KR20180004025A - 고농도 마이오-이노시톨의 효소적 제조방법 - Google Patents

고농도 마이오-이노시톨의 효소적 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 출원은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 마이오-이노시톨 모노인산 합성효소 및/또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 마이오-이노시톨 모노인산 탈인산화 효소를 이용한 마이오-이노시톨 제조방법에 관한 것이다.

Description

고농도 마이오-이노시톨의 효소적 제조방법 {Novel thermostable myo-inositol monophosphate synthase and myo-inositol monophosphate phosphatase, and an enzymatic method for producing myo-inositol using the same}
본 출원은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 마이오-이노시톨 모노인산 합성효소 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 마이오-이노시톨 모노인산 탈인산화 효소를 이용한 고농도 마이오-이노시톨 제조방법에 관한 것이다.
대부분의 고등 동물에서 필수성분인 마이오-이노시톨(myo-inositol)은 식품, 사료, 화장품, 제약 등에서 건강 기능성 소재로 널리 사용되고 있다. 그 예로, 마이오-이노시톨은 콜레스테롤 및 지방 대사에 중요한 역할을 한다고 알려져 있어, 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia) 등을 예방하고 치료하는데 효과적이라고 보고된다. 또한, 보습 유지, 피지 조절, 항산화능 조절을 통한 노화억제 등의 피부 기능성이 있어 화장품 소재로도 사용되고 있다.
마이오-이노시톨을 원료로 합성될 수 있는 유도체들 또한 고부가 기능 소재로 각광받고 있다. 그 예로 포스포글리칸의 주요 구성성분으로 인슐린 신호전달의 중요한 매개체로 보고되어 있으며, 제2형 당뇨의 치료에 효과가 있다고 알려져 있는 카이로-이노시톨(D-chiro-inositol) 및 피니톨(D-pinitol), 알츠하이머병의 치료제(2000. J Biol Chem. 275:18495-18502)나, 생리 활성물질의 합성원료(미국 특허 제5,412,080호), 액정 화합물의 합성원료(독일 특허 제3,405,663호)로서 용도가 기대되고 있는 실로-이노시톨(scyllo-inositol) 등이 있다.
지금까지 산업화 규모의 마이오-이노시톨 생산공정을 개발하고 개량하기 위한 다양한 방법들이 보고되고 있다.
종래의 통상적인 방법으로 쌀겨(rice bran) 및 옥수수 침지액(corn steep liquor) 등으로부터 물리화학적(산, 염기, 열, 압력 등) 추출법을 이용하여 마이오-이노시톨을 정제한다. 상기 원료들로부터 직접 추출을 통한 생산방법은 수율이 낮을 뿐 아니라, 원료별 추출액 내에 다양한 다량의 불순물들을 포함하기 때문에 정제공정에서 수율 및 순도 제어가 어려워 생산 효율이 매우 낮은 것으로 알려져 있다.
또 다른 방법으로서, 마이오-이노시톨 고생산능을 보유하는 균주들을 신규 발굴하거나 합성대사경로를 유전자 조작 개량하여 발효배양액으로부터 마이오-이노시톨을 분리, 정제하는 발효적 생산방법들이 보고되고 있다. 생산 균주들로는 Saccharomyces cerevisiae, Candida(특허 일본 Kokai 8-00258, 특허 일본 Kokai 8-38188, 특허 일본 Kokai 8-89262, 특허 일본 Kokai 9-117295, 특허 일본 Kokai 10-42860, 특허 일본 Kokai 10-42882, 특허 일본 Kokai 10-42883, 특허 일본 Kokai 2000-41689, 특허 일본 Kokai 9-220093, 특허 일본 Kokai 10-271995), Pichia pastoris(특허 일본 Kokai 2011-55722) 및 Escherichia coli(1999. J. Am. Chem. Soc. 121:3799-3800, 특허 WO2009/145838) 등이 보고되고 있다. 그러나, 상기 발효적 방법들은 생산성이 낮아 산업화 규모의 생산방법으로는 실용화되어 적용되고 있지 않다.
이에, 본 발명자들은 고농도 마이오-이노시톨을 생산할 수 있는 신규의 제조방법을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 본 출원의 마이오-이노시톨 모노인산 합성효소 및/또는 마이오-이노시톨 모노인산 탈인산화 효소를 이용하여 고수율로 마이오-이노시톨을 생산할 수 있음을 확인하여 본 출원을 완성하였다.
본 출원의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 마이오-이노시톨 모노인산 합성효소(myo-inositol monophosphate synthase) 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 마이오-이노시톨 모노인산 탈인산화효소(myo-inositol monophosphate phosphatase)를 이용한 마이오-이노시톨 제조방법을 제공하는 것이다.
이하, 본 출원 내용에 대하여 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시한 일 양태의 설명 및 실시형태는 공통된 사항에 대하여 다른 양태의 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 또한, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 더불어, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 출원의 목적을 달성하기 위하여, 본 출원은 하나의 양태로서, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 마이오-이노시톨 모노인산 합성효소(myo-inositol monophosphate synthase)를 제공한다. 또한, 본 출원은 다른의 양태로서, 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 마이오-이노시톨 모노인산 탈인산화효소(myo-inositol monophosphate phosphatase)를 제공한다.
