KR101981390B1 - 타가토스-6-인산 특이적인 신규 내열성 탈인산화 효소 및 이를 이용한 타가토스 제조방법 - Google Patents

타가토스-6-인산 특이적인 신규 내열성 탈인산화 효소 및 이를 이용한 타가토스 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 출원은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 타가토스-6-탈인산화 효소, 상기 타가토스-6-탈인산화 효소를 암호화하는 핵산 및 상기 핵산을 포함하는 형질전환체에 관한 것이다. 또한, 본 출원은 본 출원의 타가토스-6-인산 탈인산화 효소를 포함하는 타가토스 생산용 조성물 및 본 출원의 타가토스-6-인산 탈인산화 효소를 이용한 타가토스 제조방법에 관한 것이다.

Description

타가토스-6-인산 특이적인 신규 내열성 탈인산화 효소 및 이를 이용한 타가토스 제조방법{A novel tagatose-6-phosphate specific thermostable phosphatase and a method for producing a tagatose using the same}
본 출원은 타가토스-6-인산 탈인산화 효소 및 이를 이용한 타가토스 제조방법에 관한 것이다.
종래, 단일 효소 전환반응을 이용한 타가토스 생산 방법으로 아라비노스-이성화효소(L-arabinose isomerase)를 이용하여 갈락토스(D-galactose)로부터 타가토스(D-tagatose)를 제조하는 방법 및 L-리불로스-5-인산-4-에피머화효소(L-ribulose-5-phosphate-4-epimerase)를 이용하여 과당(D-fructose)으로부터 타가토스를 제조하는 방법이 보고된 바 있으나, 이러한 단일 효소 전환반응은 기질과 산물 간에 일정 수준의 반응평형(reaction equilibrium)이 존재한다(산물/기질 = 약 20% 내지 50%). 따라서, 상기 단일 효소 전환반응을 이용하여 고순도의 타가토스를 제조하는 경우, 반응 결과물로부터 고농도의 기질을 분리하여 제거해야 하는 추가 정제공정이 요구된다.
한편, 복합 효소 전환반응을 이용한 타가토스 생산방법으로 헥소카이네이즈(Hexokinase, EC 2.7.1.1)를 이용하여 과당과 ATP(Adenosine triphosphate)로부터 과당-6-인산(D-fructose-6-phosphate)을 생산하는 단계, 과당-6-인산-4-에피머화 효소 활성을 갖는 과당-1,6-이인산-알돌레이즈(D-fructose-1,6-bisphosphate-adolase, EC 4.1.2.13)를 이용하여 상기 과당-6-인산을 타가토스-6-인산(D-tagatose-6-phosphate)으로 전환하는 단계 및 탈인산화 효소(phosphatase)로서 파이테이즈(phytase)를 이용하여 타가토스-6-인산로부터 타가토스를 생산하는 단계를 포함하는 제조방법이 보고된 바 있다(대한민국 등록특허 제10-1627921호 및 제10-1620904호). 그러나 상기의 복합 효소 반응은 인산기의 공여 화합물로 고가의 ATP를 요구하고, 아데닌 뉴클레오타이드(adenine nucleotides)인 AMP, ADP 및 ATP가 물리화학적(열 및 pH 등) 안정성이 높지 않아 공정적용의 한계가 있으며, 파이테이즈는 기질이 다양하여 비가역적반응을 유도하는바 타가토스의 제조 수율을 높이는데 한계가 있다.
이에, 본 발명자들은 경제적 원료를 이용하면서 타가토스를 높은 수율로 생산할 수 있는 방법을 개발하기 위해 예의 노력하였다. 그 결과, 경제적 원료인 수크로스, 전분 또는 말토덱스트린으로부터 포도당(glucose) 또는 포도당-1-인산(glucose-1-phosphate), 포도당-6-인산(glucose-6-phosphate) 및 과당-6-인산으로의 전환을 거쳐 타가토스-6-인산(tagatose-6-phosphate)을 생산하는 경우, 본 출원의 타가토스-6-인산 탈인산화 효소가 비가역 반응 경로로 타가토스-6-인산 탈인산화를 수행하여 타가토스 생산 경로에 관여하는 복수의 효소를 동시에 사용 가능한 동시효소반응(one-pot enzymatic conversions)으로 타가토스를 생산할 수 있고, 타가토스로의 전환율을 현저히 높일 수 있음을 확인함으로써 본 출원을 완성하였다.
본 출원의 하나의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 타가토스-6-인산 탈인산화 효소(tagatose-6-phosphate phosphatase)를 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적은 본 출원의 타가토스-6-인산 탈인산화 효소를 암호화하는 핵산을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 본 출원의 타가토스-6-인산 탈인산화 효소를 암호화하는 핵산을 포함하는 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 본 출원의 타가토스-6-인산 탈인산화 효소, 상기 타가토스-6-인산 탈인산화 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 타가토스-6-인산 탈인산화 효소를 발현하는 미생물의 배양물을 포함하는 타가토스 생산용 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 본 출원의 타가토스-6-인산 탈인산화 효소를 이용한 타가토스 제조방법을 제공하는 것이다.
이하, 본 출원 내용에 대하여 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시한 일 양태의 설명 및 실시형태는 공통된 사항에 대하여 다른 양태의 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 또한, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 더불어, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 출원의 목적을 달성하기 위하여, 본 출원은 하나의 양태로서, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 타가토스-6-인산 탈인산화 효소(tagatose-6-phosphate phosphatase)를 제공한다.
본 출원의 타가토스-6-인산 탈인산화 효소는 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 상동성을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 상동성을 가지며 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가지더라도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
또한, 본 출원의 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 타가토스-6-인산 탈인산화 효소와 상응하는 활성을 가지는 단백질이라면 서열번호 1의 아미노산 서열 앞뒤의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이(silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또한 본 출원의 범위 내에 속한다.
나아가, 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 타가토스-6-인산 탈인산화 효소는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것일 수 있고, 또한 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것일 수 있다. 코돈 축퇴성(codon degeneracy)에 의해 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 또는 이와 상동성을 가지는 단백질로 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드 역시 본 출원의 범위에 포함될 수 있음은 자명하다.
