (G6P) se determinó usando un kit de ensayo de hexoquinasa/G6PDH (Sigma Aldrich, número de catálogo GAHK20-1KT).

Se utilizaron dos fuentes diferentes de fosfoglucoisomerasa (PGI) de Clostridium thermocellum (Uniprot ID A3DBX9) y Thermus thermophilus (Uniprot ID Q5SLL6). La actividad se midió en tampón HEPES 50 mM (pH 7,2) que contenía MgCl²5 mM y G6P 10 mM a 50 °C. La reacción se detuvo mediante filtración de enzima con un concentrador Vivaspin 2 (Corte de peso molecular 10.000). El producto, fructosa 6-fosfato (F6P), se determinó utilizando un ensayo enzimático acoplado a fructosa 6-fosfato quinasa (F6PK)/piruvato deshidrogenasa (PK)/lactato deshidrogenasa (LD) en el que una disminución de la absorbancia a 340 nm indica la producción de F6P. Esta reacción de 200 pl contenía HEPES 50 mM (pH 7,2), MgCh 5 mM, G6P 10 mM, ATP 1,5 mM, piruvato de fosfoenol 1,5 mM, NADH 200 pM, 0,1 U de PGI, 5 U de PK y 5 U de LD.

Se usó fructosa 6-fosfato epimerasa (F6PE) de Dictyoglomus thermophilum (Uniprot ID B5YBD7). La actividad se midió en tampón HEPES 50 mM (pH 7,2) que contenía MgCh 5 mM y F6P 10 mM a 50 °C. La reacción se detuvo mediante filtración de enzima con un concentrador Vivaspin 2 (Corte de peso molecular 10.000). El producto, tagatosa 6-fosfato (T6P), se determinó usando tagatosa 6-fosfato fosfatasa y detectando la liberación de fosfato libre. Para detectar la liberación de fosfato libre, se añadieron 500 pl de una solución que contenía acetato de zinc 0,1 M y molibdato de amonio 2 mM (pH 5) a 50 pl de reacción. Esto se mezcló y fue seguido por 125 pl de ácido ascórbico al 5% (pH 5). Esta solución se mezcló y luego se incubó a 30 °C durante 20 min. Se leyó la absorbancia a 850 nm para determinar la liberación de fosfato libre.

F6PE termofílico de Anaerolinea thermophila UNI-1 (Uniprot ID: E8N0N6)

Secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO .: 1)

ATGTTCGGCTCGCCTGCTCCCCTGCTGGATATGGTCACCGCGCAGAAACAGG

GCATGGCGCGGGGTATCCCATCCATTTGTTCGGCACATCCGGTGGTGCTGAGTGC

CGCCTGCCATCTTGCCCGCCGGAGCGGCGCGCCCCTGCTCATCGAAACCACCTGC

AATCAGGTCAACCACCAAGGTGGGTACAGCGGCATGACCCCCGCCGATTTTGTC

CGCTTTCTGCGCGAAATTCTGGAACGGGAAGGTATTCCCCCGCAACAGGTCATCC

TGGGCGGGGATCACCTGGGTCCTTACCCCTGGCGGAAAGAGCCTGCCGAAACCG

CCATAGCACAAGCGCTGGAAATGGTGCGGGCATACGTGCAGGCAGGCTACACCA

AAATTCATCTGGACGCTTCCATGCCCTGCGCCGATGACGACCCCGAGCGTCCCCT

GCCGCTGGAGCGCATAGCCCGACGGGCGGCGCAGTTGTGCGCCGCCGCCGAAGC

CGCCGCGGGAGCGGTTCAGCCGGTGTACGTAATTGGCAGTGAGGTGCCCCCGCC

CGGCGGCGCGCAGGGTCAGGAGGCAAGACTTCACGTCACCACTCCGCAGGAAGC

CCAAGCCGCGCTGGATGCCTTTCGGGAAGCCTTTCTGCAGGCAGGCTTGACTCCC

GTTTGGG AGCGGGT C A TT GCGC T GGT AG T CC A GC C GGGGGT GG A GTTT GGC GT G

GACAGCATTCACGCCTATCAGCGCGAAGCCGCCCGCCCGCTGAAGACCTTCATC

GAGGGCGTGCCCGGCATGGTGTATGAAGCCCACTCGACCGATTACCAGACCCGT

GCCTCCCTGCGTGCGCTGGTGGAAGACCACTTTTCCATTCTCAAGGTTGGTCCGG

CACTAACCTTTGCCTACCGCGAAGCCGTGTTCGCCCTGGAACACATCGAACGGG

AAATATTGGGCAGGCAGGATATGCCTCTCTCCCGCCTGAGTGAAGTCCTCGACG

AGGTGATGCTGAACGATCCACGCCACTGGCAGGGATACTTTGCCGGCGCTCCCG

CCGAACAGGCGCTGGCGCGCCGCTACAGTTTCAGCGACCGCATTCGCTATTACTG

GCACCATCCCGCCGCGCAGGAAGCCGTGCGGAGACTGCTCGCCAACCTGATCGA

AACCCCGCCGCCGCTGAGTTTGCTCAGCCAGTACCTGCCGCGCGAGTATGAGAT

GGTGCGCGCGGGGGAAATCTCCAGCCACCCGCAGGACCTGATTCGGGCACATAT

CCAGCACACGCTGGAAGATTACGCTGCGGCGTGCGGGTAA

Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO .: 2)

M FG SPAPLLDM VTAQ KQGM ARGIPSICSAHPVVLSAACHLARRSGAPLLIETTCN

QVNHQGGYSGMTPADFVRFLREILEREG1PPQQV1LGGDHLGPYPWRKEPAETAIAQ

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F6PE termofílica de Caldicellulosiruptorkronotskyensis (Uniprot ID: E4SEH3)

Secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO .: 3)

