JP6576650B2 - グルコースの溶出抑制方法 - Google Patents
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Description
(1)ミオイノシトール生産能を有する微生物によりミオイノシトールを発酵生産する工程を含むミオイノシトールの製造方法であって、前記ミオイノシトール生産能を有する微生物の培養上清からミオイノシトールを回収する工程に先立って、当該微生物の培養物を40〜65℃の範囲の温度に保持する工程を含むことを特徴とする、ミオイノシトールの製造方法、
である。
(2)前記の温度が45〜60℃の範囲である、上記(1)に記載の製造方法;及び
(3)前記温度保持工程の後に、更に65℃を超える温度で培養物を加熱する工程を含む、上記(1)又は(2)に記載の製造方法、
である。
(4)前記ミオイノシトール生産能を有する微生物が遺伝子組換された微生物である、上記(1)乃至(3)のいずれかに記載の製造方法;
(5)前記ミオイノシトール生産能を有する微生物が培養上清中に49g/Lの濃度以上でミオイノシトールを生産する能力を有する微生物である、上記(4)に記載の製造方法;及び
(6)前記微生物が大腸菌である、上記(4)又は(5)に記載の製造方法、
を含む。
(1)ミオイノシトール生産能を有する微生物
本発明の発酵プロセスに用いることができる「ミオイノシトール生産能を有する微生物」は、グルコース等を基質として、典型的には、それが内因性の活性であるか外来遺伝子の導入によるものであるかを問わず、グルコース−6−リン酸を生成させる活性;グルコース−6−リン酸をミオイノシトール−1−リン酸へ変換する活性(つまり、イノシトール−1−リン酸合成酵素活性);及びミオイノシトール−1−リン酸を基質としたフォスファターゼ活性を発現することでミオイノシトールを生産できる微生物を意味する。前述のように、そのような微生物は特許文献1乃至12において公知であり、そのいずれもが使用し得る。
本発明の「ミオイノシトール生産能を有する微生物」は、ミオイノシトール生産のために当該微生物の生育及び/又は維持に適した条件下で培養及び維持される。各種の微生物のための好適な培地組成、培養条件、培養時間は当業者に公知である。
発酵プロセスは、培養上清中に生産されたミオイノシトールの量を、後記実施例の方法等により継時的に測定し、その生産量が極大に達した時点で終了することができる。具体的な培養時間は用いる菌株や培養温度、培地の種類などにより変化し得るが、大腸菌の形質転換体をジャー・ファーメンターで培養する場合には、8〜150時間を非限定的な例として挙げることができる。
(1)菌体からのグルコース溶出抑制のための温度制御
前記のとおり、従来は、発酵プロセスが終了した培養物からミオイノシトールを回収する工程で、生成したミオイノシトールが生産菌自体により分解されてしまったり、或いは雑菌に汚染されて他の物質へ転換されてしまったりすることを避けるため、発酵プロセスが終了した時点で培養物を高温に加熱して菌体を失活させ、且つ高温に維持したままで雑菌による汚染を抑制しつつ、ミオイノシトールの回収・精製プロセスを実施するのが通常であった。しかして、そのような従来の加熱では、当該目的に照らして、単に加熱温度が十分に高ければよい(例えば、80℃以上)とだけ認識されており、本発明者が知る限り、それを一定の温度範囲内に制御・保持することが顧みられたことはなかった。
本発明者は、後記実施例のとおり、上記のようにしていったん制御された加温処理を経たミオイノシトール生産菌の菌体からは、その後、当該菌体を高温に加熱しても、グルコースが溶出しないことを見出した。これは、グルコースを菌体内に保持させたままで高温殺菌できることを意味する。そのような高温殺菌は、遺伝子組換微生物の環境への拡散を防止するために望ましい処理である。
上記の培養物からミオイノシトールを回収及び精製する方法は当業者に公知である。具体的に、本発明の「温度保持工程」及び、場合により追加の加熱処理を実施した後の培養物を遠心分離や濾過して上清と菌体を分離し、培養上清からミオイノシトールを精製する。培養上清からミオイノシトールを精製する方法としては、pH調整等によるタンパク質沈澱を利用した除タンパク処理、活性炭を利用した不純物の吸着による除去、イオン交換樹脂等を利用したイオン性物質の吸着による除去を実施した後に、乾燥して得られた固体を、例えば水−エタノール系から再結晶することが挙げられる。本発明の「温度保持工程」を実施することで、培養上清には実質量のグルコースが溶出されていないため、例えば上記の再結晶だけでも、ミオイノシトールからグルコースを十分に分離できるであろう。
