CN113811524A - 香兰素的制造方法 - Google Patents

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Abstract

提供一种从发酵液中回收香兰素等目标物质的方法。当通过使用了有机溶剂的溶剂提取从含有目标物质的发酵液中回收目标物质时，通过先用蛋白酶处理发酵液再进行溶剂提取，或将搅拌动力调整至指定的范围内以实施溶剂提取，能够防止溶剂提取时的乳化，由此能够从发酵液中回收目标物质。

Description

香兰素的制造方法
技术领域
本发明涉及从发酵液中回收香兰素等目标物质的方法。
背景技术
从发酵液等水层中回收物质，例如，可以通过使用了有机溶剂的溶剂提取而实施。然而，众所周知，在对含有各种杂质的发酵液进行溶剂提取时，存在水层和有机层之间发生乳化，层间的分离性降低的情况(专利文献1～2)。具体而言，例如，已知对乳酸发酵液中的乳酸进行溶剂提取时，发酵液中的杂蛋白会导致水层和有机层的分离性降低，因此提出了在溶剂提取前将杂蛋白除去的方案(专利文献1)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2011-177159
专利文献2：WO2010/114552
发明内容
本发明所要解决的技术问题
本发明以提供一种从发酵液中回收香兰素等目标物质的方法为问题。
解决技术问题的技术手段
本发明者为解决所述问题而进行了深入的研究，结果发现，在以使用了有机溶剂的溶剂提取从含有香兰素的发酵液中回收香兰素时，通过用蛋白酶处理发酵液后再进行溶剂提取，或将搅拌动力调整到指定的范围内而实施溶剂提取，能够防止溶剂提取时的乳化，从而完成了本发明。
即，本发明如下所示：
[1]、一种目标物质的制造方法，其包含下述工序(1A)和(1B)：
(1A)用蛋白酶处理含有目标物质的发酵液的工序；和
(1B)用有机溶剂从所述处理后的发酵液中提取该目标物质的工序，
所述蛋白酶为选自来源于芽孢杆菌(Bacillus)属细菌的蛋白酶和来源于曲霉(Aspergillus)属真菌的蛋白酶中的1种或1种以上的蛋白酶。
[2]如上所述的方法，其中，
所述目标物质为芳香族醛。
[3]如上所述的方法，其中，
所述目标物质为香兰素。
[4]如上所述的方法，其中，
所述蛋白酶为蛋白酶M“天野”SD、蛋白酶A“天野”SD或蛋白酶P“天野”3SD的情况除外。
[5]如上所述的方法，其中，
所述蛋白酶为选自丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶中的1种或1种以上的蛋白酶。
[6]如上所述的方法，其中，
所述蛋白酶为选自枯草杆菌蛋白酶和Bacillolysin中的1种或1种以上的蛋白酶。
[7]如上所述的方法，其中，
所述蛋白酶为选自来源于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的蛋白酶、来源于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的蛋白酶和来源于米曲霉菌(Aspergillus oryzae)的蛋白酶中的1种或1种以上的蛋白酶。
[8]如上所述的方法，其中，
所述蛋白酶为选自ALCALASE(注册商标)2.4L FG、PROTIN SD-NY10、PROTIN SD-AY10和ProteAX(注册商标)中的1种或1种以上的蛋白酶。
[9]如上所述的方法，其中，
相对于发酵液100mL，所述蛋白酶的使用量以用福林法测定的蛋白酶活性计为10～500000U、以用LNA法测定的蛋白酶活性计为0.2～10000U或以用Anson法测定的蛋白酶活性计为0.5～20000mAU。
[10]如上所述的方法，其中，
所述有机溶剂为选自甲苯、乙酸乙酯和乙酸丁酯中的1种或1种以上的成分。
[11]如上所述的方法，其中，
所述工序(1A)中的所述发酵液为除菌后的发酵液。
[12]如上所述的方法，其中，
所述工序(1B)在搅拌条件下实施。
[13]如上所述的方法，其在所述工序(1A)之前，进一步包含：利用具有目标物质生产能力的微生物生成所述目标物质，从而获得所述发酵液的工序。
[14]如上所述的方法，其在所述工序(1B)之后，进一步包含：对含有所述目标物质的有机层进行回收的工序。
[15]如上所述的方法，其进一步包含：从所述有机层中纯化出所述目标物质的工序。
[16]、一种目标物质的制造方法，其包含下述工序(2A)：
(2A)用有机溶剂从含有目标物质的发酵液中提取该目标物质的工序，
所述工序(2A)通过以经过调整的搅拌动力搅拌所述发酵液和所述有机溶剂来实施。
[17]如上所述的方法，其中，
所述目标物质为芳香族醛。
[18]如上所述的方法，其中，
所述目标物质为香兰素。
[19]如上所述的方法，其中，
所述经过调整的搅拌动力为使液液界面得到保持的搅拌动力。
[20]如上所述的方法，其中，
所述经过调整的搅拌动力超过0且为20W/kL以下。
[21]如上所述的方法，其中，
所述经过调整的搅拌动力超过0且为15W/kL以下。
[22]如上所述的方法，其中，
所述经过调整的搅拌动力超过0且为10W/kL以下。
[23]如上所述的方法，其中，
所述经过调整的搅拌动力为1.5W/kL以上。
[24]如上所述的方法，其中，
所述有机溶剂为选自甲苯、乙酸乙酯和乙酸丁酯中的1种或1种以上的成分。
[25]如上所述的方法，其中，
所述有机溶剂为甲苯，所述经过调整的搅拌动力超过0且为20W/kL以下。
[26]如上所述的方法，其中，
所述有机溶剂为乙酸乙酯，所述经过调整的搅拌动力超过0且为10W/kL以下。
[27]如上所述的方法，其中，
所述发酵液为含有菌体的发酵液。
[28]如上所述的方法，其在所述工序(2A)之前，进一步包含：利用具有目标物质生产能力的微生物生成所述目标物质，从而获得所述发酵液的工序。
[29]如上所述的方法，其在所述工序(2A)之后，进一步包含：对含有所述目标物质的有机层进行回收的工序。
[30]如上所述的方法，其进一步包含：从所述有机层中纯化出所述目标物质的工序。
附图说明
[图1]表示通过蛋白酶(ALCALASE 2.4L FG)处理，在使用甲苯对香兰素进行溶剂提取时，对乳化的防止效果的图(照片)。
[图2]表示通过蛋白酶(ALCALASE 2.4L FG)处理，香兰素发酵液中的杂蛋白的分解情况的图(照片)。
[图3]表示通过蛋白酶(ALCALASE 2.4L FG)处理，在使用乙酸乙酯或乙酸丁酯对香兰素进行溶剂提取时，对乳化的防止效果的图(照片)。
[图4]表示通过以各种蛋白酶进行的处理，在使用乙酸丁酯对香兰素进行溶剂提取时，对乳化的防止效果的图(照片)。
[图5]表示在使用甲苯从发酵液中对香兰素进行溶剂提取时，搅拌动力对收率和提取时间造成的影响的图。
[图6]表示在使用甲苯从发酵液中对香兰素进行溶剂提取时，搅拌动力对收率和传质系数造成的影响的图。
[图7]表示在使用乙酸乙酯从发酵液中对香兰素进行溶剂提取时，搅拌动力对收率造成的影响的图。
本发明的具体实施方式
以下，将对本发明详细地进行说明。
作为本发明的方法，可以举出以下的第1方式、第2方式。
本发明的方法的第1方式为包含下述工序(1A)和(1B)的方法：
(1A)用蛋白酶处理含有目标物质的发酵液的工序；和
(1B)用有机溶剂从所述处理后的发酵液中提取所述目标物质的工序。
在本发明的方法的第1方式中，也将工序(1A)称为“蛋白酶处理”或“蛋白酶处理工序”。在本发明的方法的第1方式中，也将工序(1B)称为“溶剂提取”或“溶剂提取工序”。
通过在实施蛋白酶处理后实施溶剂提取，能够防止溶剂提取时的乳化，即，可得到防止溶剂提取时的乳化的效果。在本发明的方法的第1方式中，也将该效果称为“乳化防止效果”。即，本发明的方法(具体而言，本发明的方法的第1方式)可以是防止用有机溶剂从含有目标物质的发酵液中提取该目标物质时的乳化的方法。
本发明的方法的第2方式是包含下述工序(2A)的方法：
(2A)用有机溶剂从含有目标物质的发酵液中提取该目标物质的工序，
所述工序(2A)通过以经过调整的搅拌动力搅拌所述发酵液和所述有机溶剂而实施。
在本发明的方法的第2方式中，也将工序(2A)称为“溶剂提取”或“溶剂提取工序”。
通过以经过调整的搅拌动力实施溶剂提取，能够防止溶剂提取时的乳化，即，可得到防止溶剂提取时的乳化的效果。在本发明的方法的第2方式中，也将该效果称为“乳化防止效果”。即，本发明的方法(具体而言，本发明的方法的第2方式)可以是防止用有机溶剂从含有目标物质的发酵液中提取该目标物质时的乳化的方法。
此外，通过乳化防止效果，能够高效地将含有目标物质的有机层从水层中分离，由此能够从发酵液中回收目标物质。换言之，通过乳化防止效果，能够高效地将含有目标物质的有机层从水层中分离，由此能够纯化目标物质。即，本发明的方法也可以是目标物质的纯化方法。此外，换言之，通过乳化防止效果，能够高效地将含有目标物质的有机层从水层中分离，由此能够取得目标物质。即，本发明的方法也可以是目标物质的制造方法。
乳化防止效果可以以溶剂提取时的乳化的程度为指标进行测定。乳化的程度，例如，可以作为乳液层的高度与包含乳液层的有机层(Organic Layer；OL)的高度的比率[％/OL]而测定。也将该比率称为“乳液产生量”。在本发明的方法的第1方式中，在实施蛋白酶处理后实施溶剂提取的情况下的乳液产生量，例如，可以为20[％/OL]以下、15[％/OL]以下、10[％/OL]以下、5[％/OL]以下、2[％/OL]以下、1[％/OL]以下、或0。在实施蛋白酶处理后实施溶剂提取的情况下的乳液产生量，例如，可以是在不实施蛋白酶处理而实施溶剂提取的情况下的乳液产生量的0.2倍以下、0.15倍以下、0.1倍以下、0.05倍以下、0.02倍以下、0.01倍以下、或0。在本发明的方法的第2方式中，溶剂提取时的乳液产生量，例如，可以是20[％/OL]以下、15[％/OL]以下、10[％/OL]以下、5[％/OL]以下、2[％/OL]以下、1[％/OL]以下、或0。需要说明的是，只要没有特别记载，乳化的程度是指，停止溶剂提取的操作(即，在本发明的方法的第1方式的情况下，例如，为搅拌或振荡；在本发明的方法的第2方式的情况下，为搅拌)后5分钟时的乳化程度。
<1>含有目标物质的发酵液和其制造
“含有目标物质的发酵液”是指，含有目标物质的液体原材料，其是通过利用具有目标物质生产能力的微生物(即通过具有目标物质生产能力的微生物的作用)而得到的。也将含有目标物质的发酵液称为“目标物质的发酵液”或简单称为“发酵液”。
就目标物质而言，只要是能够用有机溶剂从发酵液中提取的物质，就无特别限制。作为目标物质，可以举出醛。作为醛，可以举出芳香族醛。作为芳香族醛，可以举出香兰素(vanillin)、苯甲醛(benzaldehyde)、肉桂醛(cinnama ldehyde)。作为芳香族醛，特别是，可以举出香兰素。发酵液可以含有1种目标物质，也可以含有2种或2种以上的目标物质。
含有目标物质的发酵液是通过利用具有目标物质生产能力的微生物而(即通过具有目标物质生产能力的微生物的作用)得到的。具体而言，可以通过利用具有目标物质生产能力的微生物(即通过具有目标物质生产能力的微生物的作用)生成目标物质，由此得到该含有目标物质的发酵液。本发明的方法也可以包含如此取得发酵液的工序。
就目标物质而言，例如，可以由碳源生成，也可以由目标物质的前体生成。也将目标物质由碳源生成的情况称为“狭义的发酵”。也将目标物质由其前体生成的情况称为“生物转化”。需要说明的是，为了方便说明，而使用“发酵液”这一用语，但“发酵液”不限于通过狭义的发酵而得到，也包含通过生物转化的得到的发酵液。
<1-1>具有目标物质生产能力的微生物
含有目标物质的发酵液的制造中使用了具有目标物质生产能力的微生物。“目标物质生产能力”是指，生产目标物质的能力。即，“具有目标物质生产能力的微生物”是指，能够生产目标物质的微生物。
在将微生物用于狭义的发酵的情况下，“具有目标物质生产能力的微生物”可以是指，能够通过狭义的发酵生产目标物质的微生物。即，“具有目标物质生产能力的微生物”可以是指，可以从碳源生产目标物质的微生物。“具有目标物质生产能力的微生物”可以是指，具体而言，在用培养基(例如，含有碳源的培养基)进行培养时，能够生产目标物质，并使其在培养基中积蓄到可回收的程度的微生物。
在将微生物用于生物转化的情况下，“具有目标物质生产能力的微生物”可以是指，能够通过生物转化生产目标物质的微生物。即，“具有目标物质生产能力的微生物”可以是指，能够从该目标物质的前体生产目标物质的微生物。“具有目标物质生产能力的微生物”可以是指，具体而言，在用培养基(例如，含有碳源和目标物质的前体的培养基)培养时，能够生产目标物质，并使其在培养基中积蓄到可回收的程度的微生物。此外，“具有目标物质生产能力的微生物”可以是指，具体而言，使其在反应液中作用于目标物质的前体时，能够生产目标物质，并使其在反应液中积蓄到可回收的程度的微生物。
就具有目标物质生产能力的微生物而言，例如，可以使目标物质在培养基中或反应液中积蓄到0.01g/L以上、0.05g/L以上、0.1g/L以上、0.5g/L以上、或1.0g/L以上的量。
微生物可以是能够生产1种目标物质，也可以是能够生产2种或2种以上的目标物质。此外，微生物可以是能够由1种目标物质前体生产目标物质的微生物，也可以是能够由2种或2种以上的目标物质前体生产目标物质的微生物。
微生物可以是原本就具有目标物质生产能力的微生物，也可以是经过修饰而具有目标物质生产能力的微生物。就具有目标物质生产能力的微生物而言，例如，可以通过以下方式而取得：如下所述地赋予微生物目标物质生产能力，或，如下所述地增强微生物的目标物质生产能力。
作为用于构建具有目标物质生产能力的微生物的亲本株而使用的微生物无特别限制。作为微生物，可以举出细菌、酵母。
作为细菌，可以举出属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的细菌、棒状细菌。
作为属于肠杆菌科的细菌，可以举出属于埃希氏菌(Escherichia)属、肠杆菌(Enterobacter)属、泛菌(Pantoea)属、克雷伯氏菌(Klebsiella)属、沙雷氏菌(Serratia)属、欧文氏菌(Erwinia)属、光杆状菌(Photorhabdus)属、普罗威登斯菌(Providencia)属、沙门氏菌(Salmonella)属、摩根菌(Morganella)等属的细菌。具体而言，可以使用根据NCBI(National Center for Biotechnology Information)的数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi？id＝91347)中使用的分类法被分类为肠杆菌科的细菌。