AT GAGTCCTC AAAATC C ATT G ATT GGTTTATTT AAG A A T AG AG A A A A AG AGT

TTAAG G G TATTATTTC AG TTTG TTC TTC AAATG AAATAG TC TTAG AAG C AG TTTTA

A A A A G A ATG A AA G ATAC A A AC CTACCAATTATTATTG AAG CC AC AGC G A AC C AG

GTAAATCAATTTGG CG GGTATTCTGGGTTGACACCG TCTCAGTTCAAAGAACGAG

TTATAAAAATTG C TC AAAAAG TTG ATTTTC C AC TTG AG AG AATAATTC TTG G TG G

GGACCATCTTGGACCATTTGTGTGGCGTGACCAGGAACCAGAAATTGCTATGGA

GT ATGC T AAGC A A AT G A T A A A A G A AT AC AT AAAAG C AGGTTTTACC A AAATTC A

CATCG AC ACG AG TATG C C TTTAAAAG G G G AG AAC AG C ATAG ATG ATG AAATAAT

TGCTAAAAGAACTGCTGTGCTCTGCAGGATTGCGG AGGAGTGTTTTGAGAAGAT

TTCT AT A A ACAATCCCT ATATTAC A AGGCCAGTTT ATG TG AT AGGAGCTGATGTG

CCACCTCCCG G CG G AG AG TCTTCTATTTG TCAAACAATTACTACTAAAG ATG AAT

T AG A A AG AAG TTT AG A A T ATTTC A A AG A AGC ATTT A A A A AG G A AGGAATTGAGC

ATGTATTCGATTATGTAGTTGCTGTTGTTGCAAATTTTG GAGTTGAATTTGGGAG

C G ATG AAATTG TTG ATTTTG ATATG G AAAAAG TAAAG C CG CTAAAAG AAC TTTT

GGC A A AGT AC A AT AT AG T ATTTG A AGGCC ATTCTAC AG ATT ATC A A AC A A A AGA

AAACTTAAAAAG AATG G TCG AATG TG G TATTG CAATTTTAAAG G TTG G TCCTG CT

CTAAC ATTTAC ATTG CG CG AAG CG TTAG TAG C AC TTAG TC ATATTG AAG AAG AA

ATTT ATAGC AATG AAAAG G AG A AA C TG TC AA G A TTTAG AG A AG TTTTATTG AA T

AC TATG C TAAC ATG C AAAG ATC AC TG G AG TAAATATTTTG ATG AG AATG ATAAG

TTAATTAAG TC AAAG C TC CTATATAG C TATC TTG AC AG ATG G AG ATAC TATTTTG

AAAACG AG AG TG TG AAAAG TG C TG TTTATTC TC TTATTG G AAATTTAG AG AATG T

TAAAATTCCACCTTG G CTTG TAAG TCAG TATTTTCCTTCTCAG TACCAAAAG ATG

AG A A A A A A AG ATTT A A A A A ACGGTGC TGC C G ACC T A A T ATT GGAT A A A A T AGGG

G AAG TC ATTG ACC ATTATG TTTATG CG G TAAAAG AATAA

Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO .: 4)

M SPQ NPLIG LFKNREKEFKG IISVCSSNEIVLEAVLKRM KDTNLPIIIEATANQ VNQ

FGGYSGLTPSQ FKERVFKIAQ KVDFPLERIILGG DHLGPFVW RDQ EPEIAM EYAKQMI

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LLYSYLD RW R YYFENESVKSAVYSLIG N LENVKIPPW LVSQ YFPSQ YQ KM R KKDLK

N G A A D LILD K IG E V ID H Y V Y A V K E

F6PE termofílica de Caldilinea aerophila (Uniprot ID: I0I507)

Secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO .: 5)

ATGTCAACACTTCGCCACATCATTTTGCGACTGATCG AGCTGCGTGAACGAG

AACAGATCCATCTCACGCTGCTGGCCGTCTGTCCCAACTCGGCGGCGGTGCTGGA

GGCAGCGGTGAAGGTCGCCGCGCGCTGCCACACGCCGATGCTCTTCGCTGCCAC

GCTCAATCAAGTCGATCGCGACGGCGGCTACACCGGTTGGACGCCTGCGCAATT

CGTCGCCGAGATGCGTCGCTATGCCGTCCGCTATGGCTGCACCACCCCGCTCTAT

CCTTGCCTGGATCACGGCGGGCCGTGGCTCAAAGATCGCCATGCACAGGAAAAG

CTACCGCTCGACCAGGCGATGCATGAGGTCAAGCTGAGCCTCACCGCCTGTCTG

GAGGCCGGCTACGCGCTGCTGCACATCGACCCCACGGTCGATCGCACGCTCCCG

CCCGGAGAAGCGCCGCTCGTGCCGATCGTCGTCGAGCGCACGGTCGAGCTGATC

GAACATGCCGAACAGGAGCGACAGCGGCTGAACCTGCCGGCGGTCGCCTATGAA

GTCGGCACCGAAGAAGTACATGGCGGGCTGGTGAATTTCGACAATTTTGTCGCCT

TCTTGGATTTGCTCAAGGCAAGGCTTGAACAACGTGCCCTGATGCACGCCTGGCC

CGCCTTCGTGGTGGCGCAGGTCGGCACTGACCTGCATACAACGTATTTTGACCCC

AG TG CGGCGCAACGGCTGACTGAGATCGTGCGCCCTACCGGTGCACTGTTGAAG

GGG CACTACACCGACTGGGTCGAAAATCCCGCCGACTATCCGAG GGTAG GCATG

GGAGGCGCCAACGTTGGTCCAGAGTTTACGGCGGCCGAGTTCGAGGCGCTGGAA

GCGCTGGAACGGCGGGAACAACGGCTGTGCGCCAACCGGAAATTGCAGCCCGCC

TGTTTTTTGG CTGCACTGG AAG AGG CAGTAGTCGCTTCAGATCGTTGGCGG AAG T

GGCTCCAGCCCGATGAGATCGGCAAGCCCTTTGCAGAATTAACGCCCGCACGCC

GGCGCTGGCTCGTGCAGACCGGGGCACGCTACGTCTGGACTGCGCCGAAAGTTA

TCGCCGCACGCGAACAGCTCTATGCGCACCTCTCCCTTGTGCAGGCGGATCCACA

TGCCTACGTGGTAGAGTCAGTCGCCCGGTCAATCGAGCGCTATATCGATGCCTTC

AACTTATACG ACG CCG CTACATTG CTTG G ATG A

Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO .: 6)

M STLR HIILR LIELR ER EQ IHLTLL A VCPN S A A V LE A A V K V A ARCHTPMLF A A T LN

Q VDRDG G YTG W TPAQ FVAEM RRYAVRYG CTTPLYPCLDHG G PW LKDRHAQ EKLP

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PFAELTPAR R R W LVQ TG AR YVW TAPKVIAAR EQ LYAH LSLVQ AD PH AYVVESVAR

S IER YID A FN LYD AA TLLG

F6PE termofílica de Caldithrix abyssi (Uniprot ID: H1XRG1)

Secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO .: 7)

