JPH1042882A - イノシトールの製造法とセチルトリメチルアンモニウム塩に耐性を有する株の取得法 - Google Patents

イノシトールの製造法とセチルトリメチルアンモニウム塩に耐性を有する株の取得法

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JPH1042882A
JPH1042882A JP20478896A JP20478896A JPH1042882A JP H1042882 A JPH1042882 A JP H1042882A JP 20478896 A JP20478896 A JP 20478896A JP 20478896 A JP20478896 A JP 20478896A JP H1042882 A JPH1042882 A JP H1042882A
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inositol
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cetyltrimethylammonium
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cetyltrimethylammonium salt
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Koji Igarashi
浩司 五十嵐
Toru Yonehara
徹 米原
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Toray Industries Inc
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Abstract

(57)【要約】 【課題】経済的なイノシトール生産を可能とする。 【解決手段】セチルトリメチルアンモニウム塩に耐性を
有し、かつイノシトール生産能を有する微生物を用い
る。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】イノシトールは、高等動物に
おいてビタミンの一種として重要な物質で、栄養食品、
飼料添加物、医薬品などに利用される。本発明は、イノ
シトールを微生物を利用して製造する方法に関する。
【0002】
【従来の技術】従来イノシトールは、米糠、コーンステ
ィープリカーなどからの抽出(特開昭61−56142
号公報)、パン酵母を培養して製造する方法(欧州特許
506289号公開公報)、キャンディダ属に属する微
生物を培養して製造する方法(特開平8−258号、平
8−89262号、平8−38188号公報)などが知
られている。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】米糠、コーンスティー
プリカーなどから抽出する方法は、イノシトール以外の
不純物が多く、精製が困難であり、経済的に問題があ
る。また、パン酵母を培養して製造する方法は、生産性
が低く、やはり経済的に問題があり、さらに工業的実績
もない。また、パン酵母以外にイノシトールを菌体外に
生産する微生物としてキャンディダ属に属する微生物が
知られているが、生産性が十分ではない。
【0004】
【課題を解決するための手段】パン酵母以外にイノシト
ールを生産する潜在能力を持つ微生物をとして、キャン
ディダ属に属する微生物の変異株がイノシトール菌体外
に分泌することが知られている(特開平8−258公開
公報)。通常の発酵法、すなわち、炭素源および窒素源
などを添加し、微生物が増殖しながら、生産物を生成す
る方法で、イノシトールが菌体外に生成蓄積されること
は当然であるが、さらに通常の発酵法とは異なり、培養
によって得られた菌体もしくは培養物またはその処理物
を用い、事実上微生物の増殖が停止し、酵素反応のみが
行われる条件(以後酵素法と記す)で、炭素源からイノ
シトールを生成し、菌体外に分泌することも知られてい
る。しかし、これらの方法によるイノシトールの生成蓄
積濃度または糖などの原料からのイノシトール生成収率
は十分に満足できるものではなかった。
【0005】本発明者らはさらに生産性の高いイノシト
ールの製造方法について研究した結果、イノシトールの
生産能を有する微生物に、セチルトリメチルアンモニウ
