KR20140048334A

KR20140048334A - 미오이노시톨 및 미오이노시톨 유도체의 제조 방법

Info

Publication number: KR20140048334A
Application number: KR1020147007118A
Authority: KR
Inventors: 가즈노부 고니시; 신이치 이마주; 마유미 사토
Original assignee: 아사히 가세이 케미칼즈 가부시키가이샤
Priority date: 2011-11-14
Filing date: 2012-11-09
Publication date: 2014-04-23
Also published as: JP5541758B2; EP2921558A1; KR101740848B1; US20140296497A1; WO2013073483A9; EP2781600B1; JP2014057602A; EP2781600A4; CN104805049A; JP2014176390A; EP2781600A1; KR101667121B1; EP2921558B1; WO2013073483A1; KR20150122271A; CN105647997B; US20160194667A1; JP5781669B2; TWI481719B; JPWO2013073483A1

Abstract

[과제] 유전자 재조합 기술과 합성 생물학적 수법의 적용에 적합한, 대장균 등의 내인성 미오이노시톨 생합성 경로를 갖지 않는 숙주 미생물에 대하여, 유의적으로 개선된 미오이노시톨 생산능을 부여하는 것.
[해결수단] 내인성 미오이노시톨 생합성 경로를 갖지 않는 숙주 미생물 내에 미오이노시톨 생합성 경로를 도입하여 얻어지는 형질 전환체에 있어서, 이노시톨 모노포스파타아제 활성을 강화한다.

Description

미오이노시톨 및 미오이노시톨 유도체의 제조 방법{METHOD FOR PRODUCING MYO-INOSITOL AND MYO-INOSITOL DERIVATIVE}

본 발명은, 미오이노시톨 제조에서의 유전자 재조합 기술의 응용에 관한 것이다. 특히, 원핵 미생물의 형질 전환체를 이용한 미오이노시톨의 공업적 제조 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은, 신규 미오이노시톨 유도체 및 그 제조 방법에 관한 것이다.

미오이노시톨은, 많은 고등 동물에 있어서 필요 불가결한 물질이기 때문에, 영양 식품, 사료, 의약품 등의 성분으로서 광범위하게 이용되고 있다. 예컨대, 미오이노시톨은, 지방이나 콜레스테롤류의 대사에 있어서 중요한 역할을 담당하고 있는 것이 알려져 있고, 특히 고콜레스테롤혈증 등의 예방이나 치료에 유효한 것으로 여겨지고 있다. 따라서, 미오이노시톨의 공업적 스케일에서의 제조 프로세스에 관해, 많은 개량이 제안되어 왔다.

종래, 미오이노시톨은, 쌀겨, 콘 스티프 리커(corn steep liquor) 등으로부터 직접 추출되고 있었는데, 상기 추출 방법에서는, 미오이노시톨의 수율이 낮은 데다가 불순물이 많이 생성되기 때문에, 미오이노시톨의 정제가 곤란하고, 생산 효율이 매우 낮았다. 그래서, 미오이노시톨 생산능을 갖는 빵 효모를 배양하고, 상기 배양물로부터 미오이노시톨을 생성하는 방법도 고안되었지만, 여전히 그 생산성이 낮아, 경제적으로 성립하지 않기 때문에 공업적으로 실시되고 있지는 않다.

따라서, 보다 효율적으로 이노시톨을 생산하는 미생물의 검색이 이루어졌다. 특허문헌 1은, 이노시톨을 균체 외로 분비할 수 있는 칸디다속 효모의 발견 및 그 이용을 개시하고 있다. 특허문헌 2 및 3은, 각각, 상기 칸디다속 효모에 글루코오스 대사 길항 물질 및 항생 물질에 대한 내성을 부여하는 돌연 변이를 도입하는 것을 개시하고 있다. 특허문헌 4, 5 및 6도 또한, 각각, 이노시톨 생산능을 갖는 칸디다속 효모에 대하여 3급 아민, 헥사클로로시클로헥산 및 세틸트리메틸암모늄염에 대한 내성을 부여하는 돌연 변이를 도입함으로써, 이노시톨의 수율을 향상시키는 것을 개시하고 있다. 특허문헌 7은, 동일하게 이노시톨 생산능을 갖는 칸디다속 효모에 대하여 6-할로게노-6-데옥시글루코오스에 대한 내성을 부여하는 돌연 변이를 도입하는 것을 개시하고 있다. 특허문헌 8도, 이노시톨 생산능을 갖는 칸디다속 효모에 대하여 할로겐화피루브산에 대한 내성을 부여하는 돌연 변이를 도입하는 것을 개시하고 있다.

또한 선행기술은, 유전자 재조합에 의한 효모의 형질 전환에 관해서도 기재하고 있다. 특허문헌 9는, 일련의 미오이노시톨 생합성 반응에 있어서 이노시톨-1-인산 합성 효소가 율속 반응을 담당한다는 타당한 추론하에서, 이노시톨 분비능을 갖지 않는 칸디다속 효모를 상기 이노시톨-1-인산 합성 효소 코드화 DNA의 단독에 의해 형질 전환함으로써, 상기 효모에 대하여 이노시톨 생산능을 부여할 수 있었던 것을 개시하고 있다. 특허문헌 10은, 효모에 대하여, 글리세롤-3-인산데히드로게나아제 유전자의 프로모터의 제어하에 놓여진 이노시톨-1-인산 합성 효소 코드화 DNA를 단독으로 도입함으로써, 상기 효모의 이노시톨 생산성을 향상시키는 것을 개시하고 있다.

또한 특허문헌 11도, 메탄올 자화(資化)성 효모 피키아·파스토리스(Pichia pastoris)의 이노시톨 생산에 관한 것으로, 상기 효모에 미오이노시톨-1-인산 합성 효소 유전자를 도입하는 것과 동시에 이노시톨 인산 포스파타아제 유전자를 도입하는 것을 개시하지만, 상기 추가적인 이노시톨 인산 포스파타아제 유전자 도입의 의의 및 효과는 밝혀져 있지 않다.

따라서, 상기 효모에 관한 어느 문헌도, 일련의 미오이노시톨 생합성 반응에 있어서 이노시톨-1-인산 합성 효소가 율속 반응을 담당하는 것을 전제로 하고 있고, 미오이노시톨 생합성 경로에 존재하는 그 이외의 효소의 중요성을 시사하는 곳은 없다.

한편, 대장균으로 대표되는 원핵 미생물은, 그 왕성한 증식능이나 발효 관리에서의 여러가지 우위성으로 인해, 효모에 비해 매우 매력적인 공업 생산용 생물이다. 그러나, 내인성 미오이노시톨 생합성 경로를 가진 원핵 미생물은 알려져 있지 않다.

따라서, 원핵 미생물에 의해 미오이노시톨을 공업적으로 생산시키기 위해서는, 원핵 미생물 숙주 내에 외래성의 미오이노시톨 생합성 경로를 구축하는 것이 불가결하다.

구체적으로, 원핵 미생물 숙주 내에서 기능적인 미오이노시톨 생합성 경로를 구축하기 위해서는, 다음의 촉매 활성이 필요하다 :

활성 1 : 적당한 탄소원으로부터 글루코오스-6-인산을 생성시키는 활성 ;

활성 2 : 글루코오스-6-인산을 미오이노시톨-1-인산으로 변환하는 활성, 즉, 이노시톨-1-인산 합성 효소 활성 ; 및

활성 3 : 미오이노시톨-1-인산을 기질로 한 포스파타아제 활성.

다만, 활성 1의 생성물인 글루코오스-6-인산은, 원핵 미생물이 보편적으로 생성하는 대사 중간체이기 때문에, 상기 활성을 원핵 미생물에 부여하는 것은 필수가 아니다. 또한, 활성 3에 관해서도, 본 발명자들이 아는 한, 종래의 유전자 재조합 수법에 의한 공업적 생산에 적합한 원핵 미생물 숙주 세포의 대다수는, 내인성 이노시톨 모노포스파타아제를 발현하고 있거나, 미오이노시톨-1-인산을 기질로 할 수 있는 범용 모노포스파타아제 활성을 갖고 있다. 한편, 활성 2에 관해서 보면, 원핵 미생물은 이노시톨-1-인산 합성 효소 유전자를 갖고 있지 않은 예가 많다. 또한, 상기한 바와 같이, 미오이노시톨 생합성 반응에 있어서 이노시톨-1-인산 합성 효소가 율속 반응을 담당하는 것으로 생각되고 있다. 따라서, 원핵 미생물 숙주 내에서 기능적인 미오이노시톨 생합성 경로를 구축하기 위해서는, 이노시톨-1-인산 합성 효소 유전자를 상기 세포에 도입하는 것이 필요 충분하다고 생각되어 왔다.

실제로, 비특허문헌 1은, 대장균 형질 전환체 내에서의 미오이노시톨 생산을 개시하고 있지만, 상기 형질 전환체에는 이노시톨-1-인산 합성 효소 유전자가 도입되고 있을 뿐이다.

특허문헌 12도, 대장균 숙주 세포에 이노시톨-1-인산 합성 효소 유전자만을 도입하여 형질 전환체를 제작하고, 그것에 의해 상기 형질 전환체 내에 외래성 미오이노시톨 생합성 경로를 구축하는 것을 개시하고 있다. 다만, 상기 문헌이 목적으로 하는 최종 생성물은 D-글루카르산이고, 미오이노시톨은 중간체로서 생산된다. 특별히 기재해야 할 것은, 상기 문헌도, 「우리가 suhB 유전자 또는 상동의 포스파타아제를 과잉 발현시키지 않은 것도 또한 주목해야 한다. 그러나, 배양 산물 중에 미오이노시톨-1-인산은 검출되지 않고, 한편, 미오이노시톨은 축적되었다. 따라서, 우리는, 포스파타아제 활성은, 경로를 통과하는 대사의 흐름(flux)을 제한하지 않는다고 결론지었다.」(33페이지, 2∼5행)고 기재하고 있다.

따라서, 선행기술은, 재조합 미생물에 의한 미오이노시톨 생산에서의 이노시톨 모노포스파타아제의 결정적인 역할을 개시도 시사도 하고 있지 않다.

특허문헌 1 : 일본 특허 공개 평8-00258호 공보 특허문헌 2 : 일본 특허 공개 평8-38188호 공보 특허문헌 3 : 일본 특허 공개 평8-89262호 공보 특허문헌 4 : 일본 특허 공개 평9-117295호 공보 특허문헌 5 : 일본 특허 공개 평10-42860호 공보 특허문헌 6 : 일본 특허 공개 평10-42882호 공보 특허문헌 7 : 일본 특허 공개 평10-42883호 공보 특허문헌 8 : 일본 특허 공개 제2000-41689호 공보 특허문헌 9 : 일본 특허 공개 평9-220093호 공보 특허문헌 10 : 일본 특허 공개 평10-271995호 공보 특허문헌 11 : 일본 특허 공개 제2011-55722호 공보 특허문헌 12 : WO2009/145838호 팜플렛

비특허문헌 1 : J. Am. Chem. Soc. 1999, Vol.121, 3799-3800

내인성 미오이노시톨 생합성 경로를 갖지 않는 미생물은, 유전자 재조합 기술과 연계한 합성 생물학적 수법을 이용함으로써, 미오이노시톨 생산성을 제어하기 쉽다는 이점을 갖는다. 특히 대장균 등의 원핵 미생물 숙주는, 내인성 미오이노시톨 생합성 경로를 갖지 않는 것에 더하여, 많은 효모가 갖고 있는 이노시톨 자화능(분해능)도 갖지 않기 때문에, 합성 생물학적 수법의 적용을 한층 더 용이하게 한다. 또한, 대장균은, 그 신속한 생육 능력이나 발효 관리의 용이함 고로 공업적 발효 생산의 관점에서 매우 매력적임과 동시에, 유전자 재조합 기술의 적용에서의 실적, 확립된 안전성의 관점에서도 이점을 갖는다.

따라서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 내인성 미오이노시톨 생합성 경로를 갖지 않는 숙주 미생물에 대하여, 유의적으로 개선된 미오이노시톨 및 관련되는 유도체의 생산능을 부여하는 것이다.

상기한 바와 같이, 지금까지의 어느 연구도, 미오이노시톨 생합성 반응에 있어서 이노시톨-1-인산 합성 효소가 율속 반응을 담당하는 것을 시사해 왔다. 또한 어느 연구도, 이노시톨 모노포스파타아제 활성에 특별한 주의를 기울이는 경우는 없었다.

그러나 놀랍게도, 본 발명자들은, 내인성 미오이노시톨 생합성 경로를 갖지 않는 숙주 미생물 내에 미오이노시톨 생합성 경로를 도입하여 얻어지는 형질 전환체에서는, 이노시톨 모노포스파타아제 활성이 중대한 역할을 갖는 것을 발견했다. 예기치 않게, 이노시톨 모노포스파타아제 활성을 강화함으로써, 그와 같은 형질 전환체의 미오이노시톨 생산능이 대폭 향상되었다. 또한 본 발명자들은, 그와 같은 형질 전환체의 배양물 중에 신규한 미오이노시톨 유도체를 발견했다.