ATG A G TC TG C ATC C TTTAAATAAATTAATC G AG C G AC AC AAAAAAG G AAC G C

CGGTCGGTATTTATTCCGTCTGTTCGGCCAATCCCTTTGTTTTGAAAGCGGCCATG

CTACAG G CG CAAAAG G ATCAG TCTTTG CTACTTATTG AG G CCACTTCCAACCAG G

T AGATC A ATTCGGCGGTT AC ACCGGC AT GCGGCC CGA AG ATTTT A A A AC A AT GA

CG CTTG AACTG G CAG CCG AAAACAATTACG ATCCACAG G G ATTAATCCTG G G CG

GCGACCATCTGGGGCCCAACCGCTGGACAAAACTGAGCGCCTCCCGGGCCATGG

ACTACG CCAG AG AG CAG ATTG CCG CTTATG TTAAAG CCG G CTTTTCCAAAATCCA

CTTAGAC GCC ACC ATGCCCTTGC A A A AC GAT GCC AC AGATTCCGCCGGC CGC CTT

CCAG TCG AAACAATCG CTCAACG TACCG CAG AATTATG CG CCG TG G CCG AACAA

ACTTACCGGCAGAGCGACCAACTCTTTCCGCCGCCTGTTTACATTGTCGGCAGCG

ACGTGCCCATCCCGGGCGGCGCGCAAGAAGCGCTGAACCAGATCCATATTACGG

AGGT A AAAG AG G TT C AAC AGACC ATTG ATC ACGT GCGGCGGGCC TTT G A A A A A A

ACGGC CTGGA AGCGGCTT ACG A AAG AG TTT GC GCC GTT GTC GT GC AGCC AGGCG

TTGAATTCGCCGATCAAATCGTTTTTG AATACG CTCCCGACAG AGCGGCGG CCTT

A A A A G ATTTT ATTG AAAG CC ATTCGC AGCTGGTTT AT G A AGC GC ACTCT ACTGAT

T ACC AGACCGCACCTCTTTTGC GCC AG ATG G TAAAAG ATCACTTTG CC ATTTT A A

AGGTCGGGCCTGCGCTCACCTTTGCCCTGCGCGAAGCCATTTTTGCTCTGGCCTT

TATG G AAAAAG AG CTTTTG CCATTG CACAG AG CG CTCAAACCTTCTG CCATTCTG

G A AACGCTGGACC AA AC GATGGAC A A A AACCCTGC TT ACTGGC A A AA G C ATTAC

GGCGGAACAAAGGAAGAAGTACGCTTTGCGCAGCGGTTTAGCCTGAGCGACCGC

ATTCG TTACTACTG G CCG TTTCCAAAG G TTCAAAAG G CCCTG CG CCAATTG CTAA

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GGAATACCAACG TATTCG CCAAG G AACG TTAACCAACG ATCCG CAG G CG CTG AT

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A A ACTCTTTG AC ATTC ACGC A A A A TC A A AATTC A T T AGC AATGG AGCG AC TAT G

A

Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO .: 8)

M SLH P LN KLIER H KKG TPVG IYSVC SAN PFVLKAAM LQ AQ KD Q SLLLIEATSN Q V

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L

F6PE termofílica de Dictyoglomus thermophilum (Uniprot ID: B5YBD7)

Secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO .: 9)

ATG T GGC TT AG T A A AG ATT A T T T G A G A A A A A A G G G AG TTT A TT CT A T A T GT A

G C TC TA A TC C A TA TG TG A TTG AG G C A AG TG TTG A ATTTG C TA AG G AG A AG A ATG

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GGG AATAGAAGAGGATAGGGTGATTCTTGGAGGGGACCATTTAGGCCCTCTCCC

TTG G C AAG ATG AAC C TTC TTC TTC TG C AATG AAAAAG G C AAAAG AC C TTATAAG

GGCCTTTGTG G AG AG TG G TTATAAG AAG ATACACCTTG ATTG TAG TATG TCTCTT

TCTG ATGATCCTGTAGTG CTCTCTCCCGAG AAG ATAGCAGAAAGGG AGAGGGAA

CTTCTTG AG G TTG CAG AAG AG ACTG CTAG AAAG TACAATTTTCAG CCTG TG TATG

TGGTGGGAACTGATGTACCGGTAGCTGGAGGAGGCGAAGAGGAAGGTATTACCT

C AGT GG AG G ATTTT AG AGT AGC A A T C TCC TC TTT A A A A A A A T A T T T T GAGG A T GT

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AATTA TG AA AAA G TG TTTG AG TA TG AC AG G ATTAA G G TG A G AA AAA TTTTA G AG

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AAACGTGC ATTG AG AG AT ATGG TAG AG GAT GG AG T AAG AA TTC TT AAGGTTGGT

CCTG CTTTAACAG CAAG TTTTAG AAG G G G AG TATTTTTATTAAG TAG CATTG AG G

ATG AG C TTATATC G G AAG ATAAAAG G TC TAATATTAAG AAAG TTG TG C TTG AG A

C T A T GTT A A A AG ATG A T A A A T ATTG G AG A A A GT ATT AT A A GGATTC AG A A A G AT

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G A A A A A T A AG A A A T G ATCC A AGGG AGC T A A T A A AG A AT G A A AT A A AG A AGGT C

TTG G AG G AC TATC AC TATG C TG TAAAC TTATAA

Secuencia de nucleótidos de codón optimizado (SEQ ID NO.: 10)

[104] A T GTGG CTG AG C A A G G A C TAC C TGC GT A A G A AGGGC G TTT AC AGC A T T T GC A

GC AG C A ACCC GT A T G TT A TTG A A G C G A G C G T G G A G TT C G C G A A G G A G A A A A AC G

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A A C TG C T G G A A G T TG C G G A G G A A A C C G C G C G TA A A TA C A A C T T T C A A C C G G T G T

AT GT GGT GGGT ACCG AT GTTCCGGTTGC GGGT GGCGGT G AGG AA G AGGGT ATC A

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GTCTGGAACTGGATATCTGGTACAACCTGCTGGACCGTATTCGTTACTACTGGGA

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G AG G G TAAAATCC G TAAC G AC C C G C G TG AACTG ATTAAG AAC G AG ATTAAG AAA

G TGCTGGAAGACTACCATTATGCGGTGAACCTG TAA

Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO.: 11)