또한, 본 출원의 마이오-이노시톨 모노인산 합성효소 및 마이오-이노시톨 모노인산 탈인산화효소는 각각 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 상동성을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 상동성을 가지며, 상기 서열번호 1 또는 3의 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가지더라도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
또한, 본 출원의 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 마이오-이노시톨 모노인산 합성효소 또는 본 출원의 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 마이오-이노시톨 모노인산 탈인산화효소와 상응하는 활성을 가지는 단백질이라면 서열번호 1 또는 3의 아미노산 서열 앞뒤의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이(silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 서열번호 1 또는 3의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또한 본 출원의 범위 내에 속한다.
나아가, 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 마이오-이노시톨 모노인산 합성효소는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것일 수 있고, 상기 마이오-이노시톨 모노인산 탈인산화효소는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것일 수 있다. 또한, 상기 마이오-이노시톨 모노인산 합성효소 및 마이오-이노시톨 모노인산 탈인산화효소는 각각 서열번호 2 또는 4의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것일 수 있다. 코돈 축퇴성(codon degeneracy)에 의해 상기 서열번호 1 또는 3의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 또는 이와 상동성을 가지는 단백질로 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드 역시 본 출원의 범위에 포함될 수 있음은 자명하다.
상기에서 용어 "상동성"은 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 동일하거나 유사한 활성을 가지는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 예를 들면, 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 구체적으로 BLAST 2.0을 이용하거나, 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다. 상기에서 용어 “엄격한 조건”이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 예를 들어, 이러한 조건은 문헌(예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다.
본 출원에서 상기 엄격한 조건은 상동성을 확인하기 위해 조절될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 간의 상동성을 확인하기 위하여, 55℃의 Tm 값에 대응하는, 낮은 엄격도의 혼성화 조건이 이용될 수 있는데, 예를 들어, 5XSSC, 0.1% SDS, 0.25% 밀크, 및 무 포름아미드; 또는 30% 포름아미드, 5XSSC, 0.5% SDS 조건이 이용될 수 있다. 온화한 엄격도의 혼성화 조건은 높은 Tm 값에 대응하며, 예를 들어, 5X 또는 6XSSC를 갖는 40% 포름아미드가 사용될 수 있다. 높은 엄격도의 혼성화 조건은 가장 높은 Tm 값에 대응하며, 예를 들어, 50% 포름아미드, 5X 또는 6XSSC 조건이 이용될 수 있다. 다만, 상기 예에 제한되는 것은 아니다.
혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원은 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60℃, 63℃ 또는 65℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다. 두 뉴클레오티드 서열 사이의 유사성 또는 상동성 정도가 더 클수록, 그러한 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드의 하이브리드에 대한 Tm 값은 더 커질 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 혼성화의 상대적 안정성(더 높은 Tm 값에 대응하는)은 하기 순서로 감소한다: RNA : RNA, DNA : RNA, DNA : DNA. 길이가 100 뉴클레오티드 보다 큰 하이브리드에 대하여, Tm 값 계산 수식은 공지되어 있다(Sambrook et al., supra, 9.50-9.51 참조). 더 짧은 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드와의 혼성화에 대하여, 미스매치 위치는 보다 더 중요할 수 있고, 올리고뉴클레오티드의 길이가 그 특이성을 결정할 수 있다(Sambrook et al., supra, 11.7-11.8 참조).
구체적으로, 폴리뉴클레오티드는 500 mM 염보다 낮고 적어도 37℃의 혼성화 단계, 및 적어도 63℃의 2XSSPE에서의 세척 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하여 탐지될 수 있다. 상기 혼성화 조건은 200 mM 염보다 낮고 적어도 37℃의 혼성화 단계를 포함할 수 있다. 또는 상기 혼성화 조건은 혼성화 및 세척 단계 모두에서 63℃ 및 2XSSPE를 포함할 수 있다.
혼성화 핵산의 길이는 예를 들면, 적어도 약 10 뉴클레오티드, 15 뉴클레오티드, 20 뉴클레오티드, 또는 적어도 30 뉴클레오티드일 수 있다. 또한, 당업자는 온도 및 세척 용액 염 농도를 프로브의 길이와 같은 요소에 따라 필요할 경우 조절할 수 있다.
본 출원의 마이오-이노시톨 모노인산 합성효소 및 마이오-이노시톨 모노인산 탈인산화효소는 써모토가(Thermotoga) 속 유래의 효소일 수 있으며, 구체적으로 써모토가 네아폴리타나(Thermotoga neapolitana) 유래의 효소일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원은 다른 하나의 양태로서, 본 출원의 마이오-이노시톨 모노인산 합성효소 또는 본 출원의 마이오-이노시톨 모노인산 탈인산화효소를 암호화하는 핵산을 제공한다.
본 출원은 또 다른 하나의 양태로서, 본 출원의 마이오-이노시톨 모노인산 합성효소 또는 마이오-이노시톨 모노인산 탈인산화효소를 암호화하는 핵산을 포함하는 형질전환체를 제공한다.