상기에서 용어 "상동성"은 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 동일하거나 유사한 활성을 가지는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 예를 들면, 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 구체적으로 BLAST 2.0을 이용하거나, 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다. 상기에서 용어 “엄격한 조건”이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 예를 들어, 이러한 조건은 문헌(예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다.
본 출원에서 상기 엄격한 조건은 상동성을 확인하기 위해 조절될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 간의 상동성을 확인하기 위하여, 55℃의 Tm 값에 대응하는, 낮은 엄격도의 혼성화 조건이 이용될 수 있는데, 예를 들어, 5XSSC, 0.1% SDS, 0.25% 밀크, 및 무 포름아미드; 또는 30% 포름아미드, 5XSSC, 0.5% SDS 조건이 이용될 수 있다. 온화한 엄격도의 혼성화 조건은 높은 Tm 값에 대응하며, 예를 들어, 5X 또는 6XSSC를 갖는 40% 포름아미드가 사용될 수 있다. 높은 엄격도의 혼성화 조건은 가장 높은 Tm 값에 대응하며, 예를 들어, 50% 포름아미드, 5X 또는 6XSSC 조건이 이용될 수 있다. 다만, 상기 예에 제한되는 것은 아니다.
혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치 (mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원은 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60℃, 63℃ 또는 65℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다. 두 뉴클레오티드 서열 사이의 유사성 또는 상동성 정도가 더 클수록, 그러한 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드의 하이브리드에 대한 Tm 값은 더 커질 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 혼성화의 상대적 안정성(더 높은 Tm 값에 대응하는)은 하기 순서로 감소한다: RNA : RNA, DNA : RNA, DNA : DNA. 길이가 100 뉴클레오티드 보다 큰 하이브리드에 대하여, Tm 값 계산 수식은 공지되어 있다(Sambrook et al., supra, 9.50-9.51 참조). 더 짧은 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드와의 혼성화에 대하여, 미스매치 위치는 보다 더 중요할 수 있고, 올리고뉴클레오티드의 길이가 그 특이성을 결정할 수 있다(Sambrook et al., supra, 11.7-11.8 참조).
구체적으로, 폴리뉴클레오티드는 500 mM 염보다 낮고 적어도 37℃의 혼성화 단계, 및 적어도 63℃의 2XSSPE에서의 세척 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하여 탐지될 수 있다. 상기 혼성화 조건은 200 mM 염보다 낮고 적어도 37 ℃의 혼성화 단계를 포함할 수 있다. 또는 상기 혼성화 조건은 혼성화 및 세척 단계 모두에서 63℃ 및 2XSSPE를 포함할 수 있다.
혼성화 핵산의 길이는 예를 들면, 적어도 약 10 뉴클레오티드, 15 뉴클레오티드, 20 뉴클레오티드, 또는 적어도 30 뉴클레오티드일 수 있다. 또한, 당업자는 온도 및 세척 용액 염 농도를 프로브의 길이와 같은 요소에 따라 필요할 경우 조절할 수 있다.
본 출원의 타가토스-6-인산 탈인산화 효소는 써모토가(Thermotoga) 속 유래의 효소일 수 있으며, 구체적으로 써모토가 네아폴리타나(Thermotoga neapolitana) 유래의 효소일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원은 다른 하나의 양태로서, 본 출원의 타가토스-6-인산 탈인산화 효소를 암호화하는 핵산을 제공한다.
본 출원은 또 다른 하나의 양태로서, 본 출원의 타가토스-6-인산 탈인산화 효소를 암호화하는 핵산을 포함하는 형질전환체를 제공한다.
본 출원에서 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 암호화하는 핵산 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 핵산이 암호화하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 핵산은 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 핵산은 표적 단백질을 암호화하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 핵산은 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 핵산은 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 핵산에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 핵산은 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 단백질을 암호화하는 핵산의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
본 출원의 벡터를 형질전환 시키는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌 글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 숙주 세포로는 DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 숙주를 사용하는 것이 좋은데, 예를 들어 대장균일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원은 또 다른 하나의 양태로서, 본 출원의 타가토스-6-인산 탈인산화 효소, 상기 타가토스-6-인산 탈인산화 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 타가토스-6-인산 탈인산화 효소를 발현하는 미생물의 배양물을 포함하는 타가토스 생산용 조성물을 제공한다.
상기 타가토스 생산용 조성물은, 본 출원의 타가토스 제조 경로(도 1 참고)에 관여하는 효소; 상기 타가토스 제조 경로에 관여하는 효소를 발현하는 미생물; 또는 상기 타가토스 제조 경로에 관여하는 효소를 발현하는 미생물의 배양물을 추가적으로 포함할 수 있다. 다만, 이는 예시적인 것으로 본 출원의 타가토스-6-인산 탈인산화 효소를 이용하여 타가토스를 생산할 수 있다면, 본 출원의 타가토스 생산용 조성물에 포함되는 효소 및 타가토스 생산에 이용되는 기질이 제한되지 않는다.