M W L SK D Y LR K K G V Y SIC S SNP Y V IE AS VEF A K E K N D Y IL IE ATPHQINQF G G YS G

M TPEDFKNFVM G IIKEKG IEEDRVILG G DHLG PLPW Q DEPSSSAM KKAKDLIRAFVE

SG YKKIHLDCSM SLSDDPVVLSPEKIAERERELLEVAEETARKYNFQ PVYVVG TDVP

VAG G G EEEG ITSVEDFRVAISSLKKYFEDVPRIW DRIIG FVIM LG IG FNYEKVFEYDRI

K VR KILEE V K K E N LF VEGHS TD Y Q TKR A LR D M V E D G V R ILK V GP ALTASFRRGVFL

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W E YK EIK IALN R LFEN FSEG VD IR YIYQ Y FY D SYFK VR EG K IR N D P R E LIKN EIK KVLE

D Y H Y A V N L

Se usó tagatosa 6-fosfato fosfatasa (T6PP) de Archaeoglobus fugidis (Uniprot ID O29805). La actividad se midió en tampón HEPES 50 mM (pH 7,2) que contenía MgCl² 5 mM y T6P 10 mM a 50 °C. La reacción se detuvo mediante filtración de enzima con un concentrador Vivaspin 2 (Corte de peso molecular 10.000). La producción de tagatosa se determinó detectando la liberación de fosfato libre como se describe para F6PE.

T6PP termofílica de Archaeoglobus fulgidus (Uniprot ID: O29805)

Secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO.: 12)

ATGTTCAAACCAAAGGCCATCGCAGTTGACATAGATGGCACCCTCACCGACA

GAAAGAGGGCTCTGAACTGCAGGGCTGTTGAAGCTCTCCGCAAGGTAAAAATTC

CCGTGATTTTGGCCACTGGTAACATATCTTGTTTTGCGAGGGCTGCAGCAAAGCT

GATTGGAGTCTCAGACGTGGTAATCTGCGAGAATGGGGGCGTGGTGAGGTTCGA

GT ACG AT GGGG AGG A T ATT GTTTT AG G AG AT A A A G A G A A AT GC GTTG AGGCTGT

GAGGGTGCTTGAG AAACACTATGAG GTTGAGCTGCTGGACTTCGAATACAG GAA

GTCGGAAGTGTGCATGAGGAGGAGCTTTGACATCAACGAGGCGAGAAAGCTCAT

T G AGGGGAT GGGGGTT A AGCTTGT GG ATTC AGGCTTTGCCT ACC AC ATT AT GG AT

GCTGATG TTAGCAAGGGAAAAGCTTTGAAGTTCGTTGCCGAGAGGCTTGGTATC

AG TTCAG CG GAGTTTGCAGTTATCGGCGACTCAGAGAACGACATAGACATGTTC

AGAGTTGCTGGATTCGGAATTGCTGTTGCCAATGCCGATGAGAGGCTGAAGGAG

TATGCTGATTTAGTTACGCCATCACCAGACGGCGAGGGGGTTGTTGAGGCTTTGC

AGTTTCTGGGATTGTTGCGGTGA

Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO .: 13)

MFKPKAIAVDIDGTLTDRKRALNCRAVEALRKVKIPVILATGMSCFARAAAKLI

G VSD VVICENG G VVRFEYDG EDIVLG DKEKCVEAVRVLEKHYEVELLDFEYRKSEV

C M RRSFDINEARKLIEG M G VKLVDSG FAYHIM DADVSKG KALKFVAERLG ISSAEFA

VIG DSENDIDM FRVAG FG IAVANADERLKEYADLVTPSPDG EG VVEALQ FLG LLR

T6PP de Archaeoglobus profundus (Uniprot ID: D2RHV2_ARCPA)

Secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO .: 14)

GT GTTC A AGGCTTTGGTAGTT G AT AT AG ACGG AAC TTT G ACGG A T A AG A AG A

GGGC A AT A AAC TGC AGAGC GGT CGAAGC ACTT AG A A A ACT A A AGATTCC T GTT G

TC TT GGC AACCG G AA AC ATTTC AT GCTTTGC A AGGGCTGT AGC TAAG ATT AT AGG

TGTTTCCGATATTGTAATAGCTGAGAACGGAGGTGTTGTCAGATTCAGCTACGAC

G G AGAG GACATAGTTCTGG GGGATAGAAGTAAATGCTTAAGAGCTTTGGAGACA

CTTAG AAAACG CTTCAAAG TAG AG CTTCTCG ACAACG AATATAG G AAG TCTG AG

GTCTG CATG AG G AG G AACTTCCCTATAG AG G AAG CTAG AAAG ATACTG CCAAAA

GAT GTT AG AATAG TCG ATAC AGGCTTCGC ATACCAC AT AATCGATGC A A A T GTC

AG CAAGG GGAAGGCTTTGATGTTCATAGCCGATAAGCTTGGCTTGGACGTTAAG

GATTTCATTG CG ATAG G TG ATTCCG AAAACG ACATTG AAATG TTG G AAG TTG CA

GGTTTTGGCGTTGCAGTTGCGAATGCGGATGAAAAGCTTAAGGAGGTAGCGGAT

TTGGTCACATCGAAGCCTAATGGAGACGGAGTTGTCGAAGCTCTTGAGTTCTTGG

GACTCATTTAG

Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO 15)

M FKALVVD TD G TLTD KKR AIN C R AVEALR KLKIPVVLATG N ISC FAR AVAKIIG V

SDIVIAENG G W RFSYDG EDIVLG DRSKCLRALETLRKRFKVELLDNEYRKSEVCM R

R N FPIEEAR KILPKD VR IVD TG FAYH IID AN VSKG KALM FIAD KLG LD VKD FIAIG DSE

NDrEM LEVAG FG VAVANAD EKLKEVADLVTSKPN G D G VVEALEFLG LI

T6PP de Archaeoglobus veneficus (Uniprot ID: F2KMK2_ARCVS)

Secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO .: 16)