以下の実施例では、下記の条件でミオイノシトールを発酵により生産した。
a.ミオイノシトール生産菌:特許文献12の実施例2に記載の形質転換体を使用した。
b.前培養:上記a.のミオイノシトール生産菌を、LB平板培地上で37℃で培養し、よく生育した5つのコロニーから1白金耳ずつ、150mLの前培養培地(表1)を収容した500mLフラスコに接種した。前培養は、37℃で180rpmの回転培養により行った。
c.ジャー・ファーメンター培養:前培養のOD(600nm)が0.3〜0.5となった時点(約3時間)で、15g/Lの割合でグルコースを添加した合成培地(表2)の3Lを含む10L容ジャー・ファーメンター(丸菱バイオエンジ製)に対して前培養物(ジャー・ファーメンター内の培地に対して2%の比率)を接種した。
・培養温度 32℃;
・培養pH 6.0〔下限〕(28%(重量/容量)アンモニア水の添加により調節);
・攪拌 700rpm;
・通気 1vvm;
・原料となるグルコースについては、濃度が700g/Lのグルコース溶液を、培養液中のグルコース濃度が5g/Lを上回らない範囲になるように適宜添加した。
上記の培養で得た培養液の一部を4℃で、10,000g×10分間遠心分離して上清を回収し、培養上清のミオイノシトール濃度を測定した。具体的に、KS−G(ガードカラム)、Sugar KS−801及びSugar KS−802(いずれも商品名、昭和電工株式会社製)を連結してHPLC(検出器:RI、カラム温度:70℃、流速:1mL/min)を行うことで、培養上清中のミオイノシトール濃度を定量した。回収した培養液のミオイノシトール濃度は85g/Lであった。
実施例1と同様に、培養液を4℃で、10,000g×10分間遠心分離して上清を回収し、培養上清のミオイノシトール濃度を測定した。具体的に、KS−G(ガードカラム)、Sugar KS−801及びSugar KS−802(いずれも商品名、昭和電工株式会社製)を連結してHPLC(検出器:RI、カラム温度:70℃、流速:1mL/min)を行うことで、培養上清中のミオイノシトール濃度を定量した。回収した培養液のミオイノシトール濃度は85g/Lであった。
前記の条件で培養した、実施例1とは別のロットの培養液を4℃で、10,000g×10分間遠心分離して上清を回収し、培養上清のミオイノシトール濃度を測定した。具体的に、KS−G(ガードカラム)、Sugar KS−801及びSugar KS−802(いずれも商品名、昭和電工株式会社製)を連結してHPLC(検出器:RI、カラム温度:70℃、流速:1mL/min)を行うことで、培養上清中のミオイノシトール濃度を定量した。回収した培養液のミオイノシトール濃度は100g/Lであった。
実施例3と同様に、培養液を4℃で、10,000g×10分間遠心分離して上清を回収し、培養上清のミオイノシトール濃度を測定した。具体的に、KS−G(ガードカラム)、Sugar KS−801及びSugar KS−802(いずれも商品名、昭和電工株式会社製)を連結してHPLC(検出器:RI、カラム温度:70℃、流速:1mL/min)を行うことで、培養上清中のミオイノシトール濃度を定量した。回収した培養液のミオイノシトール濃度は100g/Lであった。
Claims (4)
- ミオイノシトール生産能を有する微生物によりミオイノシトールを発酵生産する工程を含むミオイノシトールの製造方法であって、前記ミオイノシトール生産能を有する微生物の培養上清からミオイノシトールを回収する工程に先立って、当該微生物の培養物を40〜65℃の範囲の温度に保持する工程を含むことを特徴とし、但し、前記ミオイノシトール生産能を有する微生物が遺伝子組換された大腸菌である、ミオイノシトールの製造方法。
- 前記の温度が45〜60℃の範囲である、請求項1に記載の製造方法。
- 前記温度保持工程の後に、更に65℃を超える温度で培養物を加熱する工程を含む、請求項1又は2に記載の製造方法。
- 前記ミオイノシトール生産能を有する微生物が培養上清中に49g/Lの濃度以上でミオイノシトールを生産する能力を有する微生物である、請求項1乃至3のいずれか1項に記載の製造方法。
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