BR112018077358B1 - Composição e métodos para produzir tagatose - Google Patents

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Abstract

A presente revelação refere-se a tagatose-6-fosfato fosfatase que consiste em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, um ácido nucleico que codifica a tagatose-6-fosfato fosfatase, e um transformante que compreende o ácido nucleico. Adicionalmente, a presente revelação se refere a uma composição para produzir tagatose, que compreende a tagatose-6-fosfato fosfatase da presente revelação, e um método para produzir tagatose com o uso da tagatose-6-fosfato fosfatase da presente revelação.

Description

CAMPO DA TÉCNICA
[001] A presente revelação refere-se à tagatose-6- fosfato fosfatase e um método para produzir tagatose com o uso da mesma.
ANTECEDENTES DA TÉCNICA
[002] Um método para produzir D-tagatose a partir de D- galactose com o uso de L-arabinose isomerase e um método para produzir tagatose a partir de D-frutose com o uso de L-ribulose- 5-fosfato-4-epimerase foram relatados como métodos para produzir tagatose com o uso de uma reação de conversão de enzima única convencional. Entretanto, em tal reação de conversão de enzima única, existe um certo nível de equilíbrio de reação entre um substrato e um produto (produto/substrato = cerca de 20% a 50%). Portanto, no caso da produção de tagatose de alta pureza com o uso da reação de conversão de enzima única, é necessário um processo de purificação adicional para isolar e remover uma alta concentração de um substrato a partir do resultado de reação.
[003] Por outro lado, para o método para produzir D- tagatose com o uso de uma reação de conversão de enzima múltipla, um método de preparação que compreende produzir D-frutose-6- fosfato a partir de adenosina trifosfato (ATP) e frutose com o uso de hexoquinase (EC 2.7.1.1), converter a D-frutose-6-fosfato em D-tagatose-6-fosfato com o uso de D-frutose-1,6-bisfosfato- adolase (EC 4.1.2.13) que tem a atividade de frutose-6-fosfato- 4-epimerase e produzir D-tagatose a partir de D-tagatose-6- fosfato com o uso de uma fitase como uma fosfatase, já foi relatado (patente coreana nos 10-1627921 e 10-1620904). Entretanto, a reação de enzima múltipla exige ATP dispendiosa como um doador de fosfato e é limitada em aplicação de processo devido às estabilidades físico-químicas baixas (calor, pH, etc.) dos nucleotídeos de adenina AMP, ADP e ATP. Além disso, as fitases induzem reações irreversíveis devido a sua variedade de substratos e, dessa forma, tem um limite no aumento do rendimento de produção de tagatose.
REVELAÇÃO PROBLEMA DA TÉCNICA
[004] Os presentes inventores investiram grandes esforços para desenvolver um método para produzir tagatose em alto rendimento mediante o uso de matérias-primas econômicas. Como resultado, quando a tagatose-6-fosfato é produzida através da conversão a partir de sacarose, amido ou maltodextrina, que são matérias-primas econômicas, em glicose ou glicose-1-fosfato, glicose-6-fosfato e frutose-6-fosfato, constatou-se que a tagatose pode ser produzida com conversões enzimáticas de um recipiente , em que uma pluralidade de enzimas envolvidas na via de produção de tagatose pode ser usada simultaneamente mediante a realização de desfosforilação de tagatose-6-fosfato como uma via de reação irreversível com o uso da tagatose-6-fosfato fosfatase da presente revelação; e que a taxa de conversão para tagatose pode ser consideravelmente aumentada, concluindo, assim, a presente revelação.
SOLUÇÃO DA TÉCNICA
[005] Um objetivo da presente revelação é fornecer tagatose-6-fosfato fosfatase que consistem em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
[006] Um outro objetivo da presente revelação é fornecer um ácido nucleico que codifica a tagatose-6-fosfato fosfatase da presente revelação.
[007] Mais um outro objetivo da presente revelação é fornecer um transformante que compreende o ácido nucleico que codifica a tagatose-6-fosfato fosfatase da presente revelação.
[008] Mais um outro objetivo da presente revelação é fornecer uma composição para produzir tagatose, que compreende a tagatose-6-fosfato fosfatase da presente revelação, um micro-organismo que expressa a tagatose-6-fosfato fosfatase ou uma cultura do micro-organismo que expressa a tagatose-6-fosfato fosfatase.
[009] Mais um outro objetivo da presente revelação é fornecer um método para produzir tagatose com o uso da tagatose- 6-fosfato fosfatase da presente revelação.
EFEITOS VANTAJOSOS
[010] Uma vez que a tagatose-6-fosfato fosfatase da presente revelação é termoestável, a mesma pode ser usada para produzir industrialmente tagatose, a produção de tagatose em uma alta concentração é possível explorando-se uma via de reação irreversível, e tagatose pode ser produzida com uma conversão enzimática de um recipiente com o uso de sacarose, amido ou maltodextrina, que são matérias-primas econômicas, como uma matéria-prima. Portanto, uma vez que o processo para produzir tagatose de alta pureza pode ser simplificado, o método de produção é vantajoso pelo fato de que é tanto simples como econômico.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[011] A Figura 1 mostra esquematicamente a via de reação com capacidade para produzir tagatose a partir de amido (por exemplo, maltodextrina), sacarose ou glicose, e exibe as enzimas envolvidas na mesma.
[012] A Figura 2 mostra os resultados da análise do peso molecular da tagatose-6-fosfato fosfatase (E: T6PP) da presente revelação por eletroforese de proteína (SDS-PAGE). “M” representa um marcador de tamanho de proteína, e “CE” representa um sobrenadante após a ruptura de transformante.
[013] A Figura 3 é um gráfico que mostra a atividade de conversão da tagatose-6-fosfato fosfatase da presente revelação a partir de tagatose-6-fosfato em tagatose.