본 출원에서 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 암호화하는 핵산 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 핵산이 암호화하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 핵산은 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 핵산은 표적 단백질을 암호화하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 핵산은 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 핵산은 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 핵산에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 핵산은 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 단백질을 암호화하는 핵산의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
본 출원의 벡터를 형질전환 시키는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌 글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 숙주 세포로는 DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 숙주를 사용하는 것이 좋은데, 예를 들어 대장균일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원은 또 다른 하나의 양태로서, 본 출원의 마이오-이노시톨 모노인산 합성효소 및 마이오-이노시톨 모노인산 탈인산화효소, 본 출원의 마이오-이노시톨 모노인산 합성효소 및 마이오-이노시톨 모노인산 탈인산화효소를 발현하는 미생물 또는 본 출원의 마이오-이노시톨 모노인산 합성효소 및 마이오-이노시톨 모노인산 탈인산화효소를 발현하는 미생물의 배양물을 포함하는 마이오-이노시톨 생산용 조성물을 제공한다.
본 출원의 마이오-이노시톨 생산용 조성물은, 본 출원의 마이오-이노시톨 제조 경로(도 1 참고)에 관여하는 효소, 본 출원의 마이오-이노시톨 제조 경로에 관여하는 효소를 발현하는 미생물, 또는 본 출원의 마이오-이노시톨 제조 경로에 관여하는 효소를 발현하는 미생물의 배양물을 추가로 포함할 수 있다. 다만, 이는 예시적인 것으로 본 출원의 마이오-이노시톨 모노인산 합성효소 및/또는 마이오-이노시톨 모노인산 탈인산화효소를 이용하여 마이오-이노시톨을 생산할 수 있다면, 본 출원의 마이오-이노시톨 생산용 조성물에 포함되는 효소 및 마이오-이노시톨 생산에 이용되는 기질이 제한되지 않는다.
또한, 본 출원의 마이오-이노시톨 생산용 조성물은 (a) (i) 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합, 포도당, 포도당-1-인산 또는 포도당-6-인산; (ii) 포스페이트(phosphate); (iii) 포스포글루코무타아제 또는 포도당 인산화 효소; 및/또는 (iv) α-글루칸 포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제, 수크로오스 포스포릴라아제, α-아밀라아제, 풀루란아제, 이소아밀라아제, 글루코아밀라아제 또는 수크라아제; 또는 (b) 상기 항목 (a)의 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 상기 항목 (a)의 효소를 발현하는 미생물의 배양물을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 본 출원의 전분/말토덱스트린 포스포릴라아제(starch/maltodextrin phosphorylase, EC 2.4.1.1) 및 α-글루칸 포스포릴라아제는 포스페이트(phosphate)를 포도당에 인산화 전이시켜 전분 또는 말토덱스트린으로부터 포도당-1-인산을 생산하는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 본 출원의 수크로스 포스포릴라아제(sucrose phosphorylase, EC 2.4.1.7)는 포스페이트를 포도당에 인산화 전이시켜 수크로스로부터 포도당-1-인산을 생산하는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 본 출원의 전분 액당화 효소인 α-아밀라아제(α-amylase, EC 3.2.1.1), 풀루란아제(pullulanse, EC 3.2.1.41), 글루코아밀라아제(glucoamylase, EC 3.2.1.3) 및 이소아밀라아제(isoamylase)는 전분 또는 말토덱스트린을 포도당으로 전환시키는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 본 출원의 수크라제(sucrase, EC 3.2.1.26)는 수크로스를 포도당으로 전환시키는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 본 출원의 포스포글루코무타아제(phosphoglucomutase, EC 5.4.2.2)는 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 전환시키는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 포도당인산화효소(glucokinase)는 포도당에 인산을 전이시켜 포도당-6-인산으로 전환하는 활성을 가지는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 포도당인산화효소는 폴리포스페이트 의존형 포도당인산화 효소일 수 있으며, 보다 구체적으로 아미노산 서열번호 9 및 염기 서열번호 11의 Deinococcus geothermalis 유래 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소 또는 아미노산 서열번호 10 및 염기 서열번호 12의 Anaerolinea thermophila 유래 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소일 수 있다.