作为埃希氏菌属细菌，无特别限制，可以举出根据微生物学的专家所知的分类被分类为埃希氏菌属的细菌。作为埃希氏菌属细菌，例如，可以举出Neidhardt等的著作(Backmann,B.J.1996.Derivations and Genotypes of some mutant derivatives ofEscherichia coli K-12,p.2460-2488.Table 1.In F.D.Neidhardt(ed.),Escherichiacoli and Salmonella Cellular and Molecul ar Biology/Second Edition,AmericanSociety for Microbiology Press,Washi ngton,D.C.)中所记载的细菌。作为埃希氏菌属细菌，例如，可以举出大肠杆菌(Escherichia coli)。作为大肠杆菌，具体而言，例如，可以举出W3110株(ATCC 27325)、MG1655株(ATCC 47076)等大肠杆菌K-12株；大肠杆菌K5株(ATCC 23506)；BL21(DE3)株等大肠杆菌B株；和它们的衍生株。
作为肠杆菌属细菌，无特别限制，可以举出根据微生物学的专家所知的分类而被分类为肠杆菌属的细菌。作为肠杆菌属细菌，例如，可以举出成团肠杆菌(Enterobacteragglomerans)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)。作为成团肠杆菌，具体而言，例如，可以举出成团肠杆菌ATCC12287株。作为产气肠杆菌，具体而言，例如，可以举出产气肠杆菌ATCC13048株、NBRC12 010株(Biotechonol Bioeng.2007Mar 27；98(2)340-348)、AJ110637株(FER M BP-10955)。此外，作为肠杆菌属细菌，例如，可以举出欧州专利申请公开EP0952221号说明书中记载的细菌。需要说明的是，成团肠杆菌(Enterobacteragglomerans)中也存在被分类为成团泛菌(Pantoea agglomerans)的细菌。
作为泛菌属细菌，无特别限制，可以举出根据微生物学的专家所知的分类而被分类为泛菌属的细菌。作为泛菌属细菌，例如，可以举出菠萝泛菌(Pantoea ananatis)、斯氏泛菌(Pantoea stewartii)、成团泛菌(Pantoea agglomerans)、柠檬泛菌(Pantoeacitrea)。作为菠萝泛菌，具体而言，例如，可以举出菠萝泛菌LMG20103株、AJ13355株(FERMBP-6614)、AJ13356株(FERM BP-6615)、AJ13601株(FERM BP-7207)、SC17株(FERM BP-11091)、SC17(0)株(VKPM B-9246)、以及SC17sucA株(FERM BP-8646)。需要说明的是，在肠杆菌属细菌、欧文氏菌属细菌中，也存在被再分类为泛菌属的细菌(Int.J.Syst.Bacteriol.,39,337-345(1989)；Int.J.Syst.Bacteriol.,43,162-173(1993))。例如，成团肠杆菌的某种细菌，最近，根据16S rRNA的碱基序列分析等，被再分类为了成团泛菌、菠萝泛菌、玉米细菌性枯萎病菌等(Int.J.Syst.Bacteriol.,39,337-345(1989))。泛菌属细菌中可以包含这些被再分类为泛菌属的细菌。
作为欧文氏菌属细菌，可以举出梨火疫菌(Erwinia amylovora)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)。作为克雷伯氏菌属细菌，可以举出植生克雷伯菌(Klebsiellaplanticola)。
作为棒状细菌，可以举出属于棒状杆菌(Corynebacterium)属、短杆菌(Brevibacterium)属、和微杆菌(Microbacterium)属等属的细菌。
作为棒状细菌，具体而言，可以举出下述的种。
嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)
醋谷棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)
解烷棒杆菌(Corynebacterium alkanolyticum)
帚石南棒杆菌(Corynebacterium callunae)
钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)
谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)
百合棒状杆菌(Corynebacterium lilium)
以栖糖蜜棒杆菌(Corynebacterium melassecola)
嗜热产氨棒杆菌(有效棒杆菌)(Corynebacterium thermoaminogenes(Corynebacterium efficiens))
力士棒杆菌(Corynebacterium herculis)
散枝短杆菌(谷氨酸棒状杆菌)(Brevibacterium divaricatum(Corynebacterium glutamicum))
黄色短杆菌(谷氨酸棒状杆菌)(Brevibacterium flavum(Corynebacteriumglutamicum))
未成熟短杆菌(Brevibacterium immariophilum)
乳糖发酵短杆菌(谷氨酸棒状杆菌)(Brevibacterium lactofermentum(Corynebacterium glutamicum))
玫瑰色短杆菌(Brevibacterium roseum)
解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)
硫殖短杆菌(Brevibacterium thiogenitalis)
产氨棒杆菌(停滞棒杆菌)(Corynebacterium ammoniagenes(Corynebacteri umstationis))
白短杆菌(Brevibacterium album)
蜡状短杆菌(Brevibacterium cerinum)
嗜氨微杆菌(Microbacterium ammoniaphilum)
作为棒状细菌，具体而言，可以举出下述的菌株。
嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC 13870
醋谷棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)ATCC 15806
解烷棒杆菌(Corynebacterium alkanolyticum)ATCC 21511
石南棒杆菌(Corynebacterium callunae)ATCC 15991
钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)AS1.542
谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13020,ATCC 130 32,ATCC13060,ATCC 13869,FERM BP-734
百合棒状杆菌(Corynebacterium lilium)ATCC 15990
以栖糖蜜棒杆菌(Corynebacterium melassecola)ATCC 17965
有效棒杆菌(嗜热产氨棒杆菌)(Corynebacterium efficiens(Corynebacteriu mthermoaminogenes))AJ12340(FERM BP-1539)
力士棒杆菌(Corynebacterium herculis)ATCC 13868
散枝短杆菌(谷氨酸棒状杆菌)(Brevibacterium divaricatum(Corynebacterium glutamicum))ATCC 14020
黄色短杆菌(谷氨酸棒状杆菌)(Brevibacterium flavum(Corynebacteriumglutamicum))ATCC 13826,ATCC 14067,AJ12418(FERM BP-2205)
未成熟短杆菌(Brevibacterium immariophilum)ATCC 14068
乳糖发酵短杆菌(谷氨酸棒状杆菌)(Brevibacterium lactofermentum(Corynebacterium glutamicum))ATCC 13869
玫瑰色短杆菌(Brevibacterium roseum)ATCC 13825
解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)ATCC 14066
硫殖短杆菌(Brevibacterium thiogenitalis)ATCC 19240
产氨棒杆菌(停滞棒杆菌)(Corynebacterium ammoniagenes(Corynebacteri umstationis))ATCC 6871,ATCC 6872
白短杆菌(Brevibacterium album)ATCC 15111
蜡状短杆菌(Brevibacterium cerinum)ATCC 15112
嗜氨微杆菌(Microbacterium ammoniaphilum)ATCC 15354
需要说明的是，棒状杆菌属细菌中，也包含以往被分类为短杆菌属，但现在被统合到棒状杆菌属中的细菌(Int.J.Syst.Bacteriol.,41,255(1991))。此外，停滞棒杆菌中，也包含以往被分类为产氨棒杆菌，但通过16S rRNA的碱基序列解析等而被再分类为停滞棒杆菌的细菌(Int.J.Syst.Evol.Microbio l.,60,874-879(2010))。
酵母可以是出芽酵母，也可以是裂殖酵母。酵母可以是一倍体的酵母，也可以是二倍体或二倍体以上的倍数性的酵母。作为酵母，可以举出属于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)等的酵母属、西弗毕赤酵母(Pichia ciferrii)、赛道威毕赤酵母(Pichiasydowiorum)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)等的毕赤醇母属(也称为威克汉姆酵母(Wickerhamomyces)属)、产朊假丝酵母(Candid a utilis)等的假丝酵母属、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)等的汉逊酵母属、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)等的裂殖酵母属的酵母。
这些菌株，例如，可以从ATCC(American type culture collection)(地址12301Parklawn Drive,Rockville,Maryland 20852P.O.Box 1549,Manassas,VA 20108,United States of America)处获得。即，各菌株被赋予了对应的登录编号，可以利用该登录编号来获取(参照http://www.atcc.org/)。各菌株对应的登录编号记载在ATCC的目录中。此外，这些菌株，例如，可以从保藏有各菌株的保藏机关处获得。
赋予或增强目标物质生产能力的方法，无特别限制。作为赋予或增强目标物质生产能力的方法，例如，可以利用公知的方法。赋予或增强香兰素等芳香族醛的生产能力的方法，例如，在WO2018/079687、WO2018/079686、WO2018/079685、WO2018/079684、WO2018/079683、WO2017/073701、WO 2018/079705、WO2017/122747中公开。
以下，就赋予或增强目标物质生产能力的方法具体地进行例示。需要说明的是，如以下例示的用于赋予或增强目标物质生产能力的修饰，全部都可以单独使用，或适宜地组合使用。
目标物质可以通过参与目标物质的生物合成的酶的作用而生成。这样的酶也称为“目标物质生物合成酶”。因此，微生物可以具有目标物质生物合成酶。换言之，微生物可以具有编码目标物质生物合成酶的基因。这样的基因也称为“目标物质生物合成基因”。微生物可以是原本就具有目标物质生物合成基因的微生物，也可以是导入了目标物质生物合成基因的微生物。导入基因的方法在下文记述。
此外，通过提高目标物质生物合成酶的活性，能够提高微生物的目标物质生产能力。即，作为用于赋予或增强目标物质生产能力的方法，可以举出使目标物质生物合成酶的活性提高的方法。即，微生物可以进行修饰以使得目标物质生物合成酶的活性提高。在微生物中，可以使1种目标物质生物合成酶的活性提高，也可以使2种或2种以上的目标物质生物合成酶的活性提高。使蛋白质(酶等)的活性提高的方法在下文记述。就蛋白质(酶等)的活性而言，例如，可以通过使编码该蛋白质的基因的表达提高，而使之提高。
作为目标物质生物合成基因和目标物质生物合成酶，可以举出上述例示的微生物等各种生物的基因、酶。作为目标物质生物合成基因和目标物质生物合成酶，具体而言，可以举出肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的细菌(例如，E.coli等的Escherichia属细菌)、棒状细菌(例如，C.glutamicum等的Coryneb acterium属细菌)的基因、酶。此外，作为目标物质生物合成基因和目标物质生物合成酶，还可以举出以下单独例示的生物的基因和酶。就来源于各种生物的目标物质生物合成基因的碱基序列和其编码的目标物质生物合成酶的氨基酸序列而言，例如，可以通过NCBI等公开数据库、专利文献等技术文献中取得。对于目标物质生物合成基因和目标物质生物合成酶以外的、可用于赋予或增强目标物质生产能力的基因和蛋白质而言，也是同样的。