ATGCTCCGFCCAAAGGGTCTCGCCATTGACAFCGACGGAACCATAACATACA

GGAATCGAAGCCTGAACTGTAAGGCCGTTGAAGCTCTCAGGAAGGTAAAAATCC

CTGTAGTTCTTGCAACTGGCAACATATCCTGTTTCGCAAGAACTGCTGCAAAGCT

TATAGGCGTCTCAGACATTGTTATATGCGAAAATGGAGGTATTGTTCGATTCAGC

TACGATGGCGACGACATAGTGCTTGGGGACATAAGCAAATGCCTTAAAGCGGCT

GAAATTCTCAAAG AG TACTTTG AAATCG AATTCCTTG ACG CTG AG TACAG G AAG

TCGGAG GTCTGTCTTCGCAGAAACTTTCCTATTGAAGAGGCGAGGAAAATTCTTC

ACGATGCAAAGCTTG ATGTTAAAATCGTCGATTCAG GTTTTGCGTACCACATAAT

GG AT GCG AAGGTC AGC AAAGGAAGGGCTCTTG AGT AC ATAGCT G AT G AACTTGG

TATAAGTCCGAAGGAGTTCGCTGCAATTGGTGATTCTGAGAACGACATAGACCT

GATTAAGGCTGCCGGCCTCGGTATTGCCGTTGGAGATGCTGACTTAAAGCTCAAA

AT GG AGGCC GAC GTGGT AGTCTC G A AG A AG A AT GGC G ATGGAGTT GTTGAAGC A

CTTGAGCTTCTGGGCTTAATTTAA

Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO.: 17)

M LR PK G LA ID ID G TITY R N R S LN C K A V E A LR K V K IP V V LA TG N IS C FA R TA A K LIG

VSD IVIC ENG G IVR FSYD G D DIVLG DISKCLKAAEILKEYFEIEFLDAEYR KSEVC LR R

NFPEEE A R K ILH D A K LD V K IV D S GF A Y H IM D A K V SKGRALEYIADELGISPKEF A A IG

D S E N D ID LIK A A G LG IA V G D A D LK LK M E A D V V V S K K N G D G V V E A LE LLG LI

La celodextrina fosforilasa recombinante y la celobiosa fosforilasa de C. thermocellum se describen en Ye et al., Spontaneous high-yield production of hydrogen from cellulosic materials and water catalyzed by Enzyme cocktails. ChemSusChem 2009; 2:149-152. Sus actividades se ensayaron como se describe.

La polifosfato glucoquinasa recombinante de Thermobifida fusca YX se describe en Liao et al., One-step purification and immobilization of thermophilic polyphosphate glucokinase from Thermobifida fusca YX: glucose-6-phosphate generation without ATP. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2012; 93:1109-1117. Sus actividades se ensayaron como se describe.

La isoamilasa recombinante de Sulfolobus tokodaii se describe en Cheng et al., Doubling power output of starch biobattery treated by the most thermostable isoamylase from an archaeon Sulfolobus tokodaii. Scientific Reports 2015; 5:13184. Sus actividades se ensayaron como se describe.

La 4-alfa-glucanoltransferasa recombinante de Thermococcus litoralis se describe en Jeon et al. 4-a-Glucanotransferase from the Hyperthermophilic Archaeon Thermococcus Litoralis. EUR. J. Biochem. 1997; 248: 171-178. Su actividad se midió como se describe.

Se utilizó sacarosa fosforilasa de Caldithrix abyssi (Uniprot H1XT50). Su actividad se midió en tampón HEPES 50 mM (pH 7,5) que contenía sacarosa 10 mM y fosfato orgánico 12 mM. Se midió la glucosa 1-fosfato (G1P) usando un kit de ensayo de glucosa hexoquinasa/G6PDH complementado con 25 U/ml de fosfoglucomutasa como con alfa-glucano fosforilasa.

Las unidades de enzima utilizadas en cada ejemplo a continuación se pueden aumentar o disminuir para ajustar el tiempo de reacción según se desee. Por ejemplo, si se quisiera realizar el Ejemplo 9 en 8 h en lugar de 24 h, las unidades de las enzimas se aumentarían aproximadamente 3 veces. Por el contrario, si se quisiera realizar el ejemplo 9 en 48 h en lugar de 24 h, las unidades de enzima se podrían reducir aproximadamente al doble. Estos ejemplos ilustran cómo se puede usar la cantidad de unidades enzimáticas para aumentar o disminuir el tiempo de reacción mientras se mantiene una productividad constante.

Ejemplo 1

Para validar la viabilidad técnica de la biosíntesis enzimática de fructosa 6-fosfato a partir de almidón, se expresaron de forma recombinante tres enzimas: alfa-glucano fosforilasa de T. marítima (Uniprot ID G4FEH8), fosfoglucomutasa de Thermococcus kodakaraensis (Uniprot ID Q68BJ6) y fosfoisomerasa de Clostridium thermocellum (Uniprot ID A3DBX9). Las proteínas recombinantes se sobreexpresaron en E. coli BL21 (DE3) y se purificaron como se describió anteriormente.

Se incubó a 50 °C una mezcla de reacción de 0,20 ml que contenía 10 g/l de almidón soluble, solución salina tamponada con fosfato 50 mM, pH 7,2, MgCb 5 mM, ZnCb 0,5 mM, 0,01 U de aGP, 0,01 U de PGM y 0,01 U de PGI durante 24 horas. La reacción se detuvo mediante filtración de enzima con un concentrador Vivaspin 2 (Corte de peso molecular 10.000). El producto, fructosa 6-fosfato (F6P), se determinó utilizando un ensayo enzimático acoplado a fructosa 6-fosfato quinasa (F6PK)/piruvato deshidrogenasa (PK)/lactato deshidrogenasa (LD) en el que una disminución de la absorbancia a 340 nm indica la producción de F6P como se describió anteriormente. La concentración final de F6P después de 24 horas fue de 3,6 g/l.

Ejemplo 2

Se llevaron a cabo las mismas pruebas que en el Ejemplo 1 (distintas de las temperaturas de reacción) de 40 a 80 °C. Se encontró que 10 g/l de almidón soluble producían 0,9 g/l de F6P a 40 °C y 3,6 g/l de F6P a 80 °C después de reacciones de 40 horas. Estos resultados sugieren que el aumento de la temperatura de reacción para este conjunto de enzimas aumentó los rendimientos de F6P, pero una temperatura demasiado alta puede perjudicar algo de la actividad enzimática.

Ejemplo 3

Se encontró que, a 80 °C, una relación de enzima de aGP:PGM:PGI de aproximadamente 1:1:1 daba como resultado una generación rápida de F6P. Se observó que la proporción de enzimas no influía mucho en la concentración final de F6P si el tiempo de reacción era lo suficientemente largo. Sin embargo, la proporción de enzimas afecta las velocidades de reacción y el coste total de las enzimas utilizadas en el sistema.