[014] A Figura 4 é um gráfico que mostra a atividade da tagatose-6-fosfato fosfatase da presente revelação, de acordo com a solução tampão e faixa de pH.
[015] A Figura 5 é um gráfico que mostra a atividade da tagatose-6-fosfato fosfatase da presente revelação, de acordo com a temperatura.
[016] A Figura 6 é um gráfico que mostra a atividade da tagatose-6-fosfato fosfatase da presente revelação mediante a adição de um íon metálico.
[017] A Figura 7 é um gráfico que mostra a especificidade de substrato da tagatose-6-fosfato fosfatase da presente revelação para tagatose-6-fosfato.
MELHOR MODO
[018] Doravante, a presente revelação será descrita em detalhes. Entretanto, cada uma das explicações e modalidades exemplificadoras reveladas no presente documento pode ser aplicada a outras explicações e modalidades exemplificadoras. A saber, todas as combinações de diversos fatores revelados no presente documento pertencem ao escopo da presente revelação. Adicionalmente, o escopo da presente revelação não deve ser limitado pela revelação específica fornecida doravante.
[019] Com a finalidade de alcançar o objetivo da presente revelação, um aspecto da presente revelação fornece tagatose-6-fosfato fosfatase que consiste em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
[020] A tagatose-6-fosfato fosfatase da presente revelação pode compreender um polipeptídeo que tem uma homologia com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 de pelo menos 80%, 90%, 95%, 97% ou 99%. Por exemplo, é evidente que uma proteína que tem uma sequência de aminoácidos que tem deleção, modificação, substituição ou adição de algumas sequências é abrangida pelo escopo da presente revelação, contanto que tenha a homologia e exiba eficácia que corresponde àquela da proteína que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
[021] Adicionalmente, contato que uma proteína tenha eficácia que corresponde àquela da tagatose-6-fosfato fosfatase da presente revelação, que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, a mesma não exclui uma mutação que pode ocorrer por uma adição de sequência insignificante a montante ou a jusante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, uma mutação de ocorrência natural ou uma mutação silenciosa. Além disso, uma proteína que inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 também pertence ao escopo da presente revelação.
[022] Adicionalmente, a tagatose-6-fosfato fosfatase pode ser codificada pela sequência de nucleotídeos de SED ID NO: 2, ou a tagatose-6-fosfato fosfatase pode ser codificada por uma sequência de nucleotídeos que tem uma homologia com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 80%, 90%, 95%, 97% ou 99%, mas não se limita ao mesmo. Com base na degeneração de códon, é evidente que as proteínas que consistem na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, ou polinucleotídeos que podem ser traduzidos em proteínas que têm uma homologia com as proteínas acima, também podem ser incluídas no escopo da presente revelação.
[023] Como usado aqui, o termo “homologia” se refere a um grau de correspondência com uma determinada sequência de aminoácidos ou sequência de nucleotídeos, e a homologia pode ser expressa como uma porcentagem. Na presente revelação, uma sequência de homologia que tem uma atividade que é idêntica ou similar à determinada sequência de aminoácidos ou sequência de nucleotídeos é expressa como “% de homologia”. A sequência de homologia pode ser determinada por meio, por exemplo, de software-padrão, especificamente, BLAST 2.0, que calcula os parâmetros como pontuação, identidade, similaridade, etc., ou mediante a comparação das sequências em um experimento de hibridização Southern sob condições estringentes definidas, e a definição de condições de hibridização adequadas está dentro da capacidade da técnica, e pode ser determinada por um bem conhecido pelos versados na técnica (por exemplo, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque). Como usado aqui, o termo “condições estringentes” se refere a condições que são projetadas para permitir hibridização específica entre polinucleotídeos. Por exemplo, essas condições são especificamente descritas na literatura (por exemplo, J. Sambrook et al., supra).
[024] Na presente revelação, as condições estringentes podem ser ajustadas para determinar a homologia. Com a finalidade de confirmar a homologia entre polinucleotídeos, as condições de hibridização de baixa estringência, que correspondem a um valor de Tm de 55 °C, podem ser usadas. Por exemplo, podem ser usadas condições de 5X SSC, SDS a 0,1%, leite a 0,25% e sem formamida; ou formamida a 30%, 5X SSC e SDS a 0,5% SDS. As condições de hibridização de estringência branda correspondem a valores altos de Tm; por exemplo, formamida a 40% e 5X ou 6X SSC pode ser usado. As condições de hibridização de alta estringência correspondem aos valores mais altos de Tm; por exemplo, formamida a 50% e 5X ou 6X SSC pode ser usado, mas as condições de hibridização não se limitam aos exemplos acima.
[025] A hibridização exige que dois ácidos nucleicos tenham sequências complementares, embora divergências entre bases possíveis dependendo da estringência de hibridização. O termo “complementar” é usado para descrever a relação entre bases de nucleotídeo que têm capacidade para serem hibridizadas umas com as outras. Por exemplo, em relação ao DNA, adenosina é complementar à timina e citosina é complementar à guanina. Portanto, a presente revelação pode incluir também sequências de ácidos nucleicos substancialmente similares, bem como fragmentos de ácido nucleico isolados complementares à sequência inteira.
[026] Especificamente, o polinucleotídeo que tem homologia pode ser detectado com o uso de condições de hibridização que incluem uma etapa de hibridização em um valor Tm de 55 °C e com o uso das condições descritas acima. Além disso, o valor de Tm pode ser de 60 °C, 63 °C ou 65 °C, mas não se limita ao mesmo. Aqueles versados na técnica podem ajustar adequadamente o valor de Tm de acordo com seu propósito.