就目标物质而言，例如，可以由碳源和/或该目标物质的前体生成。因此，作为目标物质生物合成酶，例如，可以举出对碳源和/或前体转化为目标物质的反应进行催化的酶。例如，就作为香兰素生物合成通路的中间体的3-脱氢莽草酸(3-dehydroshikimic acid)而言，可以通过莽草酸通路的一部分进行生产。该莽草酸通路的一部分可以包含由3-脱氧-D-阿拉伯庚糖酮酸-7-磷酸合成酶(3-deoxy-D-arabino-heptulosonic acid 7-phosphatesynthase；DAHP合成酶)、3-脱氢奎尼酸合成酶(3-dehydroquinate synthase)、和3-脱氢奎尼酸脱水酶(3-dehydroquinate dehydratase)催化的步骤。3-脱氢莽草酸可以通过3-脱氢莽草酸脱水酶(3-dehydroshikimate dehydratase；DHSD)的作用而转化为原儿茶酸(protocatechuic acid)。原儿茶酸可以通过O-甲基转移酶(O-methyltransferase；OM T)或芳香族醛氧化还原酶(aromatic aldehyde oxidoreductase)(也称为芳香族羧酸还原酶(aromatic carboxylic acid reductase；ACAR))的作用，分别转化为香兰素酸(vanillicacid)或原儿茶醛(protocatechualdehyde)。香兰素酸或原儿茶醛分别可以通过ACAR或OMT的作用而转化为香兰素。此外，苯甲醛和肉桂醛分别可以通过ACAR的作用而由苯甲酸(benzoic acid)和肉桂酸(cinnamic acid)生成。即，作为目标物质生物合成酶，具体而言，例如，可以举出DAHP合成酶、3-脱氢奎尼酸合成酶(3-dehydroquinate synthase)、3-脱氢奎尼酸脱水酶(3-dehydroquinate dehydratase)、DHSD、OMT、ACAR(WO2018/079687、WO2018/079686、WO2018/079685、WO2018/079684、WO2018/079683、WO 2017/073701、WO2018/079705)。
“3-脱氧-D-阿拉伯庚糖酮酸-7-磷酸合成酶(3-deoxy-D-arabino-heptuloson icacid 7-phosphate synthase；DAHP合成酶)”可以是指，具有对将D-赤藓糖4-磷酸和磷酸烯醇丙酮酸转化为D-阿拉伯庚糖酮酸-7-磷酸(DAHP)和磷酸的反应进行催化的活性的蛋白质(EC 2.5.1.54)。也将该活性称为“DAHP合成酶活性”。也将编码DAHP合成酶的基因称为“DAHP合成酶基因”。作为DAHP合成酶，可以举出aroF、aroG、aroH基因分别编码的AroF、AroG、Ar oH蛋白。
“3-脱氢奎尼酸合成酶(3-dehydroquinate synthase)”可以是指，具有对使DAHP脱磷氧化而生成3-脱氢奎尼酸的反应进行催化的活性的蛋白质(EC 4.2.3.4)。也将该活性称为“3-脱氢奎尼酸合成酶活性”。也将编码3-脱氢奎尼酸合成酶的基因称为“3-脱氢奎尼酸合成酶基因”。作为3-脱氢奎尼酸合成酶，可以举出aroB基因编码的AroB蛋白。
“3-脱氢奎尼酸脱水酶(3-dehydroquinate dehydratase)”可以是指，具有对使3-脱氢奎尼酸脱水而生成3-脱氢莽草酸的反应进行催化的活性的蛋白质(EC 4.2.1.10)。也将该活性称为“3-脱氢奎尼酸脱水酶活性”。也将编码3-脱氢奎尼酸脱水酶的基因称为“3-脱氢奎尼酸脱水酶基因”。作为3-脱氢奎尼酸脱水酶，可以举出aroD基因编码的AroD蛋白。
“3-脱氢莽草酸脱水酶(3-dehydroshikimate dehydratase；DHSD)”可以是指，具有对使3-脱氢莽草酸脱水而生成原儿茶酸的反应进行催化的活性的蛋白质(EC4.2.1.118)。也将该活性称为“DHSD活性”。也将编码DHSD的基因称为“DHSD基因”。作为DHSD，可以举出asbF基因编码的AsbF蛋白。作为DHSD，具体而言，可以举出苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)、粉色面包霉菌(Neurospora crassa)、柄孢壳菌(Podosporapauciseta)等各种生物的DHS D。
编码莽草酸通路的酶(DAHP合成酶、3-脱氢奎尼酸合成酶(3-dehydroquin atesynthase)、3-脱氢奎尼酸脱水酶(3-dehydroquinate dehydratase)等)的基因的表达被tyrR基因编码的Tyrosine repressor TyrR抑制。因此，也可通过降低Tyrosine repressorTyrR的活性，使莽草酸通路的酶的活性提高。
“O-甲基转移酶(O-methyltransferase；OMT)”可以是指，具有对在甲基供体的存在下使作为基质的羟基甲基化的反应进行催化的活性的蛋白质(EC2.1.1.68等)。也将该活性称为“OMT活性”。也将编码OMT的基因称为“OMT基因”。OMT可以根据制造发酵液时生产目标物质的生物合成通路的种类而具有需要的基质特异性。例如，在经由原儿茶酸到香兰素酸的转化而生产目标物质的情况下，可以使用至少以原儿茶酸作为基质的OMT。此外，例如，在经由原儿茶醛到香兰素的转化而生产目标物质的情况下，可以使用至少以原儿茶醛为基质的OMT。即，“O-甲基转移酶(O-methyltransferase；OMT)”可以是指，具体而言，具有对在甲基供体的存在下使原儿茶酸和/或原儿茶醛甲基化而生成香兰素酸和/或香兰素的反应(即间位的羟基的甲基化)进行催化的活性的蛋白质。OMT通常可以对原儿茶酸和原儿茶醛双方具有特异性，但不限于此。作为甲基供体，可以举出S-腺苷甲硫氨酸(SAM)。
作为OMT，可以举出各种生物的OMT，例如，智人(Homo sapiens，Hs)的OMT(GenBankAccession No.NP_000745,NP_009294)、拟南芥(Arabidop sis thaliana)的OMT(GenBankAccession No.NP_200227,NP_009294)、草莓(Fragaria x ananassa)的OMT(GenBankAccession No.AAF28353)、其它WO 2013/022881A1中例示的哺乳动物、植物、微生物的各种OMT。Homo sapie ns的OMT基因已发现有4种转录变体和2种OMT同源异构体。作为OMT，进一步，可以举出拟杆菌门(Bacteroidetes)细菌(即属于拟杆菌(Bacteroidetes)门的细菌)的OMT。作为拟杆菌(Bacteroidetes)门细菌，可以举出属于农研丝杆菌(Niastella)属、土生单胞菌(Terrimonas)属或噬几丁质菌(Chitinophaga)属等的细菌(InternationalJournal of Systematic and Evolutionary Microbiology(2007),57,1828-1833)。作为农研丝杆菌(Niastella)属细菌，可以举出韩国农研所丝杆菌(Niastella koreensis)。作为OMT，可以进一步举出WO2013/022881或WO2018/079683所述的变异型OMT。
就OMT活性而言，例如，可以通过如下方法进行测定：在SAM的存在下将酶和基质(例如，原儿茶酸或原儿茶醛)一同孵育，对依赖于酶和基质的产物(例如，香兰素酸或香兰素)的生成进行测定(WO2013/022881A1)。
“芳香族醛氧化还原酶(aromatic aldehyde oxidoreductase)(芳香族羧酸还原酶(aromatic carboxylic acid reductase；ACAR))”可以是指，具有对在电子供体和ATP的存在下使芳香族羧酸还原而生成对应的芳香族醛的反应进行催化的活性的蛋白质(EC1.2.99.6等)。也将该活性称为“ACAR活性”。也将编码ACAR的基因称为“ACAR基因”。ACAR可以根据制造发酵液时生产目标物质的生物合成通路的种类而具有需要的基质特异性。例如，在经由香兰素酸到香兰素的转化而生产目标物质情况下，可以使用至少以香兰素酸为基质的ACAR。此外，例如，在经由原儿茶酸到原儿茶醛的转化而生产目标物质情况下，可以使用至少以原儿茶酸为基质的ACAR。即，“ACAR”可以是指，具体而言，具有对在电子供体和ATP的存在下使香兰素酸和/或原儿茶酸还原而生成香兰素和/或原儿茶醛的反应进行催化的活性的蛋白质。ACAR可以对香兰素酸和原儿茶酸双方具有特异性，但不限于此。此外，例如，在制造苯甲醛的情况下，可以使用至少以苯甲酸为基质的ACAR。即，“ACAR”可以是指，具体而言，具有对在电子供体和ATP的存在下使苯甲酸还原而生成苯甲醛的反应进行催化的活性的蛋白质。此外，例如，在制造肉桂醛的情况下，可以使用至少以肉桂酸为基质的ACAR。即，“ACAR”可以是指，具体而言，具有对在电子供体和ATP的存在下使肉桂酸还原而生成肉桂醛的反应进行催化的活性的蛋白质。作为电子供体，可以举出NADH、NADPH。就ACAR而言，例如，可以是能够利用这些电子供体中的至少1种的ACAR。
作为ACAR，可以举出诺卡氏菌(Nocardia sp.)NRRL 5646株、放线菌(Actinomycessp.)、热醋酸梭菌(Clostridium thermoaceticum)、黑曲霉(Aspergill us niger)、甜瓜棒孢(Corynespora melonis)、革盖菌(Coriolus sp.)、链孢霉(Neurospora sp.)等各种生物的ACAR(J.Biol.Chem.2007,Vol.282,No.1,p478-485)。诺卡氏菌(Nocardia sp.)NRRL5646株被分类为艾阿华诺卡氏菌(Nocardia iowensis)。作为ACAR，可以进一步举出巴西诺卡菌(Nocardia brasiliensis)、伤口诺卡氏菌(Nocardia vulneris)等其他的诺卡氏菌(Nocardia)属细菌的ACAR。此外，作为ACAR，也可以举出扩展戈登氏菌(Gordonia effuse)等戈登氏菌(Gordonia)属细菌、Novosphingobium malaysiense等新鞘氨醇菌(Novosphingobium)属细菌、二乙醇胺强化胶球藻(Coccomyxa subellipsoidea)等胶球藻属(Coccomyxa)属微生物的ACAR(WO2018/079705A1)。
就ACAR活性而言，例如，可以通过以下方法测定：在ATP和NADPH的存在下将酶和基质(例如，香兰素酸或原儿茶酸)一同孵育，对依赖于酶和基质的NADPH的氧化进行测定(对J.Biol.Chem.2007,Vol.282,No.1,p478-485所述的方法进行修改)。
ACAR通过磷酸泛酰巯基乙胺化而变为活性型酶(J.Biol.Chem.2007,Vol.282,No.1,p478-485)。因此，可通过使催化蛋白质的磷酸泛酰巯基乙胺化的酶(也称为“磷酸泛酰巯基乙胺化酶”)的活性提高，使得ACAR的活性提高。即，作为用于赋予或增强目标物质生产能力的方法，可以举出使磷酸泛酰巯基乙胺化酶的活性提高的方法。即，可以对微生物进行修饰以使得磷酸泛酰巯基乙胺化酶的活性提高。作为磷酸泛酰巯基乙胺化酶，可以举出磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(phosphopantetheinyl transferase；PPT)。
“磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(phosphopantetheinyl transferase；PPT)”可以是指，具有对在磷酸泛酰巯基乙胺基供体的存在下使ACAR磷酸泛酰巯基乙胺化的反应进行催化的活性的蛋白质。也将该活性称为“PPT活性”。也将编码PPT的基因称为“PPT基因”。作为磷酸泛酰巯基乙胺基供体，可以举出补酶A(CoA)。作为PPT，可以举出entD基因编码的EntD蛋白。作为PPT，具体而言，可以举出巴西诺卡菌(Nocardia brasiliensis)的PPT、皮疽诺卡菌(Nocardia farcinica)IFM10152的PPT(J.Biol.Chem.2007,Vol.282,No.1,pp.478-485)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的PPT(App.Env.Microbiol.2009,Vol.75,No.9,pp.2765-2774)、E.coli的EntD蛋白等各种生物的PPT。
就PPT活性而言，例如，可以通过以下方法进行测定：在CoA的存在下使酶和ACAR一同孵育，以ACAR活性的增强作为指标进行测定(J.Biol.Chem.2007,Vol.282,No.1,pp.478-485)。
此外，如上所述，苯甲醛和肉桂醛，例如，可以分别通过ACAR的作用而由苯甲酸和肉桂酸生成。即，作为目标物质生物合成酶，例如，除了ACA R之外，还可以举出苯甲酸生物合成酶、肉桂酸生物合成酶。具体来说，就肉桂酸而言，例如，可以通过苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase；PAL；EC 4.3.1.24)的作用而由L-苯丙氨酸生成。即，作为肉桂酸生物合成酶，例如，可以举出L-苯丙氨酸生物合成酶、PAL。
此外，就苯甲醛而言，例如，也可以由L-苯丙氨酸生成(WO2017/122747)。即，作为目标物质生物合成酶，例如，还可以举出L-苯丙氨酸生物合成酶、对由L-苯丙氨酸转化为苯甲醛的反应进行催化的酶。L-苯丙氨酸可以通过氨基酸脱氨酶(amino acid deaminase；AAD；EC 1.4.3.2)、4-羟基扁桃酸合成酶(4-hydroxymandelate synthase；HMAS；EC1.13.11.46)、(S)-扁桃酸脱氢酶((S)-mandelate dehydrogenase；SMDH；EC 1.1.99.31)和苯甲酰甲酸脱羧酶(Benz oylformate decarboxylase；BFDC；EC 4.1.1.7)的作用，而依次转化为苯基丙酮酸、(S)-扁桃酸、苯甲酰甲酸和苯甲醛。即，作为对由L-苯丙氨酸转化为苯甲醛的反应进行催化的酶，可以举出这些酶。
此外，作为用于赋予或增强目标物质生产能力的方法，可以举出使目标物质以外的物质(例如，在目标物质的生产中作为中间体而生成的物质、作为目标物质的前体而被利用的物质)的吸收系统的活性提高的方法。即，对微生物进行修饰以使得上述的吸收系统的活性提高。“物质的吸收系统”可以是指，具有将物质从细胞外吸收至细胞内的功能的蛋白质。也将该活性称为“物质的吸收活性”。也将编码这样的吸收系统的基因称为“吸收系统基因”。作为这样的吸收系统，可以举出香兰素酸吸收系统、原儿茶酸吸收系统。作为香兰素酸吸收系统，可以举出vanK基因编码的VanK蛋白(M.T.Chaudhry,et al.,Microbiology,2007.153:857-865)。作为原儿茶酸吸收系统，可以举出pcaK基因编码的PcaK蛋白(M.T.Chaudhry,et al.,Microbiology,2007.153:8 57-865)。