본 출원의 타가토스 생산용 조성물은, (a) (i) 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합, 포도당, 포도당-1-인산, 포도당-6-인산, 과당-6-인산 또는 타가토스-6-인산; (ii) 포스페이트(phosphate); (iii) 과당-6-인산-4-에피머화 효소; (iv) 포도당-6-인산-이성화효소; (v) 포스포글루코무타아제 또는 포도당 인산화 효소; 및/또는 (vi) α-글루칸포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제 또는 수크로오스 포스포릴라아제, 또는 α-아밀라아제, 풀루란아제, 이소아밀라아제, 글루코아밀라아제 또는 수크라아제; 또는 (b) 상기 항목 (a)의 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 추가적으로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 전분/말토덱스트린 포스포릴라아제(starch/maltodextrin phosphorylase, EC 2.4.1.1) 및 α-글루칸 포스포릴라아제는 포스페이트(phosphate)를 포도당에 인산화 전이시켜 전분 또는 말토덱스트린으로부터 포도당-1-인산을 생산하는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 본 출원의 수크로스 포스포릴라아제(sucrose phosphorylase, EC 2.4.1.7)는 포스페이트를 포도당에 인산화 전이시켜 수크로스로부터 포도당-1-인산을 생산하는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 본 출원의 전분 액당화 효소인 α-아밀라아제(α-amylase, EC 3.2.1.1), 풀루란아제(pullulanse, EC 3.2.1.41), 글루코아밀라아제(glucoamylase, EC 3.2.1.3) 및 이소아밀라아제(isoamylase)는 전분 또는 말토덱스트린을 포도당으로 전환시키는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 본 출원의 수크라제(sucrase, EC 3.2.1.26)는 수크로스를 포도당으로 전환시키는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 본 출원의 포스포글루코무타아제(phosphoglucomutase, EC 5.4.2.2)는 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 전환시키는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 포도당인산화효소(glucokinase)는 포도당에 인산을 전이시켜 포도당-6-인산으로 전환하는 활성을 가지는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 포도당인산화효소는 폴리포스페이트 의존형 포도당인산화 효소일 수 있으며, 보다 구체적으로 아미노산 서열번호 5 및 염기 서열번호 7의 Deinococcus geothermalis 유래 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소 또는 아미노산 서열번호 6 및 염기 서열번호 8의 Anaerolinea thermophila 유래 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소일 수 있다. 본 출원의 포도당-6-인산-이성화효소는 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 전환시키는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 본 출원의 과당-6-인산-4-에피머화 효소는 과당-6-인산을 타가토스-6-인산으로 전환시키는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다.
본 출원의 타가토스 생산용 조성물은 Mg, Mn 및 Zn로 이루어진 군으로부터 선택되는 금속의 이온 또는 염을 추가적으로 포함할 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 금속의 염은 MgCl2, MgSO4, MnCl2, MnSO4, ZnCl2, ZnSO4로 이루어진 군으로부터 선택되는 금속의 염일 수 있다.
본 출원은 또 다른 하나의 양태로서, 타가토스-6-인산에 본 출원의 타가토스-6-인산 탈인산화 효소, 상기 타가토스-6-인산 탈인산화 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 타가토스-6-인산 탈인산화 효소를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜 타가토스-6-인산을 타가토스로 전환하는 단계를 포함하는 타가토스 제조방법을 제공한다.
본 출원의 제조방법은 타가토스-6-인산을 타가토스로 전환하는 단계 이전, 과당-6-인산(fructose-6-phosphate)에 과당-6-인산-4-에피머화 효소, 상기 과당-6-인산-4-에피머화 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 과당-6-인산-4-에피머화 효소를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 과당-6-인산을 타가토스-6-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 상기 제조방법은 본 출원의 과당-6-인산을 타가토스-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 포도당-6-인산(Glucose-6-phosphate)에 포도당-6-인산-이성화효소, 상기 포도당-6-인산-이성화효소를 발현하는 미생물 또는 상기 포도당-6-인산-이성화효소를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 상기 제조방법은 본 출원의 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 포도당-1-인산(Glucose-1-phosphate)에 포스포글루코무타아제, 상기 포스포글루코무타아제를 발현하는 미생물 또는 상기 포스포글루코무타아제를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 상기 제조방법은 본 출원의 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 포도당(Glucose)에 포도당 인산화 효소, 상기 포도당 인산화 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 포도당 인산화 효소를 발현하는 미생물의 배양물, 및 포스페이트를 접촉시켜, 상기 포도당을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 상기 제조방법은 본 출원의 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합에 α-글루카노포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제 또는 수크로오스 포스포릴라아제; 상기 α-글루카노포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제 또는 수크로오스 포스포릴라아제를 발현하는 미생물; 또는 상기 α-글루카노포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제 또는 수크로오스 포스포릴라아제를 발현하는 미생물의 배양물, 및 포스페이트를 접촉시켜, 상기 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합을 포도당-1-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 상기 제조방법은 본 출원의 포도당을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합에 α-아밀라아제, 풀루란아제, 글루코아밀라아제, 수크라아제 또는 이소아밀라아제; 상기 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합에 α-아밀라아제, 풀루란아제, 글루코아밀라아제, 수크라아제 또는 이소아밀라아제를 발현하는 미생물; 또는 상기 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합에 α-아밀라아제, 풀루란아제, 글루코아밀라아제, 수크라아제 또는 이소아밀라아제를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합을 포도당으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 제조방법은 포도당에 4-α-글루카노트랜스퍼라아제, 상기 4-α-글루카노트랜스퍼라아제를 발현하는 미생물 또는 상기 4-α-글루카노트랜스퍼라아제를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당을 전분, 말토덱스트린 또는 수크로스로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 제조방법에 있어서, 상기 '접촉'은 pH 5.0 내지 8.0, 60℃ 내지 90℃ 온도, 및/또는 1분 내지 24시간 동안 실시할 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 접촉은 pH 6.0 내지 8.0, pH 6.5 내지 8.0 또는 pH 6.5 내지 7.5에서 실시할 수 있다. 또한, 본 출원의 접촉은 60℃ 내지 90℃, 70℃ 내지 90℃ 또는 75℃ 내지 85℃에서 실시할 수 있다. 더불어, 본 출원의 접촉은 1분 내지 12시간, 1분 내지 6시간, 1분 내지 3시간, 1분 내지 1시간, 5분 내지 24시간, 5분 내지 12시간, 5분 내지 6시간, 5분 내지 3시간, 5분 내지 1시간, 10분 내지 24시간, 10분 내지 12시간, 10분 내지 6시간, 10분 내지 3시간, 또는 10분 내지 1시간 동안 실시할 수 있다.
또한, 본 출원의 접촉은 Mg, Mn 및 Zn로 이루어진 군으로부터 선택되는 금속의 이온 또는 염의 존재 하에서 실시할 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 금속의 염은 MgCl2, MgSO4, MnCl2, MnSO4, ZnCl2, ZnSO4로 이루어진 군으로부터 선택되는 금속의 염일 수 있다.
본 출원은 또 다른 하나의 양태로서, 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합, 및 포스페이트에 (a) 타가토스-6-인산 탈인산화 효소; 과당-6-인산-4-에피머화효소; 포도당-6-인산-이성화효소; 포스포글루코무타아제 또는 포도당 인산화 효소; 및 α-글루칸 포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제, 수크로오스 포스포릴라아제, α-아밀라아제, 풀루란아제, 이소아밀라아제, 글루코아밀라아제 또는 수크라아제; 또는 (b) 상기 항목 (a)의 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시키는 단계를 포함하는, 타가토스 제조방법을 제공한다.