[027] A estringência adequada de hibridização dos polinucleotídeos depende do comprimento e grau de complementaridade dos polinucleotídeos, e as variáveis são bem conhecidas na técnica. À medida que a similaridade ou homologia entre os dois nucleotídeos se torna maior, o valor de Tm para híbridos dos polinucleotídeos que têm tal sequência se torna maior. A estabilidade relativa para a hibridização dos polinucleotídeos (que corresponde a um valor de Tm mais alto) diminui na seguinte ordem: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. A fórmula de cálculo dos valores de Tm para híbridos, cujo comprimento é maior que 100 nucleotídeos, é publicada na técnica (Sambrook et al., supra, 9.50 a 9.51). Para hibridização com polinucleotídeos mais curtos, por exemplo, oligonucleotídeos, a posição de divergência pode ser mais importante, e o comprimento dos oligonucleotídeos pode determinar a especificidade do mesmo (Sambrook et al., supra, 11.7 a 11.8).
[028] Especificamente, os polinucleotídeos podem ser detectados com o uso das seguintes condições de hibridização: 1) uma etapa de hibridização com uma concentração de sal menor que 500 mM e uma temperatura de pelo menos 37 °C; e uma etapa de lavagem a pelo menos 63 °C com 2X SSPE; 2) uma etapa de hibridização com uma concentração de sal menor que 200 mM e uma temperatura de pelo menos 37 °C; ou 3) tanto a etapa de hibridização como de lavagem a 63 °C com 2X SSPE.
[029] O comprimento do ácido nucleico de hibridização pode ser, por exemplo, de pelo menos cerca de 10 nucleotídeos, 15 nucleotídeos, 20 nucleotídeos ou pelo menos 30 nucleotídeos. Além disso, aqueles versados na técnica podem ajustar a temperatura e a concentração de sal de solução de lavagem conforme necessário, dependendo de fatores como o comprimento da sonda.
[030] A tagatose-6-fosfato fosfatase da presente revelação pode ser uma enzima derivada de Thermotoga sp., e especificamente pode ser uma enzima derivada de Thermotoga neapolitana, mas não se limita ao mesmo.
[031] Um outro aspecto da presente revelação fornece um ácido nucleico que codifica a tagatose-6-fosfato fosfatase da presente revelação.
[032] Mais um outro aspecto da presente revelação fornece um transformante que compreende o ácido nucleico que codifica a tagatose-6-fosfato fosfatase da presente revelação.
[033] Como usado aqui, o termo “transformação” se refere a um processo de introduzir em uma célula hospedeira um vetor que inclui um ácido nucleico que codifica uma proteína- alvo, possibilitando, assim, a expressão da proteína codificada pelo ácido nucleico na célula hospedeira. Para o ácido nucleico transformado, não importa se o ácido nucleico transformado é inserido no cromossomo de uma célula hospedeira e situado na mesma ou situado fora do cromossomo, contanto que possa ser expresso na célula hospedeira, e ambos os casos estão incluídos. Adicionalmente, o ácido nucleico inclui DNA e RNA que codificam a proteína-alvo. O ácido nucleico pode ser inserido em qualquer forma contanto que possa ser introduzido em uma célula hospedeira e expresso na mesma. Por exemplo, o ácido nucleico pode ser introduzido em uma célula hospedeira sob a forma de um cassete de expressão, que é um construto de gene que inclui todos os elementos essenciais necessários para a autoexpressão. O cassete de expressão pode convencionalmente incluir um promotor ligada de maneira funcional ao ácido nucleico, um sinal de terminação de transcrição, um domínio de ligação de ribossoma e um sinal de terminação de tradução. O cassete de expressão pode ser sob a forma de um vetor de expressão com a capacidade de autorreplicação. Adicionalmente, o ácido nucleico pode ser introduzido em uma célula hospedeira tal como é e ligado de maneira funcional a uma sequência essencial para sua expressão na célula hospedeira, mas o ácido nucleico não se limita ao mesmo.
[034] Adicionalmente, como usado aqui, o termo “ligado de modo funcional” se refere a uma ligação funcional entre uma sequência promotora, a qual inicia e media a transcrição do ácido nucleico que codifica a proteína alvo da presente revelação, e a sequência de gene acima.
[035] O método da presente revelação para transformar o vetor inclui qualquer método para introduzir um ácido nucleico em uma célula, e pode ser realizado mediante a seleção de uma técnica-padrão adequada conhecida na técnica, de acordo com uma célula hospedeira. Os exemplos do método podem incluir eletroporação, precipitação de fosfato de cálcio (CaPO4), precipitação de cloreto de cálcio (CaCl2), microinjeção, uma técnica de polietilenoglicol (PEG), uma técnica de DEAE- dextrano, uma técnica de lipossoma catiônico, uma técnica de acetato de lítio-DMSO, etc., mas não se limita ao mesmo.
[036] Como a célula hospedeira, é preferencial usar um hospedeiro que tem uma alta eficácia de introdução de DNA e uma alta eficácia de expressão do DNA introduzido. Por exemplo, o mesmo pode ser E. coli, mas não se limita ao mesmo.
[037] Mais um outro aspecto da presente revelação fornece uma composição para produzir tagatose, que compreende a tagatose-6-fosfato fosfatase da presente revelação, um micro-organismo que expressa a tagatose-6-fosfato fosfatase ou uma cultura do micro-organismo que expressa a tagatose-6-fosfato fosfatase.
[038] A composição para produzir tagatose pode compreender adicionalmente uma enzima envolvida na via de produção de tagatose (consulte a Figura 1) da presente revelação, um micro-organismo que expressa a enzima envolvida na via de produção de tagatose da presente revelação ou uma cultura do micro-organismo que expressa a enzima envolvida na via de produção de tagatose da presente revelação. Entretanto, isso é meramente um exemplo, isto é, uma enzima a ser contida na composição da presente revelação para produzir tagatose e um substrato usado para a produção de tagatose não são limitados, contanto que a tagatose possa ser produzida com o uso da tagatose-6-fosfato fosfatase da presente revelação.