ム塩に対する耐性を付与することにより、イノシトール
の蓄積濃度、生成収率が著しく向上することを見出し本
発明に到達した。
【0006】すなわち、本発明はセチルトリメチルアン
モニウム塩に耐性を有し、かつイノシトールを分泌する
性質を持った微生物を培養して、培養液中にイノシトー
ルを蓄積せしめ、前記培養液よりイノシトールを採取す
ることおよび、セチルトリメチルアンモニウム塩に耐性
を有し、かつイノシトール生産能を有する微生物を培養
して、得られた菌体、もしくはそれらの処理物を用い、
イノシトールを生成蓄積せしめる反応を行い、前記反応
液よりイノシトールを単離採取することを特徴とするイ
ノシトールの製造方法である。
【0007】
【発明の実施の形態】本発明に使用する微生物は、セチ
ルトリメチルアンモニウム塩に耐性を有し、イノシトー
ルを分泌する微生物であるならばいずれでもよいが、親
株としては、本発明者らによりイノシトールを分泌する
変異株として取得された、キャンディダ・ボイディニイ
(Candida boidinii)TER80(F
ERMP−15109)を用いることが好ましい。イノ
シトールを分泌する性質があれば、他に薬剤に対する耐
性、栄養要求性などの性質があってもよく、イノシトー
ルを分泌する微生物はすべて本発明に含まれるものであ
る。
【0008】セチルトリメチルアンモニウム塩として
は、具体的にはセチルトリメチルアンモニウムブロマイ
ドなどが挙げられる。
【0009】本発明で用いられる変異株の代表的なもの
としてはキャンディダ・ボイディニイCTMA3−2
(FERM P−15741)がある。キャンディダ・
ボイディニイCTMA3−2はキャンディダ・ボイディ
ニイTER80より通常の変異処理方法によって得られ
たもので、セチルトリメチルアンモニウムブロマイドに
耐性な変異株である。
【0010】変異株の誘導は親株を紫外線照射するか、
あるいは変異誘発剤(たとえばN−メチル−N´−ニト
ロ−N−ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホン酸
など)で処理した後、親株が生育できないような濃度の
セチルトリメチルアンモニウムブロマイドを含む固体培
地で生育可能な菌株を採取すればよい。
【0011】セチルトリメチルアンモニウムブロマイド
に耐性な変異株とは、親株よりセチルトリメチルアンモ
ニウムブロマイドに強い耐性を有する株のことである。
親株の相対生育度が30%以下を示すセチルトリメチル
アンモニウムブロマイドの濃度範囲において、60%以
上の相対生育度を示す変異株を取得するのが好ましい。
ここでの相対生育度は培養液の660nmにおける吸光
度を測定し、各菌株のセチルトリメチルアンモニウムブ
ロマイドを添加していない培養液の吸光度を100%と
した時の相対値で示す。耐性を検定する場合のセチルト
リメチルアンモニウムブロマイドは市販のものを用いれ
ばよい。なお、セチルトリメチルアンモニウムブロマイ
ドに耐性を有する株の分離時には、好ましくはグルコー
ス以外の炭素源を用い、グリセロール、メタノール、エ
タノールなどのアルコール類を用いるのが好ましい。
【0012】本発明における培養方法について説明す
る。イノシトール生産用の培地は、炭素源、窒素源、無
機イオンおよび必要に応じてその他の有機微量成分を含
有する通常の培地が好ましく用いられる。
【0013】炭素源としては、グルコース、フラクトー
ス、でんぷんおよびセルロースの加水分解物、糖蜜など
の糖類、フマール酸、クエン酸、コハク酸のごとき有機
酸、メタノール、エタノール、グリセロールのごときア
ルコール類などを1〜15%、窒素源として、酢酸アン
モニウムのごとき有機アンモニウム塩、硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アン
モニウムのごとき無機アンモニウム塩、アンモニアガ
ス、アンモニア水、尿素等を0.1〜4.0%、有機微
量成分としては、ビオチン等の被要求性物質が0.00
0001%〜0.1%、また必要に応じて、コーンステ
ィープリカー、ペプトン、酵母エキス等0〜5%をそれ
ぞれ適当に含有する培地が用いられる。これらの他に、
リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、
塩化ナトリウム、硫酸亜鉛、硫酸銅、硫酸第1鉄などが
微量成分として添加される。また好ましくは消泡剤など