就物质的吸收活性而言，例如，可以通过公知的方法(M.T.Chaudhry,et al.,Microbiology,2007.153:857-865)进行测定。
此外，作为用于赋予或增强目标物质生产能力的方法，可以举出使参与目标物质以外的物质(副产物)的生成的酶的活性降低的方法。也将这样的目标物质以外的物质称为“副产物”。也将这样的酶称为“副产物生成酶”。作为副产物生成酶，例如，可以举出参与目标物质的利用消耗的酶、对从目标物质的生物合成通路中分支而生成目标物质以外的物质的反应进行催化的酶。关于使蛋白质(酶等)的活性降低的方法在下文记述。就蛋白质(酶等)的活性而言，例如，可通过破坏编码该蛋白质的基因等而使其降低。例如，有报告称在棒状细菌中，香兰素是按照香兰素→香兰素酸→原儿茶酸的顺序进行代谢，被利用消耗的(Current Microbiology,2005,Vol.51,p59-65)。即，作为副产物生成酶，具体而言，可以举出对从香兰素转化为原儿茶酸的反应进行催化的酶、对原儿茶酸的进一步代谢进行催化的酶。作为这样的酶，可以举出香兰素酸脱甲基酶(vanillate demethylase)、原儿茶酸3,4-加双氧酶(protocatechuate 3,4-dioxygenase)和将原儿茶酸3,4-加双氧酶的反应产物进一步分解为琥珀酰CoA和乙酰CoA的各种酶(Appl.Microbiol.Biotechnol.,2012,Vol.95,p77-89)。此外，香兰素可以通过醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase；ADH)的作用而转化为香草醇(Kunjapur AM.et al.,J.Am.Chem.Soc.,2014,Vol.136,p11644-11654.；HansenEH.et al.,App.Env.Microbiol.,2009,Vol.75,p2765-2774.)。即，作为副产物生成酶，具体而言，还可以举出ADH。此外，作为香兰素生物合成通路的中间体的3-脱氢莽草酸可以通过莽草酸脱氢酶(shikimatedehydrogenase)的作用而转化为莽草酸。即，作为副产物生成酶，具体而言，还可以举出莽草酸脱氢酶。
“香兰素酸脱甲基酶(vanillate demethylase)”可以是指，具有对使香兰素酸脱甲基化而生成原儿茶酸的反应进行催化的活性的蛋白质。也将该活性称为“香兰素酸脱甲基酶活性”。也将编码香兰素酸脱甲基酶的基因称为“香兰素酸脱甲基酶基因”。作为香兰素酸脱甲基酶，可以举出vanAB基因编码的VanAB蛋白(Current Microbiology,2005,Vol.51,p59-65)。vanA基因和vanB基因分别编码香兰素酸脱甲基酶的亚基A和亚基B。使香兰素酸脱甲基酶活性降低时，例如，可以对vanAB基因双方进行破坏等，也可以只对其中一方进行破坏等。需要说明的是，vanAB基因通常和vanK基因一起构成vanABK操纵子。因此，为了使香兰素酸脱甲基酶活性降低，可以对vanABK操纵子整体进行破坏等(例如，缺损)。此时，可以再次向宿主中导入vanK基因。例如，在利用存在于菌体外的香兰素酸，且对vanABK操纵子整体进行了破坏等(例如，缺损)的情况下，优选再次导入vanK基因。
香兰素酸脱甲基酶活性例如可以通过以下方法进行测定：将酶与基质(即，香兰素酸)一同孵育，对依赖于酶和基质的产物(即，原儿茶酸)的生成进行测定(J Bacteriol,2001,Vol.183,p3276-3281)。
“原儿茶酸3,4-加双氧酶”可以是指，具有对使原儿茶酸氧化而生成β-羧基顺式,顺式-粘康酸的反应进行催化的活性的蛋白质。也将该活性称为“原儿茶酸3,4-加双氧酶活性”。也将编码原儿茶酸3,4-加双氧酶的基因称为“原儿茶酸3,4-加双氧酶基因”。作为原儿茶酸3,4-加双氧酶，可以举出pcaGH基因编码的PcaGH蛋白(Appl.Microbiol.Biotechnol.,2012,Vol.95,p77-89)。pcaG基因和pcaH基因分别编码原儿茶酸3,4-加双氧酶的α亚基和β亚基。使原儿茶酸3,4-加双氧酶活性降低时，例如，可以对pcaGH基因双方进行破坏等，也可以只对其中一方进行破坏等。
原儿茶酸3,4-加双氧酶活性例如可以通过以下方法进行测定：将酶与基质(即，原儿茶酸)一同孵育，对依赖于酶和基质的氧消耗进行测定(Meth.Enz.,1970,Vol.17A,p526-529)。
“醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase；ADH)”可以是指，具有对在电子供体的存在下使醛还原而生成醇的反应进行催化的活性的蛋白质(EC 1.1.1.1，EC 1.1.1.2，EC1.1.1.71等)。也将该活性称为“ADH活性”。也将编码ADH的基因称为“ADH基因”。就作为ADH的基质的醛而言，可以举出作为目标物质而例示了的醛，例如，香兰素、苯甲醛、肉桂醛等芳香族醛。即，作为在“ADH活性”的说明中提到的醛和醇的组合，可以举出香兰素和香草醇的组合、苯甲醛和苯甲醇的组合、肉桂醛和肉桂醇的组合等芳香族醛和芳香族醇的组合。也将以芳香族醛、香兰素、苯甲醛、肉桂醛为基质的ADH分别称为“芳香族醇脱氢酶(aromaticalcohol dehydrogenase)”、“香草醇脱氢酶(vanil lyl alcohol dehydrogenase)”、“苯甲醇脱氢酶(benzyl alcohol dehydrogenas e)”、“肉桂醇脱氢酶(cinnamyl alcoholdehydrogenase)”。此外，也将以芳香族醛、香兰素、苯甲醛、肉桂醛为基质的ADH活性分别称为“芳香族醇脱氢酶(aromatic alcohol dehydrogenase)活性”、“香草醇脱氢酶(vanillylalcohol deh ydrogenase)活性”、“苯甲醇脱氢酶(benzyl alcohol dehydrogenase)活性”、“肉桂醇脱氢酶(cinnamyl alcohol dehydrogenase)活性”。ADH可以以1种醛为基质，也可以以2种或2种以上的醛为基质。作为电子供体，可以举出NADH、NADPH。就ADH而言，例如，可以是能够利用这些电子供体中的至少1种的ADH。
作为ADH，可以举出由yqhD基因、NCgl0324基因、NCgl0313基因、NCgl2709基因、NCgl0219基因、NCgl2382基因分别编码的YqhD蛋白、NCgl0324蛋白、NCgl0313蛋白、NCgl2709蛋白、NCgl0219蛋白、NCgl2382蛋白。yqhD基因和NCgl0324基因都编码香草醇脱氢酶(vanillyl alcohol dehydr ogenase)。就yqhD基因而言，例如，可以在E.coli等肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的细菌中发现。就NCgl0324基因、NCgl0313基因、NCgl2709基因、NCgl0219基因、NCgl2382基因而言，例如，可以在谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)等棒状细菌中发现。
在微生物中，可以使1种ADH的活性降低，也可以使2种或2种以上的ADH的活性降低。例如，可以使选自NCgl0324蛋白、NCgl2709蛋白和NCgl0313蛋白中的1种或1种以上，例如全部的ADH的活性降低。此外，可以至少使NCgl0324蛋白和NCgl2709蛋白中的一方或双方的活性降低。即，例如，可以至少使NCgl0324蛋白的活性降低，也可以进一步使NCgl2709蛋白的活性降低。或，可以至少使NCgl2709蛋白的活性降低，也可以进一步使NCgl0324蛋白的活性降低。就ADH和目标物质的组合而言，只要是通过使棒状细菌中ADH的活性降低以使得目标物质的生产提高的，就无特别限制。例如，可以至少使得，以作为目标物质而生产的醛为基质的ADH的活性降低。即，例如，为了香兰素、苯甲醛、肉桂醛等芳香族醛的生产，而分别使得香草醇脱氢酶、苯甲醇脱氢酶、肉桂醇脱氢酶等芳香族醇脱氢酶的活性降低。例如，在生产香兰素时，可以使YqhD蛋白的活性降低。此外，例如，在生产香兰素时，可以使NCgl0324蛋白和NCgl0313蛋白中的一方或双方的活性降低，可以至少使NCgl0324蛋白的活性降低。此外，例如，在生产苯甲醛时，可以使NCgl0324蛋白和NCgl2709蛋白中的一方或双方的活性降低。此外，例如，在生产肉桂醛时，可以使NCgl0324蛋白和NCgl2709蛋白中的一方或双方的活性降低。YqhD蛋白可以具有香草醇脱氢酶活性。NCgl0324蛋白可以具有以下的全部活性：香草醇脱氢酶活性、苯甲醇脱氢酶活性、和肉桂醇脱氢酶活性。NCgl2709蛋白可以具有苯甲醇脱氢酶活性和肉桂醇脱氢酶活性的双方。
就ADH活性而言，例如，可以通过以下方法进行测定：在NADPH或NADH的存在下将酶和基质(例如，香兰素等的醛)一同孵育，对依赖于酶和基质的NADPH或NADH的氧化进行测定。
“莽草酸脱氢酶(shikimate dehydrogenase)”可以是指，具有对在电子供体的存在下使3-脱氢莽草酸还原而生成莽草酸的反应进行催化的活性的蛋白质(EC 1.1.1.25)。也将该活性称为“莽草酸脱氢酶活性”。也将编码莽草酸脱氢酶的基因称为“莽草酸脱氢酶基因”。作为电子供体，可以举出NADH、NADPH。就莽草酸脱氢酶而言，例如，可以是能够利用这些电子供体中的至少1种的莽草酸脱氢酶。作为莽草酸脱氢酶，可以举出aroE基因编码的AroE蛋白。
莽草酸脱氢酶活性例如可以通过以下方法进行测定：在NADH或NADPH的存在下使酶和基质(即，3-脱氢莽草酸)一同孵育，对依赖于酶和基质的NADH或NADPH的氧化进行测定。
此外，作为用于赋予或增强香兰素等目标物质的生产能力的方法，可以举出使L-半胱氨酸生物合成酶的活性提高的方法(WO2018/079687)。
“L-半胱氨酸生物合成酶”可以是指，参与L-半胱氨酸的生物合成的蛋白质。也将编码L-半胱氨酸生物合成酶的基因称为“L-半胱氨酸生物合成基因”。作为L-半胱氨酸生物合成酶，可以举出参与硫的利用的蛋白质。作为参与硫的利用的蛋白质，可以举出cysIXHDNYZ基因和fpr2基因分别编码的CysIXHDNYZ蛋白和Fpr2蛋白。CysIXHDNYZ蛋白，特别是，参与硫酸盐、亚硫酸盐等无机硫化合物的还原。Fpr2蛋白，特别是，可以参与用于亚硫酸盐的还原的电子传递。作为L-半胱氨酸生物合成酶，还可以举出O-乙酰丝氨酸(硫醇)裂解酶(O-acetylserine(thiol)-lyase)。作为O-乙酰丝氨酸(硫醇)裂解酶，也可以举出cysK基因编码的CysK蛋白。可以使1种L-半胱氨酸生物合成酶的活性提高，也可以使2种或2种以上的L-半胱氨酸生物合成酶的活性提高。例如，可以使CysIXHDNYZ蛋白、Fpr2蛋白和CysK蛋白中的1种或1种以上的活性提高，也可以使CysIXHDNYZ蛋白和Fpr2蛋白中的1种或1种以上的活性提高。
就L-半胱氨酸生物合成酶的活性而言，例如，可以通过使表达L-半胱氨酸生物合成酶的基因(即，cysIXHDNYZ基因、fpr2基因、cysK基因等L-半胱氨酸生物合成基因)的表达提高，而使其提高。
就L-半胱氨酸生物合成基因的表达而言，例如，可以通过调整该基因的表达控制因子的活性(例如，提高或降低)，而使其提高。即，就L-半胱氨酸生物合成基因的表达而言，例如，可以通过使该基因的正表达控制因子(例如，激活因子)的活性提高，而使其提高。此外，就L-半胱氨酸生物合成基因的表达而言，例如，可以通过使该基因的负表达控制因子(例如，抑制因子)的活性降低，而使其提高。也将这样的控制因子称为“控制蛋白质”。也将编码这样的控制因子的基因称为“控制基因”。
作为如上所述的激活因子，可以举出cysR基因和ssuR基因分别编码的CysR蛋白和SsuR蛋白。通过提高CysR蛋白的活性，可提高cysIXHDNYZ基因、fpr2基因、和ssuR基因中的1种或1种以上的表达。此外，通过提高SsuR蛋白的活性，可提高参与有机硫化合物的利用的基因的表达。可以提高CysR蛋白和SsuR蛋白中的一方或双方的活性。例如，可以至少使CysR蛋白的活性降低。就这样的激活因子的活性而言，例如，可通过使编码该激活因子的基因的表达提高，而使其提高。
作为如上所述的抑制因子，可以举出mcbR基因编码的McbR蛋白。通过使McbR蛋白的活性的降低，可使cysR基因和ssuR基因中的1种或1种以上的表达提高，此外，由此，可使cysIXHDNYZ基因和fpr2基因中的1种或1种以上的表达提高。就这样的抑制因子的活性而言，例如，可通过使编码该抑制因子的基因的表达降低或破坏编码该抑制因子的基因，而使其降低。
即，具体而言，就L-半胱氨酸生物合成酶的活性而言，例如，可通过使cysIXHDNYZ基因、fpr2基因、cysR基因、和ssuR基因中的1种或1种以上的表达提高，而使其提高。即，“使L-半胱氨酸生物合成酶的活性提高”可以是指，例如，使cysIXHDNYZ基因、fpr2基因、cysR基因、和ssuR基因中的1种或1种以上的表达提高。例如，可以至少使cysR基因的表达提高。此外，例如，也可以使这些基因的表达全部提高。可以通过提高cysR基因的表达而使cysIXHDNYZ基因、fpr2基因、和ssuR基因中的1种或1种以上的表达提高。
此外，作为用于赋予或增强香兰素等目标物质的生产能力的方法，可以举出使NCgl2048蛋白的活性降低的方法(WO2018/079686)。
“NCgl2048蛋白”可以是指，NCgl2048基因编码的蛋白质。需要说明的是，关于保守变体，NCgl2048蛋白的“原来的功能”可以是指，具有C.glutamicum ATCC 13869株的NCgl2048蛋白的氨基酸序列的蛋白质的功能，也可以是指通过在微生物中降低其活性而使目标物质的生产提高的性质。
此外，作为用于赋予或增强香兰素等目标物质的生产能力的方法，可以举出使烯醇化酶(enolase)的活性降低的方法(WO2018/079684)。