따라서, 본 발명의 제1 국면은 :

(1) 미오이노시톨 또는 미오이노시톨 유도체의 제조 방법으로서, 이하의 공정 :

1) 내인성 이노시톨-1-인산 합성 효소를 발현하지 않는 미생물의 형질 전환체로서, 적어도 상기 형질 전환체 내에 발현 가능하게 도입된 이노시톨-1-인산 합성 효소를 코드하는 외래 유전자를 포함하며, 또한 상기 형질 전환체 내에서의 기능적인 이노시톨 모노포스파타아제의 과잉 생산 또는 이노시톨 모노포스파타아제의 활성화를 유도하는 유전자 재조합 또는 변이를 갖는 상기 형질 전환체를 준비하는 공정 ; 및

2) 상기 형질 전환체의 생육 및/또는 유지에 적합한 조건하에서, 상기 형질 전환체와 상기 형질 전환체에 의해 미오이노시톨로 변환될 수 있는 탄소원을 접촉시키는 공정을 포함하는, 상기 제조 방법이다.

보다 특정적으로는, 내인성 이노시톨-1-인산 합성 효소를 발현하지 않는 미생물 내에 발현 가능하게 도입된 이노시톨-1-인산 합성 효소를 코드하는 외래 유전자를 갖는 형질 전환체를 이용한 미오이노시톨 또는 미오이노시톨 유도체의 제조 방법에 있어서, 상기 형질 전환체가, 기능적인 이노시톨 모노포스파타아제의 과잉 생산 또는 이노시톨 모노포스파타아제의 활성화를 유도하는 유전자 재조합 또는 변이를 갖는 형질 전환체인 것을 특징으로 하는, 상기 제조 방법이다.

상기 (1)의 배양물 중에 생산된 미오이노시톨 유도체는 신규 화합물이고, 상기 유도체에서는 글루코오스와 미오이노시톨이 β1→4 결합되어 있었다. 따라서, 본 발명의 일 양태는 :

(2) 상기 미오이노시톨 유도체가, 하기 구조식 :

로 표시되는 화합물인, 상기 (1)에 기재된 제조 방법이다.

합성 생물학적 수법의 적용 및 발효 생산에서의 원핵 미생물, 특히 대장균의 이점은 이미 서술했다. 따라서, 본 발명의 적합한 양태는 :

(3) 상기 내인성 이노시톨-1-인산 합성 효소를 발현하지 않는 미생물이 원핵 생물인, 상기 (1) 또는 (2)에 기재된 제조 방법 ;

(4) 상기 내인성 이노시톨-1-인산 합성 효소를 발현하지 않는 미생물이, 내인성 이노시톨 모노포스파타아제 유전자를 갖는 미생물인, 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 제조 방법 ;

(5) 상기 내인성 이노시톨-1-인산 합성 효소를 발현하지 않는 미생물이, 대장균, 바실루스속 세균, 코리네박테리움속 세균, 자이모모나스속 세균으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 세균인, 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 제조 방법 ; 및

(6) 상기 세균이 대장균인, 상기 (5)에 기재된 제조 방법을 포함한다.

숙주 미생물이 내인성 이노시톨 모노포스파타아제 활성을 갖고 있는지의 여부에 상관없이, 상기 세포 내에서 이노시톨 모노포스파타아제를 과잉 생산시킴으로써, 상기 세포의 이노시톨 모노포스파타아제 활성을 강화할 수 있다. 여러 공지된 기술을 적용하여 세포에 이노시톨 모노포스파타아제를 과잉 생산시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 이하의 양태 :

(7) 상기 이노시톨 모노포스파타아제의 과잉 생산이, 상기 미생물에 대하여,

a) 외래 이노시톨 모노포스파타아제 유전자를 도입하는 것,

b) 내인성 이노시톨 모노포스파타아제 유전자의 카피수를 증가시키는 것,

c) 내인성 이노시톨 모노포스파타아제 유전자의 조정 영역에 변이를 도입하는 것,

d) 내인성 이노시톨 모노포스파타아제 유전자의 조정 영역을 고발현 유도성외래 조정 영역으로 치환하는 것, 또는

e) 내인성 이노시톨 모노포스파타아제 유전자의 조정 영역을 결실시키는 것에 의해 유도되는, 상기 (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 기재된 제조 방법 ; 및

(8) 상기 이노시톨 모노포스파타아제의 과잉 생산이, 상기 미생물에 대하여 외래 이노시톨 모노포스파타아제 유전자를 도입하는 것에 의해 유도되는, 상기 (7)에 기재된 제조 방법을 포함한다.

또한, 숙주 세포가 내인성 이노시톨 모노포스파타아제 유전자를 갖고 있는 경우에는, 이하의 양태에 의해서도 상기 세포의 이노시톨 모노포스파타아제 활성을 강화할 수 있다.

(9) 상기 이노시톨 모노포스파타아제의 활성화가, 상기 미생물에 대하여,

f) 내인성 이노시톨 모노포스파타아제 유전자에 변이를 도입하는 것,

g) 내인성 이노시톨 모노포스파타아제 유전자의 일부 또는 전부를 치환하는 것,

h) 내인성 이노시톨 모노포스파타아제 유전자의 일부를 결실시키는 것,

i) 이노시톨 모노포스파타아제 활성을 저하시키는 다른 단백질을 감소시키는 것, 또는

j) 이노시톨 모노포스파타아제 활성을 저하시키는 화합물의 생성을 감소시키는 것에 의해 유도되는, 상기 (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.

본 발명의 미오이노시톨의 발효 생산에 있어서는, 이노시톨-1-인산 합성 효소의 기질인 글루코오스-6-인산의 생성에 적합한 화합물을 포함한 탄소원을 배양 기재로서 이용하는 것이 적합하다. 또한 본 발명의 제조 방법은, 상기 탄소원과의 접촉하에 생육 및/또는 유지된 상기 형질 전환체의 배양물로부터 미오이노시톨 또는 미오이노시톨 유도체를 분리하는 추가의 공정을 포함해도 좋다. 따라서, 본 발명의 더욱 적합한 양태는 :

(10) 상기 탄소원이, 상기 형질 전환체 내에서 글루코오스-6-인산으로 변환될 수 있는 화합물을 포함하는 상기 (1) 내지 (9) 중 어느 하나에 기재된 제조 방법 ;

(11) 상기 탄소원이, D-글루코오스, 수크로오스, 올리고당, 다당, 전분, 셀룰로오스, 쌀겨，폐당밀, 및 D-글루코오스를 함유하는 바이오매스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 상기 (10)에 기재된 제조 방법 ; 및

(12) 상기 탄소원과의 접촉하에 생육 및/또는 유지된 상기 형질 전환체의 배양물 중에 축적된 미오이노시톨 또는 미오이노시톨 유도체를 분리하는 공정을 더 포함하는, 상기 (1) 내지 (11) 중 어느 하나에 기재된 제조 방법을 포함한다.

또한 본 발명은, 상기 미오이노시톨의 제조 방법에 이용하기 위한 형질 전환체도 의도한다. 따라서, 본 발명의 제2 국면은 :

(13) 내인성 이노시톨-1-인산 합성 효소를 발현하지 않는 미생물의 형질 전환체로서, 적어도 상기 형질 전환체 내에 발현 가능하게 도입된 이노시톨-1-인산 합성 효소를 코드하는 외래 유전자를 포함하며, 또한 상기 형질 전환체 내에서의 기능적인 이노시톨 모노포스파타아제의 과잉 생산 또는 이노시톨 모노포스파타아제의 활성화를 유도하는 유전자 재조합 또는 변이를 갖는 상기 형질 전환체이다.

보다 특정적으로는, 내인성 이노시톨-1-인산 합성 효소를 발현하지 않는 미생물 내에 발현 가능하게 도입된 이노시톨-1-인산 합성 효소를 코드하는 외래 유전자를 갖는 형질 전환체에 있어서, 기능적인 이노시톨 모노포스파타아제의 과잉 생산 또는 이노시톨 모노포스파타아제의 활성화를 유도하는 유전자 재조합 또는 변이를 갖는 것을 특징으로 하는, 상기 형질 전환체이다.

또한, 본 발명의 제1 국면에 있어서 기재한 양태는, 본 발명의 제2 국면에 있어서도 적용된다. 이들 양태는 :

(14) 상기 내인성 이노시톨-1-인산 합성 효소를 발현하지 않는 미생물이 원핵 생물인, 상기 (13)에 기재된 형질 전환체 ;

(15) 상기 내인성 이노시톨-1-인산 합성 효소를 발현하지 않는 미생물이, 내인성 이노시톨 모노포스파타아제 유전자를 갖는 미생물인, 상기 (13) 또는 (14)에 기재된 형질 전환체 ;

(16) 상기 내인성 이노시톨-1-인산 합성 효소를 발현하지 않는 미생물이, 대장균, 바실루스속 세균, 코리네박테리움속 세균, 자이모모나스속 세균으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 세균인, 상기 (13) 내지 (15) 중 어느 하나에 기재된 형질 전환체 ;

(17) 상기 세균이 대장균인, 상기 (16)에 기재된 형질 전환체 ;

(18) 상기 이노시톨 모노포스파타아제의 과잉 생산이, 상기 미생물에 대하여,

a) 외래 이노시톨 모노포스파타아제 유전자를 도입하는 것,

d) 내인성 이노시톨 모노포스파타아제 유전자의 조정 영역을 고발현 유도성 외래 조정 영역으로 치환하는 것, 또는

e) 내인성 이노시톨 모노포스파타아제 유전자의 조정 영역을 결실시키는 것

에 의해 유도되는, 상기 (13) 내지 (17) 중 어느 하나에 기재된 형질 전환체 ;

(19) 상기 이노시톨 모노포스파타아제의 과잉 생산이, 상기 미생물에 대하여 외래 이노시톨 모노포스파타아제 유전자를 도입하는 것에 의해 유도되는, 상기 (18)에 기재된 형질 전환체 ; 및

(20) 상기 이노시톨 모노포스파타아제의 활성화가, 상기 미생물에 대하여,

i) 이노시톨 모노포스파타아제 활성을 저하시키는 다른 단백질을 감소시키는 것,

j) 이노시톨 모노포스파타아제 활성을 저하시키는 화합물의 생성을 감소시키는 것

에 의해 유도되는, 상기 (13) 내지 (17) 중 어느 하나에 기재된 형질 전환체를 포함한다.

본 발명의 제3 국면은, 상기 형질 전환체의 배양물 중에 생산되는 것이 발견된, 신규 미오이노시톨 유도체이다. 따라서, 본 발명은 :

(21) 하기 구조식 :

로 표시되는 화합물이다.

또한, 본 발명의 신규 미오이노시톨 유도체는, β-글리코시드 결합을 가수 분해하는 반응을 촉매할 수 있는 효소(EC 3. 2. 1. 21 등)에 의해, 용이하게 글루코오스와 미오이노시톨로 분해되는 것도 확인되었다. 상기 효소 분해는, 상기 (1)에서 얻어진 배양물을 상기 효소로 직접 처리하는 것, 상기 배양물의 조(粗)정제물을 상기 효소로 처리하는 것, 혹은 단리한 본 발명의 미오이노시톨 유도체를 상기 효소로 처리하는 것 중 어느 것에 의해서도 달성할 수 있다. 따라서, 본 발명의 제4 국면은 :

(22) 미오이노시톨의 제조 방법으로서, 상기 (21)의 미오이노시톨 유도체를, β-글리코시드 결합을 가수 분해하는 반응을 촉매할 수 있는 효소에 의해 분해하여, 미오이노시톨을 생성시키는 것을 특징으로 하는, 상기 방법이다.

또한 본 발명은, 본 발명의 신규 미오이노시톨 유도체를 포함하는 조성물을 의도한다. 예컨대, 미오이노시톨은, 영양 식품, 사료, 의약품 등의 성분으로서 광범위하게 이용되고 있다. 그러나, 환경 중에는, 미오이노시톨을 자화하는, 효모, 바실루스속 세균 및 장내 세균 등이 존재한다. 따라서, 미오이노시톨을 영양 식품, 사료, 의약품 등을 위한 조성물로서 이용할 때에는, 미오이노시톨이, 그 생리적 작용을 발휘하는 것이 요구될 때까지, 상기한 미오이노시톨 자화성 세균 등으로부터 보호되는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 제5 국면은 :

(23) 상기 (21)의 미오이노시톨 유도체를 포함하는 조성물이다.

본 발명에 의하면, 미생물 배양 기술에 의한 공업적 미오이노시톨 생산의 효율화를 달성할 수 있다. 또한, 본 발명에서는 신규한 미오이노시톨 유도체가 제공된다. 본 발명의 신규한 미오이노시톨 유도체는 용이하게 미오이노시톨로 변환되지만, 미오이노시톨을 자화하는 미생물 등에 대하여 저항성이다.