[039] A composição da presente revelação para produzir tagatose pode compreender adicionalmente: (a) (i) amido, maltodextrina, sacarose ou uma combinação dos mesmos, glicose, glicose-1-fosfato, glicose-6-fosfato, frutose-6-fosfato ou tagatose-6-fosfato; (ii) fosfato; (iii) frutose-6-fosfato-4- epimerase; (iv) glicose-6-fosfato isomerase; (v) fosfoglicomutase ou glicoquinase; e/ou (vi) α- glucanofosforilase, amido fosforilase, maltodextrina fosforilase ou sacarose fosforilase, ou α-amilase, pululanase, isoamilase, glicoamilase ou sacarase; ou (b) um micro-organismo que expressa qualquer uma das enzimas ou uma cultura do micro-organismo, mas não se limita ao mesmo.
[040] A amido/maltodextrina fosforilase (EC 2.4.1.1) e α-glucanofosforilase da presente revelação podem incluir quaisquer proteínas, contanto que sejam proteínas que são submetidas à transferência de fosforila a partir de fosfato para glicose, tendo, assim, a atividade para produzir glicose-1- fosfato a partir de amido ou maltodextrina. A sacarose fosforilase (EC 2.4.1.7) da presente revelação pode incluir qualquer proteína, contanto que seja uma proteína que é submetida à transferência de fosforila a partir de fosfato para glicose, tendo, assim, a atividade para produzir glicose-1-fosfato a partir de sacarose. A α-amilase (EC 3.2.1.1), pululanase (EC 3.2.1.41), glicoamilase (EC 3.2.1.3) e isoamilase da presente revelação, que são enzimas para sacarificação de amido, podem incluir quaisquer proteínas, contanto que seja proteínas que têm atividade para converter amido ou maltodextrina em glicose. A sacarose (EC 3.2.1.26) da presente revelação pode incluir qualquer proteína, contato que seja uma proteína que tem a atividade para converter sacarose em glicose. A fosfoglicomutase (EC 5.4.2.2) da presente revelação pode incluir qualquer proteína, contanto que seja uma proteína que tem a atividade para converter glicose-1-fosfato em glicose-6-fosfato. A glicoquinase pode incluir qualquer proteína, contanto que seja uma proteína com capacidade para transferir fosfato para glicose, tendo, assim, a atividade para converter em glicose-6- fosfato. Especificamente, a glicoquinase pode ser uma glicoquinase dependente de polifosfato, e mais especificamente, pode ser uma glicoquinase dependente de polifosfato derivada de Deinococcus geothermalis que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e na sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 7, ou pode ser uma glicoquinase dependente de polifosfato derivada de Anaerolinea thermophila que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 e na sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 8. A glicose-6-fosfato isomerase da presente revelação pode incluir qualquer proteína, contanto que seja uma proteína que tem uma atividade para converter glicose- 6-fosfato em frutose-6-fosfato. A frutose-6-fosfato-4-epimerase da presente revelação pode incluir qualquer proteína, contanto que seja uma proteína que tem uma atividade para converter frutose-6-fosfato em tagatose-6-fosfato.
[041] A composição da presente revelação para produzir tagatose pode compreender adicionalmente um íon ou sal de um metal selecionado do grupo que consiste em Mg, Mn e Zn. Especificamente, o sal de metal da presente revelação pode ser um sal de um metal selecionado do grupo que consiste em MgCl2, MgSO4, MnCl2, MnSO4, ZnCl2 e ZnSO4.
[042] Mais um outro aspecto da presente revelação fornece um método para produzir tagatose, que compreende converter tagatose-6-fosfato em tagatose mediante a reação da tagatose-6-fosfato com a tagatose-6-fosfato fosfatase da presente revelação, um micro-organismo que expressa a tagatose- 6-fosfato fosfatase ou uma cultura do micro-organismo que expressa a tagatose-6-fosfato fosfatase.
[043] O método de produção da presente revelação pode compreender adicionalmente converter frutose-6-fosfato em tagatose-6-fosfato mediante a reação da frutose-6-fosfato com frutose-6-fosfato-4-epimerase, um micro-organismo que expressa a frutose-6-fosfato-4-epimerase ou uma cultura do micro-organismo que expressa a frutose-6-fosfato-4-epimerase, antes de converter a tagatose-6-fosfato em tagatose.
[044] Adicionalmente, o método de produção pode compreender adicionalmente converter glicose-6-fosfato em frutose-6-fosfato mediante a reação da glicose-6-fosfato com glicose-6-fosfato isomerase, um micro-organismo que expressa a glicose-6-fosfato isomerase ou uma cultura do micro-organismo que expressa a glicose-6-fosfato isomerase, antes de converter a frutose-6-fosfato da presente revelação em tagatose-6-fosfato.
[045] Adicionalmente, o método de produção pode compreender adicionalmente converter glicose-1-fosfato em glicose-6-fosfato mediante a reação da glicose-1-fosfato com fosfoglicomutase, um micro-organismo que expressa a fosfoglicomutase ou uma cultura do micro-organismo que expressa a fosfoglicomutase, antes de converter a glicose-6-fosfato da presente revelação em frutose-6-fosfato.
[046] Adicionalmente, o método de produção pode compreender adicionalmente converter glicose em glicose-6- fosfato mediante a reação da glicose com glicoquinase, um microorganismo que expressa a glicoquinase ou uma cultura do microorganismo que expressa a glicoquinase, e fosfato, antes de converter a glicose-6-fosfato da presente revelação em frutose- 6-fosfato.