“烯醇化酶(enolase)”可以是指，具有对使2-磷酸-D-丙三醇酸(2-phospho-D-glyceric acid)脱水而生成磷酸烯醇丙酮酸(phosphoenolpyruvic acid)的反应进行催化的活性的蛋白质(EC 4.2.1.11)。也将该活性称为“烯醇化酶活性”。烯醇化酶也称为“磷酸丙酮酸水合酶(phosphopyruvate hydratase)”。也将编码烯醇化酶的基因称为“烯醇化酶基因”。作为烯醇化酶，可以举出eno基因编码的Eno蛋白。
烯醇化酶活性例如可以通过以下方法进行测定：将酶与基质(例如，2-磷酸-D-丙三醇酸)一同孵育，对依赖于酶和基质的磷酸烯醇丙酮酸的生成进行测定。
此外，作为用于赋予或增强香兰素等目标物质的生产能力的方法，可以举出使S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶(S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase)的活性提高的方法(WO2018/079684)。
“S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶(S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase)”可以是指，具有对使S-腺苷-L-高半胱氨酸(S-adenosyl-L-homocysteine；SAH)水解而生成L-高半胱氨酸和腺苷的反应进行催化的活性的蛋白质(EC 3.3.1.1)。也将该活性称为“S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶活性”。S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶也称为“腺苷高半胱氨酸酶(adenosylhomocysteinase)”。也将编码S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶的基因称为“S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶基因”。作为S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶，可以举出sahH基因编码的SahH蛋白。作为S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶，具体而言，可以举出酵母、链霉菌(Streptomyces)属细菌、棒状细菌等各种生物的S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶。
S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶活性例如可以通过以下方法进行测定：将酶与基质(例如，S-腺苷-L-高半胱氨酸)和DTNB(5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)，5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoic acid))一同孵育，基于412nm的吸光度对依赖于产物(例如，高半胱氨酸)的TNB(5-巯基-2-硝基苯甲酸，5-Mercapto-2-nitrobenzoic acid)的生成进行测定(J MolMicrobiol Biotechnol 2008,15:277-286)。
就进行活性调整的蛋白质而言，例如，可以根据目标物质的种类、生产目标物质的生物合成通路的种类、和微生物本来具有的蛋白质的种类、活性等条件适宜地进行选择。例如，在通过生物转化而由原儿茶酸制造香兰素时，特别是，可以使OMT、ACAR、PPT、和原儿茶酸吸收系统中的1种或1种以上的活性提高。此外，例如，在通过生物转化而由香兰素酸制造香兰素时，特别是，可以使ACAR、PPT、和香兰素酸吸收系统中的1种或1种以上的活性提高。此外，在通过生物转化而由原儿茶醛制造香兰素时，特别是，可以使OMT的活性提高。
具有目标物质生产能力的微生物的育种中使用的基因和蛋白质，例如，可以分别具有上述例示了的基因和蛋白质的公知的碱基序列和氨基酸序列(以下，也简单称为“公知的碱基序列和氨基酸序列”)。作为公知的碱基序列和氨基酸序列，例如，可以举出WO2018/079687、WO2018/079686、WO2018/079685、WO2018/079684、WO2018/079683、WO2017/073701、WO2018/079705、或WO2017/122747所记载的序列。需要说明的是，“具有(氨基酸或碱基)序列”这一表达，只要没有特别记载，可以表示该“包含(氨基酸或碱基)序列”，也可以包含该“由(氨基酸或碱基)序列构成”的情况。
具有目标物质生产能力的微生物的育种中使用的基因和蛋白质分别可以是具有公知的碱基序列和氨基酸序列的基因和蛋白质的保守变体。“保守变体”是指，保持原来的功能的变体。作为保守变体，例如，可以举出具有公知的碱基序列和氨基酸序列的基因和蛋白质的同源体或人工修饰体。
“保持原来的功能”是指，基因或蛋白质的变体具有原来的基因或蛋白质的功能(活性、性质)所对应的功能(活性、性质)。基因的“保持原来的功能”是指，基因的变体编码保持有原来的功能的蛋白质。例如，ACAR基因的“保持原来的功能”是指，基因的变体编码具有ACAR活性的蛋白质。此外，ACAR的“保持原来的功能”是指，蛋白质的变体具有ACAR活性。各蛋白质的活性例如可以通过WO2018/079687、WO2018/079686、WO2018/079685、WO2018/079684、WO2018/079683、WO2017/073701、WO2018/079705、或WO2017/122747记载的方法进行测定。
以下，就保守变体进行例示。
就具有目标物质生产能力的微生物的育种中使用的基因或蛋白质的同源体而言，例如，通过使用公知的碱基序列或氨基酸序列作为检索序列的BLAST检索、FASTA检索，可以容易地从公开数据库中取得。此外，就具有目标物质生产能力的微生物的育种中使用的基因的同源体而言，例如，可以以棒状细菌等生物的染色体作为模板，使用根据公知的碱基序列而制作的寡核苷酸作为引物，通过PCR而取得。
就具有目标物质生产能力的微生物的育种中使用的基因而言，只要保持原来的功能，就各自可以是编码具有以下的氨基酸序列的蛋白质的基因：在公知的氨基酸序列中，1个或数个位置处的1个或数个氨基酸被置换、缺失、插入或添加的氨基酸序列。例如，就编码的蛋白质而言，其N末端和/或C末端可以延长或短缩。需要说明的是。虽然根据氨基酸残基的蛋白质的立体结构中的位置、种类而有所不同，但所述“1或数个”是指，具体而言，例如，为1～50个、1～40个、1～30个，优选为1～20个，更优选为1～10个，进一步优选为1～5个，特别优选为1～3个。
所述1个或数个氨基酸的置换、缺失、插入、或添加，是蛋白质的功能正常保持的保守变异。代表性的保守变异是保守置换。保守置换是，置换部位为芳香族氨基酸时，在Phe、Trp、Tyr间相互置换的变异，置换部位为疏水性氨基酸时，在Leu、Ile、Val间相互置换的变异，为极性氨基酸时，在Gln、Asn间相互置换的变异，为碱基性氨基酸时，在Lys、Arg、His间相互置换的变异，为酸性氨基酸时，在Asp、Glu间相互置换的变异，为具有羟基的氨基酸时，在Ser、Thr间相互置换的变异。作为被视为保守置换的置换，具体而言，可以举出：Ala向Ser或Thr的置换、Arg向Gln、His或Lys的置换、Asn向Glu、Gln、Lys、His或Asp的置换、Asp向Asn、Glu或Gln的置换、Cys向Ser或Ala的置换、Gln向Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg的置换、Glu向Gly、Asn、Gln、Lys或Asp的置换、Gly向Pro的置换、His向Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr的置换、Ile向Leu、Met、Val或Phe的置换、Leu向Ile、Met、Val或Phe的置换、Lys向Asn、Glu、Gln、His或Arg的置换、Met向Ile、Leu、Val或Phe的置换、Phe向Trp、Tyr、Met、Ile或Leu的置换、Ser向Thr或Ala的置换、Thr向Ser或Ala的置换、Trp向Phe或Tyr的置换、Tyr向His、Phe或Trp的置换、以及Val向Met、Ile或Leu的置换。此外，如上所述的氨基酸的置换、缺失、插入、添加、或倒位等中也包含：基于作为基因来源的生物的个体差、物种的差异情况等而天然产生的变异(突变(mutant)或变异(variant))所引起的情况。
此外，就具有目标物质生产能力的微生物的育种中使用的基因而言，只要保持原来的功能，就各自可以是编码具有以下氨基酸序列的蛋白质的基因，所述氨基酸序列相对于公知的氨基酸序列整体，例如，具有50％以上、65％以上、80％以上，优选为90％以上，更优选为95％以上，进一步优选为97％以上，特别优选为99％以上的同一性。
此外，就具有目标物质生产能力的微生物的育种中使用的基因而言，只要保持原来的功能，就分别可以是以下的DNA：所述DNA与根据公知的碱基序列而调制的探针，例如针对公知的碱基序列的整体或一部分的互补序列，在严格的条件下杂交。“严格的条件”是指，形成所谓的特异性杂交，而不形成非特异性杂交的条件。作为一个例子，可举出以下条件：同一性高的DNA彼此之间，例如具有50％以上、65％以上、80％以上，优选为90％以上，更优选为95％以上，进一步优选为97％以上，特别优选为99％以上的同一性的DNA彼此杂交，而同一性比其低的DNA彼此之间不杂交的条件；或者，以与作为通常的Southern杂交的清洗条件的60℃、1×SSC、0.1％SDS相当，优选与60℃、0.1×SSC、0.1％SDS相当，更优选与68℃、0.1×SSC、0.1％SDS相当的盐浓度和温度清洗1次，优选清洗2～3次清洗的条件。
如上所述，所述杂交中使用的探针也可以是基因的互补序列的一部分。就这样的探针而言，可以通过以根据公知的碱基序列而制作的寡核苷酸作为引物，以包含上述的基因的DNA片段为模板，通过PCR而制作。例如，作为探针，可以使用长度300bp左右的DNA片段。使用长度300bp左右的DNA片段作为探针时，作为杂交的清洗条件，可以举出50℃、2×SSC、0.1％SDS。
此外，根据宿主不同，密码子的简并性有所不同，因此，就具有目标物质生产能力的微生物的育种中使用的基因而言，任意的密码子可以和与其等价的密码子置换。
需要说明的是，氨基酸序列间的“同一性”是指，用blastp使用默认设定的ScoringParameters(Matrix：BLOSUM62；Gap Costs：Existence＝11,Extension＝1；CompositionalAdjustments：Conditional compositional score matrix adjustment)算出的氨基酸序列间的同一性。此外，碱基序列间的“同一性”是指，由blastn使用默认设定的ScoringParameters(Match/Mismatch Scores＝1,-2；Gap Costs＝Linear)算出的碱基序列间的同一性。
<使蛋白质的活性提高的方法>
以下，就使蛋白质的活性提高的方法进行说明。
“蛋白质的活性提高”可以是指，该蛋白质的活性与未修饰株相比有所提高。“蛋白质的活性提高”可以是指，具体而言，该蛋白质的平均一个细胞中的活性与未修饰株相比有所提高。此处所谓的“未修饰株”可以是指，未进行使靶标蛋白质活性提高的修饰的对照株。作为未修饰株，可以举出野生株、亲本株。作为未修饰株，具体而言，可以举出各微生物物种的模式株(type strain)。此外，作为未修饰株，具体而言，还可以举出微生物的说明中例示的菌株。即，在一个方式中，蛋白质的活性可以与模式株(即属于具有目标物质生产能力的微生物的种的模式株)相比有所提高。此外，在另一个方式中，蛋白质的活性可以与C.glutamicum ATCC 13869株相比有所提高。此外，在另一个方式中，蛋白质的活性可以与C.glutamicum ATCC 13032株相比有所提高。此外，在另一个方式中，蛋白质的活性可以与E.coli K-12 MG1655株相比有所提高。需要说明的是，也将“蛋白质的活性提高”称为“蛋白质的活性增强”。“蛋白质的活性提高”可以是指，更具体而言，与未修饰株相比，该蛋白质的平均一个细胞中的分子数增加，和/或，该蛋白质的平均一个分子的功能提高。即，“蛋白质的活性提高”中的“活性”不限于蛋白质的催化剂活性，也可以是指编码蛋白质的基因的转录量(mRNA量)或翻译量(蛋白质的量)。此外，“蛋白质的活性提高”中，不仅包含在原来就具有靶标蛋白质的活性的菌株中使该蛋白质的活性提高的情况，还包含对原本不存在靶标蛋白质的活性的菌株赋予该蛋白质的活性的情况。此外，只要结果是蛋白质的活性提高，也可以在使宿主原来具有的靶标蛋白质的活性降低或消失的基础上，赋予适宜的靶标蛋白质的活性。
就蛋白质的活性提高的程度而言，只要蛋白质的活性与未修饰株相比有所提高就无特别限制。蛋白质的活性可以上升至例如为未修饰株的1.2倍以上、1.5倍以上、2倍以上、或3倍以上。此外，未修饰株不具有靶标蛋白质的活性时，通过导入编码该蛋白质的基因使该蛋白质生成即可，例如，该蛋白质可以以其活性能够被测定到的程度进行生产。
就使蛋白质的活性提高的修饰而言，例如，可以通过使编码该蛋白质的基因的表达上升而达成。“基因的表达上升”可以是指，该基因的表达与野生株、亲本株等未修饰株相比有所提高。“基因的表达上升”可以是指，具体而言，该基因的平均一个细胞中的表达量与未修饰株相比有所提高。“基因的表达上升”可以是指，更具体而言，基因的转录量(mRNA量)提高和/或基因的翻译量(蛋白质的量)提高。需要说明的是，也将“基因的表达上升”称为“基因的表达增强”。基因的表达可以上升至例如未修饰株的1.2倍以上、1.5倍以上、2倍以上、或3倍以上。此外，“基因的表达上升”中，不仅包含在原本就表达靶标基因的菌株中使该基因的表达量上升的情况，还包含在原本不表达靶标基因的菌株中，使该基因表达的情况。即，“基因的表达上升”也可以是指，例如，向不携带有靶标基因的菌株中导入该基因，使该基因表达。
就基因表达的上升而言，例如，可以通过使基因的拷贝数增加而达成。