이때, 상기 제조방법은 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합에서 하나 이상을 기질로 사용할 경우, 이때 효소는 도 1을 참고하여 해당 기질과 반응할 수 있는 효소 및 해당 기질이 반응하여 생성된 생성물과 반응할 수 있는 효소를 포함하도록 선택하여 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다.
본 출원의 타가토스-6-인산 탈인산화 효소는 내열성이 있어 산업적으로 타가토스 생산이 가능하고, 비가역 반응 경로를 수행하여 고농도의 타가토스 생산이 가능하고 경제적 원료인 수크로스, 전분 또는 말토덱스트린을 원료로 사용하여 동시효소반응으로 타가토스를 생산할 수 있다. 따라서, 고순도의 타가토스를 제조하기 위한 공정을 단순화할 수 있어 제조공정이 간단하면서도 경제적인 이점이 있다.
도 1은 전분(예컨대, 말토덱스트린), 수크로스 또는 포도당으로부터 타가토스를 제조할 수 있는 반응 경로 및 이에 관여하는 효소들을 모식적으로 나타낸 것이다.
도 2는 본 출원의 타가토스-6-인산 탈인산화 효소(E: T6PP)의 분자량을 단백질 전기영동(SDS-PAGE)으로 분석한 결과를 나타낸다. M은 단백질 크기 측정 마커(size marker), CE는 형질전환체 파쇄 상등액을 나타낸다.
도 3은 본 출원의 타가토스-6-인산 탈인산화 효소의 타가토스-6-인산에서 타가토스로의 전환 활성을 확인한 것이다.
도 4는 본 출원의 타가토스-6-인산 탈인산화 효소의 완충용액 및 pH 범위에 따른 활성을 확인한 것이다.
도 5는 본 출원의 타가토스-6-인산 탈인산화 효소의 온도에 따른 활성을 확인한 것이다.
도 6은 본 출원의 타가토스-6-인산 탈인산화 효소의 금속 이온 첨가에 따른 활성을 확인한 것이다.
도 7은 본 출원의 타가토스-6-인산 탈인산화 효소의 타가토스-6-인산에 대한 기질 특이성을 확인한 것이다.
이하 본 출원을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 출원의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.
실시예 1: 타가토스-6-인산 탈인산화 효소의 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 및 형질전환 미생물의 제조
신규 내열성의 타가토스-6-인산 탈인산화 효소(D-tagatose-6-phosphate phosphatase)를 발굴하기 위해 호열성 미생물인 써모토가 네아폴리타나(Thermotoga neapolitana)에서 유전자를 분리하였고, 재조합 발현벡터 및 형질전환 미생물을 제조하였다.
구체적으로, Genbank에 등록된 써모토가 네아폴리타나 유전자 서열들을 대상으로 타가토스-6-인산 탈인산화 효소로 예상되는 유전자 t6pp를 선발하고, 이의 아미노산 서열(서열번호 1) 및 염기서열(서열번호 2) 정보를 바탕으로 정방향 프라이머(forward primer, 서열번호 3) 및 역방향 프라이머(reverse primer, 서열번호 4)를 고안하여 합성하였다. 상기 합성된 프라이머를 이용하여 써모토가 네아폴리타나 염색체 DNA(genomic DNA)를 주형으로 중합효소 연쇄반응(PCR)을 95℃에서 30초 동안 변성, 55℃에서 30초 동안 어닐링　및 68℃에서 2분 동안 중합하였고　상기 반응들은　25회 반복한 조건을　사용하였으며, 제한효소 NdeI 및 XhoI을 사용하여 대장균 발현용 플라스미드 벡터 pET21a(Novagen사)에 삽입하여 재조합 발현벡터를 제작하고 pET21a-CJ_tn_t6pp라 명명하였다. 통상적인 형질전환 방법(참조: Sambrook et al. 1989)으로 대장균 BL21(DE3) 균주에 상기 pET21a-CJ_tn_t6pp를 형질 전환하여 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 제조하고 E. coli BL21(DE3)/CJ_tn_t6pp라 명명하였다.
상기 E. coli BL21(DE3)/CJ_tn_t6pp 균주를 부다페스트 조약 하에 2016년 6월 23일자로 한국미생물 보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 기탁하여 기탁번호 KCCM11850P를 부여 받았다.
실시예 2: 재조합 효소의 제조
재조합 타가토스 탈인산 효소(이하, T6PP)를 제조하기 위해, E. coli BL21 (DE3)/CJ_tn_t6pp를 LB 액체배지 5 ml를 포함하는 배양 튜브에 접종하고, 600 nm에서 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃의 진탕 배양기에서 종균 배양을 하였다. 이후, 종균 배양된 배양액을 LB 액체배지를 포함하는 배양 플라스크에 접종하여 본 배양을 진행하고, 600 nm에서의 흡광도가 2.0이 될 때 1 mM IPTG를 첨가하여 T6PP의 발현생산을 유도하였다. 상기 종균 배양 및 본 배양은 교반 속도 200 rpm, 온도 37℃에서 실시하였다. 배양 완료 후, 배양액을 8,000×g로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 균체를 회수하였다. 50 mM Tris-HCl(pH 7.0) 완충용액으로 상기 회수된 균체를 2회 세척하고, 동일 완충용액으로 현탁 후 초음파 세포파쇄기를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 세포 파쇄물은 13,000×g로 4℃에서 20분 동안 원심분리 후 상등액만을 취하고, His-tag 친화 크로마토그래피를 사용하여 상기 상등액으로부터 T6PP를 정제하였다.
SDS-PAGE 분석을 통하여 분자량을 확인하였으며, 그 결과 상기 정제된 T6PP의 분자량은 약 29 kDa 인 것을 확인하였다(도 2a, E로 표시).