も添加し、培養条件の安定化をはかる。
【0014】培養は好気条件で行うのが好ましい。培養
の間、培地のpH3〜8に、温度は20〜35℃に調節
し、24〜96時間振盪または通気撹拌培養すれば好ま
しい結果が得られる。
【0015】次に本発明における酵素法でのイノシトー
ルの生産方法について説明する。前記発酵法における培
地と同様に培養し、菌体を得る。この菌体をそのまま反
応に用いてもよいが、好ましくは公知の方法で原形質分
離(プラスモリシス)化処理を行う。
【0016】反応原料としては、一般に知られているイ
ノシトール生合成の前駆体である、グルコース−6−リ
ン酸あるいはさらにグルコース−6−リン酸の前駆体で
あるグルコースを使用するのが好ましい。反応はニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)、アンモニ
ウムイオンの存在下で行い、グルコースを前駆体とする
場合には、さらにマグネシウム、アデノシン−3−リン
酸もしくはその前駆体を添加するのが好ましい。なお、
これらのイノシトール生合成に必要な化合物群は、各々
単独に添加してもよいが、これらを含む天然由来の混合
物をかわりに使用することも可能である。また、SH基
保護剤など反応を安定化するための添加物を含んでもよ
い。反応の間、反応液のpH3〜8に、温度は20〜3
5℃に調節し、10〜72時間振盪または通気撹拌すれ
ば好ましい結果が得られる。
【0017】培養液中に分泌蓄積されたイノシトール
は、そのまま単離採取することなく、飼料などに用いる
ことができる。また、培養液あるいは反応液からイノシ
トールを採取するには公知の方法で可能である。例え
ば、菌体を遠心分離などで除去した後、カチオンおよび
アニオン交換樹脂でイオン性の物質を除き、濃縮すれば
結晶を取得することができる。
【0018】このようにして得られたイノシトールは、
栄養食品、栄養補助食品、粉ミルクなどの食品添加剤、
ニワトリ、牛、豚などの家畜用飼料添加剤、ハマチ、エ
ビなどの養殖魚用飼料添加剤、犬、猫などのペットフー
ド用添加剤、医薬品などの原料や添加剤、化粧品、入浴
剤、トイレタリー製品、医薬部外品などの添加剤などに
用いられる。
【0019】
【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
る。
【0020】実施例1 (セチルトリメチルアンモニウムブロマイド耐性変異株
の分離)キャンディダ・ボイディニイTER80の菌体
を常法によりN−メチル−N´−ニトロ−N−ニトロソ
グアニジン処理(300μg/ml、30℃10分)し
た後、この細胞を適当に希釈し、表1に示した培地に3
mg/lの濃度でセチルトリメチルアンモニウムブロマ
イド(Nacalai tesque製)を加えた平板
培地に塗布し、30℃で4日間培養した。生育してきた
変異処理したキャンディダ・ボイディニイTER80の
コロニーを、純粋な変異株として単離し、キャンディダ
・ボイディニイCTMA3−2を取得した。
【0021】
【表1】
【0022】(セチルトリメチルアンモニウムブロマイ
ド耐性変異株の耐性度)キャンディダ・ボイディニイT
ER80およびキャンディダ・ボイディニイCTMA3
−2を表2に示す培地を用いて30℃で24時間振盪培
養し、生育した菌体を集菌し生理食塩水で洗浄した。こ
の菌体懸濁液を表2に示す培地5mlおよび表2の組成
にセチルトリメチルアンモニウムブロマイド(CTM
A)を3mg/l添加した培地5mlに植菌して、30
℃にて培養し、各菌株の72時間後の生育度を調べた。
その結果は表3に示すとおりである。本発明で使用する
セチルトリメチルアンモニウムブロマイドに耐性な変異
株は親株と比較して、セチルトリメチルアンモニウムブ
ロマイドによって生育が阻害されず、強いセチルトリメ
チルアンモニウムブロマイド耐性を獲得していることを
示している。
【0023】
【表2】
【0024】
【表3】
【0025】実施例2、比較例1 (発酵法によるイノシトールの生産)実施例1で得たセ
チルトリメチルアンモニウムブロマイドに耐性を有する
菌株およびキャンディダ・ボイディニイTER80をそ
れぞれ、あらかじめ120℃20分蒸気滅菌した表4に
示した組成の培地5mlに一白金耳植菌し、30℃24
時間振盪して前培養した。この培養液を、あらかじめ1
20℃20分蒸気滅菌した表4に示した組成の培地50