도 1은 INO1 유전자의 코드 영역을 나타낸다(서열 번호 1).
도 2는 suhB 유전자의 코드 영역을 나타낸다(서열 번호 3).
도 3은 본 발명의 미오이노시톨 유도체의 생산예를 도시한다. 도면 중, 화살표는, 본 발명의 미오이노시톨 유도체를 포함하는 분획을 나타낸다. KS-G(가드 컬럼), Sugar KS-801 및 Sugar KS-802(모두 상품명, 쇼와 덴꼬 주식회사 제조)를 연결한 HPLC(이동상: 물, 컬럼 온도: 70℃, 유속: 1 mL/min, 검출기: RI)로 분석한 결과이다.
도 4는 본 발명의 미오이노시톨 유도체의 ¹H-NMR 스펙트럼이다.
도 5는 본 발명의 미오이노시톨 유도체의 ¹³C-NMR 스펙트럼이다.
도 6은 본 발명의 미오이노시톨 유도체의 β-글루코시다아제에 의한 분해의 예를 도시한다. Shodex Asahipak NH₂P-50 4E(상품명, 쇼와 덴꼬 주식회사 제조)를 이용한 HPLC(이동상: 물/아세토니트릴=25/75, 컬럼 온도: 40℃, 유속: 0.8 mL/min, 검출기: RI)에 의한 분석 결과이다.

본 발명의 과제는, 내인성 미오이노시톨 생합성 경로를 갖지 않는 숙주 미생물 내에 미오이노시톨 생합성 경로를 도입하여 얻어지는 형질 전환체 중에서, 즉, 내인성 이노시톨-1-인산 합성 효소를 발현하지 않는 숙주 미생물에 상기 효소의 외래 유전자를 도입한 형질 전환체 중에서, 이노시톨 모노포스파타아제 활성을 강화함으로써 해결된다. 또, 본 명세서에 있어서, 「외래」 내지 「외래성」이라는 용어는, 형질 전환 전의 숙주 미생물이, 본 발명에 의해 도입되어야 할 유전자를 갖고 있지 않은 경우, 그 유전자에 의해 코드되는 효소를 실질적으로 발현하지 않는 경우, 및 상이한 유전자에 의해 상기 효소의 아미노산 서열을 코드하고 있지만, 형질 전환 후에 필적할 내인성 효소 활성을 발현하지 않는 경우에 있어서, 본 발명에 기초하는 유전자 내지 핵산 서열을 숙주에 도입하는 것을 의미하기 위해 이용된다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 숙주 미생물의 「내인성 이노시톨-1-인산 합성 효소를 발현하지 않는다」라는 특성은, 상기 숙주 세포 내에 미오이노시톨 생합성 경로를 새롭게 구축(즉, 기존의 내인성 경로의 영향이 없음)하는 것을 가능하게 하기 때문에, 합성 생물학적 수법의 적용에 있어서 매우 매력적이다. 예시되는 원핵 미생물은 : 에셰리키아, 슈도모나스, 바실루스, 지오바실루스, 메타노모나스, 메틸로바실루스, 메틸로필루스, 프로타미노박터, 메틸로코쿠스, 코리네박테리움, 브레비박테리움, 자이모모나스 및 리스테리아속의 세균이다. 공업적 발효 생산에 있어서 적합한 원핵 미생물의 비한정적인 예시는, 대장균, 바실루스속 세균, 코리네박테리움속 세균, 자이모모나스속 세균을 포함한다. 대장균은, 그 신속한 생육 능력이나 발효 관리의 용이함 고로 특히 바람직한 본 발명의 숙주 미생물의 예이다.

또한, 본 발명의 숙주 세포로서 이용할 수 있는 세포주는, 통상적 의미에서의 야생형이어도 좋고, 혹은, 영양 요구성 변이주, 항생 물질 내성 변이주여도 좋다. 또한, 본 발명의 숙주 세포로서 이용할 수 있는 세포주는, 상기와 같은 변이에 관한 각종 마커 유전자를 갖도록 이미 형질 전환되어 있어도 좋다. 이들의 변이나 유전자는, 본 발명 형질 전환체의 제작·유지·관리에 유익한 성질을 제공할 수 있다. 바람직하게는, 클로람페니콜, 암피실린, 카나마이신, 테트라사이클린 등의 항생 물질에 내성을 나타내는 주를 이용함으로써, 본 발명의 미오이노시톨 및 미오이노시톨 유도체의 생산을 간편하게 행할 수 있다.

합성 생물학을 지향하는 본 발명에 있어서는, 숙주 세포에 있어서 새로운 미오이노시톨 생합성 경로를 구축하기 위해, 상기한 내인성 이노시톨-1-인산 합성 효소를 발현하지 않는 숙주 미생물에 대하여 외래 이노시톨-1-인산 합성 효소 유전자를 도입한다. 이노시톨-1-인산 합성 효소 유전자는 공지되어 있고(예컨대, GenBank Accession Nos. AB032073, AF056325, AF071103, AF078915, AF120146, AF207640, AF284065, BC111160, L23520, U32511), 그 어느 것이나 본 발명의 목적에 사용할 수 있다. 특히, 효모 유래의 INO1 유전자(서열 번호 1)는, 잘 알려져 있는 이노시톨-1-인산 합성 효소 유전자의 예이고, 본 발명에 있어서도 적합하게 사용할 수 있다. 다만, 본 발명에 이용할 수 있는 이노시톨-1-인산 합성 효소 유전자는 효모 유래의 것에 한정되지 않고, 다른 진핵 미생물이나 그 이외의 생물에서 유래되는 것이어도, 혹은 인공적으로 합성한 것이어도, 상기 숙주 미생물 세포 내에서 실질적인 이노시톨-1-인산 합성 효소 활성을 발현할 수 있는 것이면 된다.

따라서 또한, 본 발명의 목적에 이용할 수 있는 이노시톨-1-인산 합성 효소 유전자는, 상기 숙주 미생물 세포 내에서 실질적인 이노시톨-1-인산 합성 효소 활성을 발현할 수 있는 것이면, 자연계에서 발생할 수 있는 모든 변이나, 인공적으로 도입된 변이 및 수식을 갖고 있어도 좋다. 예컨대, 특정한 아미노산을 코드하는 여러가지 코돈에는 여분의 코돈(redundancy)이 존재하는 것이 알려져 있다. 그 때문에 본 발명에 있어서도 동일한 아미노산으로 최종적으로 번역되게 되는 대체 코돈을 이용해도 좋다. 즉, 유전자 코드는 축중(縮重)하고 있기 때문에, 어느 특정한 아미노산을 코드하는 데 복수의 코돈을 사용할 수 있고, 그 때문에 아미노산 서열은 임의의 1세트의 유사한 DNA 올리고뉴클레오티드로 코드될 수 있다. 그 세트의 유일한 멤버만이 천연형 효소의 유전자 서열과 동일하지만, 미스매치의 어느 DNA 올리고뉴클레오티드조차도 적절한 긴축 조건하(예컨대, 3×SSC, 68℃에서 하이브리다이즈하고, 2×SSC, 0.1% SDS 및 68℃에서 세정)에서 천연형 서열에 하이브리다이즈할 수 있고, 천연형 서열을 코드하는 DNA를 동정, 단리할 수 있고, 또한 그와 같은 유전자도 본 발명에 있어서 이용할 수 있다. 특히, 대부분의 생물은 특정한 코돈(최적 코돈)의 서브세트를 우선적으로 이용하는 것이 알려져 있기 때문에(Gene, Vol.105, pp.61-72, 1991 등), 숙주 미생물에 따라 「코돈 최적화」를 행하는 것은 본 발명에 있어서도 유용할 수 있다.

그리고, 본 발명에 있어서도, 이노시톨-1-인산 합성 효소 유전자가 「발현 카세트」로서 숙주 미생물 세포 내에 도입됨으로써, 보다 안정적이고 고레벨의 이노시톨-1-인산 합성 효소 활성이 얻어지는 것을 당업자는 이해할 것이다. 본 명세서에 있어서 「발현 카세트」란, 발현 대상의 핵산 또는 발현 대상의 유전자에 기능적으로 결합된 전사 및 번역을 레귤레이트하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오티드를 의미한다. 전형적으로, 본 발명의 발현 카세트는, 코드 서열로부터 5' 상류에 프로모터 서열, 3' 하류에 터미네이터 서열, 경우에 따라 추가적인 통상의 조절 엘리먼트를 기능적으로 결합된 상태에서 포함하고, 그와 같은 경우에, 발현 대상의 핵산 또는 발현 대상의 유전자가 숙주 미생물에 「발현 가능하게 도입」된다.

프로모터는, 구조성 프로모터인지 조절 프로모터인지에 구애되지 않고, RNA 폴리머라아제를 DNA에 결합시키고, RNA 합성을 개시시키는 DNA 서열로 정의된다. 강한 프로모터란 mRNA 합성을 고빈도로 개시시키는 프로모터로, 본 발명에 있어서도 적합하게 사용된다. lac계, trp계, TAC 또는 TRC계, λ파지의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코트 단백질의 제어 영역, 해당계 효소(예컨대, 3-포스포글리세레이트키나아제, 글리세르알데히드-3-인산 탈수소 효소), 글루타민산 데카르복실라아제 A, 세린히드록시메틸트랜스퍼라아제에 대한 프로모터 등이, 그 숙주 세포의 성질 등에 따라 이용 가능하다. 프로모터 및 터미네이터 서열 외에, 다른 조절 엘리먼트의 예로서 들 수 있는 것은, 선택 마커, 증폭 시그널, 복제 기점 등이다. 적합한 조절 서열에 관해서는, 예컨대, "Gene Expression Technology : Methods in Enzymology 185", Academic Press(1990)에 기재되어 있다.

상기에서 설명한 발현 카세트는, 예컨대, 플라스미드, 파지, 트랜스포존, IS 엘리먼트, 파스미드, 코스미드, 또는 선형 혹은 고리형의 DNA 등으로 이루어지는 벡터에 도입되고, 숙주 미생물 중에 삽입된다. 플라스미드 및 파지가 바람직하다. 이들 벡터는, 숙주 미생물 중에서 자율 복제되는 것이어도 좋고, 또한 염색체에 의해 복제되어도 좋다. 적합한 플라스미드는, 예컨대, 대장균의 pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III113-B1, λgt11 또는 pBdCI; 간균의 pUB110, pC194 또는 pBD214; 코리네박테리움속의 pSA77 또는 pAJ667 등이다. 이들 외에도 사용 가능한 플라스미드 등은, "Cloning Vectors", Elsevier, 1985에 기재되어 있다. 벡터로의 발현 카세트의 도입은, 적당한 제한 효소에 의한 절단, 클로닝, 및 라이게이션을 포함하는 관용의 방법에 의해 가능하다.

상기와 같이 하여 본 발명의 발현 카세트를 갖는 벡터가 구축된 후, 상기 벡터를 숙주 미생물에 도입할 때에 적용할 수 있는 수법으로서, 예컨대, 공침, 프로토플라스트 융합, 일렉트로포레이션, 레트로바이러스 트랜스펙션 등의 관용의 클로닝법 및 트랜스펙션법이 사용된다. 이들의 예는, 「분자 생물학의 최신 프로토콜(Current Protocols in Molecular Biology)」, F. Ausubel 등, Publ. Wiley Interscience, New York, 1997, 또는 Sambrook 등, 「분자 클로닝 : 실험실 매뉴얼」, 제2판, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989에 기재되어 있다.

놀랍게도, 본 발명자들은, 내인성 미오이노시톨 생합성 경로를 갖지 않는 숙주 미생물 내에 미오이노시톨 생합성 경로를 도입하여 얻어지는 형질 전환체에서는, 이노시톨 모노포스파타아제 활성이 중대한 역할을 갖는 것을 발견했다. 상기한 바와 같이, 지금까지의 어느 연구도, 이노시톨 모노포스파타아제 활성에 특별한 주의를 기울이는 경우는 없었다. 그러나, 예기치 않게, 이노시톨 모노포스파타아제 활성을 강화함으로써, 그와 같은 형질 전환체의 미오이노시톨 생산능이 대폭 향상되었다. 또한, 그와 같은 형질 전환체는, 실질적인 양으로 본 발명의 미오이노시톨 유도체를 생산하고 있었다.

따라서, 본 발명의 일양태는, 상기한 이노시톨-1-인산 합성 효소를 코드하는 외래 유전자에 의해 형질 전환된 숙주 미생물 세포에 있어서, 이노시톨 모노포스파타아제를 과잉 생산시키는 것을 포함한다.

본 발명에서 의도되는 이노시톨 모노포스파타아제란, 이노시톨-1-인산에 대하여 높은 기질 특이성을 나타내는 것 외에도, 광범위한 기질에 대하여 작용할 수 있는 인산모노에스테르 가수 분해 효소 활성을 나타냄으로써, 이노시톨-1-인산을 실질적으로 가수 분해화할 수 있는 단백질을 포함한다. 전형적인 이노시톨 모노포스파타아제로는, 예컨대, 이노시톨-1-모노포스파타아제가 알려져 있고, 많은 생물 유래의 상기 유전자(suhB 유전자)는 GenBank Accession Nos. ZP_04619988, YP_001451848 등에서 공표되어 있다. 특히, 대장균 유래의 suhB 유전자(서열 번호 3 : AAC75586(MG1655))의 사용은, 대장균을 숙주 세포로 하는 경우에 편리하다.