[047] Adicionalmente, o método de produção pode compreender adicionalmente converter amido, maltodextrina, sacarose ou uma combinação dos mesmos em glicose-1-fosfato mediante a reação do amido, maltodextrina, sacarose ou combinação dos mesmos com fosfato e α-glucanofosforilase, amido fosforilase, maltodextrina fosforilase ou sacarose fosforilase; um micro-organismo que expressa a α-glucanofosforilase, amido fosforilase, maltodextrina fosforilase ou sacarose fosforilase; ou uma cultura do micro-organismo que expressa a α- glucanofosforilase, amido fosforilase, maltodextrina fosforilase ou sacarose fosforilase, antes de converter a glicose-1-fosfato da presente revelação em glicose-6-fosfato.
[048] Adicionalmente, o método de produção pode compreender adicionalmente converter amido, maltodextrina, sacarose ou uma combinação dos mesmos em glicose mediante a reação do amido, maltodextrina, sacarose ou combinação dos mesmos com α-amilase, pululanase, glicoamilase, sacarase ou isoamilase; um micro-organismo que expressa a α-amilase, pululanase, glicoamilase, sacarase ou isoamilase; ou uma cultura do micro-organismo que expressa a α-amilase, pululanase, glicoamilase, sacarase ou isoamilase, antes de converter a glicose da presente revelação em glicose-6-fosfato.
[049] O método de produção pode compreender adicionalmente converter glicose em amido, maltodextrina ou sacarose mediante a reação da glicose com 4-α- glucanotransferase, um micro-organismo que expressa a 4-α- glucanotransferase ou uma cultura do micro-organismo que expressa a 4-α-glucanotransferase.
[050] No método de produção, a “reação” pode ser realizada em um pH de 5,0 a 8.0, uma temperatura de 60 °C a 90 °C e/ou durante 1 minuto a 24 horas. Especificamente, a reação da presente revelação pode ser realizada em um pH de 6,0 a 8,0, um pH de 6,5 a 8,0 ou um pH de 6,5 a 7,5. Adicionalmente, a reação da presente revelação pode ser realizada a 60 °C a 90 °C, 70 °C a 90 °C ou 75 °C a 85 °C. Ainda, a reação da presente revelação pode ser realizada durante 1 minuto a 12 horas, 1 minuto a 6 horas, 1 minuto a 3 horas, 1 minuto a 1 hora, 5 minutos a 24 horas, 5 minutos a 12 horas, 5 minutos a 6 horas, 5 minutos a 3 horas, 5 minutos a 1 hora, 10 minutos a 24 horas, 10 minutos a 12 horas, 10 minutos a 6 horas, 10 minutos a 3 horas ou 10 minutos a 1 hora.
[051] Adicionalmente, a reação da presente revelação pode ser realizada na presença de um íon ou sal de um metal selecionado do grupo que consiste em Mg, Mn e Zn. Especificamente, o sal de metal da presente revelação pode ser um sal de um metal selecionado do grupo que consiste em MgCl2, MgSO4, MnCl2, MnSO4, ZnCl2 e ZnSO4.
[052] Mais outro aspecto da presente revelação fornece um método para produzir tagatose que compreende reagir amido, maltodextrina, sacarose ou uma combinação dos mesmos e fosfato com (a) tagatose-6-fosfato fosfatase; frutose-6-fosfato-4- epimerase; glicose-6-fosfato isomerase; fosfoglicomutase ou glicoquinase; e α-glucanofosforilase, amido fosforilase, maltodextrina fosforilase, sacarose fosforilase, α-amilase, pululanase, isoamilase, glicoamilase ou sacarase; ou (b) um micro-organismo que expressa qualquer uma das enzimas ou uma cultura do micro-organismo.
MODO PARA INVENÇÃO
[053] Mais adiante neste documento, a presente revelação será descrita em detalhes com as modalidades exemplificativas anexas. Entretanto, as modalidades exemplificativas reveladas no presente documento são apenas para propósitos ilustrativos e não devem ser interpretadas como limitantes ao escopo da presente revelação.
EXEMPLO 1: PREPARAÇÃO DE VETOR DE EXPRESSÃO RECOMBINANTE QUE CONTÉM GENE DE TAGATOSE-6-FOSFATO FOSFATASE, E MICRO-ORGANISMO TRANSFORMADO
[054] A fim de descobrir D-tagatose-6-fosfato fosfatase inovadora termoestável, um gene foi isolado a partir de Thermotoga neapolitana, um micro-organismo termofílico, e, então, um vetor de expressão recombinante e um micro-organismo transformado foram produzidos.
[055] Especificamente, com base nas sequências de genes de Thermotoga neapolitana registradas no Genbank, t6pp, que é um gene esperado para codificar tagatose-6-fosfato fosfatase, foi selecionado. Depois disso, com base nas informações de sua sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 1) e sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 2), um iniciador direto (SEQ ID NO: 3) e um iniciador inverso (SEQ ID NO: 4) foram desenvolvidos e sintetizados. A reação em cadeia de polimerase (PCR) foi realizada com os iniciadores sintetizados com o uso de DNA cromossômico de Thermotoga neapolitana (DNA genômico) como um modelo. Especificamente, PCR foi realizada durante um total de 25 ciclos sob as seguintes condições: desnaturação a 95 °C durante 30 segundos, anelamento a 55 °C durante 30 segundos e polimerização a 68 °C durante 2 minutos. Os resultantes são inseridos em pET21a (Novagen Inc.), que é um vetor plasmidial para expressão em E. coli, com o uso de enzimas de restrição NdeI e XhoI, e, então, um vetor de expressão recombinante foi construído e nomeado como pET21a-CJ_tn_t6pp. pET21a-CJ_tn_t6pp foi transformado na cepa de E. coli BL21(DE3) por meio de um método de transformação convencional (Sambrook et al. 1989) para preparar um micro-organismo transformado em um vetor recombinante que inclui a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2, e isso foi designado como E. coli BL21(DE3)/CJ_tn_t6pp.