mlを含む500ml容三角フラスコに植え継ぎ、30
℃72時間振盪して培養した後、あらかじめ滅菌してお
いたグルコースを50g/lになるように添加し、総計
120時間培養した。
【0026】培養終了後、菌体、炭酸カルシウムを除去
したろ液中のイノシトール濃度を高速液体クロマトグラ
フィーを用いて定量したところ、表5に示すような結果
を得た。親株と比較し、変異株ではイノシトールの生産
量が大幅に向上している。
【0027】
【表4】
【0028】
【表5】
【0029】実施例3 実施例1での培養液1L分の上清をカチオン交換樹脂ダ
イヤイオンSK1B(三菱化学製)に通液し、その素通
り画分をあつめ、さらにアニオン交換樹脂ダイヤイオン
PA316(三菱化学製)に通液し、その素通り画分を
あつめ、濃縮晶析し、純度97%以上のイノシトール結
晶8.4gを得た。
【0030】
【発明の効果】本発明の酵母を用い、本発明の発酵法お
よび菌体を用いた反応により、既存の方法と比較し、よ
り経済的なイノシトールの生産が可能となる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12R 1:72)

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 セチルトリメチルアンモニウム塩に耐性
    を有し、かつイノシトール分泌生産能を有する微生物を
    用いることを特徴とするイノシトールの製造方法。
  2. 【請求項2】 セチルトリメチルアンモニウム塩に耐性
    を有し、かつイノシトール分泌生産能を有する微生物を
    培養して、培養液中にイノシトールを蓄積せしめること
    を特徴とする請求項1記載のイノシトールの製造方法。
  3. 【請求項3】 セチルトリメチルアンモニウム塩に耐性
    を有し、かつイノシトール分泌生産能を有する微生物を
    培養して、培養液中にイノシトールを蓄積せしめ、前記
    培養液よりイノシトールを採取することを特徴とする請
    求項2記載のイノシトールの製造方法。
  4. 【請求項4】 セチルトリメチルアンモニウム塩に耐性
    を有し、かつイノシトール分泌生産能を有する微生物を
    培養して、得られた菌体、もしくはそれらの処理物を用
    い、イノシトールを生成蓄積せしめる反応を行うことを
    特徴とする請求項1記載のイノシトールの製造方法。
  5. 【請求項5】 セチルトリメチルアンモニウム塩に耐性
    を有し、かつイノシトール分泌生産能を有する微生物を
    培養して、得られた菌体、もしくはそれらの処理物を用
    い、イノシトールを生成蓄積せしめる反応を行い、前記
    反応液よりイノシトールを採取することを特徴とする請
    求項4記載のイノシトールの製造方法。
  6. 【請求項6】 セチルトリメチルアンモニウム塩がセチ
    ルトリメチルアンモニウムブロマイドであることを特徴
    とする請求項1から5のいずれか1項に記載のイノシト
    ールの製造方法。
  7. 【請求項7】 イノシトール生産能を有する微生物がキ
    ャンディダ属に属する微生物であることを特徴とする請
    求項1から6のいずれか1項に記載のイノシトールの製
    造方法。
  8. 【請求項8】 キャンディダ属に属する微生物が、キャ
    ンディダ・ボイディニイであることを特徴とする請求項
    7記載のイノシトールの製造方法。
  9. 【請求項9】 セチルトリメチルアンモニウム塩耐性で
    かつイノシトール分泌生産能を有する微生物を取得する
    方法において、炭素源としてアルコール類を用いること
    を特徴とする、セチルトリメチルアンモニウム塩に耐性
    を持つ変異株の取得法。
  10. 【請求項10】 セチルトリメチルアンモニウム塩が、
    セチルトリメチルアンモニウムブロマイドであることを
    特徴とする、請求項9記載のセチルトリメチルアンモニ
    ウム塩に耐性を持つ変異株の取得方法。
JP20478896A 1996-08-02 1996-08-02 イノシトールの製造法とセチルトリメチルアンモニウム塩に耐性を有する株の取得法 Pending JPH1042882A (ja)

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