基因的拷贝数的增加可以通过向宿主的染色体中导入该基因而达成。就向染色体中导入基因而言，例如，可以利用同源重组进行(Miller,J.H.Expe riments in MolecularGenetics,1972,Cold Spring Harbor Laboratory)。作为利用同源重组的基因导入法，例如，可以举出Red-driven integration法(Datse nko,K.A,and Wanner,B.L.Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.97:6640-6645(2000))等使用直链状DNA的方法、使用包含温度感受性复制起点的质粒的方法、使用能够接合传递的质粒的方法、使用不具有在宿主内发挥功能的复制起点的自杀载体的方法、使用了噬菌体的转导(transduction)法。就基因而言，可以只导入1拷贝，也可以导入2拷贝或2拷贝以上。例如，可通过以在染色体上存在多个拷贝的序列为靶标进行同源重组，向染色体中导入基因的多个拷贝。作为染色体上存在多个拷贝的序列，可以举出重复DNA序列(repeti tive DNA)、存在于转座子的两端的反向重复。此外，也可以以目标物质的生产中不需要的基因等的染色体上的适当的序列为靶标进行同源重组。此外，就基因而言，也可以使用转座子、Mini-Mu而在染色体上随机地导入(日本特开平2-109985号公报，US5882888，EP805867B1)。
就染色体上导入有靶标基因的确认而言，可以通过使用了具有与该基因的全部或一部分互补的序列的探针的Southern杂交，或使用了基于该基因的序列而制作的引物的PCR等而确认。
此外，基因的拷贝数的增加也可以通过将包含该基因的载体导入到宿主中而达成。例如，可通过以下方式使该基因的拷贝数增加：使包含靶标基因的DNA片段与在宿主中发挥功能的载体连接而构建该基因的表达载体，使用该表达载体对宿主进行转化。就包含靶标基因的DNA片段而言，例如，可通过以具有靶标基因的微生物的基因组DNA为模板的PCR而取得。作为载体，可以使用能够在宿主的细胞内自主复制的载体。载体可以是多拷贝载体。此外，为了筛选转化体，载体可以具有抗生素抗性基因等标记。此外，载体可以具备用于使插入的基因表达的启动子、终止子。载体可以是，例如，来源于细菌质粒的载体、来源于酵母质粒的载体、来源于噬菌体的载体、粘粒、或噬菌粒等。作为在大肠杆菌等肠杆菌科的细菌中能够自主复制的载体，具体而言，例如，可以举出pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pBR322、pSTV29(以上都可以从Takara Bio公司处获得)、pACYC184、pMW 219(Nippon Gene公司)、pTrc99A(Pharmacia公司)、pPROK类载体(Clontech公司)、pKK233-2(Clontech公司)、pET类载体(Novagen公司)、pQE类载体(QIAGEN公司)、pCold TF DNA(TaKaRa)、pACYC类载体、广宿主域载体RSF1010。作为能够在棒状细菌中自主复制的载体，具体而言，例如，可以举出pHM1519(Agric.Biol.Chem.,48,2901-2903(1984))；pAM330(Agric.Biol.Chem.,48,2901-2903(1984))；具有改良的药剂耐性基因的质粒；pCRY30(日本特开平3-210184)；pCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE、和pCRY3KX(日本特开平2-72876、美国专利5185262号)；pCRY2和pCRY3(日本特开平1-191686)；pAJ655、pAJ611、和pAJ1844(日本特开昭58-192900)；pCG1(日本特开昭57-134500)；pCG2(日本特开昭58-35197)；pCG4和pCG11(日本特开昭57-183799)；pPK4(美国专利6090597号)；pVK4(日本特开平No.9-322774)；pVK7(日本特开平10-215883)；pVK9(WO2007/046389)；pVS7(WO2013/069634)；pVC7(日本特开平9-070291)。此外，作为能够在棒状细菌中自主复制的载体，具体而言，例如，还可以举出作为pVC7的变体的pVC7H2。
在导入基因时，基因只要能够在宿主中表达即可。具体来说，就基因而言，只要以使得受到在宿主中发挥功能的启动子的控制而表达的方式得到保持即可。“在宿主中发挥功能的启动子”可以是指，在宿主中具有启动子活性的启动子。启动子可以是来源于宿主的启动子，也可以是来源于异种的启动子。启动子可以是导入的基因所固有的启动子，也可以是其他基因的启动子。作为启动子，例如，可以利用如本说明书中记载的更为强力的启动子。
可以在基因的下游配置用于终结转录的终止子。就终止子而言，只要能够在宿主中发挥功能就无特别限制。终止子可以是来源于宿主的终止子，来源于异种的终止子。终止子可以是导入的基因所固有的终止子，也可以是其他基因的终止子。作为终止子，具体而言，例如，可以举出T7终止子、T4终止子、fd噬菌体终止子、tet终止子、和trpA终止子。
关于各种可以在微生物中利用的载体、启动子、终止子，例如在“微生物学基础讲座8基因工学，共立出版，1987年”中有详细记载，可以利用它们。
此外，在导入2种或2种以上的基因的情况下，各基因只要以能够表达的形式保持在宿主中即可。例如，各基因可以都保持在一个表达载体上，也可以都保持在染色体上。此外，各基因可以分别保持在多个表达载体上，也可以分别保持在一个或多个的表达载体上和染色体上。此外，可以用2种或2种以上的基因构成操纵子并进行导入。“导入2种或2种以上的基因”的情况，例如，可以是导入分别编码2种或2种以上的蛋白质(例如，酶)的基因的情况、导入分别编码构成一个蛋白质复合体(例如，酶复合体)的2种或2种以上的亚基的基因的情况、或导入它们的组合的情况。
就导入的基因而言，只要编码在宿主中发挥功能的蛋白质就无特别限制。导入的基因可以是来源于宿主的基因，也可以是来源于异种的基因。就导入的基因而言，例如，可使用基于该基因的碱基序列而设计的引物，以具有该基因的生物的基因组DNA或搭载有该基因的质粒等作为模板，通过PCR而取得。此外，就导入的基因而言，例如，也可以根据该基因的碱基序列进行全合成(Gene,60(1),115-127(1987))。取得的基因可以直接利用，或进行适宜的修饰而利用。即，可通过修饰基因，而取得其变体。基因的修饰可通过公知的方法进行。例如，可通过部位特异性变异法，向DNA的目标部位处导入目标变异。即，例如，可通过部位特异性变异法，对基因的编码区域进行修饰以使得编码的蛋白质在特定部位处包含氨基酸残基的置换、缺失、插入、和/或添加。作为部位特异性变异法，可以举出使用PCR的方法(Higuchi,R.,61,in PCR technology,Erlich,H.A.Eds.,Stockton press(1989)；Carter,P.,Meth.in Enzymol.,154,382(1987))、使用噬菌体的方法(Kramer,W.and Frits,H.J.,Meth.in Enzymol.,154,350(1987)；Kunkel,T.A.et al.,Meth.in Enzymol.,154,367(1987))。或，也可以全合成基因的变体。
需要说明的是，在蛋白质作为包含多个亚基的复合体而发挥功能的情况下，只要结果是提高了蛋白质的活性，就既可以对所有亚基都进行修饰，也可以只对一部分进行修饰。即，例如，通过使基因的表达上升而提高蛋白质的活性时，可以使分别编码这些亚基的基因的表达全都增强，也可以只使得一部分的表达增强。通常而言，优选使分别编码这些亚基的基因的表达全都增强。此外，就构成复合体的各亚基而言，只要复合体具有靶标蛋白质的功能，就可以来源于1种生物，也可以来源于2种或2种以上不同的生物。即，例如，可以将编码多个亚基并且来源于同一生物的基因导入宿主中，也可以将分别来源于不同生物的基因导入宿主中。
此外，基因表达的上升可通过使基因的转录效率提高而达成。此外，基因表达的上升可通过使基因的翻译效率提高而达成。就基因的转录效率、翻译效率的提高而言，例如，可通过修饰表达调节序列而达成。“表达调节序列”可以是指，影响基因表达的部位的总称。作为表达调节序列，例如，可以举出启动子、Shine Dalgarno(SD)序列(也称为核糖体结合部位(RBS))、和RBS与起始密码子之间的间隔区域。表达调节序列可使用启动子检索载体、GENE TYX等基因解析软件来确定。就这些表达调节序列的修饰而言，例如，可通过使用温度感受性载体的方法、Red-driven integration法(WO2005/010175)进行。
就基因转录效率的提高而言，例如，可通过将染色体上的基因启动子置换为更强力的启动子而达成。“更强力的启动子”可以是指，比原本存在的野生型的启动子更能够提高基因转录的启动子。作为更强力的启动子，例如，可以举出作为公知的高表达启动子的T7启动子、trp启动子、lac启动子、thr启动子、tac启动子、trc启动子、tet启动子、araBAD启动子、rpoH启动子、msrA启动子、来源于双岐杆菌(Bifidobacterium)的Pm1启动子、PR启动子、和PL启动子。此外，作为能够在棒状细菌中利用的更强力的启动子，例如，可以举出进行了人为设计变更的P54-6启动子(Appl.Microbiol.Biotechnol.,53,674-679(2000))、在棒状细菌内能够以乙酸、乙醇、丙酮酸等进行诱导pta、aceA、aceB、adh、amyE启动子，作为在棒状细菌内表达量较多的强力启动子的cspB、SOD、tuf(EF-Tu)启动子(Journal ofBiotechnology 104(2003)311-323,Appl Environ Microbiol.2005Dec；71(12):8587-96.)、P2启动子(WO 2018/079684)、P3启动子(WO2018/079684)、lac启动子、tac启动子、trc启动子、F1启动子。此外，作为更强力的启动子，也可以通过使用各种报告基因，来取得既有的启动子的高活性型。例如，可通过使启动子区域内的-35、-10区域靠近共有序列，而使得启动子的活性提高(国际公开第00/18935号)。作为高活性型启动子，可以举出各种tac样启动子(Katashkina JI et al.Russian Federation Patent application 2006134574)。启动子的强度的评价法和强力的启动子的例子在Goldstein等的论文(Prokaryoticpromoters in biotechnology.Biotechnol.Annu.Rev.,1,105-128(1995))等中有所记载。
就基因翻译效率的提高而言，例如，可通过将染色体上的基因的Shine Dalgarno(SD)序列(也称为核糖体结合部位(RBS))置换为更强力的SD序列而达成。“更强力的SD序列”可以是指，比原本存在的野生型的SD序列更能够提高mRNA翻译的SD序列。作为更强力的SD序列，例如，可以举出来源于噬菌体T7的基因10的RBS(Olins P.O.et al,Gene,1988,73,227-235)。此外，众所周知，RBS和起始密码子之间的间隔区域，特别是紧接起始密码子的上游处的序列(5’-UTR)中的数个核苷酸的置换、或插入、或缺失对mRNA的稳定性和翻译效率有非常大的影响，可以通过对它们进行修饰来使基因的翻译效率提高。
就基因翻译效率的提高而言，例如，也可通过密码子的修饰而达成。例如，通过将存在于基因中的稀有密码子置换为更高频使用的同义密码子，可提高基因的翻译效率。即，导入的基因，例如，可以根据使用的宿主的密码子使用频率进行修饰以使得具有最适合的密码子。密码子的置换，例如，可通过向DNA的目标部位导入目标变异的部位特异性变异法来进行。此外，置换了密码子的基因片段也可以全合成而得到。各种生物中的密码子的使用频率在“密码子使用数据库”(http://www.kazusa.or.jp/codon；Nakamura,Y.et al,Nucl.Acids Res.,28,292(2000))公开。
此外，基因表达的上升也可通过使提高基因表达的调节子扩增，或，使降低基因表达的调节子缺失或弱化来达成。
如上所述的使基因表达上升的方法，可以单独使用，也可以以任意的组合进行使用。
此外，就使蛋白质的活性提高的修饰而言，例如，也可通过使蛋白质的比活性增强来达成。在比活性的增强中，可以包含反馈抑制的脱敏(desensitization to feedbackinhibition)。即，在蛋白质受到基于代谢物的反馈抑制的情况下，通过以使得反馈抑制脱敏的方式使基因或蛋白质在宿主中变异，能够使蛋白质的活性提高。需要说明的是，只要没有特别记载，“反馈抑制的脱敏”中就可以包含反馈抑制完全解除的情况和反馈抑制减轻的情况。此外，也将“反馈抑制脱敏”(即反馈抑制被减轻或解除)称为“对反馈抑制具有耐性”。比活性增强的蛋白质，例如，可通过对各种生物进行探索而取得。此外，也可通过向既有的蛋白质中导入变异来取得高活性型。就导入的变异而言，例如，可以是蛋白质的1个或数个位置处的1个或数个氨基酸被置换、缺失、插入、和/或添加的变异。变异的导入，例如，可通过如上所述的部位特异性变异法来进行。此外，变异的导入，例如，也可通过诱变处理来进行。作为诱变处理，可以举出X射线的照射、紫外线的照射、以及使用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、甲基磺酸乙酯(EMS)和甲基磺酸甲酯(MMS)等变异剂进行的处理。此外，也可以在体外(in vitro)直接用羟胺处理DNA，诱发随机变异。比活性的增强可以单独使用，也可以与如上所述的使基因表达增强的方法任意地组合进行使用。
转化的方法无特别限定，可以使用以往已知的方法。例如，可以使用如对于大肠杆菌K-12所报告的、用氯化钙处理受体菌细胞以增加DNA透过性的方法(Mandel,M.and Higa,A.,J.Mol.Biol.1970,53,159-162)；如对于枯草芽孢杆菌所报告的、从增殖阶段的细胞调制感受态细胞以导入DNA的方法(Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Young,F.E.,1997.Gene1:153-167)。或，也可以应用如对于枯草芽孢杆菌、放线菌类以及酵母所已知的、使DNA受体菌的细胞处于易于吸收重组DNA的原生质体或原生质球的状态，以将重组DNA导入DNA受体菌的方法(Chang,S.and Choen,S.N.,1979.Mol.Gen.Genet.168:111-115；Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Hopwood,O.A.1978.Nature 274:398-400；Hinnen,A.,Hicks,J.B.andFink,G.R.1978.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:1929-1933)。或，也可以利用如对于棒状细菌所报告的电脉冲法(日本特开平2-207791)。