[056] A cepa E. coli BL21(DE3)/CJ_tn_t6pp foi depositada no Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM), que é uma autoridade de depósito internacional sob o Tratado de Budapeste, em 23 de junho de 2016, e com no de acesso atribuído KCCM11850P.
EXEMPLO 2: PREPARAÇÃO DE ENZIMA RECOMBINANTE
[057] Com a finalidade de preparar uma tagatose fosfatase recombinante (doravante denominada como T6PP), E. coli BL21 (DE3)/CJ_tn_t6pp foi inoculada em um tubo de cultura que contém 5 ml de meio líquido LB e, então, uma cultura original foi iniciada em um incubador agitado a 37 °C até que a absorvância em 600 nm alcançasse 2,0. A solução de cultura original foi inoculada em um frasco de cultura que contém o meio líquido LB e a cultura principal foi realizada. Quando a absorvância em 600 nm alcançou 2,0, IPTG 1 mM foi adicionado para induzir a expressão/produção de T6PP. A cultura original e cultura principal foram realizadas em uma taxa de agitação de 200 rpm em uma temperatura de 37 °C. Mediante a conclusão da cultura principal, a solução de cultura foi centrifugada a 4 °C em 8.000 x g durante 20 minutos, e, então, as células foram recuperadas. As células recuperadas foram lavadas duas vezes com um tampão de Tris-HCl 50 mM (pH 7,0), suspensas no mesmo tampão e, então, as células foram rompidas com o uso de um disruptor de células ultrassônico. Os restos de células foram centrifugados a 4 °C em 13.000 x g durante 20 minutos e, então, apenas o sobrenadante foi obtido. T6PP foi purificado a partir do sobrenadante com o uso de cromatografia de afinidade His-tag.
[058] O peso molecular foi confirmado por meio da análise de SDS-PAGE, e como resultado, constatou-se que o peso molecular do T6PP foi de cerca de 29 kDa (indicado como “E” na Figura 2a).
EXEMPLO 3: CONFIRMAÇÃO DA ATIVIDADE DE CONVERSÃO DE T6PP EM TAGATOSE
[059] Com a finalidade de analisar a atividade de conversão de T6PP a partir de tagatose-6-fosfato em tagatose, tagatose-6-fosfato (50 mM) foi suspensa em um tampão de Tris- HCl 50 mM (pH 7,5), e o T6PP purificado (0,1 unidade/ml) e MgCl2 (10 mM) foram adicionados ao mesmo. Depois disso, os resultantes foram reagidos a 70 °C durante 10 minutos e, então, os resultantes de reação foram analisados com HPLC. A análise por HPLC foi realizada com o uso de uma coluna HPX-87H (Bio-Rad, Inc.) mediante o fluxo de ácido sulfúrico 5 mM na fase móvel em uma taxa de fluxo de 0,6 ml/min a 60 °C. Tagatose e tagatose-6- fosfato foram detectadas por um detector de índice de refração.
[060] Como resultado, foi constatado que a tagatose foi produzida a partir do produto de reação de T6PP (Figura 3).
EXEMPLO 4: CONFIRMAÇÃO DA ATIVIDADE DE T6PP DE ACORDO COM PH, TEMPERATURA E ADIÇÃO DE ÍON METÁLICO 4-1. CONFIRMAÇÃO DE ATIVIDADE DE ACORDO COM pH
[061] Com a finalidade de investigar a influência de pH em T6PP, o T6PP purificado (0,1 unidade/ml) foi adicionado à tagatose-6-fosfato (50 mM) suspensa em um tampão 50 mM com diversos pHs (pH 4,0 a 7,0, citrato de sódio; pH 4,0 a 7,0, acetato de sódio; pH 6,0 a 8,0, fosfato de potássio: pH 7,0 a 9,0, Tris-HCl) e, então, reagido a 70 °C durante 10 minutos. Depois disso, a tagatose foi analisada quantitativamente por HPLC sob as mesmas condições analíticas como no Exemplo 3.
[062] Como resultado, foi confirmado que T6PP mostrou a atividade máxima no tampão Tris-HCl (especialmente, em pH 7,0), e que T6PP mostrou 80% ou mais de sua atividade em uma faixa de pH muito ampla (5,0 a 8,0), em comparação com a atividade máxima (Figura 4).
4-2. CONFIRMAÇÃO DE ATIVIDADE DE ACORDO COM A TEMPERATURA
[063] Com a finalidade de analisar a atividade de T6PP de acordo com a temperatura, o T6PP purificado (0,1 unidade/ml) foi adicionado à tagatose-6-fosfato (50 mM) suspensa em um tampão de Tris-HCl 50 mM (pH 7,0) e, então, reagido a 40 °C, 50 °C, 60 °C, 70 °C, 80 °C e 90 °C durante 10 minutos. Depois disso, a tagatose foi analisada quantitativamente por HPLC sob as mesmas condições analíticas como no Exemplo 3.
[064] Como resultado, foi confirmado que T6PP mostrou uma alta atividade a 70 °C a 90 °C e particularmente exibiu a atividade máxima a 80 °C (Figura 5).