본 출원은 또 다른 하나의 양태로서, 마이오-이노시톨-모노-인산에 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 마이오-이노시톨-모노-인산 탈인산화효소, 상기 마이오-이노시톨-모노-인산 탈인산화효소를 발현하는 미생물 또는 상기 마이오-이노시톨-모노-인산 탈인산화효소를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜 마이오-이노시톨-모노-인산을 마이오-이노시톨로 전환하는 단계를 포함하는 마이오-이노시톨 제조방법을 제공한다. 본 양태에서, 본 출원의 제조방법은 본 출원의 마이오-이노시톨-모노-인산을 마이오-이노시톨로 전환하는 단계 이전, 포도당-6-인산에 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 마이오-이노시톨-모노-인산 합성효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜 포도당-6-인산을 마이오-이노시톨-모노-인산으로 전환하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 출원은 또 다른 하나의 양태로서, 포도당-6-인산에 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 마이오-이노시톨-모노-인산 합성효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜 포도당-6-인산을 마이오-이노시톨-모노-인산으로 전환하는 단계를 포함하는 마이오-이노시톨 제조방법을 제공한다. 본 양태에서, 본 출원의 제조방법은 본 출원의 포도당-6-인산을 마이오-이노시톨-모노-인산으로 전환하는 단계 이후, 마이오-이노시톨-모노-인산에 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 마이오-이노시톨-모노-인산 탈인산화효소, 상기 마이오-이노시톨-모노-인산 탈인산화효소를 발현하는 미생물 또는 상기 마이오-이노시톨-모노-인산 탈인산화효소를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜 마이오-이노시톨-모노-인산을 마이오-이노시톨로 전환하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 출원의 제조방법은 본 출원의 포도당-6-인산을 마이오-이노시톨-모노-인산으로 전환하는 단계 이전, 포도당-1-인산(glucose-1-phosphate)에 포스포글루코무타아제, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 출원의 제조방법은 본 출원의 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 포도당-1-인산(Glucose-1-phosphate)에 포스포글루코무타아제, 상기 포스포글루코무타아제를 발현하는 미생물 또는 상기 포스포글루코무타아제를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 출원의 제조방법은 본 출원의 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합에 α-글루칸 포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제 또는 수크로오스 포스포릴라아제; 상기 포스포릴라아제를 발현하는 미생물; 또는 상기 포스포릴라아제를 발현하는 미생물의 배양물, 및 포스페이트를 접촉시켜, 상기 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합을 포도당-1-인산으로 전환하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 출원의 제조방법은 본 출원의 포도당을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합에 α-아밀라아제, 풀루란아제, 글루코아밀라아제, 수크라아제 또는 이소아밀라아제; 상기 아밀라아제, 플루란아제 또는 수크라아제를 발현하는 미생물; 또는 상기 아밀라아제, 플루란아제 또는 수크라아제를 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합을 포도당으로 전환하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 출원의 제조방법은 포도당에 4-α-글루카노트랜스퍼라아제, 상기 4-α-글루카노트랜스퍼라아제를 발현하는 미생물 또는 상기 4-α-글루카노트랜스퍼라아제를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당을 전분, 말토덱스트린 또는 수크로스로 전환하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 출원의 제조방법에 있어서, 본 출원의 '접촉'은 pH 5.0 내지 10.0, 50℃ 내지 90℃, 및/또는 1분 내지 24시간 동안 실시할 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 접촉은 pH 5.0 내지 9.0, pH 6.0 내지 8.0, 또는 pH 6.5 내지 7.5에서 실시할 수 있다. 또한, 본 출원의 접촉은 60℃ 내지 80℃ 또는 65℃ 내지 75℃에서 실시할 수 있다. 더불어, 본 출원의 접촉은 1분 내지 12시간, 1분 내지 6시간, 1분 내지 3시간, 1분 내지 1시간, 5분 내지 24시간, 5분 내지 12시간, 5분 내지 6시간, 5분 내지 3시간, 5분 내지 1시간, 10분 내지 24시간, 10분 내지 12시간, 10분 내지 6시간, 10분 내지 3시간, 또는 10분 내지 1시간 동안 실시할 수 있다.
본 출원은 또 다른 하나의 양태로서, 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합, 및 포스페이트에 (a) 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 마이오-이노시톨-모노-인산 탈인산화 효소; 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 마이오-이노시톨-모노-인산 합성효소; 포스포글루코무타아제 또는 포도당 인산화 효소; 및 α-글루칸 포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제, 수크로오스 포스포릴라아제, α-아밀라아제, 풀루란아제, 이소아밀라아제, 글루코아밀라아제 또는 수크라아제; 또는 (b) 상기 항목 (a)의 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시키는 단계를 포함하는, 마이오-이노시톨 제조방법을 제공한다.
본 출원의 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 마이오-이노시톨-모노-인산 탈인산화 효소는 마이오-이노시톨-모노-인산을 빠른 시간 내에 매우 높은 수율로 마이오-이노시톨로 전환시킬 수 있다(1시간 반응 시 약 85%). 또한, 본 출원의 방법에 의하면 세포 외 효소 반응 완충액 내에서의 마이오-이노시톨을 생산하므로 재조합 세포를 이용한 발효 방법과 비교하여 저비용으로 마이오-이노시톨을 생산할 수 있다.
도 1은 마이오-이노시톨의 전환 경로 및 이에 관여하는 효소들을 모식적으로 나타낸 것이다.
도 2는 (A) 서열번호 1의 효소를 포함하는 형질전환체, 및 (B) 서열번호 3의 효소를 포함하는 형질전환체로부터 생산된 재조합 효소를 크로마토그래피로 확인한 것이다. M은 단백질 크기 측정 마커(size marker), CFE는 세포파쇄 상등액, PE는 정제된 효소이다.
도 3은 마이오-이노시톨 모노인산 합성효소의 활성을 확인한 HPLC 결과이다.
도 4는 마이오-이노시톨 모노인산 합성효소 및 마이오-이노시톨 모노인산 탈인산화 효소를 동시에 사용하여 포도당-6-인산으로부터 마이오-이노시톨이 생산되는지 분석한 HPLC 결과이다.
이하 본 출원을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 출원의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.
실시예 1: 마이오-이노시톨 모노인산 합성효소와 마이오-이노시톨 모노인산 탈인산화 효소의 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 및 형질전환 미생물의 제조
본 출원에 적용된 신규 내열성의 마이오-이노시톨 모노인산 합성효소(myo-inositol monophosphate synthase)와 마이오-이노시톨 모노인산 탈인산화 효소(myo-inositol monophosphate phosphatase)를 제공하기 위해 호열성 미생물인 써모토가 네아폴리타나(Themotoga neapolitana)에서 각 유전자를 분리하였고, 재조합 발현벡터 및 형질전환 미생물들을 각각 제조하였다.