이노시톨-1-인산 합성 효소 유전자에 관해 기재한, 변이나 수식 및 코돈 최적화, 및 발현 카세트, 프로모터 등의 레귤레이터 서열 및 플라스미드 등과 그것에 의한 형질 전환의 설명은, 전부 본 발명의 이노시톨 모노포스파타아제 유전자에 관해 적용되는 것을 당업자는 용이하게 이해할 것이다. 따라서, 본 발명에서의 이노시톨 모노포스파타아제의 과잉 생산은, 외래 이노시톨 모노포스파타아제 유전자의 발현 카세트에 의해 상기 숙주 미생물을 형질 전환함으로써 달성할 수 있는 것도 분명하다.

그리고 또한, 많은 미생물 세포는 본 발명에서 의도되는 이노시톨 모노포스파타아제 활성을 발현하고 있는(즉, 이노시톨 모노포스파타아제 활성을 코드하는 내인성 유전자를 갖고 있는) 것으로 생각된다. 따라서, 본 발명에서의 이노시톨 모노포스파타아제의 과잉 생산은, 내인성 이노시톨 모노포스파타아제 유전자의 카피수를 증가시키는 것 ; 내인성 이노시톨 모노포스파타아제 유전자의 조정 영역에 변이를 도입하는 것 ; 내인성 이노시톨 모노포스파타아제 유전자의 조정 영역을 고발현 유도성 외래 조정 영역으로 치환하는 것 ; 및 내인성 이노시톨 모노포스파타아제 유전자의 조정 영역을 결실시키는 것에 의해서도 유도할 수 있다. 구체적으로 이노시톨 모노포스파타아제의 과잉 발현을 달성하기 위해서는, 내인성 이노시톨 모노포스파타아제 유전자를 포함하거나, 혹은 상기 내인성 유전자의 코드화 영역에 적합한 조정 영역을 부가한 발현 카세트를 포함하는 구축물에 의해 상기 숙주 미생물을 형질 전환하고, 상기 형질 전환체 내에서의 상기 이노시톨 모노포스파타아제 유전자의 카피수를 원래의 숙주 세포에 비해 실질적으로 증가시키거나, 내인성 이노시톨 모노포스파타아제 유전자를 갖는 원래의 숙주 세포에 관해, 염색체의 변이, 부가 및 결실을 공지된 유전자 재조합 기술에 의해 실시하거나, 혹은, 변이제 등을 이용하여 염색체에 랜덤으로 변이 도입을 행함으로써 달성할 수 있다. 이노시톨 모노포스파타아제의 과잉 생산의 확인에는, 공지된 SDS-PAGE 분석법 등을 이용할 수 있다.

또한, 이노시톨 모노포스파타아제 활성을 강화하기 위한 본 발명의 다른 양태는, 상기한 이노시톨-1-인산 합성 효소를 코드하는 외래 유전자에 의해 형질 전환된 숙주 미생물 세포에 있어서, 이노시톨 모노포스파타아제의 활성화를 유도하는 것을 포함한다. 그 목적을 위해, 1) 내인성 이노시톨 모노포스파타아제 유전자에 변이를 도입하는 것, 2) 내인성 이노시톨 모노포스파타아제 유전자의 일부 또는 전부를 치환하는 것, 3) 내인성 이노시톨 모노포스파타아제 유전자의 일부를 결실시키는 것, 4) 이노시톨 모노포스파타아제 활성을 저하시키는 다른 단백질을 감소시키는 것, 및/또는 5) 이노시톨 모노포스파타아제 활성을 저하시키는 화합물의 생성을 감소시키는 것과 같은 수법을 예시할 수 있다.

상기 이노시톨 모노포스파타아제 활성을 강화하기 위한 1)∼5)의 수법에 관해, 구체적으로는, 이노시톨 모노포스파타아제의 유전자에 변이, 부가 혹은 결실을 실시한 후에 상기 유전자를 코드하는 이노시톨 모노포스파타아제의 활성을 평가함으로써, 이노시톨 모노포스파타아제 활성이 강화된 이노시톨 모노포스파타아제를 얻을 수 있다.

상기한 바와 같이 하여 얻어지는 형질 전환체, 예컨대, 외래 이노시톨-1-인산 합성 효소 유전자의 발현 카세트 및 이노시톨 모노포스파타아제 유전자의 발현 카세트를 갖는 벡터(각각의 발현 카세트는, 별개의 또는 동일한 벡터 상에 배치되어도 좋음)에 의해 트랜스펙트된 형질 전환체는, 본 발명의 미오이노시톨 및 미오이노시톨 유도체 생산을 위해, 상기 형질 전환체의 생육 및/또는 유지에 적합한 조건하에서 배양 및 유지된다. 각종 숙주 미생물 세포에서 유래되는 형질 전환체를 위한 적합한 배지 조성, 배양 조건, 배양 시간은 당업자에게 공지되어 있다.

배지는, 하나 이상의 탄소원, 질소원, 무기염, 비타민, 및 경우에 따라 미량 원소 내지 비타민 등의 미량 성분을 포함하는 천연, 반합성, 합성 배지여도 좋다. 그러나, 사용하는 배지는, 배양해야 할 형질 전환체의 영양 요구를 적절히 만족시켜야 하는 것은 물론이다. 또한, 상기 형질 전환체와 상기 형질 전환체에 의해 미오이노시톨 및 미오이노시톨 유도체로 변환될 수 있는 탄소원을 접촉시키기 위해, 본 발명의 배지는, 궁극적으로 미오이노시톨 생산의 기질로서 이용 가능한 탄소원, 즉 형질 전환체 내에서 글루코오스-6-인산으로 변환될 수 있는 화합물을 함유해야 한다. 탄소원은, D-글루코오스, 수크로오스, 올리고당, 다당, 전분, 셀룰로오스, 쌀겨，폐당밀일 수 있고, 또한 D-글루코오스를 함유하는 바이오매스일 수 있다. 적합한 바이오매스로는, 옥수수 분해액이나 셀룰로오스 분해액을 예시할 수 있다. 또한 배지는, 형질 전환체가 유용한 부가적 형질을 발현하는 경우, 예컨대 항생 물질에 대한 내성 마커를 갖는 경우, 대응하는 항생 물질을 포함하고 있어도 좋다. 이에 따라, 발효중의 잡균에 의한 오염 리스크가 저감된다.

상기, 셀룰로오스나 다당류 등의 탄소원을 숙주 미생물이 자화할 수 없는 경우에는, 상기 숙주 미생물에 외래 유전자를 도입하는 등의 공지된 유전자 공학적 수법을 실시함으로써, 이들 탄소원을 사용한 미오이노시톨 생산에 적응시킬 수 있다. 외래 유전자로는, 예컨대, 셀룰라아제 유전자나 아밀라아제 유전자 등을 들 수 있다.

배양은, 배치식이어도 좋고 연속식이어도 좋다. 또한, 어느 경우에도, 배양의 적절한 시점에서 추가의 상기 탄소원 등을 보급하는 형식이어도 상관없다. 또한 배양은, 적합한 온도, 산소 농도, pH 등을 유지하면서 계속되어야 한다. 일반적인 미생물 숙주 세포에서 유래되는 형질 전환체의 적합한 배양 온도는, 통상 15℃∼45℃, 바람직하게는 25℃∼37℃의 범위이다. 숙주 미생물이 호기성인 경우, 발효중의 적절한 산소 농도를 확보하기 위해 진탕(플라스크 배양 등), 교반/통기(자·퍼멘터 배양 등)를 행할 필요가 있다. 이들 배양 조건은, 당업자에 있어서 용이하게 설정 가능하다.

상기한 배양물로부터 미오이노시톨을 정제하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 원핵 미생물 숙주 세포의 형질 전환체의 경우, 미오이노시톨은 배양 상청 중 또는 균체 내에 존재하는데, 필요하면 배양 균체로부터 추출해도 좋다. 배양 균체로부터 추출하는 경우, 예컨대, 배양물을 원심 분리하여 상청과 균체를 분리하고, 호모게나이저를 이용하면서, 계면 활성제, 유기 용매, 효소 등에 의해 균체를 파괴할 수 있다. 배양 상청, 및 경우에 따라 균체 추출액으로부터도 미오이노시톨을 정제하는 방법으로는, pH 조정 등에 의한 단백질 침전을 이용한 제(除)단백 처리, 활성탄을 이용한 불순물의 흡착에 의한 제거, 이온 교환 수지 등을 이용한 이온성 물질의 흡착에 의한 제거를 실시한 후에, 건조시켜 얻어진 고체를, 예컨대 물-에탄올계로부터 재결정하는 것을 들 수 있다. 물론, 제품마다 목적이 되는 순도에 따라 일부의 공정을 삭제하거나, 혹은 크로마토그래피 등의 추가의 정제 공정을 실시하거나 해도 좋은 것은 물론이다.

그리고 또한, 적절한 조건에서 배양된 상기 배양물로부터는, 본 발명의 신규한 미오이노시톨 유도체도 얻을 수 있다. 전형적인 본 발명의 미오이노시톨 유도체는, 1-4-O-β-D-글루코피라노실-미오이노시톨로 칭해지고, 이하의 구조를 갖는다.

상기한 미오이노시톨 유도체는, 본 발명의 형질 전환체를, 비교적 다량의 미오이노시톨(예컨대, 약 30∼120 g/L 정도)을 생성시킬 수 있는 배지 내에서 배양함으로써 생산시키는 것이 유리하다. 즉, 통상, 본 발명의 형질 전환체는, 본 발명의 미오이노시톨 유도체에 비해, 미오이노시톨을 다량으로 생산한다. 그러나, 본 발명의 형질 전환체는, 하기의 실시예에서 나타내는 바와 같이, 배지에 첨가된 글루코오스의 양에 따라, 보다 많은 미오이노시톨뿐만 아니라 미오이노시톨 유도체도 생산할 수 있기 때문에, 그와 같은 배양 조건은, 본 발명의 미오이노시톨 유도체를 얻는 데에도 적합하다.

본 발명의 미오이노시톨 유도체는, 미오이노시톨에 관해 상기한 방법에 따름으로써 배양물로부터 조(粗)정제할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 미오이노시톨 유도체는, 배양 상청을 활성탄 처리하고, 다음으로 이온 교환 수지(양이온 교환 수지 및 음이온 교환 수지)로 처리함으로써 조정제할 수 있다.

그러나, 상기한 조정제물은, 본 발명의 미오이노시톨 유도체와 미오이노시톨의 양쪽을 포함하고 있기 때문에, 본 발명의 미오이노시톨 유도체를 단리하기 위해서는, 그곳으로부터 미오이노시톨을 분리할 필요가 있다. 예컨대, 상기 조정제한 배양액이 다량의 미오이노시톨을 포함하고 있는 것과 같은 경우에는, 상기 조정제액을 감압 농축시킴으로써 미오이노시톨의 일부를 석출시키고, 여과 등에 의해 제거할 수 있다. 또한, 상기 여과액에 에탄올을 첨가하면 나머지 미오이노시톨을 석출(정석)시킬 수 있다. 따라서, 에탄올에 의한 정석을 적절히 반복하면, 원하는 순도의 본 발명의 미오이노시톨 유도체를 얻을 수 있다. 혹은, 정석과 함께 또는 단독으로, 크로마토그래피, 예컨대, SUGAR KS-801 및 SUGAR KS-802, 및 Shodex Asahipak NH₂P-50 4E(모두 상품명, 쇼와 덴꼬 주식회사 제조)를 이용한 분취 HPLC 등에 의해, 본 발명의 미오이노시톨 유도체와 미오이노시톨을 따로따로 얻을 수 있다.

본 발명의 미오이노시톨 유도체는, β1→4 결합을 가수 분해하는 능력을 갖는 β-글루코시다아제에 의해 용이하게 분해되어, 대응하는 몰수의 글루코오스와 미오이노시톨을 생성하는 것도 확인되었다. 본 발명의 미오이노시톨 유도체를 β-글루코시다아제 등에 의해 효소적으로 분해하기 위해서는, 예컨대 물이나 완충액(초산 완충액, 인산 완충액 등)에 의한 본 발명의 미오이노시톨 유도체의 용액에 대하여 적당량의 효소를 첨가하고, 그 효소 반응에 적절한 조건 및 시간으로, 상기 용액을 인큐베이션하면 된다. 그와 같은 목적에 있어서 유리하게 사용할 수 있는 β-글루코시다아제는 시판되고 있으며, 그 어느 것이나 사용할 수 있지만, 예컨대 아스페르길루스속의 곰팡이 유래의 셀로비아제(Cellobiase)(SIGMA사)를 이용하면 된다. 첨가하는 효소의 양은, 제조원의 지시를 참고로 하면서, 본 발명의 미오이노시톨 유도체의 용액 중의 농도 등에 기초하여, 적절히 결정하면 된다. 또한, 반응시의 pH는, 일반적으로는 pH 4.0∼9.0의 범위이지만, 요컨대, 사용하는 효소의 최적 pH로 하면 된다. 또한, 반응시의 온도도, 사용하는 효소의 최적 온도 범위로 하면 되고, 예컨대, 약 20∼50℃ 정도의 범위로 하면 된다. 반응 시간은, 본 발명의 미오이노시톨 유도체의 분해율을 정량적으로 추적하면서, 거의 모든 본 발명의 미오이노시톨 유도체가 미오이노시톨로 변환된 시점으로 하면 된다.