4-3. CONFIRMAÇÃO DE ATIVIDADE DE ACORDO COM A ADIÇÃO DE ÍON METÁLICO
[065] Com a finalidade de investigar o efeito de adição de um íon metálico na atividade de T6PP, cada um dos íons metálicos (por exemplo, NiSO4, CuSO4, MnSO4, CaCl2, ZnSO4, MgCl2, CoSO4 e APO) foi adicionado à tagatose-6-fosfato (50 mM) suspensa em um tampão de Tris-HCl 50 mM (pH 7,0) a uma concentração final de 0,5 mM. Para a remoção dos íons metálicos, T6PP (0,1 unidade/ml), que foi dialisado mediante o tratamento com EDTA 10 mM, foi adicionado aos mesmos e, então, os resultantes foram reagidos a 70 °C durante 10 minutos. Depois disso, a tagatose foi analisada quantitativamente por HPLC sob as mesmas condições analíticas como no Exemplo 3.
[066] Como resultado, foi confirmado que a atividade de T6PP foi principalmente aumentada mediante a adição de íon de Mg, e que a atividade também foi aumentada mediante a adição de íons de Mn e Zn (Figura 6).
EXEMPLO 5: ANÁLISE DE ESPECIFICIDADE DE SUBSTRATO DE T6PP
[067] Com a finalidade de determinar se T6PP tem especificidade de substrato para tagatose-6-fosfato, a atividade de T6PP em diversos sacarídeos fosforilados foi analisada. Cada uma dentre glicose-1-fosfato (50 mM), glicose-6-fosfato (50 mM), frutose-6-fosfato (50 mM), tagatose-6-fosfato (50 mM) e tagatose-6-fosfato (50 mM) foi usada como o substrato. Um tampão de Tris-HCl 50 mM (pH 7,0) e o T6PP purificado (1 unidade/ml) foram adicionados e, então, os resultantes foram reagidos a 70 °C durante 1 hora. Depois disso, cada um dentre os sacarídeos e sacarídeos fosforilados foi quantitativamente analisado por HPLC sob as mesmas condições analíticas como no Exemplo 3.
[068] Como resultado, foi confirmado que T6PP tem uma atividade de desfosforilação apenas para tagatose-6-fosfato (Figura 7).
[069] Embora a presente revelação tenha sido descrita com referência às modalidades ilustrativas particulares, será compreendido por aqueles versados na técnica que a presente revelação pertence que a presente revelação pode ser incorporada em outras formas específicas sem que se afaste do espírito da técnica ou características essenciais da presente revelação. Portanto, as modalidades descritas acima são consideradas como sendo ilustrativas em todos os aspectos e não restritivas. Adicionalmente, o escopo da presente revelação é definido pelas reivindicações anexas em vez da descrição detalhada, e deve-se compreender que todas as modificações ou variações derivadas dos significados e escopo da presente revelação e equivalentes dos mesmos são incluídos no escopo das reivindicações anexas.

Claims (13)

1. Composição para produzir tagatose caracterizada pelo fato de que compreende a tagatose-6-fosfato fosfatase que consiste em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, um micro-organismo que expressa a referida tagatose-6-fosfato fosfatase, ou uma cultura do micro-organismo que expressa a referida tagatose-6-fosfato fosfatase, em que a composição compreende ainda: (i) amido, maltodextrina, sacarose, ou uma combinação dos mesmos.
2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente: (a) (ii) fosfato; (iii) frutose-6-fosfato-4-epimerase; (iv) glicose-6-fosfato isomerase; (v) fosfoglicomutase ou glicoquinase; e (vi) α-glucanofosforilase, amido fosforilase, maltodextrina fosforilase, sacarose fosforilase, α-amilase, pululanase, isoamilase, glicoamilase ou sacarase; ou (b) um micro-organismo que expressa uma ou mais das enzimas selecionadas de (a) ou uma cultura do micro-organismo que expressa qualquer uma das enzimas selecionadas de (a).
3. Método para produzir tagatose caracterizado pelo fato de que compreende converter tagatose-6-fosfato em tagatose mediante a reação da tagatose-6-fosfato com: (i) uma tagatose-6-fosfato fosfatase que consiste em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (ii) um micro-organismo que expressa a referida tagatose- 6-fosfato fosfatase, ou (iii) uma cultura do micro-organismo que expressa a referida tagatose-6-fosfato fosfatase.
4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente converter frutose-6- fosfato em tagatose-6-fosfato mediante a reação da frutose-6- fosfato com: (i) frutose-6-fosfato-4-epimerase, (ii) um micro-organismo que expressa a referida frutose-6-fosfato-4-epimerase, ou (iii) uma cultura do micro-organismo que expressa a referida frutose-6-fosfato-4-epimerase, antes de converter a tagatose-6- fosfato em tagatose.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente converter glicose-6- fosfato em frutose-6-fosfato mediante a reação da glicose-6- fosfato com: (i) glicose-6-fosfato isomerase, (ii) um micro-organismo que expressa a referida glucose-6-fosfato isomerase ou (iii) uma cultura do micro-organismo que expressa a referida glucose-6-fosfato isomerase, antes de converter a frutose-6- fosfato em tagatose-6-fosfato.
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente converter glicose-1- fosfato em glicose-6-fosfato mediante a reação da glicose-1- fosfato com: (i) fosfoglicomutase, (ii) um micro-organismo que expressa a referida fosfoglicomutase, ou (iii) uma cultura do micro-organismo que expressa a referida fosfoglicomutase, antes de converter a glicose-6-fosfato em frutose-6-fosfato.
7. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente converter glicose em glicose-6-fosfato mediante a reação da glicose com: (i) glicoquinase, (ii) um micro-organismo que expressa a referida glicoquinase, ou (iii) uma cultura do micro-organismo que expressa a referida glicoquinase, e fosfato, antes de converter a glicose-6-fosfato em frutose-6-fosfato.
8. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente converter amido, maltodextrina, sacarose ou uma combinação dos mesmos em glicose- 1-fosfato mediante a reação do amido, maltodextrina, sacarose ou combinação dos mesmos com: (i) fosfato e α-glucanofosforilase, amido fosforilase, maltodextrina fosforilase ou sacarose fosforilase; (ii) um micro-organismo que expressa as mesmas; ou (iii) uma cultura do micro-organismo que expressa as mesmas, antes de converter a glicose-1-fosfato em glicose-6-fosfato.
9. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente converter amido, maltodextrina, sacarose ou uma combinação dos mesmos em glicose mediante a reação do amido, maltodextrina, sacarose ou combinação dos mesmos com: (i) α-amilase, pululanase, glicoamilase, sacarase ou isoamilase; (ii) um micro-organismo que expressa as mesmas; ou (iii) uma cultura do micro-organismo que expressa as mesmas, antes de converter a glicose em glicose- 6-fosfato.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 9, caracterizado pelo fato de que a reação é realizada em um pH de 5,0 a 8,0, uma temperatura de 60 °C a 90 °C, e durante 1 minuto a 24 horas.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 10, caracterizado pelo fato de que a reação é realizada na presença de um íon ou sal de um metal selecionado do grupo que consiste em Mg, Mn e Zn.
12. Método para produzir tagatose caracterizado pelo fato de que compreende reagir amido, maltodextrina ou uma combinação dos mesmos e fosfato com (a) a tagatose-6-fosfato fosfatase que consiste em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; frutose-6-fosfato-4-epimerase; glicose-6-fosfato isomerase; fosfoglicomutase ou glicoquinase; e α-glucanofosforilase, amido fosforilase, maltodextrina fosforilase, α-amilase, pululanase, isoamilase ou glicoamilase; ou (b) um micro-organismo que expressa todas as enzimas de (a), um micro-organismo que expressa cada uma das enzimas de (a), ou uma cultura do referido microorganismo.
13. Método para produzir tagatose caracterizado pelo fato de que compreende reagir sacarose e fosfato com (a) a tagatose- 6-fosfato fosfatase que consiste em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; frutose-6-fosfato-4-epimerase; glicose-6- fosfato isomerase; fosfoglucomutase ou glucoquinase; e sacarose fosforilase ou sacarase; ou (b) um micro-organismo que expressa todas as enzimas de (a), um micro-organismo que expressa cada uma das enzimas de (a), ou uma cultura do referido micro-organismo.
BR112018077358-1A 2016-06-30 2017-06-30 Composição e métodos para produzir tagatose BR112018077358B1 (pt)

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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112018006587A2 (pt) 2015-10-02 2018-10-23 Bonumose Llc produção enzimática de d-tagatose
KR101836889B1 (ko) * 2016-01-15 2018-03-09 씨제이제일제당(주) 신규 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소 및 이를 이용한 포도당-6-인산 제조방법
KR20180111667A (ko) * 2017-03-31 2018-10-11 씨제이제일제당 (주) 타가토스 생산용 조성물 및 이를 이용한 타가토스 제조방법
KR102194285B1 (ko) * 2018-10-19 2020-12-23 씨제이제일제당 주식회사 신규 과당-4-에피머화 효소 및 이를 이용한 타가토스의 제조 방법
KR102513451B1 (ko) * 2019-10-31 2023-03-23 주식회사 삼양사 프럭토오스 6-포스페이트 4-에피머화 효소 및 이의 용도
CN112342178B (zh) 2020-11-05 2022-02-25 中国科学院天津工业生物技术研究所 重组微生物、其制备方法及在生产塔格糖中的应用
CN112342179B (zh) 2021-01-05 2021-04-06 中国科学院天津工业生物技术研究所 产塔格糖的枯草芽孢杆菌基因工程菌及制备塔格糖的方法
CN112708616B (zh) * 2021-03-29 2021-08-20 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种固定化多酶体系生产塔格糖的方法
CN112760317B (zh) 2021-04-07 2021-08-24 中国科学院天津工业生物技术研究所 仿生硅矿化微囊固定化多酶生产塔格糖的方法
CN112760316B (zh) 2021-04-07 2021-08-24 中国科学院天津工业生物技术研究所 人工油体固定化多酶生产塔格糖的方法

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6709653B1 (en) 1994-09-16 2004-03-23 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies specific for human inositol monophosphatase H1
US20030235894A1 (en) * 1999-05-06 2003-12-25 Tongyang Confectioner Co. Biological tagatose production by recombinant Escherichia coli
JP2004535205A (ja) * 2001-07-16 2004-11-25 アルラ・フーズ・エイ・エム・ビィ・エイ タガトースの製造方法
CN101095479A (zh) * 2007-06-20 2008-01-02 江南大学 一种塔格糖的制备方法
KR100964091B1 (ko) * 2008-01-28 2010-06-16 씨제이제일제당 (주) 대두 올리고당을 이용한 타가토스의 제조 방법
KR101550796B1 (ko) * 2013-06-05 2015-09-07 씨제이제일제당 (주) 타가토스의 제조방법
US9914919B2 (en) * 2013-07-29 2018-03-13 Samyang Corporation Aldolase, aldolase mutant, and method and composition for producing tagatose by using same
KR101480422B1 (ko) 2013-07-29 2015-01-13 건국대학교 산학협력단 효소조합 반응에 의한 과당으로부터 타가토스 생산 방법 및 그 조성물
KR101627921B1 (ko) 2014-07-23 2016-06-13 건국대학교 산학협력단 알돌레이즈 돌연변이체 및 이를 이용한 타가토스 생산 방법
KR101620904B1 (ko) 2013-10-11 2016-05-23 (주)케비젠 기질 및 효소 컴비네이션 반응을 이용한 프럭토스로부터 타가토스 생산용 조성물 및 이의 용도
BR112018006587A2 (pt) * 2015-10-02 2018-10-23 Bonumose Llc produção enzimática de d-tagatose

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