구체적으로, Genbank에 등록된 써모토가 네아폴리타나 유전자 서열들을 대상으로 본 출원의 효소들과 관련된 유전자 서열들을 선발하였고, 아미노산 서열(서열번호 1, 마이오-이노시톨 모노인산 합성효소; 서열번호 3, 마이오-이노시톨 모노인산 탈인산화 효소)과 염기 서열(서열번호 2, 마이오-이노시톨 모노인산 합성효소; 서열번호 4, 마이오-이노시톨 모노인산 탈인산화 효소) 정보를 바탕으로 정방향 프라이머(서열번호 5, 마이오-이노시톨 모노인산 합성효소; 서열번호 6, 마이오-이노시톨 모노인산 탈인산화 효소) 및 역방향 프라이머(서열번호 7, 마이오-이노시톨 모노인산 합성효소; 서열번호 8, 마이오-이노시톨 모노인산 탈인산화 효소)를 고안하였다. 합성된 프라이머를 이용하여 써모토가 네아폴리타나 염색체 DNA(genomic DNA)로부터 각 유전자를 중합효소 연쇄반응(PCR)을 이용하여 증폭하였고, 구체적으로 95℃에서 30초 동안 변성, 55℃에서 30초 동안 어닐링　및 68℃에서 2분 동안 중합하였고　상기 반응들은　25회 반복한 조건을　사용하였으며, 증폭된 해당 효소의 유전자들은 제한효소 NdeⅠ 및 XhoⅠ을 사용하여 대장균 발현용 플라스미드 벡터 pET21a(Novagen사)에 삽입하여 CJ_tn_isyn(마이오-이노시톨 모노인산 합성효소 발현 플라스미드)과 CJ_tn_t6pp(마이오-이노시톨 모노인산 탈인산화 효소 발현 플라스미드)라 명명된 재조합 발현벡터를 제작하였다. CJ_tn_isyn와 CJ_tn_t6pp는 통상적인 형질전환 방법(참조: Sambrook et al. 1989)으로 대장균 BL21(DE3) 균주에 형질 전환하여 E. coli BL21(DE3)/CJ_tn_isyn 와 E. coli BL21(DE3)/CJ_tn_t6pp라 명명된 형질전환 미생물을 제조하였다.
각각 서열번호 2번 및 4번의 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질 전환된 것을 특징으로 하는, 대장균 BL21 (DE3)/CJ_tn_isyn (Escherichia coli BL21 (DE3)/CJ_tn_isyn) 균주 및 대장균 BL21 (DE3)/CJ_tn_t6pp (Escherichia coli BL21 (DE3)/CJ_tn_t6pp) 균주를 부다페스트 조약 하에 2016년 6월 23일자로 한국미생물보존센터 (Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 기탁하여 각각 기탁번호 KCCM11849P 및 KCCM11850P를 부여 받았다.
실시예 2: 재조합 효소의 제조
재조합 효소(이하, ISYN 및 T6PP)들을 제조하기 위해, E. coli BL21(DE3)/CJ_tn_isyn와 E. coli BL21(DE3)/CJ_tn_t6pp를 각각 LB 액체배지 5 ml를 포함하는 배양 튜브에 접종하고, 600 nm에서 흡광도가 2.0이 될 때까지 37 ℃의 진탕 배양기에서 종균 배양을 하였다. 본 종균 배양된 배양액을 LB 액체배지를 포함하는 배양 플라스크에 접종하여 본 배양을 진행하였다. 600 nm에서의 흡광도가 2.0이 될 때 1 mM IPTG를 첨가하여 재조합 효소의 발현생산을 유도하였다. 상기 배양 과정 중의 교반 속도는 200 rpm이며 배양 온도는 37 ℃가 유지되도록 하였다. 배양액은 8,000×g로 4 ℃에서 20분 동안 원심분리 후 균체를 회수하였다. 회수된 균체는 50 mM Tris-HCl(pH 7.0) 완충용액으로 2회 세척하였고, 동일 완충용액으로 현탁 후 초음파 세포파쇄기를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 세포 파쇄물은 13,000×g로 4 ℃에서 20분 동안 원심분리 후 상등액만을 취하였다. 재조합 효소는 상기 상등액으로부터 His-tag 친화 크로마토그래피를 사용하여 정제되었다. 정제된 재조합 효소액은 50 mM Tris-HCl(pH 7.0) 완충용액으로 투석 후 효소의 특성 분석에 사용하였다.
그 결과, 정제된 재조합 마이오-이노시톨 모노인산 합성효소(ISYN)와 마이오-이노시톨 모노인산 탈인산화 효소(T6PP)는 SDS-PAGE 분석을 통하여 각 약 43 kDa과 약 29 kDa 인 것을 확인하였다 (도 2).