또, 상기한 바와 같이, 본 발명의 형질 전환체는, 전형적인 배양 조건하에서는, 본 발명의 미오이노시톨 유도체를 미오이노시톨과 함께, 미오이노시톨에 비해 유의적으로 적은 양으로 생산하기 때문에, 오히려, 상기 형질 전환체의 배양물을 그대로 상기 효소로 처리하거나, 또는 상기 배양물을 활성탄 처리 정도로 조정제한 후에 효소 처리함으로써, 본 발명의 미오이노시톨 유도체를 미오이노시톨로 변환하여, 미오이노시톨의 생산성을 더욱 높일 수 있다. 혹은, 본 발명의 미오이노시톨 유도체를 단리한 후에, β-글루코시다아제에 의해 처리하여, 미오이노시톨을 얻어도 좋다. 그 때에, 본 발명의 미오이노시톨 유도체는, 미오이노시톨을 자화할 수 있는 편재균(효모, 고초균, 장내 세균)에 대하여 저항성이기 때문에, 사용까지(또는, 생리 작용을 발현할 때까지), 미오이노시톨을 본 발명의 미오이노시톨 유도체의 형태로 유지해 두는 것의 이점을 당업자는 이해할 것이다.

따라서, 의약품, 식품, 화장품 등의 유효 성분이나 기능성 성분으로서 이용하는 것도, 본 발명의 미오이노시톨 유도체의 잠재적인 용도 중 하나이다. 즉, 상기한 바와 같이 미오이노시톨은 많은 고등 동물에 있어서 필요 불가결한 물질이기 때문에, 영양 식품, 사료, 의약품 등의 성분으로서 광범위하게 이용되고 있다. 예컨대, 미오이노시톨은, 지방이나 콜레스테롤류의 대사에 있어서 중요한 역할을 담당하고 있는 것이 알려져 있고, 특히 고콜레스테롤혈증 등의 예방이나 치료에 유효한 것으로 여겨지고 있다. 그리고, 본 발명의 미오이노시톨 유도체는 효소적으로 분해되어 용이하게 미오이노시톨을 생성하는 점으로부터, 본 발명의 미오이노시톨 유도체가 생체 내에서 효소적으로 분해되어 미오이노시톨을 산생하는 것을 기대하여, 본 발명의 미오이노시톨 유도체 자체를 의약품 등에 첨가하는 것은, 매우 흥미로운 본 발명의 이용 양태이다.

예컨대, 본 발명의 미오이노시톨 유도체를 유효 성분으로서 함유하는 의약 조성물은, 정제, 분말, 과립, 캡슐, 당의정, 액제, 또는 시럽제 등의 경구 투여 형태로 할 수 있고, 혹은 주사제, 점적제, 좌제, 경피 또는 흡수제 등의 비경구 투여 형태로 하는 것도 가능하다. 이들 제제에 따른 각종 담체가 사용된다. 예를 들면, 경구제의 담체로는, 부형제(예컨대, 젖당, 백당, 포도당, 만니톨, 에리스리톨, 크실리톨, 말티톨, 소르비톨, 각종 전분, 결정 셀룰로오스, 분말 셀룰로오스 등), 결합제(예컨대, 덱스트린, 아라비아 고무, 알긴산나트륨, 포비돈, 폴리비닐알콜, 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오스, 카르멜로오스나트륨 등), 활택제(예컨대, 스테아르산, 스테아르산칼슘, 스테아르산마그네슘, 탈크 등), 유동성 촉진제(예컨대, 함수 이산화규소, 경질 무수규산, 산화티탄 등), 착색제를 들 수 있다.

의약 조성물의 투여량은 특별히 한정되지 않지만, 예컨대, 일반적으로는 성인은 1일당 0.01∼2000 mg의 유효 성분을 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 투여 빈도는 월 1회 내지 연일 투여가 가능하고, 바람직하게는 1회/주 내지 3회/주, 또는 5회/주, 혹은 연일 투여이다. 1일 투여량, 투여 기간, 및 투여 빈도도 환자의 연령, 체중, 신체적 건강도, 및 치료해야 할 질환이나 그 중증도 등에 따라, 함께 적절히 증감시켜도 좋다.

이상의 설명을 접한 당업자는, 본 발명을 충분히 실시할 수 있다. 이하, 보다 나은 설명의 목적으로서 실시예를 제공하며, 따라서, 본 발명은 해당 실시예에 한정되는 것은 아니다. 또, 본 명세서에 있어서 특별히 언급이 없는 한 뉴클레오티드 서열은 5'로부터 3' 방향을 향해 기재된다.

실시예

실시예 1 : 플라스미드의 구축

1-a) 이노시톨 모노포스파타아제 발현 카세트

대장균주 W3110(NBRC 12713)을 LB 배지 중(2 ml)에서 37℃에서 진탕 배양했다. 배양 종료 후, 배양액으로부터 균체를 회수하고, Nucleo Spin Tissue(제품명, MACHEREY-NAGEL사 제조)를 사용하여 게놈 DNA를 추출했다. 추출한 게놈 DNA를 주형으로 이용하여, 이하의 프라이머에 의해 PCR 증폭하고[PrimeSTAR Max DNA Polymerase(제품명, 다카라바이오 제조), 반응 조건: 98℃ 10 sec, 55℃ 5 sec, 72℃ 20 sec, 28 cycle], suhB 유전자의 코드 영역(서열 번호 3)을 클로닝했다.

얻어진 suhB 코드 영역은 하기 서열의 프로모터의 하류에 전사 가능하게 삽입했다.

즉, 플라스미드 pNFP-A51(FERM ABP-11515로서, 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터에 2011년 10월 25일에 기탁했음)의 멀티클로닝 사이트에 터미네이터 서열 및 상기 프로모터 서열을 삽입했다.

도입된 프로모터 서열의 하류에 상기에서 클로닝된 suhB 코드 영역을 라이게이션하여, pNFP-A54를 구축했다. 구축한 pNFP-A54를, 염화칼슘법(요도사 유전자 공학 실험 노트 상 타무라 다카아키저, 참조)에 의해 대장균 AKC-016주(FERM ABP-11512로서, 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 미생물 기탁 센터에 2011년 4월 20일에 기탁했음)에 트랜스펙트했다. SDS-PAGE에 의해 상기 대장균의 가용성 분획에서의 이노시톨 모노포스파타아제의 고발현을 확인했다.

1-b) 이노시톨-1-인산 합성 효소 발현 카세트

단리한 주정 효모의 배양액으로부터 균체를 회수하고, Nucleo Spin Tissue(제품명, MACHEREY-NAGEL사 제조)를 사용하여 게놈 DNA를 추출했다. 추출한 게놈 DNA를 주형으로 이용하여, 이하의 프라이머에 의해 PCR 증폭하고[PrimeSTAR Max DNA Polymerase(제품명, 다카라바이오 제조), 반응 조건: 98℃ 10 sec, 55℃ 5 sec, 72℃ 20 sec, 28 cycle], INO1 유전자의 코드 영역(서열 번호 1)을 클로닝했다.

얻어진 ino1 코드 영역은 하기 서열의 프로모터의 하류에 전사 가능하게 삽입했다.

즉, 상기 플라스미드 pNFP-A51의 멀티클로닝 사이트에 터미네이터 서열 및 상기 프로모터 서열을 삽입했다.

도입된 프로모터 서열의 하류에 상기에서 클로닝된 ino1 코드 영역을 라이게이션하여, pNFP-D78을 구축했다. 구축한 pNFP-D78을, 염화칼슘법(요도사 유전자 공학 실험 노트 상 타무라 다카아키저, 참조)에 의해 대장균 AKC-016주(FERM ABP-11512로서, 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 미생물 기탁 센터에 2011년 4월 20일에 기탁했음)에 트랜스펙트했다. SDS-PAGE에 의해 상기 대장균의 가용성 분획에서의 이노시톨-1-인산 합성 효소의 고발현을 확인했다.

1-c) 형질 전환을 위한 플라스미드의 구축

pNFP-D78을 SalI로 소화하고, 평활 말단화 및 5' 말단 탈인산화했다. pNFP-A54 중의 suhB 발현 카세트를 클로닝하고, pNFP-D78에 라이게이션했다. pNFP-D78 중의 INO1 발현 카세트와 순방향으로 suhB 발현 카세트가 라이게이션되어 있었던 pNFP-G22를 취득했다.

실시예 2 : 미오이노시톨 생산

2-a) 발현 카세트 함유 플라스미드로 트랜스펙트한 형질 전환체에 의한 미오이노시톨 생산

실시예 1의 순서에 따라 구축한 플라스미드 pNFP-G22를, 대장균 AKC-016주(FERM ABP-11512로서, 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 미생물 기탁 센터에 2011년 4월 20일에 기탁했음)에 염화칼슘법(요도사 유전자 공학 실험 노트 상 타무라 다카아키저, 참조)을 이용하여 트랜스펙트했다. 상기 형질 전환체를 AKC-016-G22주라고 명명했다.

한편, 대조의 형질 전환은, INO1 발현 카세트만을 포함한 플라스미드 pNFP-D78로 트랜스펙트하여 얻고, 상기 대조의 형질 전환체를 AKC-016-D78주라고 명명했다. 얻어진 각각의 형질 전환체를, 암피실린(100 mg/L) 함유 LB 플레이트 상에서, 37℃, 1일간 배양하여, 콜로니를 형성시켰다. 암피실린(100 mg/L)을 포함하는 LB 배지 2 mL를 15 mL 용량의 시험관에 넣고, 상기 플레이트로부터 콜로니를 백금이로 식균하고, 37℃에서, 3∼5시간, OD(600 nm)가 0.5 정도로 될 때까지 180 rpm으로 배양을 행하고, 이것을 본배양을 위한 전배양액으로 했다.

250 mL 용량의 Jar 배양 장치(기종명 바이오 Jr.8, 바이오트 제조)에, 10 g/L, 15 g/L 또는 30 g/L의 글루코오스와, 100 mg/L의 암피실린을 포함하는 합성 배지(하기 표), 또는 LB 배지를 100 mL 넣고, 2 mL의 전배양액을 첨가하여 본배양(미오이노시톨 생산 시험)을 행했다. 배양 조건은 다음과 같다; 배양 온도 30℃; 배양 pH 6.7; 알칼리 첨가 10%(중량/용량) 암모니아수; 교반 1200 rpm; 통기 0.1 vvm.

상기한 배양액을, 4℃에서, 10,000 g×10분간 원심 분리하여 상청을 회수하고, 배양 상청의 미오이노시톨 농도를 측정했다. 구체적으로, KS-G(가드 컬럼), Sugar KS-801 및 Sugar KS-802(모두 상품명, 쇼와 덴꼬 주식회사 제조)를 연결하여 HPLC(검출기: RI, 컬럼 온도: 70℃, 유속: 1 mL/min)를 행함으로써, 배양 상청 중의 미오이노시톨 농도를 정량했다. 본 발명의 형질 전환체(AKC-016-G22주)와 대조주(AKC-016-D78주)를 비교한 결과를 표 2(합성 배지) 및 표 3(LB 배지)에 나타냈다.

2-b) 발현 카세트를 염색체 상에 갖는 형질 전환체에 의한 미오이노시톨 생산

본 실시예에서는, 또한 INO1 발현 카세트 및 suhB 발현 카세트의 쌍방을 염색체 상에 갖는 형질 전환체도 제작했다(대장균 AKC-018주, FERM ABP-11514로서, 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터에 2011년 10월 25일에 기탁했음).

한편, 대조의 형질 전환은, INO1 발현 카세트만을 염색체 상에 도입하여 얻었다(대장균 AKC-017주, FERM ABP-11513으로서, 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터에 2011년 10월 25일에 기탁했음).

각각의 형질 전환체를, 암피실린을 포함하지 않는 LB 배지에서 전배양하고, 또한, 암피실린을 포함시키지 않으며 또한 글루코오스의 첨가량을 10 g/L 또는 30 g/L로 한 것 이외에는 실시예 2-a)와 동일한 합성 배지 및 LB 배지를 이용하여, 상기 형질 전환체에 의해 실시예 2-a)와 동일한 배양 조건하에서 미오이노시톨을 생산시켰다. 계속해서, 실시예 2-a)와 동일한 방법에 의해 배양 상청 중의 미오이노시톨 농도를 정량했다. 본 발명의 형질 전환체(AKC-018주)와 대조주(AKC-017주)를 비교한 결과를 표 4(합성 배지) 및 표 5(LB 배지)에 나타냈다.