실시예 3: T6PP의 타가토스 전환 활성 확인
T6PP의 타가토스-6-인산에서 타가토스로의 전환 활성 분석을 위하여, 50 mM Tris-HCl(pH 7.5) 완충용액에 50 mM 타가토스-6-인산을 현탁하고, 이에 0.1 unit/ml의 정제된 T6PP와 10 mM MgCl2를 첨가하여 70℃에서 10분 동안 반응시킨 후 HPLC를 이용하여 반응 결과물을 분석하였다. HPLC 분석은 HPX-87H(Bio-Rad사) 컬럼을 사용하여 60℃에서 5 mM 황산을 이동상으로 0.6 ml/min 유속으로 흘려 주면서 수행하였으며, Refractive Index Detector로 타가토스와 타가토스-6-인산을 검출하였다.
그 결과, T6PP의 반응 결과물에서 타가토스가 생성됨을 확인할 수 있었다(도 3).
실시예 4: pH, 온도 및 금속이온 첨가에 따른 T6PP의 활성 확인
4-1. pH에 따른 활성 확인
T6PP에 대한 pH 영향성을 조사하기 위하여, 다양한 pH의 50 mM 완충용액(pH 4.0-7.0, 시트르산 나트륨; pH 4.0-7.0, 아세트산 나트륨; pH 6.0-8.0, 인산 칼륨: pH 7.0-9.0, Tris-HCl)에 현탁된 50 mM 타가토스-6-인산에 0.1 unit/ml의 정제된 T6PP를 첨가하여 70℃에서 10분 동안 반응시켰다. 이후, 실시예 3과 동일한 분석 조건으로 HPLC를 이용하여 타가토스를 정량 분석하였다.
그 결과, T6PP는 Tris-HCl 완충용액(특히, pH 7.0)에서 최대 활성을 보였고, pH 5.0-8.0에 걸친 매우 광범위한 범위에서 최대 활성 대비 80% 이상의 활성을 나타내었다(도 4).
4-2. 온도에 따른 활성 확인
온도에 따른 T6PP의 활성 분석을 위하여, 50 mM Tris-HCl(pH 7.0) 완충용액에 현탁된 50 mM 타가토스-6-인산에 0.1 unit/ml의 정제된 T6PP를 첨가하여 40℃, 50℃, 60℃, 70℃, 80℃ 및 90 ℃에서 10분 동안 반응시켰다. 이후, 실시예 3과 동일한 분석 조건으로 HPLC를 이용하여 타가토스를 정량 분석하였다.
그 결과, T6PP는 70 ℃ 내지 90 ℃에서 높은 활성을 나타냈고, 특히 80 ℃에서 최대 활성을 나타내었다 (도 5).
4-3. 금속 이온 첨가에 따른 활성 확인
금속 이온 첨가가 T6PP의 활성에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 50 mM Tris-HCl(pH 7.0) 완충용액에 현탁된 50 mM 타가토스-6-인산에 각각의 금속이온(NiSO4, CuSO4, MnSO4, CaCl2, ZnSO4, MgCl2, CoSO4 및 APO)을 최종농도 0.5 mM로 첨가하였다. 이에, 금속 이온 제거를 위하여 10 mM EDTA를 처리하여 투석한 T6PP를 0.1 unit/ml 첨가하고, 70 ℃에서 10분 동안 반응시켰다. 이후, 실시예 3과 동일한 분석 조건으로 HPLC를 이용하여 타가토스를 정량 분석하였다.
그 결과, T6PP는 Mg 이온 첨가 시 활성이 가장 증가하고, Mn 및 Zn 이온 첨가 시에도 활성이 증가함을 확인하였다(도 6).
실시예 5: T6PP의 기질 특이성 분석
T6PP이 타가토스-6-인산에 대하여 기질 특이성을 갖는지 확인하기 위하여 다양한 인산화당에 대한 T6PP의 활성을 분석하였다. 기질로는 50 mM의 포도당-1-인산, 포도당-6-인산, 과당-6-인산, 타가토스-6-인산 및 타가토스-6-인산을 각각 사용하였고, 50 mM Tris-HCl(pH 7.0) 완충용액 및 1 unit/ml의 정제된 T6PP를 첨가하여 70 ℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 실시예 3과 동일한 분석 조건으로 HPLC를 이용하여 각 당 및 인산당을 정량 분석하였다.
그 결과, T6PP은 타가토스-6-인산에 대해서만 탈인산 활성이 있음을 확인 할 수 있었다(도 7).
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
한국미생물보존센터 KCCM11850P 20160623
<110> CJ CheilJedang Corporation <120> A novel tagatose-6-phosphate specific thermostable phosphatase and a method for producing a tagatose using the same <130> KPA160804-KR-P1 <150> KR 10-2016-0082547 <151> 2016-06-30 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 263 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tagatose-6-phosphate phosphatase <400> 1 Met Glu Gly Gly Ile Glu Leu Asp Arg Leu Asp Phe Ser Ile Lys Leu 1 5 10 15 Leu Arg Arg Val Gly His Phe Leu Met Leu His Trp Gly Lys Val Asp 20 25 30 Ser Val Glu Lys Lys Thr Gly Phe Lys Asp Ile Val Thr Glu Ile Asp 35 40 45 Lys Lys Ala Gln Glu Met Ile Val Glu Glu Ile Arg Lys Val Phe Pro 50 55 60 Asp Glu Asn Ile Ile Ala Glu Glu Gly Ile Ser Glu Asn Gly Lys Lys 65 70 75 80 Leu Trp Ile Ile Asp Pro Ile Asp Gly Thr Ile Asn Phe Val His Gly 85 90 95 Leu Pro Asn Phe Ser Ile Ser Ile Ala Tyr Val Glu Asn Gly Glu Val 100 105 110 Lys Met Gly Val Val His Ala Pro Ala Leu Asn Glu Thr Leu Tyr Ala 115 120 125 Glu Glu Asn Gly Gly Ala Phe Leu Asn Gly Glu Arg Ile Arg Val Ser 130 135 140 Gly Asn Thr Ser Leu Glu Glu Cys Val Gly Ser Thr Gly Ser Tyr Val 145 150 155 160 Asp Phe Thr Gly Lys Phe Ile Glu Lys Met Glu Lys Lys Thr Arg Arg 165 170 175 Val Arg Ile Leu Gly Ser Ala Ala Leu Asn Ala Cys Tyr Val Gly Ala 180 185 190 Gly Arg Val Asp Phe Phe Val Thr Trp Arg Ile Asn Pro Trp Asp Ile 195 200 205 Ala Ala Gly Leu Ile Val Val Lys Glu Ala Gly Gly Thr Val Thr Asp 210 215 220 Phe Ala Gly Lys Glu Ala Asn Val Phe Ser Lys Asn Phe Val Phe Ser 225 230 235 240 Asn Gly Leu Val His Glu Glu Val Leu Glu Val Val Asn Glu Val Leu 245 250 255 Lys Glu Ile Gly Glu Gly Lys 260 <210> 2 <211> 792 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tagatose-6-phosphate phosphatase <400> 2 atggagggag ggatcgaatt ggacagactg gacttttcga taaaactcct gagaagggtt 60 gggcactttc tcatgcttca ctggggaaag gtggacagtg tggagaaaaa gaccggtttc 120 aaagacatcg tgacggaaat agacaaaaag gcccaggaga tgatagtgga ggagatcaga 180 aaggtttttc cggatgagaa cataatagcg gaggagggaa tctcggagaa cggaaaaaaa 240 ctctggataa tagatcccat agacgggacg ataaacttcg ttcatggact tcccaacttt 300 tccatctcca tcgcttacgt