실시예 3: 재조합 효소의 활성 분석
본 출원의 마이오-이노시톨 모노인산 합성효소의 활성 분석을 위한 반응 조성물은 50 mM Tris-HCl(pH 7.5) 완충용액에 현탁된 50 mM 포도당-6-인산을 사용하였다. 상기 반응 조성물에 0.1 unit/ml 정제효소와 기질인 포도당-6-인산을 온도 60 ℃에서 1시간 동안 반응 후, 각 반응액에 10 unit/ml 포스파테이즈(NEB사 Alkaline phosphatase, Calf Intestinal)를 첨가하여 온도 37 ℃에서 1시간 처리한 후 HPLC를 이용하여 반응물을 분석하였다. HPLC 분석 조건은 SP850(Shodex사) 컬럼을 사용하여 80 ℃에서 이동상으로 0.6 ml/min 유속으로 흘려 주면서 수행하였으며 Refractive Index Detector로 포도당 및 마이오-이노시톨을 검출 분석하였다. 도 3의 결과는 재조합 생산된 마이오-이노시톨 모노인산 합성효소가 포도당-6-인산을 마이오-이노시톨 모노인산으로 전환하는 활성이 있음을 보여준다 (도 3). 기질 및 산물간 정량 분석 결과 약 1시간 반응 후 약 85% 전환됨을 확인 할 수 있었다.
다음으로, 본 출원의 마이오-이노시톨 모노인산 탈인산화 효소의 활성 분석을 위해 기질로 포도당-1-인산, 포도당-6-인산, 또는 이노시톨 모노인산을 사용하였고, 각 기질은 50 mM 농도로 50 mM Tris-HCl(pH 7.0) 완충용액에서 현탁 후 이용 되었다. 각 반응 조성물에 0.1 unit/ml의 정제효소를 첨가하여 70 ℃에서 약 1시간 동안 반응 후 HPLC를 이용하여 당 정량 및 각 인산당을 분석하였다.
그 결과 본 출원의 재조합 효소는 기질로서 이노시톨 모노인산에 대해서만 탈인산화 활성이 있음을 확인할 수 있었다.
본 출원의 마이오-이노시톨 모노인산 합성효소 및 마이오-이노시톨 모노인산 탈인산화 효소를 동시에 사용하여 포도당-6-인산으로부터 마이오-이노시톨이 생산되는지 분석하였다. 반응 조성물로 0.1 unit/ml의 정제된 재조합 마이오-이노시톨 모노인산 합성효소 및 마이오-이노시톨 모노인산 탈인산화 효소, 10 mM MgCl2(또는 MgSO4) 및 50 mM 포도당-6-인산을 첨가하여 60 ℃ (50 mM Tris-HCl, pH 7.0 완충용액) 1시간 동안 반응 후 HPLC를 이용하여 반응물을 분석하였다. HPLC 분석 조건은 SP850(Shodex사) 컬럼을 사용하여 80 ℃에서 이동상으로 0.6 ml/min 유속으로 흘려 주면서 수행하였으며 Refractive Index Detector로 마이오-이노시톨)을 검출 분석하였다. 분석 결과, 상기 재조합 정제효소들을 동시에 첨가한 반응물에서 마이오-이노시톨이 고수율로 생성됨을 확인할 수 있었다 (도 4).
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
한국미생물보존센터 KCCM11849P 20160623 한국미생물보존센터 KCCM11850P 20160623
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125 Asn Thr Cys Thr Thr Glu Ala Phe Lys Pro Phe Gly Asn Lys Glu Glu 130 135 140 Leu Leu Lys Ala Ile Glu Asn Asn Asp Lys Glu Arg Leu Thr Ala Thr 145 150 155 160 Gln Val Tyr Ala Tyr Ala Ala Thr Leu Tyr Ala Lys Lys Arg Gly Gly 165 170 175 Ala Ala Phe Val Asn Val Ile Pro Thr Tyr Ile Ala Asn Asp Pro Ala 180 185 190 Phe Val Glu Leu Ala Lys Gly Asn Asn Leu Val Val Phe Gly Asp Asp 195 200 205 Gly Ala Thr Gly Ala Thr Pro Phe Thr Ala Asp Val Leu Ser His Leu 210 215 220 Ala Gln Arg Asn Arg Tyr Val Lys Asp Val Ala Gln Phe Asn Ile Gly 225 230 235 240 Gly Asn Met Asp Phe Leu Ala Leu Thr Asp Glu Gly Lys Asn Lys Ser 245 250 255 Lys Glu Phe Thr Lys Ser Ser Ile Val Lys Asp Ile Leu Gly Tyr Asp 260 265 270 Ala Pro His Tyr Ile Lys Pro Thr Gly Tyr Leu Glu Pro Leu Gly Asp 275 280 285 Lys Lys Phe Ile Ala Ile His Ile Glu Tyr Thr Ser Phe Asn Gly Ala 290 295 300 Thr Asp Glu Leu Met Ile Ser Gly Arg Ile Asn Asp Ser Pro Ala Leu 305 310 315 320 Gly Gly Leu Leu Val Asp Leu Val Arg Leu Gly Lys Ile Ala Leu Asn 325 330 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cggctttcgt cgaactcgca aaagggaaca 600 atcttgtggt ctttggagac gatggagcaa cgggtgcgac cccattcacg gcagacgtgt 660 tgagccatct tgcccagagg aacaggtatg tcaaagatgt cgcacagttc aacataggtg 720 gaaacatgga ctttcttgca ctcaccgatg aaggaaagaa caagagtaaa gagttcacaa 780 agtccagtat cgtgaaagac atcctcggtt acgatgcacc gcactacata aaaccaacgg 840 gctatcttga acccctcgga gacaaaaagt tcatagcgat ccacattgag tacacgagtt 900 tcaacggtgc aaccgatgaa ctcatgataa gcggaaggat caacgacagt ccagcccttg 960 gaggtcttct tgtggatctt gtaagactcg gaaagatcgc cctcaacagg aaagagtacg 1020 gaacagtcta tcctgtgaac gccttctaca tgaagaatcc cggtccattt gaaggaaaga 1080 acataccgag gatcatcgcg tacgagaaga tgaggatctg ggcgggactg aaaccaaaat 1140 ggctgtga 1148 <210> 3 <211> 263 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> myo-inositol monophosphate phosphatase <400> 