상기 실시예 2-a) 및 2-b)의 결과는, 대장균 숙주(대조주)에서의 내인성 이노시톨 모노포스파타아제 활성의 존재를 확인하기는 하지만, 합성 생물학적 수법에 의한 종래의 미오이노시톨 생산에 있어서 상기 활성이 충분하지 않았음을 나타냈다. 놀랍게도, 상기 숙주에서의 이노시톨 모노포스파타아제 활성의 항진은, 대조와 비교하여 대략 1.5∼5배나 미오이노시톨 생산성을 향상시켰다. 더욱 놀랍게도, 이노시톨 모노포스파타아제 활성이 항진된 미생물에 있어서, 미오이노시톨 생산량은 주입 글루코오스량에 정비례하여 증가했다. 이것은, 종래의 기술 상식에 반하여, 합성 생물학적 수법에 의한 미오이노시톨 생산에 있어서, 이노시톨 모노포스파타아제 활성의 중요한 역할을 실증하고 있다.

실시예 3 : 신규 미오이노시톨 유도체

3-a) 신규 미오이노시톨 유도체의 생산

본 실시예에서는, 실시예 2-a)에서 얻은 본 발명의 형질 전환체인 AKC-016-G22주에 의한 신규 미오이노시톨 유도체의 생산을 나타낸다.

암피실린(100 mg/L)을 포함하는 LB 배지 100 mL를 500 mL 용량의 시험관에 넣고, AKC-016-G22주를 배양한 플레이트로부터 콜로니를 백금이로 식균하고, 37℃에서, 3∼5시간, OD(600 nm)가 0.5 정도로 될 때까지 180 rpm으로 배양을 행하고, 이것을 본배양을 위한 전배양액으로 했다.

10 L 용량의 Jar 배양 장치(마루비시 바이오엔지사 제조)에, 15 g/L의 글루코오스와, 100 mg/L의 암피실린을 포함하는 하기의 합성 배지(표 6)를 3 L 넣고, 60 mL의 전배양액을 첨가하여 본배양을 했다. 배양 조건은 다음과 같다; 배양 온도 32℃; 배양 pH 6.0[하한]; 알칼리 첨가 28%(중량/용량) 암모니아수; 교반 850 rpm; 통기 1 vvm. 원료가 되는 글루코오스 피드 용액(표 7)은, 배양액 중의 글루코오스 농도가 0∼5 g/L가 되도록 적절히 첨가했다.

배양 시간 69.5시간 후, 상기한 배양액의 일부를, 4℃에서, 10,000 g×10분간 원심 분리하여 상청을 회수했다. 상청을, KS-G(가드 컬럼), Sugar KS-801 및 Sugar KS-802(모두 상품명, 쇼와 덴꼬 주식회사 제조)를 연결한 HPLC(이동상: 물, 컬럼 온도: 70℃, 유속: 1 mL/min, 검출기: RI)로 분석한 결과, 미오이노시톨 농도는 102 g/L였다.

한편, 본 발명의 신규 미오이노시톨 유도체(1-4-O-β-D-글루코피라노실-미오이노시톨)는, Shodex Asahipak NH₂P-50 4E(상품명, 쇼와 덴꼬 주식회사 제조)를 이용한 HPLC(이동상: 물/아세토니트릴=25/75, 컬럼 온도: 40℃, 유속: 0.8 mL/min, 검출기: RI)에 의한 분석에서, 리텐션 타임이 17.4분이 되고(한편, 상기 분석시의 미오이노시톨의 리텐션 타임은 13분이었음), 상기 상청 중에 0.3 g/L의 농도로 포함되어 있었다.

3-b) 신규 미오이노시톨 유도체의 단리

상기한 바와 같이 하여 얻은 배양액의 1000 mL를, 대형 원심기를 이용하여 8,800 rpm으로 20분간 원심 후, 다시 소형 원심기를 이용하여 13,000 rpm으로 5분간 원심했다. 얻어진 상청으로부터, 0.45 ㎛의 필터(MILLIPORE사 옴니 포어 멤브레인, 모델 번호 JHWP09025)를 이용하여, 감압 여과로 고형물을 여과 분리했다. 필터 여과 후의 여과액 1000 mL에 활성탄 시라사기 A(상품명, 니혼 엠바이로 케미컬즈사 제조)를 5 g 첨가하고, 스터러로 30분간 교반했다. 그 액으로부터, 0.45 ㎛의 필터를 이용하여, 감압 여과로 활성탄을 여과 분리했다. 활성탄 처리 후의 여과액에 양이온 교환 수지(오르가노사 제조 앰버라이트 IR120B H⁺형)를 500 mL 첨가하고, 스터러로 30분간 교반했다. 그 액으로부터, 0.45 ㎛의 필터를 이용하여, 감압 여과로 양이온 교환 수지를 여과 분리했다. 양이온 교환 처리 후의 여과액에 음이온 교환 수지(오르가노사 제조 앰버라이트 IRA96SB OH^-형)를 500 mL 첨가하고, 스터러로 30분간 교반했다. 그 액으로부터, 0.45 ㎛의 필터를 이용하여, 감압 여과로 음이온 교환 수지를 여과 분리했다.

음이온 교환 처리 후의 여과액 1000 mL에 관해, 에바퍼레이터로 70℃, 100 mbar에서 물을 증류 제거하고, 4배로 농축하여 250 mL로 했다. 실온까지 자연히 냉각시킨 후 4℃에서 보존하고, 미오이노시톨을 석출시킨 후, 감압 여과로 미오이노시톨을 여과 분리했다. 여과액 189 mL의 조성은, 미오이노시톨이 5.83%, 및 본 발명의 미오이노시톨 유도체가 0.131%였다(모두, W/V). 실온에서 이 액에 에탄올을 189 mL 첨가하고, 또한 미오이노시톨을 석출시킨 후, 감압 여과로 미오이노시톨을 여과 분리했다. 여과액 373 mL의 조성은, 미오이노시톨이 1.41%, 및 본 발명의 미오이노시톨 유도체가 0.067%였다. 또한 여과액으로부터, 에바퍼레이터(70℃, 100 mbar)를 이용하여 에탄올을 증류 제거하여, 미오이노시톨이 8.46%이고, 본 발명의 미오이노시톨 유도체가 0.401%인 수용액 62 mL를 얻었다. 이것에 또한 실온에서 에탄올을 186 mL 첨가하고, 미오이노시톨을 석출시킨 후, 감압 여과로 미오이노시톨을 여과 분리했다. 여과액 244 mL의 조성은, 미오이노시톨이 0.33%, 및 본 발명의 미오이노시톨 유도체가 0.100%였다. 여과액으로부터, 에바퍼레이터(70℃, 100 mbar)를 이용하여 에탄올과 물을 증류 제거하여, 미오이노시톨이 3.30%, 및 본 발명의 미오이노시톨 유도체가 0.998%인 용액을, 24 mL 얻었다.

상기한 용액 중에, 미오이노시톨 및 본 발명의 미오이노시톨 유도체는 별도의 물질(구조는 미동정)이고, 양자로부터의 분리가 곤란한 복수의 불순물의 존재가 확인되었기 때문에, 여러가지 정제 방법을 검토한 결과, 효소 처리가 유효했다. 즉, 상기한 미오이노시톨 및 본 발명의 미오이노시톨 유도체의 혼합액 500 μL에 대하여, 150 mM의 Bis-Tris(pH 7.0) 버퍼의 300 μL와, 100 UN/mL의 α-글루코시다아제[Sigma-Aldrich사 제조, 바실루스 스테아로테르모필루스(Bacillus stearothermophilus) 유래]의 200 μL를 첨가하고, 인큐베이터(AS ONE SI-300C)를 이용하여, 반응 온도 40℃, 1,200 rpm으로 교반하면서 22시간 반응을 행했다. 반응 후, HPLC 분석에 의해, 상기한 불순물 중 하나가 분해된 것을 확인했다. 그 후, 반응액을 99℃의 드라이 블록 배스(SIBATA 제조 BI-1200)에서 5분간 가온하고, 효소를 실활시켰다. 반응 완료된 액을 원심 분리 후, 상청을 0.45 ㎛의 필터를 이용하여 여과했다. 여과액을 동결 건조시킨 후, 물을 첨가하여 5 mL의 수용액으로 했다. 이 액 500 μL에 또한 150 mM의 Bis-Tris(pH 7.0) 버퍼의 300 μL와, 100 UN/mL의 β-글루코시다아제(오리엔탈 효모 공업 주식회사 제조, 아몬드 유래)의 200 μL를 첨가하고, 인큐베이터를 이용하여 반응 온도 40℃, 1,200 rpm으로 교반하면서, 0.5시간의 단시간에서의 반응을 행했다. 반응 후, HPLC 분석에 의해, 또 하나의 불순물이 분해된 것을 확인했다. 그 후, 반응액을 99℃의 드라이 블록 배스에서 5분간 가온하고, 효소를 실활시켰다. 원심 분리 후, 상청을 0.45 ㎛의 필터를 이용하여 여과했다. 여과액을 동결 건조시킨 후, 물을 첨가하여, 본 발명의 미오이노시톨 유도체를 약 0.99% 포함하는 수용액(2.5 mL)으로 했다.

상기한 효소 분해에 의한 정제 후의 수용액을 이용하여, 1회의 주입량을 10 μL로 하고, 200회의 HPLC 분취를 행했다. 분취시의 HPLC 조건은 이하와 같았다 :

컬럼 : Shodex Asahipak NH₂P-50 4E,

이동상 : 물/아세토니트릴=25/75

유속 : 0.8 mL/min

온도 : 40℃

검출기 : RI

오토샘플러 : 시마즈 SIL-20A형 전량 시료 주입식

HPLC 분취 후의 샘플로부터, 에바퍼레이터(70℃, 100 mbar)에 의해 아세토니트릴을 증류 제거하고, 또한 동결 건조에 의해 물도 증류 제거하여, 본 발명의 미오이노시톨 유도체의 건조 고형물을 얻었다(수량 : 19 mg).

3-c) 신규 미오이노시톨 유도체의 구조 결정

실시예 3-b)에서 분취한 화합물을, 이하의 NMR 분석에 의해 구조 결정했다.

장치 : Avance600(Bruker Biospin사 제조)

프로브 : 크라이오프로브(¹³C 고감도)

측정 온도 : 18℃(시료 열화 방지와 ¹H-NMR일 때에 물 시그널을 이동시키기 위해, 전부 291K(18℃)로 했음)

용매 : D₂O(ALDRICH사 제조)

내부 표준 : TSP

¹H 관측 주파수 : 600.13 MHz

¹³C 관측 주파수 : 150.92 MHz

측정 결과 및 피크의 귀속은 이하와 같았다. 한편, 표 중, 피크 번호의 「GH-1」이란, 글루코오스 잔기의 1위 수소인 것을 나타낸다. 또한 「IH-1」이란, 미오이노시톨 잔기의 1위 수소인 것을 나타낸다. 다른 것도 마찬가지이다.

또한, 피크의 귀속은, COSY, CH-COSY, HMBC, J 분해 2차원 NMR에 의해 확인했다.

3-d) 신규 미오이노시톨 유도체의 효소 분해

실시예 3-b)에서 분취한 화합물을, 아스페르길루스속의 곰팡이 유래의 β-글루코시다아제인, 셀로비아제(SIGMA사)에 의해 분해했다. 구체적으로, 상기 화합물을, 400 μL의 150 mM Bis-Tris 완충액(pH=7.0)에, 6 mg/ml의 농도로 용해했다. 상기 용액에, 25 U/mL의 셀로비아제를 100 μL 첨가하고, 40℃에서 22시간까지 인큐베이트(1200 rpm, Bioshaker M·BR022, TAITEC사)하여 반응시켰다. 반응 0시간, 3시간, 22시간째에 반응액을 샘플링하고, HPLC(컬럼: Shodex Asahipak NH₂P-50 4E(상품명), 이동상: 물/아세토니트릴=25/75, 유속: 0.8 mL/min, 컬럼 온도: 40℃, 검출기: RI)로 반응 상황을 확인했다.

도 6에 도시한 결과와 같이, 반응 개시로부터 3시간째에는, 본 발명의 미오이노시톨 유도체가 대부분 분해되어, 대응하는 양의 글루코오스와 실로-이노시톨이 생성되었다. 또한, 반응 개시로부터 22시간 후에는, 본 발명의 미오이노시톨 유도체는 완전히 분해되어 있었다. 이러한 점에서, 본 발명의 미오이노시톨 유도체가, β-글루코시다아제에 의해 용이하게 분해되는 것을 알 수 있었다. 또한, 본 효소 실험에서도, 본 발명의 미오이노시톨 유도체의 구조 결정의 올바름이 확인되었다.

본 발명은, 미오이노시톨 및 그 유도체의 공업적 발효 생산에 이용할 수 있다.