ggagaatgga gaggtgaaga tgggagttgt gcacgctcct 360 gcactcaacg aaacactcta cgccgaagaa aacgggggtg cttttttgaa cggtgaaagg 420 atcagggtgt ctggaaacac aagtcttgaa gagtgcgtgg gatcaacggg aagctatgtg 480 gatttcaccg gaaagtttat cgagaagatg gaaaagaaaa caaggagagt gagaattctg 540 gggagtgcgg cgctgaacgc ctgctacgtg ggagcaggga gggtggattt cttcgtcact 600 tggaggatca atccgtggga catcgcagca ggcctgatag ttgtgaaaga ggcgggagga 660 acggtgacag attttgccgg aaaagaggca aacgttttct cgaagaattt tgtcttctcc 720 aacggactcg ttcacgaaga agttctcgaa gtggtgaacg aggttctgaa agagatagga 780 gaggggaagt ga 792 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 3 ttttcatatg gagggaggga tcgaattg 28 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 4 catactcgag cttcccctct cctatct 27 <210> 5 <211> 270 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polyphosphate-dependent glucokinase <400> 5 Met Leu Ala Ala Ser Asp Ser Ser Gln His Gly Gly Lys Ala Val Thr 1 5 10 15 Leu Ser Pro Met Ser Val Ile Leu Gly Ile Asp Ile Gly Gly Ser Gly 20 25 30 Ile Lys Gly Ala Pro Val Asp Thr Ala Thr Gly Lys Leu Val Ala Glu 35 40 45 Arg His Arg Ile Pro Thr Pro Glu Gly Ala His Pro Asp Ala Val Lys 50 55 60 Asp Val Val Val Glu Leu Val Arg His Phe Gly His Ala Gly Pro Val 65 70 75 80 Gly Ile Thr Phe Pro Gly Ile Val Gln His Gly His Thr Leu Ser Ala 85 90 95 Ala Asn Val Asp Lys Ala Trp Ile Gly Leu Asp Ala Asp Thr Leu Phe 100 105 110 Thr Glu Ala Thr Gly Arg Asp Val Thr Val Ile Asn Asp Ala Asp Ala 115 120 125 Ala Gly Leu Ala Glu Ala Arg Phe Gly Ala Gly Ala Gly Val Pro Gly 130 135 140 Glu Val Leu Leu Leu Thr Phe Gly Thr Gly Ile Gly Ser Ala Leu Ile 145 150 155 160 Tyr Asn Gly Val Leu Val Pro Asn Thr Glu Phe Gly His Leu Tyr Leu 165 170 175 Lys Gly Asp Lys His Ala Glu Thr Trp Ala Ser Asp Arg Ala Arg Glu 180 185 190 Gln Gly Asp Leu Asn Trp Lys Gln Trp Ala Lys Arg Val Ser Arg Tyr 195 200 205 Leu Gln Tyr Leu Glu Gly Leu Phe Ser Pro Asp Leu Phe Ile Ile Gly 210 215 220 Gly Gly Val Ser Lys Lys Ala Asp Lys Trp Gln Pro His Val Ala Thr 225 230 235 240 Thr Arg Thr Arg Leu Val Pro Ala Ala Leu Gln Asn Glu Ala Gly Ile 245 250 255 Val Gly Ala Ala Met Val Ala Ala Gln Arg Ser Gln Gly Asp 260 265 270 <210> 6 <211> 253 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polyphosphate-dependent glucokinase <400> 6 Met Gly Arg Gln Gly Met Glu Ile Leu Gly Ile Asp Ile Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Ile Lys Gly Ala Pro Val Asp Val Glu Thr Gly Gln Leu Thr Ala 20 25 30 Glu Arg Tyr Arg Leu Pro Thr Pro Glu Asn Ala Leu Pro Glu Glu Val 35 40 45 Ala Leu Val Val Ala Gln Ile Val Glu His Phe Gln Trp Lys Gly Arg 50 55 60 Val Gly Ala Gly Phe Pro Ala Ala Ile Lys His Gly Val Ala Gln Thr 65 70 75 80 Ala Ala Asn Ile His Pro Thr Trp Ile Gly Leu His Ala Gly Asn Leu 85 90 95 Phe Ser Glu Lys Cys Gly Cys Pro Val Ser Val Leu Asn Asp Ala Asp 100 105 110 Ala Ala Gly Leu Ala Glu Met Ile Phe Gly Ala Gly Lys Gly Gln Lys 115 120 125 Gly Val Val Leu Met Ile Thr Ile Gly Thr Gly Ile Gly Thr Ala Leu 130 135 140 Phe Thr Asp Gly Ile Leu Val Pro Asn Thr Glu Leu Gly His Ile Glu 145 150 155 160 Ile Arg Gly Lys Asp Ala Glu Gln Arg Ser Ser Glu Ala Ala Arg Gln 165 170 175 Arg Lys Asp Trp Thr Trp Gln Gln Trp Ala Lys Arg Leu Asn Glu His 180 185 190 Leu Glu Arg Leu Glu Ala Leu Phe Trp Pro Asp Leu Phe Ile Leu Gly 195 200 205 Gly Gly Ala Val Lys Asn His Glu Lys Phe Phe Pro Tyr Leu Lys Leu 210 215 220 Arg Thr Pro Phe Val Ala Ala Lys Leu Gly Asn Leu Ala Gly Ile Val 225 230 235 240 Gly Ala Ala Trp Tyr Ala His Thr Gln Glu Thr Gln Ala 245 250 <210> 7 <211> 813 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polyphosphate-dependent glucokinase <400> 7 atgctggcag ccagtgacag cagccagcat ggcgggaagg ctgttacgct atctcccatg 60 agcgtgatcc tcgggattga cataggtggg agcggcatca agggggcccc tgtggacacg 120 gcaaccggga agctggtggc cgagcgccac cgcatcccca cgcccgaggg cgcgcaccca 180 gacgcggtga aggacgtggt ggttgagctg gtgcggcatt ttgggcatgc ggggccagtc 240 ggcatcactt tccctggcat cgtgcagcac ggccataccc tgagcgcagc caatgtggat 300 aaagcctgga ttggcctgga cgccgacacg ctttttactg aggcgaccgg tcgcgacgtg 360 accgtgatca acgacgcaga tgccgcgggg ctagcggagg cgaggttcgg ggccggggca 420 ggtgtgccgg gcgaggtgtt gctgttgacc tttgggacag