3 Met Glu Gly Gly Ile Glu Leu Asp Arg Leu Asp Phe Ser Ile Lys Leu 1 5 10 15 Leu Arg Arg Val Gly His Phe Leu Met Leu His Trp Gly Lys Val Asp 20 25 30 Ser Val Glu Lys Lys Thr Gly Phe Lys Asp Ile Val Thr Glu Ile Asp 35 40 45 Lys Lys Ala Gln Glu Met Ile Val Glu Glu Ile Arg Lys Val Phe Pro 50 55 60 Asp Glu Asn Ile Ile Ala Glu Glu Gly Ile Ser Glu Asn Gly Lys Lys 65 70 75 80 Leu Trp Ile Ile Asp Pro Ile Asp Gly Thr Ile Asn Phe Val His Gly 85 90 95 Leu Pro Asn Phe Ser Ile Ser Ile Ala Tyr Val Glu Asn Gly Glu Val 100 105 110 Lys Met Gly Val Val His Ala Pro Ala Leu Asn Glu Thr Leu Tyr Ala 115 120 125 Glu Glu Asn Gly Gly Ala Phe Leu Asn Gly Glu Arg Ile Arg Val Ser 130 135 140 Gly Asn Thr Ser Leu Glu Glu Cys Val Gly Ser Thr Gly Ser Tyr Val 145 150 155 160 Asp Phe Thr Gly Lys Phe Ile Glu Lys Met Glu Lys Lys Thr Arg Arg 165 170 175 Val Arg Ile Leu Gly Ser Ala Ala Leu Asn Ala Cys Tyr Val Gly Ala 180 185 190 Gly Arg Val Asp Phe Phe Val Thr Trp Arg Ile Asn Pro Trp Asp Ile 195 200 205 Ala Ala Gly Leu Ile Val Val Lys Glu Ala Gly Gly Thr Val Thr Asp 210 215 220 Phe Ala Gly Lys Glu Ala Asn Val Phe Ser Lys Asn Phe Val Phe Ser 225 230 235 240 Asn Gly Leu Val His Glu Glu Val Leu Glu Val Val Asn Glu Val Leu 245 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Pro Val Asp Thr Ala Thr Gly Lys Leu Val Ala Glu 35 40 45 Arg His Arg Ile Pro Thr Pro Glu Gly Ala His Pro Asp Ala Val Lys 50 55 60 Asp Val Val Val Glu Leu Val Arg His Phe Gly His Ala Gly Pro Val 65 70 75 80 Gly Ile Thr Phe Pro Gly Ile Val Gln His Gly His Thr Leu Ser Ala 85 90 95 Ala Asn Val Asp Lys Ala Trp Ile Gly Leu Asp Ala Asp Thr Leu Phe 100 105 110 Thr Glu Ala Thr Gly Arg Asp Val Thr Val Ile Asn Asp Ala Asp Ala 115 120 125 Ala Gly Leu Ala Glu Ala Arg Phe Gly Ala Gly Ala Gly Val Pro Gly 130 135 140 Glu Val Leu Leu Leu Thr Phe Gly Thr Gly Ile Gly Ser Ala Leu Ile 145 150 155 160 Tyr Asn Gly Val Leu Val Pro Asn Thr Glu Phe Gly His Leu Tyr Leu 165 170 175 Lys Gly Asp Lys His Ala Glu Thr Trp Ala Ser Asp Arg Ala Arg Glu 180 185 190 Gln Gly Asp Leu Asn Trp Lys Gln Trp Ala Lys Arg Val Ser Arg Tyr 195 200 205 Leu Gln Tyr Leu Glu Gly Leu Phe Ser Pro Asp Leu Phe Ile Ile Gly 210 215 220 Gly Gly Val Ser Lys Lys Ala Asp Lys Trp Gln Pro His Val Ala Thr 225 230 235 240 Thr Arg Thr Arg Leu Val Pro Ala Ala Leu Gln Asn Glu Ala Gly Ile 245 250 255 Val Gly Ala Ala Met Val Ala Ala Gln Arg Ser Gln Gly Asp 260 265 270 <210> 10 <211> 253 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polyphosphate-dependent glucokinase <400> 10 Met Gly Arg Gln Gly Met Glu Ile Leu Gly Ile Asp Ile Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Ile Lys Gly Ala Pro Val Asp Val Glu Thr Gly Gln Leu Thr Ala 20 25 30 Glu Arg Tyr Arg Leu Pro Thr Pro Glu Asn Ala Leu Pro Glu Glu Val 35 40 45 Ala Leu Val Val Ala Gln Ile Val Glu His Phe Gln Trp Lys Gly Arg 50 55 60 Val Gly Ala Gly Phe Pro Ala Ala Ile Lys His Gly Val Ala Gln Thr 65 70 75 80 Ala Ala Asn Ile His Pro Thr Trp Ile Gly Leu His Ala Gly Asn Leu 85 90 95 Phe Ser Glu Lys Cys Gly Cys Pro Val Ser Val Leu Asn Asp Ala Asp 100 105 110 Ala Ala Gly Leu Ala Glu Met Ile Phe Gly Ala Gly Lys Gly Gln Lys 115 120 125 Gly Val Val Leu Met Ile Thr Ile Gly Thr Gly Ile Gly Thr Ala Leu 130 135 140 Phe Thr Asp Gly Ile Leu Val Pro Asn Thr Glu Leu Gly His Ile Glu 145 150 155 160 Ile Arg Gly Lys Asp Ala Glu Gln Arg Ser Ser Glu Ala Ala Arg Gln 165 170 175 Arg Lys Asp Trp Thr Trp Gln Gln Trp