Ejemplo 4

Se incubó a 50 °C una mezcla de reacción de 0,20 ml que contenía 10 g/l de maltodextrina, solución salina tamponada con fosfato 50 mM, pH 7,2, MgCb 5 mM, ZnCl² 0,5 mM, 0,01 U de aGP, 0,01 U de PGM y 0,01 U de PGI a 50 °C durante 24 horas. La reacción se detuvo mediante filtración de enzima con un concentrador Vivaspin 2 (Corte de peso molecular 10.000). El producto, fructosa 6-fosfato (F6P), se determinó utilizando un ensayo enzimático acoplado a fructosa 6-fosfato quinasa (F6PK)/piruvato deshidrogenasa (PK)/lactato deshidrogenasa (LD) en el que una disminución de la absorbancia a 340 nm indica la producción de F6P como se describió anteriormente. La concentración final de F6P después de 24 horas fue de 3,6 g/l.

Ejemplo 5

Para probar la producción de F6P a partir de Avicel, se usó celulasa Sigma para hidrolizar la celulosa a 50 °C. Para eliminar la beta-glucosidasa de la celulasa comercial, se mezclaron 10 unidades de papel de filtro/ml de celulasa con 10 g/l de Avicel en un baño de agua helada durante 10 min. Después de centrifugar a 4 °C, se decantó el sobrenadante que contenía beta-glucosidasa. Avicel que estaba unido con celulasa que contenía endoglucanasa y celobiohidrolasa se resuspendió en un tampón de citrato (pH 4,8) para hidrólisis a 50 °C durante tres días. El hidrolizado de celulosa se mezcló con 5 U/ml de celodextrina fosforilasa, 5 U/l de celobiosa fosforilasa, 5 U/ml de aGP, 5 U/ml de PGM y 5 U/ml PGI en un tampón HEPES 100 mM (pH 7,2) que contenía fosfato 10 mM, MgCb 5 mM y ZnCb 0,5 mM. La reacción se llevó a cabo a 60 °C durante 72 horas y se encontraron altas concentraciones de F6P (pequeñas cantidades de glucosa y sin celobiosa). Se detectó F6P usando el ensayo de enzima acoplada descrito anteriormente. La glucosa se detectó usando un kit de ensayo de hexoquinasa/G6PDH como se describió anteriormente.

Ejemplo 6

Para aumentar los rendimientos de F6P de Avicel, Avicel se trató previamente con ácido fosfórico concentrado para producir celulosa amorfa (RAC), como se describe en Zhang et al., A transition from cellulose swelling to cellulose dissolution by ophosphoric acid: evidence from enzymatic hydrolysis and supramolecular structure. Biomacromolecules 2006; 7:644-648. Para eliminar la beta-glucosidasa de la celulasa comercial, se mezclaron 10 unidades de papel de filtro/ml de celulasa con 10 g/l de RAC en un baño de agua helada durante 5 min. Después de centrifugar a 4 °C, se decantó el sobrenadante que contenía beta-glucosidasa. La RAC que estaba unida con celulasa que contenía endoglucanasa y celobiohidrolasa se resuspendió en un tampón de citrato (pH 4,8) para hidrólisis a 50 °C durante 12 horas. El hidrolizado de RAC se mezcló con 5 U/ml de celodextrina fosforilasa, 5 U/l de celobiosa fosforilasa, 5 U/ml de aGP, 5 U/ml de PGM y 5 U/ml de PGI en un tampón HEPES 100 mM (pH 7,2) que contenía fosfato 10 mM, MgCl²5 mM y ZnCl²0,5 mM. La reacción se llevó a cabo a 60 °C durante 72 horas. Se recuperaron altas concentraciones de F6P y glucosa porque no se agregaron enzimas para convertir la glucosa en F6P. Se detectó F6P usando el ensayo de enzima acoplada descrito anteriormente. La glucosa se detectó usando un kit de ensayo de hexoquinasa/G6PDH como se describió anteriormente.

Ejemplo 7

Para aumentar aún más los rendimientos de F6P de RAC, se añadieron polifosfato glucoquinasa y polifosfato. Para eliminar la beta-glucosidasa de la celulasa comercial, se mezclaron 10 unidades de papel de filtro/ml de celulasa con 10 g/l de RAC en un baño de agua helada durante 5 min. Después de centrifugar a 4 °C, se decantó el sobrenadante que contenía beta-glucosidasa. La RAC que estaba unida con celulasa que contenía endoglucanasa y celobiohidrolasa se resuspendió en un tampón de citrato (pH 4,8) para la hidrólisis a 50 °C y se incubó en un tampón de citrato (pH 4,8) para la hidrólisis a 50 °C durante 12 horas. El hidrolizado de RAC se mezcló con 5 U/ml de polifosfato glucoquinasa, 5 U/ml de celodextrina fosforilasa, 5 U/ml de celobiosa fosforilasa, 5 U/ml de aGP, 5 U/ml de PGM y 5 U/ml de PGI en un tampón HEPES 100 mM (pH 7,2) que contenía polifosfato 50 mM, fosfato 10 mM, MgCl²5 mM y ZnCl²0,5 mM. La reacción se llevó a cabo a 50 °C durante 72 horas. Se encontró F6P en altas concentraciones con solo pequeñas cantidades de glucosa ahora presentes. Se detectó F6P usando el ensayo de enzima acoplada descrito anteriormente. La glucosa se detectó usando un kit de ensayo de hexoquinasa/G6PDH como se describió anteriormente.

Ejemplo 8

Para validar la producción de tagatosa a partir de F6P, se mezclaron 2 g/l de F6P con 1 U/ml de fructosa 6-fosfato epimerasa (F6PE) y 1 U/ml de tagatosa 6-fosfato fosfatasa (T6PP) en tampón HEPES 50 mM (pH 7,2) que contenía MgCl²5 mM. La reacción se incubó durante 16 horas a 50 °C. La conversión del 100% de F6P en tagatosa se observa mediante HPLC (serie Agilent 1100) utilizando una columna Agilent Hi-Plex H y un detector de índice de refracción. La muestra se corrió en H²SO⁴5 mM a razón de 0,6 ml/min.

Ejemplo 9

Para validar la producción de tagatosa a partir de maltodextrina, se incubó a 50 °C una mezcla de reacción de 0,20 ml que contenía 20 g/l de maltodextrina, solución salina tamponada con fosfato 50 mM pH 7,2, MgCh 5 mM, 0,05 U de aGP, 0,05 U de PGM, 0,05 U de PGI, 0,05 U de F6PE y 0,05 U de T6PP durante 24 horas. La reacción se detuvo mediante filtración de enzima con un concentrador Vivaspin 2 (Corte de peso molecular 10.000). La tagatosa se detectó y cuantificó utilizando un HPLC Agilent serie 1100 con detector de índice de refracción y una columna Agilent Hi-Plex H. La fase móvil fue H²SO⁴5 mM, que pasó a razón de 0,6 ml/min. Se obtuvo un rendimiento de 9,2 g/l de tagatosa. Esto equivale al 92% del rendimiento teórico debido a los límites de degradación de maltodextrina sin enzimas como isoamilasa o 4-glucano transferasa. Se utilizaron patrones de diversas concentraciones de tagatosa para cuantificar este rendimiento.