gcatcggcag cgcgctgatc 480 tataacggcg tgctggtgcc caacaccgag tttgggcatc tgtatctcaa gggcgacaag 540 cacgccgaga catgggcgtc cgaccgggcc cgtgagcagg gcgacctgaa ctggaagcag 600 tgggccaaac gggtcagccg gtacctccag tatctggaag gtctcttcag tcccgatctc 660 tttatcatcg gtgggggcgt gagcaagaag gccgacaagt ggcagccgca cgtcgcaaca 720 acacgtaccc gcctggtgcc cgctgccctc cagaacgagg ccggaatcgt gggggccgcg 780 atggtggcgg cgcagcggtc acagggggac taa 813 <210> 8 <211> 762 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polyphosphate-dependent glucokinase <400> 8 atggggaggc agggcatgga aattttaggg attgatatcg gaggatccgg catcaaaggg 60 gctccggtgg atgtagaaac cggccagtta accgccgagc gataccgctt acccaccccc 120 gaaaatgcct tacctgaaga agtggctctg gtagttgccc aaattgtcga acactttcag 180 tggaaaggtc gtgtaggggc aggatttcct gctgccatca agcacggcgt ggcacagacg 240 gccgcaaaca tccaccctac atggattgga cttcatgctg gcaacctttt cagcgaaaaa 300 tgcggatgtc ctgtctcagt gttgaatgat gcggatgctg ccggactggc ggaaatgatc 360 tttggggcag gaaaaggcca gaaaggggtg gtgctgatga ttaccattgg cactggcatc 420 gggacagccc tgttcaccga tgggatattg gtccctaata ccgagttggg acatattgaa 480 attcggggca aagatgccga acagcgctct tcggaagccg cccgccagcg gaaggattgg 540 acctggcaac aatgggcaaa gcgtctgaat gagcatttgg agcgcctgga agccctgttc 600 tggcccgatt tattcatcct tggtggaggg gcagtaaaaa atcatgaaaa gttcttccct 660 tatctaaaac tgcgtactcc ctttgttgca gcaaaattgg ggaatctggc tgggattgta 720 ggcgcagcgt ggtatgctca cacccaggaa acgcaagcct ga 762

Claims (16)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 타가토스-6-인산 탈인산화 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는 타가토스 생산용 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 타가토스 생산용 조성물은,
    (a) (i) 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합; (ii) 포스페이트(phosphate); (iii) 과당-6-인산-4-에피머화 효소; (iv) 포도당-6-인산-이성화효소; (v) 포스포글루코무타아제 또는 포도당 인산화 효소; 및 (vi) α-글루카노포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제, 수크로오스 포스포릴라아제, α-아밀라아제, 풀루란아제, 이소아밀라아제, 글루코아밀라아제 또는 수크라아제; 또는
    (b) 상기 항목 (a)의 효소들 중 선택된 하나이상의 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 추가적으로 포함하는, 타가토스 생산용 조성물.
  6. 타가토스-6-인산에 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 타가토스-6-인산 탈인산화 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜 타가토스-6-인산을 타가토스로 전환하는 단계를 포함하는 타가토스 제조방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 방법은 타가토스-6-인산을 타가토스로 전환하는 단계 이전, 과당-6-인산(fructose-6-phosphate)에 과당-6-인산-4-에피머화 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 과당-6-인산을 타가토스-6-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함하는, 타가토스 제조방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 방법은 상기 과당-6-인산을 타가토스-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 포도당-6-인산(Glucose-6-phosphate)에 포도당-6-인산-이성화효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함하는, 타가토스 제조방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 방법은 상기 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 포도당-1-인산(Glucose-1-phosphate)에 포스포글루코무타아제, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함하는, 타가토스 제조방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 방법은 상기 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 포도당(Glucose)에 포도당 인산화 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물, 및 포스페이트를 접촉시켜, 상기 포도당을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함하는, 타가토스 제조방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 방법은 상기 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합에 α-글루칸 포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제 또는 수크로오스 포스포릴라아제; 이를 발현하는 미생물; 또는 상기 미생물의 배양물, 및 포스페이트를 접촉시켜, 상기 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합을 포도당-1-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함하는, 타가토스 제조방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 방법은 상기 포도당을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합에 α-아밀라아제, 풀루란아제, 글루코아밀라아제, 수크라아제 또는 이소아밀라아제; 이를 발현하는 미생물; 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합을 포도당으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함하는, 타가토스 제조방법.
  13. 제6항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉은
    pH 5.0 내지 8.0, 60℃ 내지 90℃ 온도 또는 1분 내지 24시간 동안; 또는
    pH 5.0 내지 8.0, 60℃ 내지 90℃ 온도 및 1분 내지 24시간 동안;
    실시하는, 타가토스 제조방법.