독립행정법인 제품평가기술기반기구 특허생물기탁센터(IPOD, NITE)

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SEQUENCE LISTING <110> ASAHI KASEI CHEMICALS <120> Method of production of myo-inositol and myo-inositol derivative <130> F112149-WO-00 <150> JP2011-248438 <151> 2011-11-14 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1602 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <221> CDS <222> (1)..(1602) <400> 1 atg aca gaa gat aat att gct cca atc acc tcc gtt aaa gta gtt acc 48 Met Thr Glu Asp Asn Ile Ala Pro Ile Thr Ser Val Lys Val Val Thr 1 5 10 15 gac aag tgc acg tac aag gac aac gag ctg ctc acc aag tac agc tac 96 Asp Lys Cys Thr Tyr Lys Asp Asn Glu Leu Leu Thr Lys Tyr Ser Tyr 20 25 30 gaa aat gct gta gtt acg aag aca gct agt ggc cgc ttc gat gtc acg 144 Glu Asn Ala Val Val Thr Lys Thr Ala Ser Gly Arg Phe Asp Val Thr 35 40 45 ccc act gtt caa gac tac gtg ttc aaa ctt gac tta aaa aag ccg gaa 192 Pro Thr Val Gln Asp Tyr Val Phe Lys Leu Asp Leu Lys Lys Pro Glu 50 55 60 aaa cta gga att atg ctc att ggg tta ggt ggc aac aat ggc tcc acc 240 Lys Leu Gly Ile Met Leu Ile Gly Leu Gly Gly Asn Asn Gly Ser Thr 65 70 75 80 tta gtg gcc tcg gta ttg gcg aat aag cac aat gtg gag ttt caa act 288 Leu Val Ala Ser Val Leu Ala Asn Lys His Asn Val Glu Phe Gln Thr 85 90 95 aag gaa ggc gtt aag caa cca aac tac ttc ggc tcc atg act caa tgt 336 Lys Glu Gly Val Lys Gln Pro Asn Tyr Phe Gly Ser Met Thr Gln Cys 100 105 110 tct acc ttg aaa ctg ggt gtc gat gcg gag ggg aat gac gtt tat gct 384 Ser Thr Leu Lys Leu Gly Val Asp Ala Glu Gly Asn Asp Val Tyr Ala 115 120 125 cct ttt aac tct ctg ttg ccc atg gtt agc cca aac gac ttt gtc gtc 432 Pro Phe Asn Ser Leu Leu Pro Met Val Ser Pro Asn Asp Phe Val Val 130 135 140 tct ggt tgg gac atc aat aac gca gat cta tac gaa gct atg cag aga 480 Ser Gly Trp Asp Ile Asn Asn Ala Asp Leu Tyr Glu Ala Met Gln Arg 145 150 155 160 agt cag gtt ctc gaa tat gat ctg caa caa cgc ttg aag gcg aag atg 528 Ser Gln Val Leu Glu Tyr Asp Leu Gln Gln Arg Leu Lys Ala Lys Met 165 170 175 tcc ttg gtg aag cct ctt cct tcc att tac tac cct gat ttc att gca 576 Ser Leu Val Lys Pro Leu Pro Ser Ile Tyr Tyr Pro Asp Phe Ile Ala 180 185 190 gct aat caa gat gag aga gcc aat aac tgc atc aat ttg gat gaa aaa 624 Ala Asn Gln Asp Glu Arg Ala Asn Asn Cys Ile Asn Leu Asp Glu Lys 195 200 205 ggc aac gta acc acg agg ggt aag tgg gcc cat ctg caa cgc atc aga 672 Gly Asn Val Thr Thr Arg Gly Lys Trp Ala His Leu Gln Arg Ile Arg 210 215 220 cgc gat att cag aat ttc aaa gaa gaa aac gcc ctt gat aaa gta atc 720 Arg Asp Ile Gln Asn Phe Lys Glu Glu Asn Ala Leu Asp Lys Val Ile 225 230 235 240 gtt ctt tgg act gca aat act gag agg tac gta gaa gta tct cct ggt 768 Val Leu Trp Thr Ala Asn Thr Glu Arg Tyr Val Glu Val Ser Pro Gly 245 250 255 gtt aat gac acc atg gaa aac ctc ttg cag tct att aag aat gac cat 816 Val Asn Asp Thr Met Glu Asn Leu Leu Gln Ser Ile Lys Asn Asp His 260 265 270 gaa gag att gct cct tcc acg atc ttt gca gca gca tct atc ttg gaa 864 Glu Glu Ile Ala Pro Ser Thr Ile Phe Ala Ala Ala Ser Ile Leu Glu 275 280 285 ggt gtc ccc tat att aat ggt tca ccg cag aat act ttt gtt ccc ggc 912 Gly Val Pro Tyr Ile Asn Gly Ser Pro Gln Asn Thr Phe Val Pro Gly 290 295 300 ttg gtt cag ctg gct gag cat gag ggt aca ttc att gcg gga gac gat 960 Leu Val Gln Leu Ala Glu His Glu Gly Thr Phe Ile Ala Gly Asp Asp 305 310 315 320 ctc aag tcg gga caa acc aag ttg aag tct gtt ctg gcc cag ttc tta 1008 Leu Lys Ser Gly Gln Thr Lys Leu Lys Ser Val Leu Ala Gln Phe Leu 325 330 335 gtg gat gca ggt att aaa ccg gtc tcc att gca tcc tat aac cat tta 1056 Val Asp Ala Gly Ile Lys Pro Val Ser Ile Ala Ser Tyr Asn His Leu 340 345 350 ggc aat aat gac ggt tat aac tta tct gct cca aaa caa ttt agg tct 1104 Gly Asn Asn Asp Gly Tyr Asn Leu Ser Ala Pro Lys Gln Phe Arg Ser 355 360 365 aag gag att tcc aaa agt tct gtc ata gat gac atc atc gcg tct aat 1152 Lys Glu Ile Ser Lys Ser Ser Val Ile Asp Asp Ile Ile Ala Ser Asn 370 375 380 gat atc ttg tac aat gat aaa ctg ggt aaa aaa gtt gac cac tgc att 1200 Asp Ile Leu Tyr Asn Asp Lys Leu Gly Lys Lys Val Asp His Cys Ile 385 390 395 400 gtc att aaa tat atg aag ccc gtc ggg gac tca aaa gtg gca atg gac 1248 Val Ile Lys Tyr Met Lys Pro Val Gly Asp Ser Lys Val Ala Met Asp 405 410 415 gag tat tac agt gag ttg atg tta ggt ggc cat aac cgg att tcc att 1296 Glu Tyr Tyr Ser Glu Leu Met Leu Gly Gly His Asn Arg Ile Ser Ile 420 425 430 cac aat gtt tgc gaa gat tct tta ctg gct acg ccc ttg atc atc gat 1344 His Asn Val Cys Glu Asp Ser Leu Leu Ala Thr Pro Leu Ile Ile Asp 435 440 445 ctt tta gtc atg act gag ttt tgt aca aga gtg tcc tat aag aag gtg 1392 Leu Leu Val Met Thr Glu Phe Cys Thr Arg Val Ser Tyr Lys Lys Val 450 455 460 gac cca gtt aaa gaa gat gct ggc aaa ttt gag aac ttt tat cca gtt 1440 Asp Pro Val Lys Glu Asp Ala Gly Lys Phe Glu Asn Phe Tyr Pro Val 465 470 475 480 tta acc ttc ttg agt tac tgg tta aaa gct cca tta aca aga cca gga 1488 Leu Thr Phe Leu Ser Tyr Trp Leu Lys Ala Pro Leu Thr Arg Pro Gly 485 490 495 ttt cac ccg gtg aat ggc tta aac aag caa aga acc gcc tta gaa aat 1536 Phe His Pro Val Asn Gly Leu Asn Lys Gln Arg Thr Ala Leu Glu Asn 500 505 510 ttt tta aga ttg ttg att gga ttg cct tct caa aac gaa cta aga ttc 1584 Phe Leu Arg Leu Leu Ile Gly Leu Pro Ser Gln Asn Glu Leu Arg Phe 515 520 525 gaa gag aga ttg ttg taa 1602 Glu Glu Arg Leu Leu 530 <210> 2 <211> 533 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 2 Met Thr Glu Asp Asn Ile Ala Pro Ile Thr Ser Val Lys Val Val Thr 1 5 10 15 Asp Lys Cys Thr Tyr Lys Asp Asn Glu Leu Leu Thr Lys Tyr Ser Tyr 20 25 30 Glu Asn Ala Val Val Thr Lys Thr Ala Ser Gly Arg Phe Asp Val Thr 35 40 45 Pro Thr Val Gln Asp Tyr Val Phe Lys Leu Asp Leu Lys Lys Pro Glu 50 55 60 Lys Leu Gly Ile Met Leu Ile Gly Leu Gly Gly Asn Asn Gly Ser Thr 65 70 75 80 Leu Val Ala Ser Val Leu Ala Asn Lys His Asn Val Glu Phe Gln Thr 85 90 95 Lys Glu Gly Val Lys Gln Pro Asn Tyr Phe Gly Ser Met Thr Gln Cys 100 105 110 Ser Thr Leu Lys Leu Gly Val Asp Ala Glu Gly Asn Asp Val Tyr Ala 115 120 125 Pro Phe Asn Ser Leu Leu Pro Met Val Ser Pro Asn Asp Phe Val Val 130 135 140 Ser Gly Trp Asp Ile Asn Asn Ala Asp Leu Tyr Glu Ala Met Gln Arg 145 150 155 160 Ser Gln Val Leu Glu Tyr Asp Leu Gln Gln Arg Leu Lys Ala Lys Met 165 170 175 Ser Leu Val Lys Pro Leu Pro Ser Ile Tyr Tyr Pro Asp Phe Ile Ala 180 185 190 Ala Asn Gln Asp Glu Arg Ala Asn Asn Cys Ile Asn Leu Asp Glu Lys 195 200 205 Gly Asn Val Thr Thr Arg Gly Lys Trp Ala His Leu Gln Arg Ile Arg 210 215 220 Arg Asp Ile Gln Asn Phe Lys Glu Glu Asn Ala Leu Asp Lys Val Ile 225 230 235 240 Val Leu Trp Thr Ala Asn Thr Glu Arg Tyr Val Glu Val Ser Pro Gly 245 250 255 Val Asn Asp Thr Met Glu Asn Leu Leu Gln Ser Ile Lys Asn Asp His 260 265 270 Glu Glu Ile Ala Pro Ser Thr Ile Phe Ala Ala Ala Ser Ile Leu Glu 275 280 285 Gly Val Pro Tyr Ile Asn Gly Ser Pro Gln Asn Thr Phe Val Pro Gly 290 295 300 Leu Val Gln Leu Ala Glu His Glu Gly Thr Phe Ile Ala Gly Asp Asp 305 310 315 320 Leu Lys Ser Gly Gln Thr Lys Leu Lys Ser Val Leu Ala Gln Phe Leu 325 330 335 Val Asp Ala Gly Ile Lys Pro Val Ser Ile Ala Ser Tyr Asn His Leu 340 345 350 Gly Asn Asn Asp Gly Tyr Asn Leu Ser Ala Pro Lys Gln Phe Arg Ser 355 360 365 Lys Glu Ile Ser Lys Ser Ser Val Ile Asp Asp Ile Ile Ala Ser Asn 370 375 380 Asp Ile Leu Tyr Asn Asp Lys Leu Gly Lys Lys Val Asp His Cys Ile 385 390 395 400 Val Ile Lys Tyr Met Lys Pro Val Gly Asp Ser Lys Val Ala Met Asp 405 410 415 Glu Tyr Tyr Ser Glu Leu Met Leu Gly Gly His Asn Arg Ile Ser Ile 420 425 430 His Asn Val Cys Glu Asp Ser Leu Leu Ala Thr Pro Leu Ile Ile Asp 435 440 445 Leu Leu Val Met Thr Glu Phe Cys Thr Arg Val Ser Tyr Lys Lys Val 450 455 460 Asp Pro Val Lys Glu Asp Ala Gly Lys Phe Glu Asn Phe Tyr Pro Val 465 470 475 480 Leu Thr Phe Leu Ser Tyr Trp Leu Lys Ala Pro Leu Thr Arg Pro Gly 485 490 495 Phe His Pro Val Asn Gly Leu Asn Lys Gln Arg Thr Ala Leu Glu Asn 500 505 510 Phe Leu Arg Leu Leu Ile Gly Leu Pro Ser Gln Asn Glu Leu Arg Phe 515 520 525 Glu Glu Arg Leu Leu 530 <210> 3 <211> 804 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (1)..(804) <400> 3 atg cat ccg atg ctg aac atc gcc gtg cgc gca gcg cgc aag gcg ggt 48 Met His Pro Met Leu Asn Ile Ala Val Arg Ala Ala Arg Lys Ala Gly 1 5 10 15 aat tta att gcc aaa aac tat gaa acc ccg gac gct gta gaa gcg agc 96 Asn Leu Ile Ala Lys Asn Tyr Glu Thr Pro Asp Ala Val Glu Ala Ser 20 25 30 cag aaa ggc agt aac gat ttc gtg acc aac gta gat aaa gct gcc gaa 144 Gln Lys Gly Ser Asn Asp Phe Val Thr Asn Val Asp Lys Ala Ala Glu 35 40 45 gcg gtg att atc gac acg att cgt aaa tct tac cca cag cac acc atc 192 Ala Val Ile Ile Asp Thr Ile Arg Lys Ser Tyr Pro Gln His Thr Ile 50 55 60 atc acc gaa gaa agc ggt gaa ctt gaa ggt act gat cag gat gtt caa 240 Ile Thr Glu Glu Ser Gly Glu Leu Glu Gly Thr Asp Gln Asp Val Gln 65 70 75 80 tgg gtt atc gat cca ctg gat ggc act acc aac ttt atc aaa cgt ctg 288 Trp Val Ile Asp Pro Leu Asp Gly Thr Thr Asn Phe Ile Lys Arg Leu 85 90 95 ccg cac ttc gcg gta tct atc gct gtt cgt atc aaa ggc cgc acc gaa 336 Pro His Phe Ala Val Ser Ile Ala Val Arg Ile Lys Gly Arg Thr Glu 100 105 110 gtt gct gtg gta tac gat cct atg cgt aac gaa ctg ttc acc gcc act 384 Val Ala Val Val Tyr Asp Pro Met Arg Asn Glu Leu Phe Thr Ala Thr 115 120 125 cgc ggt cag ggc gca cag ctg aac ggc tac cga ctg cgc ggc agc acc 432 Arg Gly Gln Gly Ala Gln Leu Asn Gly Tyr Arg Leu Arg Gly Ser Thr 130 135 140 gct cgc gat ctc gac ggt act att ctg gcg acc ggc ttc ccg ttc aaa 480 Ala Arg Asp Leu Asp Gly Thr Ile Leu Ala Thr Gly Phe Pro Phe Lys 145 150 155 160 gca aaa cag tac gcc act acc tac atc aac atc gtc ggc aaa ctg ttc 528 Ala Lys Gln Tyr Ala Thr Thr Tyr Ile Asn Ile Val Gly Lys Leu Phe 165 170 175 aac gaa tgt gca gac ttc cgt cgt acc ggt tct gcg gcg ctg gat ctg 576 Asn Glu Cys Ala Asp Phe Arg Arg Thr Gly Ser Ala Ala Leu Asp Leu 180 185 190 gct tac gtc gct gcg ggt cgt gtt gac ggt ttc ttt gaa atc ggt ctg 624 Ala Tyr Val Ala Ala Gly Arg Val Asp Gly Phe Phe Glu Ile Gly Leu 195 200 205 cgc ccg tgg gac ttc gcc gca ggc gag ctg ctg gtt cgt gaa gcg ggc 672 Arg Pro Trp Asp Phe Ala Ala Gly Glu Leu Leu Val Arg Glu Ala Gly 210 215 220 ggc atc gtc agc gac ttc acc ggt ggt cat aac tac atg ctg acc ggt 720 Gly Ile Val Ser Asp Phe Thr Gly Gly His Asn Tyr Met Leu Thr Gly 225 230 235 240 aac atc gtt gct ggt aac ccg cgc gtt gtt aaa gcc atg ctg gcg aac 768 Asn Ile Val Ala Gly Asn Pro Arg Val Val Lys Ala Met Leu Ala Asn 245 250 255 atg cgt gac gag tta agc gac gct ctg aag cgt taa 804 Met Arg Asp Glu Leu Ser Asp Ala Leu Lys Arg 260 265 <210> 4 <211> 267 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 4 Met His Pro Met Leu Asn Ile Ala Val Arg Ala Ala Arg Lys Ala Gly 1 5 10 15 Asn Leu Ile Ala Lys Asn Tyr Glu Thr Pro Asp Ala Val Glu Ala Ser 20 25 30 Gln Lys Gly Ser Asn Asp Phe Val Thr Asn Val Asp Lys Ala Ala Glu 35 40 45 Ala Val Ile Ile Asp Thr Ile Arg Lys Ser Tyr Pro Gln His Thr Ile 50 55 60 Ile Thr Glu Glu Ser Gly Glu Leu Glu Gly Thr Asp Gln Asp Val Gln 65 70 75 80 Trp Val Ile Asp Pro Leu Asp Gly Thr Thr Asn Phe Ile Lys Arg Leu 85 90 95 Pro His Phe Ala Val Ser Ile Ala Val Arg Ile Lys Gly Arg Thr Glu 100 105 110 Val Ala Val Val Tyr Asp Pro Met Arg Asn Glu Leu Phe Thr Ala Thr 115 120 125 Arg Gly Gln Gly Ala Gln Leu Asn Gly Tyr Arg Leu Arg Gly Ser Thr 130 135 140 Ala Arg Asp Leu Asp Gly Thr Ile Leu Ala Thr Gly Phe Pro Phe Lys 145 150 155 160 Ala Lys Gln Tyr Ala Thr Thr Tyr Ile Asn Ile Val Gly Lys Leu Phe 165 170 175 Asn Glu Cys Ala Asp Phe Arg Arg Thr Gly Ser Ala Ala Leu Asp Leu 180 185 190 Ala Tyr Val Ala Ala Gly Arg Val Asp Gly Phe Phe Glu Ile Gly Leu 195 200 205 Arg Pro Trp Asp Phe Ala Ala Gly Glu Leu Leu Val Arg Glu Ala Gly 210 215 220 Gly Ile Val Ser Asp Phe Thr Gly Gly His Asn Tyr Met Leu Thr Gly 225 230 235 240 Asn Ile Val Ala Gly Asn Pro Arg Val Val Lys Ala Met Leu Ala Asn 245 250 255 Met Arg Asp Glu Leu Ser Asp Ala Leu Lys Arg 260 265 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR Primer for suhB Coding Region <400> 5 atgcatccga tgctgaac 18 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR Primer for suhB Coding Region <400> 6 ttaacgcttc agagcgtcg 19 <210> 7 <211> 109 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Promoter for suhB coding region <400> 7 gtcgtttttc tgcttaggat tttgttattt aaattaagcc tgtaatgcct tgcttccatt 60 gcggataaat cctacttttt tattgccttc aaataaattt aaggagttc 109 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR Primer for INO1 Coding Region <400> 8 atgacagaag ataatattgc tc 22 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR Primer for INO1 Coding Region <400> 9 ttacaacaat ctctcttcg 19 <210> 10 <211> 155 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Promoter for INO1 coding sequence <400> 10 ctcaagccca aaggaagagt gaggcgagtc agtcgcgtaa tgcttaggca caggattgat 60 ttgtcgcaat gattgacacg attccgcttg acgctgcgta aggtttttgt aattttacag 120 gcaacctttt attcactaac aaatagctgg tggaa 155