蛋白质的活性提高可通过测定该蛋白质的活性来确认。
也可通过确认编码该蛋白质的基因表达的上升，来确认蛋白质的活性的提高。可通过对该基因的转录量的上升进行确认，或对该基因表达的蛋白质的量的上升进行确认来确认基因表达的上升。
基因转录量上升的确认可通过将该基因转录的mRNA的量与野生株或亲本株等未修饰株比较来进行。作为评价mRNA量的方法，可以举出Northern杂交、RT-PCR、微阵列、RNA-seq等(Sambrook,J.,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual/Third Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor(USA),2001)。mRNA的量，例如，可以上升至未修饰株的1.2倍以上、1.5倍以上、2倍以上、或3倍以上。
蛋白质量上升的确认可通过使用抗体的蛋白质印迹法进行(Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor(USA),2001))。蛋白质的量(例如，平均一个细胞中的分子数)，例如，可以上升至未修饰株的1.2倍以上、1.5倍以上、2倍以上、或3倍以上。
所述使蛋白质的活性提高的方法可以用于任意的蛋白质的活性增强或任意的基因的表达增强。
<使蛋白质的活性降低的方法>
以下，就使蛋白质的活性降低的方法进行说明。
“蛋白质的活性降低”可以是指，该蛋白质的活性与未修饰株相比有所降低。“蛋白质的活性降低”可以是指，具体而言，该蛋白质的平均一个细胞中的活性与未修饰株相比有所减少。此处所谓的“未修饰株”可以是指，未进行使靶标蛋白质的活性降低的修饰的对照株。作为未修饰株，可以举出野生株、亲本株。作为未修饰株，具体而言，可以举出各微生物物种的模式株(type strain)。此外，作为未修饰株，具体而言，还可以举出微生物的说明中例示的菌株。即，在一个方式中，蛋白质的活性可以是与模式株(即属于具有目标物质生产能力的微生物的种的模式株)相比有所降低。此外，在另一个方式中，蛋白质的活性可以与C.glutamicum ATCC 13869株相比有所降低。此外，在另一个方式中，蛋白质的活性可以与C.glutamicum ATCC 13032株相比有所降低。此外，在另一个方式中，蛋白质的活性可以与E.coli K-12 MG1655株相比有所降低。需要说明的是，“蛋白质的活性降低”中也可以包含该蛋白质的活性完全消失的情况。更具体而言，“蛋白质的活性降低”可以是指，与未修饰株相比，该蛋白质的平均一个细胞中的分子数降低，和/或，该蛋白质的平均一个分子的功能降低。即，“蛋白质的活性降低”中的“活性”不限于蛋白质的催化剂活性，也可以是指编码蛋白质的基因的转录量(mRNA量)或翻译量(蛋白质的量)。需要说明的是，“蛋白质的平均一个细胞中的分子数降低”中也可以包含该蛋白质完全不存在的情况。此外，“蛋白质的平均一个分子的功能降低”中也可以包含该蛋白质的平均一个分子的功能完全消失的情况。就蛋白质的活性的降低的程度而言，只要蛋白质的活性与未修饰株相比有所降低就无特别限制。蛋白质的活性，例如，可以降低至未修饰株的50％以下、20％以下、10％以下、5％以下、或0％。
就使蛋白质的活性降低的修饰而言，例如，可通过使编码该蛋白质的基因的表达降低而达成。“基因的表达降低”可以是指，该基因的表达与野生株、亲本株等未修饰株相比有所降低。具体而言，“基因的表达降低”可以是指，该基因的平均一个细胞中的表达量与未修饰株相比有所减少。更具体而言，“基因的表达降低”可以是指，基因的转录量(mRNA量)降低和/或基因的翻译量(蛋白质的量)降低。“基因的表达降低”中也可以包含该基因完全不表达的情况。需要说明的是，也将“基因的表达降低”称为“基因的表达弱化”。基因的表达，例如，可以降低至未修饰株的50％以下、20％以下、10％以下、5％以下、或0％。
基因的表达的降低，例如，可以是转录效率的降低引起的，也可以是翻译效率的降低引起的，也可以是它们的组合引起的。就基因的表达的降低而言，例如，可通过对基因的启动子、Shine Dalgarno(SD)序列(也称为核糖体结合部位(RBS))、RBS与起始密码子之间的间隔区域等表达调节序列进行修饰而达成。对表达调节序列进行修饰时，可以对表达调节序列的1碱基以上、2碱基以上、或3碱基以上进行修饰。就基因的转录效率的降低而言，例如，可通过将染色体上的基因的启动子置换为更弱的启动子而达成。“更弱的启动子”可以是指，与原本存在的野生型的启动子相比，使基因的转录弱化的启动子。作为更弱的启动子，例如，可以举出诱导型的启动子。作为更弱的启动子，例如，还可以举出P4启动子(WO2018/079684)、P8启动子(WO2018/079684)。即，诱导型的启动子在非诱导条件下(例如，在不存在诱导物质下)可以作为更弱的启动子而发挥功能。此外，也可以使表达调节序列的一部分或全部缺失。此外，就基因表达的降低而言，例如，也可通过对与表达控制相关的因子进行操作而达成。作为与表达控制相关的因子，可以举出与转录、翻译控制相关的低分子(诱导物质、抑制物质等)、蛋白质(转录因子等)、核酸(siRNA等)等。此外，就基因表达的降低而言，例如，也可通过向基因的编码区域中导入使基因的表达降低的变异来达成。例如，通过将基因编码区域的密码子置换为在宿主中更为低频使用的同义密码子，可使基因的表达降低。此外，例如，通过如本说明书中所记载的基因的破坏，可使得基因表达本身降低。
此外，就使蛋白质的活性降低的修饰而言，例如，可通过破坏编码该蛋白质的基因来达成。“基因被破坏”可以是指，对该基因进行修饰以使得其不产生正常发挥功能的蛋白质。“不产生正常发挥功能的蛋白质”中可以包含该基因完全不产生蛋白质的情况、该基因产生平均一个分子的功能(例如，活性、性质)降低或消失的蛋白质的情况。
基因的破坏，例如，可通过使染色体上的基因缺失(缺损)而达成。“基因的缺失”可以是指，基因编码区域的一部分或全部区域的缺失。进一步而言，可以使染色体上包含基因编码区域前后的序列的基因整体都缺失。只要能够达成使蛋白质的活性降低的效果，缺失的区域就可以是N末端区域(即编码蛋白质的N末端侧的区域)、内部区域、C末端区域(即编码蛋白质的C末端侧的区域)等中任一区域。通常，缺失的区域越长越能可靠地使基因失活。缺失的区域，例如，可以为基因的编码区域全长的10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、或95％以上的长度的区域。此外，缺失区域前后的序列优选阅读框不一致。通过阅读框的不一致，可使缺失区域的下游发生移码。
此外，就基因的破坏而言，例如，也可通过向染色体上的基因的编码区域中导入氨基酸置换(错义突变)、导入终止密码子(无义突变)、或导入1～2碱基的添加或缺失(移码突变)等来达成(Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617(1997),Proceedingsof the National Academy of Sciences,USA 955511-5515(1998),Journal ofBiological Chemistry 26 116,20833-20839(1991))。
此外，就基因的破坏而言，例如，也可通过向染色体上的基因的编码区域中插入其他碱基序列来达成。插入部位可以是基因的任何区域，插入的碱基序列越长越能可靠地使基因失活。此外，插入部位前后的序列优选阅读框不一致。通过阅读框的不一致，可使插入部位的下游发生移码。作为其他的碱基序列，只要是使编码的蛋白质的活性降低或消失的就无特别限制，例如，可以举出抗生素抗性基因等标记基因、对目标物质的生产有用的基因。
基因的破坏特别是可以以使得编码的蛋白质的氨基酸序列缺失(缺损)的方式实施。换言之，就使蛋白质的活性降低的修饰而言，例如，可通过使蛋白质的氨基酸序列(氨基酸序列的一部分或全部的区域)缺失而达成，具体来说，可通过对基因进行修饰以使其编码氨基酸序列(氨基酸序列的一部分或全部的区域)缺失了的蛋白质而达成。需要说明的是，“蛋白质的氨基酸序列的缺失”可以是指，蛋白质的氨基酸序列的一部分或全部的区域的缺失。此外，“蛋白质的氨基酸序列的缺失”可以是指蛋白质中原来的氨基酸序列消失，也可以包含原来的氨基酸序列变为其他氨基酸序列的情况。即，例如，因移码而变为其他氨基酸序列的区域可以视为缺失的区域。通过使氨基酸序列缺失，典型的情况是蛋白质的全长会缩短，但也存在蛋白质的全长没有变化或延长的情况。例如，可通过使基因的编码区域的一部分或全部的区域缺失，来使编码的蛋白质的氨基酸序列中，该缺失区域编码的区域缺失。此外，例如，可通过向基因的编码区域中导入终止密码子，来使编码的蛋白质的氨基酸序列中，该导入部位下游区域编码的区域缺失。此外，例如，可通过基因的编码区域中的移码，来使该移码部位编码的区域缺失。关于氨基酸序列的缺失中的使之缺失的区域的位置和长度，可比照适用基因的缺失中的使之缺失的区域的位置和长度的说明。
就对染色体上的基因进行如上所述的修饰而言，例如，可通过以下方式达成：制作以使得不产生正常发挥功能的蛋白质的方式进行了修饰的破坏型基因，使用包含该破坏型基因的重组DNA转化宿主，使破坏型基因和染色体上的野生型基因发生同源重组，从而以破坏型基因置换染色体上的野生型基因。此时，如果根据宿主的营养缺陷型等性质而使重组DNA中包含标记基因，则易于操作。作为破坏型基因，可以举出使基因的编码区域的一部分或全部区域缺失的基因、导入了错义突变的基因、导入了无义突变的基因、导入了移码突变的基因、插入有转座子、标记基因的基因。破坏型基因编码的蛋白质即使生成了，也具有与野生型蛋白质不同的立体结构，其功能降低或消失。利用这样的同源重组的基因置换而进行的基因破坏已经得到了确立，存在以下方法：被称为“Red-driven integration”的方法(Datsenko,K.A,and Wanner,B.L.Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.97:6640-6645(2000))、将Red-driven integration法和来源于λ噬菌体的切出系统(Cho,E.H.,Gumport,R.I.,Gardner,J.F.J.Bacteriol.184:5200-5203(2002))组合的方法(WO2005/010175号参照)等使用直链状DNA的方法、使用包含温度感受性复制起点的质粒的方法、使用能够接合传递的质粒的方法、使用不具有在宿主内发挥功能的复制起点的自杀载体的方法等(美国专利第6303383号，日本特开平05-007491号)。
此外，就使蛋白质的活性降低的修饰而言，例如，也可以通过诱变处理来进行。作为诱变处理，可以举出X射线的照射、紫外线的照射、以及使用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、甲基磺酸乙酯(EMS)和甲基磺酸甲酯(MMS)等变异剂的处理。
需要说明的是，在蛋白质作为包含多个亚基的复合体而发挥功能的情况下，只要结果是蛋白质的活性降低，就既可以对这些亚基的全部进行修饰，也可以只对一部分进行修饰。即，例如，可以使分别编码这些亚基的基因全部被破坏等，也可以只破坏一部分等。此外，在蛋白质存在多个同工酶的情况下，只要结果是蛋白质的活性降低，就既可以使这些同工酶的全都活性降低，也可以只使一部分的活性降低。即，例如，可以使分别编码这些同工酶的基因全部被破坏等，也可以只破坏一部分等。
如上所述的使蛋白质的活性降低的方法，可以单独使用，也可以任意组合使用。
蛋白质活性的降低可通过测定该蛋白质的活性来确认。
蛋白质活性的降低，也可通过确认编码该蛋白质的基因的表达的降低来进行确认。基因的表达的降低可通过确认该基因的转录量的降低或确认该基因表达的蛋白质的量的降低来进行确认。
基因转录量的降低的确认可通过将该基因转录的mRNA的量与未修饰株比较而进行。作为评价mRNA的量的方法，可以举出Northern杂交、RT-PC R、微阵列、RNA-seq等(Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor(USA),2001))。mRNA的量，例如，可以降至未修饰株的50％以下、20％以下、10％以下、5％以下、或0％。
蛋白质量的降低的确认可使用抗体通过蛋白质印迹法来进行(MolecularCloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor(USA),2001))。蛋白质的量(例如，平均一个细胞中的分子数)，例如，可以降低至未修饰株的50％以下、20％以下、10％以下、5％以下、或0％。
基因的破坏可通过以下方式确认：根据破坏时使用的手段，确定该基因的一部分或全部的碱基序列、限制酶图谱、或全长等来确认。
所述的使蛋白质的活性降低的方法可以用于任意蛋白质的活性降低、任意基因的表达降低。
<1-2>含有目标物质的发酵液的制造
<1-2-1>狭义的发酵
就发酵液而言，例如，可通过利用了具有目标物质生产能力的微生物的狭义的发酵来制造。即，可通过狭义的发酵生成目标物质，由此取得含有目标物质的发酵液。也将通过狭义的发酵制造发酵液的工序称为“发酵工序”。
发酵工序可通过培养具有目标物质生产能力的微生物而实施。具体而言，在发酵工序中，目标物质可由碳源生成。即，发酵工序，例如，可以是用培养基(例如，含有碳源的培养基)培养微生物，在该培养基中生成、积蓄目标物质的工序。此外，换言之，发酵工序，例如，可以是利用微生物由碳源生成目标物质的工序。
就使用的培养基而言，只要能够使微生物增殖、生产目标物质，就无特别限制。作为培养基，例如，可以使用在细菌、酵母等微生物的培养中使用的通常的培养基。培养基可以根据需要而含有碳源、氮源、磷酸源、硫源、其它的各种有机成分、无机成分等培养基成分。培养基成分的种类、浓度可以根据使用的微生物的种类等各条件而适宜地设定。