Ejemplo 10

Se incubó a 50 °C una mezcla de reacción que contenía 200 g/l de maltodextrina, tampón de acetato 10 mM (pH 5,5), MgCl² 5 mM 0,1 g/l de isoamilasa a 80 °C durante 24 horas. Esto se usó para crear otra mezcla de reacción que contenía 20 g/l de maltodextrina tratada con isoamilasa, solución salina tamponada con fosfato 50 mM pH 7,2, MgCl² 5 mM, 0,05 U de aGP, 0,05 U de PGM, 0,05 U de PGI, 0,05 U de F6PE y 0,05 U de T6PP durante 24 horas. La producción de tagatosa se cuantificó como en el Ejemplo 9. El rendimiento de tagatosa se aumentó a 16 g/l con el pretratamiento de maltodextrina por isoamilasa. Esto equivale al 80% del rendimiento teórico.

Ejemplo 11

Para aumentar aún más los rendimientos de tagatosa a partir de maltodextrina, se añadió 0,05 U de 4-glucano transferasa (4GT) a la reacción descrita en el ejemplo 9.

Se incubó a 50 °C una mezcla de reacción de 0,2 ml que contenía 20 g/l de maltodextrina tratada con isoamilasa (vease el ejemplo 9), solución salina tamponada con fosfato 50 mM pH 7,2, MgCl²5 mM, 0,05 U de aGP, 0,05 U de PGM, 0,05 U de PGI, 0,05 U de F6PE 0,05 U de T6PP y 0,05 U de 4GT durante 24 horas. La producción de tagatosa se cuantificó como en el Ejemplo 9. El rendimiento de tagatosa se aumentó a 17,7 g/l con la adición de 4GT a maltodextrina tratada con IA. Esto equivale al 88,5% del rendimiento teórico.

Ejemplo 12

Para determinar el intervalo de concentración de solución salina tamponada con fosfato (PBS), se incubó a 50 °C una mezcla de reacción de 0,20 ml que contenía 50 g/l de maltodextrina; solución salina tamponada con fosfato 6,25 mM, 12,5 mM, 25 mM, 37,5 mM o 50 mM pH 7,2; MgCh 5 mM; 0,1 U de aGP; 0,1 U de PGM; 0,1 U de PGI; 0,1 U de F6PE; y 0,1 U de T6PP durante 6 horas. La corta duración garantiza que no se alcanzó la finalización y, por lo tanto, se pudieron ver claramente las diferencias en la eficiencia. La producción de tagatosa se cuantificó como en el ejemplo 9. Respectivamente, se obtuvo un rendimiento de 4,5 g/l, 5,1 g/l, 5,6 g/l, 4,8 g/l o 4,9 g/l de tagatosa para las reacciones que contenían solución salina tamponada con fosfato, 6,25 mM , 12,5 mM, 25 mM, 37,5 mM o 50 mM pH 7,2 (Tabla 1). Estos resultados indican que una concentración de PBS 25 mM pH 7,2 es ideal para estas condiciones de reacción particulares. Es importante observar que incluso el uso de PBS 6,25 mM a pH 7,2 da como resultado un cambio significativo debido al reciclaje de fosfato. Esto muestra que los métodos de reciclado de fosfato descritos son capaces de mantener bajos los niveles de fosfato incluso a niveles industriales de productividad volumétrica (por ejemplo, 200­ 300 g/l de maltodextrina).

Tabla 1

Ejemplo 13

Para determinar el intervalo de pH de la reacción en cascada, se incubó a 50 °C una mezcla de reacción de 0,20 ml que contenía 50 g/l de maltodextrina; solución salina tamponada con fosfato 50 mM, pH 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2 o 7,3; MgCl²5 mM; 0,02 U de aGP; 0,02 U de PGM; 0,02 U de PGI; 0,02 U de F6PE; y 0,02 U de T6PP durante 16 horas. Las unidades se disminuyeron para garantizar que no se alcanzara la terminación y, por lo tanto, se podían ver claramente las diferencias en la eficiencia. La producción de tagatosa se cuantificó como en el Ejemplo 8. Respectivamente, se obtuvo un rendimiento de 4,0 g/l, 4,1 g/l 4,2 g/l, 4,1 g/l, 4,4 g/l, 4,1 g/l, 3,8 g/l o 4,0 g/l de tagatosa para las reacciones que contenían solución salina tamponada con fosfato 50 mM a pH 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2 o 7,3 (Tabla 2). Estos resultados indican que un pH de 6,8 es ideal para estas condiciones de reacción particulares, aunque el sistema funciona en un amplio intervalo de pH.

Tabla 2

Ejemplo 14

Para investigar el escalamiento, se incubó a 50 °C una mezcla de reacción de 20 ml que contiene 50 g/l de maltodextrina tratada con isoamilasa (vease el Ejemplo 9), solución salina tamponada con fosfato 50 mM pH 7,2, MgCl²5 mM, 10 U de aGP, 10 U de PGM, 10 U de PGI, 10 U de F6PE y 10 U de T6PP durante 24 horas. La producción de tagatosa se cuantificó como en el Ejemplo 8. El rendimiento de tagatosa fue 37,6 g/l a una escala de 20 ml y 50 g/l de maltodextrina. Esto equivale al 75% del rendimiento teórico. Estos resultados indican que el escalamiento a mayores volúmenes de reacción no dará como resultado pérdidas significativas de rendimiento.

Ejemplo 15

Para aumentar aún más los rendimientos de tagatosa a partir de maltodextrina, se añaden 0,05 U de maltosa fosforilasa a la reacción descrita en el Ejemplo 9.

Ejemplo 16

Para aumentar aún más los rendimientos de tagatosa a partir de maltodextrina, se añaden 0,05 U de polifosfato glucoquinasa y polifosfato 75 mM a la reacción descrita en el Ejemplo 9.