Claims

미오이노시톨 또는 미오이노시톨 유도체의 제조 방법으로서, 이하의 공정:
1) 내인성 이노시톨-1-인산 합성 효소를 발현하지 않는 미생물의 형질 전환체로서, 적어도 상기 형질 전환체 내에 발현 가능하게 도입된 이노시톨-1-인산 합성 효소를 코드하는 외래 유전자를 포함하며, 또한 상기 형질 전환체 내에서의 기능적인 이노시톨 모노포스파타아제의 과잉 생산 또는 이노시톨 모노포스파타아제의 활성화를 유도하는 유전자 재조합 또는 변이를 갖는 상기 형질 전환체를 준비하는 공정; 및
2) 상기 형질 전환체의 생육 및/또는 유지에 적합한 조건하에서, 상기 형질 전환체와 상기 형질 전환체에 의해 미오이노시톨로 변환될 수 있는 탄소원을 접촉시키는 공정
을 포함하는, 상기 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 미오이노시톨 유도체가, 하기의 구조식:

로 표시되는 화합물인 제조 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 내인성 이노시톨-1-인산 합성 효소를 발현하지 않는 미생물이 원핵 생물인 제조 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 내인성 이노시톨-1-인산 합성 효소를 발현하지 않는 미생물이, 내인성 이노시톨 모노포스파타아제 유전자를 갖는 미생물인 제조 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 내인성 이노시톨-1-인산 합성 효소를 발현하지 않는 미생물이, 대장균, 바실루스속 세균, 코리네박테리움속 세균, 자이모모나스속 세균으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 세균인 제조 방법.
제5항에 있어서, 상기 세균이 대장균인 제조 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이노시톨 모노포스파타아제의 과잉 생산이, 상기 미생물에 대하여,
a) 외래 이노시톨 모노포스파타아제 유전자를 도입하는 것,
b) 내인성 이노시톨 모노포스파타아제 유전자의 카피수를 증가시키는 것,
c) 내인성 이노시톨 모노포스파타아제 유전자의 조정 영역에 변이를 도입하는 것,
d) 내인성 이노시톨 모노포스파타아제 유전자의 조정 영역을 고발현 유도성 외래 조정 영역으로 치환하는 것, 또는
e) 내인성 이노시톨 모노포스파타아제 유전자의 조정 영역을 결실시키는 것
에 의해 유도되는 제조 방법.
제7항에 있어서, 상기 이노시톨 모노포스파타아제의 과잉 생산이, 상기 미생물에 대하여 외래 이노시톨 모노포스파타아제 유전자를 도입하는 것에 의해 유도되는 제조 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이노시톨 모노포스파타아제의 활성화가, 상기 미생물에 대하여,
f) 내인성 이노시톨 모노포스파타아제 유전자에 변이를 도입하는 것,
g) 내인성 이노시톨 모노포스파타아제 유전자의 일부 또는 전부를 치환하는 것,
h) 내인성 이노시톨 모노포스파타아제 유전자의 일부를 결실시키는 것,
i) 이노시톨 모노포스파타아제 활성을 저하시키는 다른 단백질을 감소시키는 것,
j) 이노시톨 모노포스파타아제 활성을 저하시키는 화합물의 생성을 감소시키는 것
에 의해 유도되는 제조 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탄소원이, 상기 형질 전환체 내에서 글루코오스-6-인산으로 변환될 수 있는 화합물을 포함하는 제조 방법.
제10항에 있어서, 상기 탄소원이, D-글루코오스, 수크로오스, 올리고당, 다당, 전분, 셀룰로오스, 쌀겨，폐당밀, 및 D-글루코오스를 함유하는 바이오매스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 제조 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탄소원과의 접촉하에 생육 및/또는 유지된 상기 형질 전환체의 배양물 중에 축적된 미오이노시톨 또는 미오이노시톨 유도체를 분리하는 공정을 더 포함하는 제조 방법.
내인성 이노시톨-1-인산 합성 효소를 발현하지 않는 미생물의 형질 전환체로서, 적어도 상기 형질 전환체 내에 발현 가능하게 도입된 이노시톨-1-인산 합성 효소를 코드하는 외래 유전자를 포함하며, 또한 상기 형질 전환체 내에서의 기능적인 이노시톨 모노포스파타아제의 과잉 생산 또는 이노시톨 모노포스파타아제의 활성화를 유도하는 유전자 재조합 또는 변이를 갖는 상기 형질 전환체.
제13항에 있어서, 상기 내인성 이노시톨-1-인산 합성 효소를 발현하지 않는 미생물이 원핵 생물인 형질 전환체.
제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 내인성 이노시톨-1-인산 합성 효소를 발현하지 않는 미생물이, 내인성 이노시톨 모노포스파타아제 유전자를 갖는 미생물인 형질 전환체.
제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 내인성 이노시톨-1-인산 합성 효소를 발현하지 않는 미생물이, 대장균, 바실루스속 세균, 코리네박테리움속 세균, 자이모모나스속 세균으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 세균인 형질 전환체.
제16항에 있어서, 상기 세균이 대장균인 형질 전환체.
제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이노시톨 모노포스파타아제의 과잉 생산이, 상기 미생물에 대하여,
a) 외래 이노시톨 모노포스파타아제 유전자를 도입하는 것,
b) 내인성 이노시톨 모노포스파타아제 유전자의 카피수를 증가시키는 것,
c) 내인성 이노시톨 모노포스파타아제 유전자의 조정 영역에 변이를 도입하는 것,
d) 내인성 이노시톨 모노포스파타아제 유전자의 조정 영역을 고발현 유도성 외래 조정 영역으로 치환하는 것, 또는
e) 내인성 이노시톨 모노포스파타아제 유전자의 조정 영역을 결실시키는 것
에 의해 유도되는 형질 전환체.
제18항에 있어서, 상기 이노시톨 모노포스파타아제의 과잉 생산이, 상기 미생물에 대하여 외래 이노시톨 모노포스파타아제 유전자를 도입하는 것에 의해 유도되는 형질 전환체.
제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이노시톨 모노포스파타아제의 활성화가, 상기 미생물에 대하여,
f) 내인성 이노시톨 모노포스파타아제 유전자에 변이를 도입하는 것,
g) 내인성 이노시톨 모노포스파타아제 유전자의 일부 또는 전부를 치환하는 것,
h) 내인성 이노시톨 모노포스파타아제 유전자의 일부를 결실시키는 것,
i) 이노시톨 모노포스파타아제 활성을 저하시키는 다른 단백질을 감소시키는 것,
j) 이노시톨 모노포스파타아제 활성을 저하시키는 화합물의 생성을 감소시키는 것
에 의해 유도되는 형질 전환체.
하기 구조식 :

로 표시되는 화합물.
미오이노시톨의 제조 방법으로서, 제21항에 기재된 미오이노시톨 유도체를, β-글리코시드 결합을 가수 분해하는 반응을 촉매할 수 있는 효소에 의해 분해하여, 미오이노시톨을 생성시키는 것을 특징으로 하는 상기 방법.
제21항에 기재된 미오이노시톨 유도체를 포함하는 조성물.