Ala Lys Arg Leu Asn Glu His 180 185 190 Leu Glu Arg Leu Glu Ala Leu Phe Trp Pro Asp Leu Phe Ile Leu Gly 195 200 205 Gly Gly Ala Val Lys Asn His Glu Lys Phe Phe Pro Tyr Leu Lys Leu 210 215 220 Arg Thr Pro Phe Val Ala Ala Lys Leu Gly Asn Leu Ala Gly Ile Val 225 230 235 240 Gly Ala Ala Trp Tyr Ala His Thr Gln Glu Thr Gln Ala 245 250 <210> 11 <211> 813 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polyphosphate-dependent glucokinase <400> 11 atgctggcag ccagtgacag cagccagcat ggcgggaagg ctgttacgct atctcccatg 60 agcgtgatcc tcgggattga cataggtggg agcggcatca agggggcccc tgtggacacg 120 gcaaccggga agctggtggc cgagcgccac cgcatcccca cgcccgaggg cgcgcaccca 180 gacgcggtga aggacgtggt ggttgagctg gtgcggcatt ttgggcatgc ggggccagtc 240 ggcatcactt tccctggcat cgtgcagcac ggccataccc tgagcgcagc caatgtggat 300 aaagcctgga ttggcctgga cgccgacacg ctttttactg aggcgaccgg tcgcgacgtg 360 accgtgatca acgacgcaga tgccgcgggg ctagcggagg 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Claims (8)

  1. 마이오-이노시톨-모노-인산에 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 마이오-이노시톨-모노-인산 탈인산화효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜 마이오-이노시톨-모노-인산을 마이오-이노시톨로 전환하는 단계를 포함하는 마이오-이노시톨 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 방법은 상기 마이오-이노시톨-모노-인산을 마이오-이노시톨로 전환하는 단계 이전, 포도당-6-인산에 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 마이오-이노시톨-모노-인산 합성효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜 포도당-6-인산을 마이오-이노시톨-모노-인산으로 전환하는 단계를 추가로 포함하는, 마이오-이노시톨 제조방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 방법은 상기 포도당-6-인산을 마이오-이노시톨-모노-인산으로 전환하는 단계 이전, 포도당-1-인산(glucose-1-phosphate)에 포스포글루코무타아제, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계를 추가로 포함하는, 마이오-이노시톨 제조방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 방법은 상기 포도당-6-인산을 마이오-이노시톨-모노-인산으로 전환하는 단계 이전, 포도당(glucose)에 포도당 인산화 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물, 및 포스페이트를 접촉시켜, 상기 포도당을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계를 추가로 포함하는, 마이오-이노시톨 제조방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 방법은 상기 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합에 α-글루카노포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제 또는 수크로오스 포스포릴라아제; 이를 발현하는 미생물; 또는 상기 미생물의 배양물, 및 포스페이트를 접촉시켜, 상기 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합을 포도당-1-인산으로 전환하는 단계를 추가로 포함하는, 마이오-이노시톨 제조방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 방법은 상기 포도당을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계 이전, 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합에 α-아밀라아제, 풀루란아제, 글루코아밀라아제, 수크라아제 또는 이소아밀라아제; 이를 발현하는 미생물; 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합을 포도당으로 전환하는 단계를 추가로 포함하는, 마이오-이노시톨 제조방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉은 pH 5.0 내지 10.0, 온도 50℃ 내지 90℃, 및/또는 1분 내지 24시간 동안 실시하는, 마이오-이노시톨 제조방법.
  8. 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합, 및 포스페이트에 (a) 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 마이오-이노시톨-모노-인산 탈인산화 효소; 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 마이오-이노시톨-모노-인산 합성효소; 포스포글루코무타아제 또는 포도당 인산화 효소; 및 α-글루칸 포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제, 수크로오스 포스포릴라아제, α-아밀라아제, 풀루란아제, 이소아밀라아제, 글루코아밀라아제 또는 수크라아제; 또는 (b) 상기 항목 (a)의 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시키는 단계를 포함하는, 마이오-이노시톨 제조방법.
KR1020170083759A 2016-06-30 2017-06-30 고농도 마이오-이노시톨의 효소적 제조방법 KR20180004025A (ko)

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