Ejemplo 17

Para producir tagatosa a partir de fructosa, se incuba a 50 °C una mezcla de reacción que contiene 10 g/l de fructosa, tampón Tris 50 mM pH 7,0, polifosfato 75 mM, MgCh 5 mM, 0,05 U de fructosa polifosfato quinasa, 0,05 U de F6PE y 0,05 U de T6PP durante 24 horas. La producción de tagatosa se cuantifica como en el Ejemplo 9.

Ejemplo 18

Para producir tagatosa a partir de glucosa, se incuba a 50 °C una mezcla de reacción que contiene 10 g/l de glucosa, tampón Tris 50 mM pH 7,0, polifosfato 75 mM, MgCh 5 mM, 0,05 U de glucosa polifosfato quinasa, 0,05 U de PGI, 0,05 U de F6PE y 0,05 U de T6PP durante 24 horas. La producción de tagatosa se cuantifica como en el Ejemplo 9. Ejemplo 19

Para producir tagatosa a partir de sacarosa, se incuba a 50 °C una mezcla de reacción que contiene 10 g/l de sacarosa, solución salina tamponada con fosfato 50 mM pH 7,0, MgCh 5 mM, 0,05 U de sacarosa fosforilasa, 0,05 U de PGM, 0,05 U de PGI, 0,05 U de F6PE y 0,05 U de T6Pp durante 24 horas. La producción de tagatosa se cuantifica como en el Ejemplo 9.

Ejemplo 20

Para aumentar aún más los rendimientos de tagatosa a partir de sacarosa, se añaden polifosfato 75 mM y 0,05 U de polifosfato fructoquinasa a la mezcla de reacción del ejemplo 15. La producción de tagatosa se cuantifica como en el ejemplo 9.

Claims (17)

REIVINDICACIONES

1. Un proceso enzimático para preparar tagatosa, comprendiendo el proceso las etapas de:

(i) convertir fructosa 6-fosfato (F6P) en tagatosa 6-fosfato (T6P) catalizado por una fructosa 6-fosfato epimerasa (F6PE); y

(ii) convertir la T6P producida en tagatosa catalizado por una tagatosa 6-fosfato fosfatasa (T6PP),

en el que las etapas del proceso (i) y (ii) se llevan a cabo en un solo recipiente de reacción, y en el que las etapas del proceso están libres de ATP.

2. El proceso de la reivindicación 1, que comprende además una etapa de conversión de glucosa 6-fosfato (G6P) en las F6P, en el que la etapa es catalizada por fosfoglucosa isomerasa (PGI).

3. El proceso de la reivindicación 2, que comprende además la etapa de convertir glucosa 1 -fosfato (G1P) en la G6P, en el que la etapa es catalizada por fosfoglucomutasa (PGM).

4. El proceso de la reivindicación 3, que además comprende la etapa de convertir un sacárido en la G1P, en el que la etapa es catalizada por al menos una enzima, en el que el sacárido se selecciona del grupo que consiste en un derivado de almidón, un almidón, celulosa o un derivado del mismo y sacarosa.

5. El proceso de la reivindicación 4, en el que al menos una enzima se selecciona del grupo que consiste en alfaglucano fosforilasa (aGP), maltosa fosforilasa, sacarosa fosforilasa, celodextrina fosforilasa, celobiosa fosforilasa y celulosa fosforilasa.

6. El proceso de la reivindicación 4, en el que el sacárido es un derivado de almidón seleccionado del grupo que consiste en amilosa, amilopectina, almidón soluble, almidón, amilodextrina, maltodextrina, maltosa y glucosa.

7. El proceso de la reivindicación 4 o la reivindicación 6, que comprende además la etapa de convertir almidón en un derivado de almidón en el que el derivado de almidón se prepara mediante hidrólisis enzimática de almidón o mediante hidrólisis ácida de almidón.

8. El proceso de la reivindicación 6, en el que se añade al proceso 4-glucano transferasa (4GT).

9. El proceso de la reivindicación 7, en el que el derivado de almidón se prepara mediante hidrólisis enzimática de almidón catalizado por isoamilasa, pululanasa, alfa-amilasa o una combinación de las mismas.

10. El proceso de la reivindicación 1, que además comprende:

la etapa de convertir fructosa en F6P, en el que la etapa es catalizada por al menos una enzima.

11. El proceso de la reivindicación 2, que además comprende:

la etapa de convertir glucosa en la G6P, en el que la etapa es catalizada por al menos una enzima.

12. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que la fructosa 6-fosfato epimerasa se caracteriza porque:

es codificada por un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 60% de identidad de secuencia con las SEQ ID NOS.: 1, 3, 5, 7, 9 o 10; o comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60% de identidad de secuencia con las SEQ ID NOS.: 2, 4, 6, 8 u 11.

13. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que la tagatosa 6-fosfato fosfatasa se caracteriza porque:

es codificada por un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 60% de identidad de secuencia con las SEQ ID NOS.: 12, 14 o 16; o comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60% de identidad de secuencia con las SEQ ID NOS.: 13, 15 o 17.

14. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en el que las etapas del proceso se llevan a cabo: a una temperatura en el intervalo de 37 °C a 85 °C, a un pH en el intervalo de 5,0 a 8,0 y/o durante 8 horas a 48 horas; y/o

Sin NAD(H), a una concentración de fosfato de 0,1 mM a 150 mM, el fosfato se recicla y/o al menos una etapa del proceso implica una reacción química energéticamente favorable.

15. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en el que el proceso es un proceso enzimático para preparar tagatosa a partir de un derivado de almidón, comprendiendo el proceso las etapas de:

(i) convertir un sacárido en glucosa 1-fosfato (G1P) usando alfa-glucano fosforilasa (aGP), en el que el sacárido se selecciona de uno o más derivados de almidón;

(ii) convertir G1P en glucosa 6-fosfato (G6P) usando una fosfoglucomutasa (PGM);

(iii) convertir G6P en fructosa 6-fosfato (F6P) usando una fosfoglucoisomerasa (PGI);

(iv) convertir fructosa 6-fosfato (F6P) en tagatosa 6-fosfato (T6P) catalizado por una fructosa 6-fosfato epimerasa (F6PE); y

(v) convertir la T6P producida en tagatosa catalizado por una tagatosa 6-fosfato fosfatasa (T6PP),

en el que las etapas (i) -(v) se llevan a cabo en un solo recipiente de reacción.

16. El proceso de la reivindicación 10, que comprende además la etapa de convertir sacarosa en fructosa, en el que la etapa es catalizada por al menos una enzima.

17. El proceso de la reivindicación 11, que comprende además la etapa de convertir sacarosa en glucosa, en el que la etapa es catalizada por al menos una enzima.