  14. 제6항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉은 Mg, Mn 및 Zn로 이루어진 군으로부터 선택되는 금속의 이온 또는 염의 존재 하에서 실시하는, 타가토스의 제조방법.
  15. 전분, 말토덱스트린 또는 이의 조합, 및 포스페이트에
    (a) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 타가토스-6-인산 탈인산화 효소; 과당-6-인산-4-에피머화효소; 포도당-6-인산-이성화효소; 포스포글루코무타아제 또는 포도당 인산화 효소; 및 α-글루칸 포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제, α-아밀라아제, 풀루란아제, 이소아밀라아제 또는 글루코아밀라아제; 또는
    (b) 상기 항목 (a)에서 선택되는 모든 효소들을 발현하는 미생물, (a)의 효소 각각을 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시키는 단계를 포함하는, 타가토스 제조방법.
  16. 수크로스 및 포스페이트에
    (a) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 타가토스-6-인산 탈인산화 효소; 과당-6-인산-4-에피머화효소; 포도당-6-인산-이성화효소; 포스포글루코무타아제 또는 포도당 인산화효소; 및 수크로오스 포스포릴라아제 또는 수크라아제; 또는
    (b) 상기 항목 (a)에서 선택되는 모든 효소들을 발현하는 미생물, (a)의 효소 각각을 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시키는 단계를 포함하는, 타가토스 제조방법.
KR1020170083758A 2016-06-30 2017-06-30 타가토스-6-인산 특이적인 신규 내열성 탈인산화 효소 및 이를 이용한 타가토스 제조방법 KR101981390B1 (ko)

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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PE20181204A1 (es) 2015-10-02 2018-07-23 Bonumose Llc Produccion enzimatica de d-tagatosa
KR101836889B1 (ko) * 2016-01-15 2018-03-09 씨제이제일제당(주) 신규 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소 및 이를 이용한 포도당-6-인산 제조방법
KR102074957B1 (ko) * 2017-03-31 2020-02-10 씨제이제일제당 주식회사 타가토스 생산용 조성물 및 이를 이용한 타가토스 제조방법
KR102194285B1 (ko) * 2018-10-19 2020-12-23 씨제이제일제당 주식회사 신규 과당-4-에피머화 효소 및 이를 이용한 타가토스의 제조 방법
KR102513451B1 (ko) * 2019-10-31 2023-03-23 주식회사 삼양사 프럭토오스 6-포스페이트 4-에피머화 효소 및 이의 용도
CN112342178B (zh) * 2020-11-05 2022-02-25 中国科学院天津工业生物技术研究所 重组微生物、其制备方法及在生产塔格糖中的应用
CN112342179B (zh) 2021-01-05 2021-04-06 中国科学院天津工业生物技术研究所 产塔格糖的枯草芽孢杆菌基因工程菌及制备塔格糖的方法
CN112708616B (zh) * 2021-03-29 2021-08-20 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种固定化多酶体系生产塔格糖的方法
CN112760317B (zh) 2021-04-07 2021-08-24 中国科学院天津工业生物技术研究所 仿生硅矿化微囊固定化多酶生产塔格糖的方法
CN112760316B (zh) 2021-04-07 2021-08-24 中国科学院天津工业生物技术研究所 人工油体固定化多酶生产塔格糖的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003008617A1 (en) 2001-07-16 2003-01-30 Arla Foods Amba Process for manufacturing of tagatose
KR101480422B1 (ko) 2013-07-29 2015-01-13 건국대학교 산학협력단 효소조합 반응에 의한 과당으로부터 타가토스 생산 방법 및 그 조성물
KR101627921B1 (ko) 2014-07-23 2016-06-13 건국대학교 산학협력단 알돌레이즈 돌연변이체 및 이를 이용한 타가토스 생산 방법

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6709653B1 (en) * 1994-09-16 2004-03-23 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies specific for human inositol monophosphatase H1
US20030235894A1 (en) * 1999-05-06 2003-12-25 Tongyang Confectioner Co. Biological tagatose production by recombinant Escherichia coli
CN101095479A (zh) * 2007-06-20 2008-01-02 江南大学 一种塔格糖的制备方法
KR100964091B1 (ko) * 2008-01-28 2010-06-16 씨제이제일제당 (주) 대두 올리고당을 이용한 타가토스의 제조 방법
HUE046414T2 (hu) 2013-06-05 2020-02-28 Cj Cheiljedang Corp Eljárás tagatóz elõállítására
WO2015016544A1 (ko) * 2013-07-29 2015-02-05 건국대학교 산학협력단 알돌레이즈, 알돌레이즈 돌연변이체 및 이를 이용한 타가토스 생산 방법과 생산용 조성물
KR101620904B1 (ko) 2013-10-11 2016-05-23 (주)케비젠 기질 및 효소 컴비네이션 반응을 이용한 프럭토스로부터 타가토스 생산용 조성물 및 이의 용도
PE20181204A1 (es) * 2015-10-02 2018-07-23 Bonumose Llc Produccion enzimatica de d-tagatosa

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003008617A1 (en) 2001-07-16 2003-01-30 Arla Foods Amba Process for manufacturing of tagatose
KR101480422B1 (ko) 2013-07-29 2015-01-13 건국대학교 산학협력단 효소조합 반응에 의한 과당으로부터 타가토스 생산 방법 및 그 조성물
KR101627921B1 (ko) 2014-07-23 2016-06-13 건국대학교 산학협력단 알돌레이즈 돌연변이체 및 이를 이용한 타가토스 생산 방법

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Applied and environmental microbiology, Vol.79, NO.11, pp.3511-3515 (2013.03.22.)
NCBI, GenBank accession no. CP000916.1 (2014.01.30.)*

Also Published As

Publication number Publication date
AU2017287766A1 (en) 2019-01-24
US20190203189A1 (en) 2019-07-04
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JP2019519238A (ja) 2019-07-11
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AU2017287766B2 (en) 2021-05-20
EP3480304A4 (en) 2020-02-12
EP3480304A1 (en) 2019-05-08
WO2018004310A1 (ko) 2018-01-04
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