就碳源而言，只要是微生物能够利用以生产目标物质的，就无特别限制。作为碳源，具体而言，例如，可以举出葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、糖蜜，淀粉的水解物、生物质的水解物等糖类；乙酸、柠檬酸、琥珀酸、葡萄糖酸等有机酸类；乙醇、甘油、粗甘油等醇类；脂肪酸类。需要说明的是，作为碳源，特别是可使用来源于植物的原料。作为植物，例如，可以举出玉米、米、小麦、大豆、甘蔗、甜菜、棉。作为来源于植物的原料，例如，可以举出根、茎、干、枝、叶、花、种子等器官、包含它们的植物体、这些植物器官的分解产物。来源于植物的原料的利用形态无特别限制，例如，可以使用未加工品、榨汁、粉碎物、纯化物等中的任一形态。此外，木糖等五碳糖、葡萄糖等六碳糖、或它们的混合物，例如，可从植物生物质中取得并使用。具体而言，就这些糖类而言，可通过对植物生物质进行水蒸气处理、浓酸水解、稀酸水解、纤维素酶等酶进行的水解、碱处理等处理，而取得。需要说明的是，一般来说半纤维素比纤维素更容易被水解，因此可以预先使植物生物质中的半纤维素水解，使五碳糖游离，然后使纤维素水解而生成六碳糖。此外，就木糖而言，例如，可以使微生物具有从葡萄糖等六碳糖到木糖的转化通路，通过从六碳糖的转化而供给。作为碳源，可以使用1种碳源，也可以将2种或2种以上的碳源组合使用。
就培养基中的碳源的浓度而言，只要微生物能够增殖、生产目标物质，就无特别限制。培养基中的碳源的浓度，例如，可以在不抑制目标物质的生产的范围内尽可能的高。培养基中碳源的初始浓度，例如，可以为5～30w/v％或10～20w/v％。此外，可以适宜地将碳源添加到培养基中。例如，随着发酵的进行，发生碳源的减少或枯竭，可以根据这些情况而向培养基中添加碳源。虽然只要最终生产了目标物质，碳源也可以暂时枯竭，但是培养有时会优选以使得碳源不枯竭的形式或以使得在碳源枯竭的状态下无法继续的形式进行实施。
作为氮源，具体而言，例如，可以举出硫酸铵、氯化铵、磷酸铵等铵盐、蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、大豆蛋白质分解物等有机氮源、氨、尿素。也可以将用于pH调整的氨气、氨水作为氮源而利用。作为氮源，可以使用1种氮源，也可以将2种或2种以上的氮源组合使用。
作为磷酸源，具体而言，例如，可以举出磷酸二氢钾、磷酸氢二钾等磷酸盐、焦磷酸等磷酸聚合物。作为磷酸源，可以使用1种磷酸源，也可以将2种或2种以上的磷酸源组合使用。
作为硫源，具体而言，例如，可以举出硫酸盐、硫代硫酸盐、亚硫酸盐等无机硫化合物、半胱氨酸、胱氨酸、谷胱甘肽等含硫氨基酸。作为硫源，可以使用1种硫源，也可以将2种或2种以上的硫源组合使用。
作为其它的各种有机成分、无机成分，具体而言，例如，可以举出氯化钠、氯化钾等无机盐类；铁、锰、镁、钙等微量金属类；维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、烟酸酰胺、维生素B12等维生素类；氨基酸类；核酸类；含有它们的蛋白胨、酪蛋白氨基酸、酵母提取物、大豆蛋白质分解物等有机成分。作为其它的各种有机成分、无机成分，可以使用1种成分，也可以将2种或2种以上的成分组合使用。
此外，在使用其生长繁殖要求氨基酸等营养素的营养缺陷型变异株的情况下，培养基可以优选含有这样的营养素。此外，培养基可以含有目标物质的生产所利用的成分。作为这样的成分，具体而言，例如，可以举出甲基供体(例如，SAM)、它们的前体(例如，蛋氨酸)。
就培养条件而言，只要微生物能够增殖、生成目标物质，就无特别限制。培养，例如，可以以细菌、酵母等微生物的培养中使用的通常条件进行。培养条件可以根据使用的微生物的种类等各条件而适宜设定。
培养可以使用液体培养基来进行。培养时，例如，可以将用琼脂培养基等固体培养基培养的微生物直接接种到液体培养基中，也可以将用液体培养基进行了种培养的微生物接种到主培养用的液体培养基中。即，培养可以分为种培养和主培养进行。此时，种培养和主培养的培养条件可以相同，也可以不同。目标物质至少在主培养的期间生产即可。培养开始时培养基中含有的微生物的量无特别限制。例如，可以使用OD660＝4～100的种培养液，在培养开始时，以相对于主培养用的培养基为0.1质量％～100质量％，或1质量％～50质量％的浓度进行接种。
培养可以以批次培养(batch culture)、分批补料培养(Fed-batch culture)、连续培养(continuous culture)、或它们的组合的形式进行实施。需要说明的是，也将培养开始时的培养基称为“初始培养基”。此外，也将在分批补料培养或连续培养中添加到培养体系(例如，发酵槽)中的培养基称为“分批补料培养基”。此外，也将在分批补料培养或连续培养中将分批补料培养基添加到培养体系中的操作称为“分批补料”。需要说明的是，在将培养分为种培养和主培养进行的情况下，种培养和主培养的培养形态可以相同，也可以不同。例如，种培养和主培养可以同样地以批次培养的形式进行，也可以以批次培养的形式进行种培养，而主培养以分批补料培养或连续培养的形式进行。
碳源等各种成分可以包含在初始培养基、分批补料培养基、或这两者中。即，在培养的过程中，碳源等各种成分可以单独地或以任意的组合添加到培养基中。这些成分中的每一种都可以添加1次或多次，也可以连续地添加。初始培养基中含有的成分的种类与分批补料培养基中含有的成分的种类可以相同，也可以不同。此外，初始培养基中含有的各成分的浓度与分批补料培养基中含有的各成分的浓度可以相同，也可以不同。此外，也可以使用含有成分的种类和/或浓度不同的2种或2种以上的分批补料培养基。例如，在间歇地进行多次分批补料的情况下，各分批补料培养基中含有的成分的种类和/或浓度可以相同，也可以不同。
培养例如可以在好气条件下实施。“好气条件”可以是指，培养基中的溶解氧浓度为0.33ppm以上或1.5ppm以上的条件。氧浓度，具体而言，例如可以控制在相对于饱和氧浓度为1～50％或5％左右。就培养而言，例如，可以以通气培养或振荡培养的形式进行。培养基的pH例如可以为pH 3～10或pH 4.0～9.5。培养中，可以根据需要对培养基的pH进行调整。培养基的pH可使用氨气、氨水、碳酸钠、重碳酸钠、碳酸钾、重碳酸钾、碳酸镁、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁等各种碱性或酸性物质进行调整。培养温度例如可以为20～45℃或25℃～37℃。培养期间例如可以为10小时～120小时。就培养而言，例如，可以在培养基中的碳源耗尽前，或微生物失去活性前，持续地进行。
通过在这样的条件下培养微生物，目标物质在培养基中积蓄，从而得到含有目标物质的发酵液(具体来说是培养液)。
<1-2-2>生物转化
发酵液例如可通过利用了具有目标物质生产能力的微生物的生物转化而制造。即，可通过生物转化生成目标物质，由此取得含有目标物质的发酵液。也将通过生物转化制造发酵液的工序称为“生物转化工序”。
具体而言，在生物转化工序中，目标物质可由该目标物质的前体制造。更具体而言，在生物转化工序中，目标物质可通过利用微生物将该目标物质的前体转化为该目标物质而制造。即，生物转化工序可以是利用微生物将目标物质的前体转化为该目标物质的工序。
也将目标物质的前体简单称为“前体”。作为前体，可以举出目标物质的生物合成通路中的中间体(例如，在目标物质生物合成酶的相关记载中提到的物质)。就前体而言，例如，可以是其在向目标物质的转化中需要SAM的物质。作为前体，具体而言，可以举出原儿茶酸、原儿茶醛、香兰素酸、苯甲酸、桂皮酸、L-苯丙氨酸。原儿茶酸、原儿茶醛、香兰素酸中的任一个，例如，都可以作为用于生产香兰素的前体而使用。苯甲酸和L-苯丙氨酸中的任一个，例如，都可以作为用于生产苯甲醛的前体而使用。桂皮酸和L-苯丙氨酸中的任一种，例如，都可以作为用于生产肉桂醛的前体而使用。作为前体，可以使用1种前体，也可以将2种或2种以上的前体组合使用。如果前体是可以采取盐的形态的化合物，则前体可以以游离体的形式使用，可以以盐的形式使用，也可以以它们的混合物的形式使用。即，只要没有特别记载，“前体”可以是指，游离体形式的前体或其盐，或它们的混合物。作为盐，例如，可以举出硫酸盐、盐酸盐、碳酸盐、铵盐、钠盐、钾盐。作为前体的盐，可以使用1种盐，也可以将2种或2种以上的盐组合使用。
作为前体，可以使用市售品，也可以使用适宜制造而取得的前提。前体的制造方法无特别限制，例如，可以使用公知的方法。前体例如可通过化学合成法、酶法、生物转化法、发酵法、提取法、或它们的组合而制造。即，例如，就目标物质的前体而言，可利用对该前体的前体转化为该目标物质的前体的转化反应进行催化的酶(也称为“前体生成酶”)，由这样的前体的前体制造。此外，例如，就目标物质的前体而言，可利用具有前体生产能力的微生物，由碳源或由这样的前体的前体制造。“具有前体生产能力的微生物”可以是指，能够从碳源或从这样的前体的前体生成目标物质的前体的微生物。例如，作为通过酶法或生物转化法制造原儿茶酸的方法，可以举出使用恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KS-0180将对甲酚转化为原儿茶酸的方法(日本特开平7-75589号公报)；使用NADH依赖性对羟基苯甲酸羟化酶将对羟基苯甲酸转化为原儿茶酸的方法(日本特开平5-244941号公报)；通过使用添加有对苯二甲酸的培养基，对导入了参与由对苯二甲酸生成原儿茶酸的反应的基因的转化体进行培养而制造原儿茶酸的方法(日本特开2007-104942号公报)；使用具有原儿茶酸生产能力且原儿茶酸5位氧化酶活性降低或缺损了的微生物，由其前体制造原儿茶酸的方法(日本特开2010-207094号公报)。此外，作为通过发酵法制造原儿茶酸的方法，可以举出使用属于短杆菌(Brevibacteriu m)属的细菌，将乙酸作为碳源制造原儿茶酸的方法(日本特开昭50-89592号公报)；使用导入有编码3-二氢莽草酸脱氢酶的基因的属于埃希氏菌(Escherichia)属或克雷伯氏菌(Klebsiella)属的细菌，以葡萄糖为碳源制造原儿茶酸的方法(美国专利第5272073号说明书)。此外，香兰素酸可通过以下方法制造：以原儿茶酸作为前体，通过利用了OMT的酶法或利用了具有OMT的微生物的生物转化法(J.Am.CHm.Soc.,1998,Vol.120)制造；或以阿魏酸为前体，通过利用了Pseudomonas sp.AV10株的生物转化法(J.App.Microbiol.,2013,Vol.116,p903-910)制造。此外，原儿茶醛可以以原儿茶酸为前体，通过利用了ACAR的酶法或利用了具有ACAR的微生物的生物转化法而制造。制造而得的前体可直接用于生物转化法，或适宜地进行浓缩、稀释、干燥、溶解、分馏、提取、纯化等处理后用于生物转化法。即，作为前体，例如，可以使用以期望的程度进行了纯化的纯化品，也可以使用含有前体的原材料。就含有前体的原材料而言，只要微生物能够利用前体，就无特别限制。作为含有前体的原材料，具体而言，例如，可以举出培养具有前体生产能力的微生物而得到的培养液、从该培养液中分离的培养上清、它们的浓缩物(例如，浓缩液)、干燥物等处理物。
在一个方式中，生物转化工序可通过培养具有目标物质生产能力的微生物而实施。也将该方式称为“生物转化的第1方式”。即，生物转化工序，例如，可以是以含有目标物质的前体的培养基培养微生物，将该前体转化为目标物质的工序。具体而言，生物转化工序可以是以含有目标物质的前体的培养基培养微生物，使目标物质在该培养基中生成、积蓄的工序。
使用的培养基只要含有目标物质的前体且微生物能够增殖、生产目标物质，就无特别限制。就培养条件而言，只要微生物能够增殖、生产目标物质，就无特别限制。关于生物转化的第1方式中的培养，除了在该方式中培养基含有目标物质的前体之外，可比照适用关于狭义的发酵中的培养的记载(例如，关于培养基、培养条件的记载)。
前体可以在培养的整个期间中都包含在培养基中，也可以只在培养的一部分期间中包含在培养基中。即，在“以含有前体的培养基培养微生物”的概念中，不需要前体在培养的整个期间中都包含在培养基中。例如，前体可以从培养开始时就包含在培养基中，也可以不包含。如果前体在培养开始时不包含在培养基中，则在培养开始后将前体添加至培养基中。添加的时机可以根据培养时间等各条件适宜设定。例如，可以在微生物充分地生长繁殖后再将前体添加到培养基中。此外，无论哪种情况，都可以适宜地将前体添加到培养基中。例如，随着目标物质的生成，发生前体的减少或枯竭，可以根据这些情况而向培养基中添加前体。将前体添加至培养基中的手段无特别限制。例如，可通过将含有前体的分批补料培养基分批补料至培养基中，来将前体添加至培养基中。此外，例如，也可通过将具有目标物质生产能力的微生物和具有前体生产能力的微生物进行共培养，使具有前体生产能力的微生物在培养基中生成前体，由此将前体添加到培养基中。“将某些成分添加到培养基中”中的“成分”也可以包含在培养基中生成或再生的物质。这些添加手段也可以适宜地组合使用。就培养基中的前体浓度而言，只要微生物能够将前体作为目标物质的原料而利用，就无特别限制。培养基中的前体浓度以游离体的重量计，例如，可以为0.1g/L以上、1g/L以上、2g/L以上、5g/L以上、10g/L以上、或15g/L以上，可以为200g/L以下、100g/L以下、50g/L以下、或20g/L以下，也可以为它们的组合。前体可以在培养的整个期间中，以所述例示的浓度包含在培养基中，也可以并非如此。前体例如可以在培养开始时以所述例示的浓度包含在培养基中，也可以在培养开始后添加至培养基中并使得其达到所述例示的浓度。如果培养分为种培养和主培养进行，则目标物质至少在主培养期间生产即可。因此，前体至少在主培养期间，即在主培养的整个期间或主培养的一部分的期间中，包含在培养基中即可。即，前体可以在种培养期间包含在培养基中，也可以不包含。这样的情况下，关于培养的记载(例如，“培养期间(培养的期间)”、“培养开始”)可以认为是关于主培养的。
在另一个方式中，生物转化工序可通过利用具有目标物质生产能力的微生物的菌体来实施。也将该方式称为“生物转化的第2方式”。即，生物转化工序例如可以是利用微生物的菌体，将反应液中的目标物质的前体转化为目标物质的工序。具体而言，生物转化工序可以是使微生物的菌体对反应液中的目标物质的前体发生作用，使目标物质在该反应液中生成、积蓄的工序。也将这样的利用菌体而实施的生物转化工序称为“转化反应”。
微生物的菌体通过培养微生物而得到。就用于取得菌体的培养法而言，只要微生物能够增殖，就无特别限制。在进行用于取得菌体的培养时，前体可以包含在培养基中，也可以不包含。此外，在进行用于取得菌体的培养时，目标物质可以在培养基生产，也可以不生产。关于生物转化的第2方式中的用于取得菌体的培养，可比照适用关于狭义的发酵中的培养的记载(例如，关于培养基、培养条件的记载)。
菌体可以以包含在培养液(具体而言是培养基)的状态直接用于转化反应，也可以从培养液(具体而言是培养基)中回收后再用于转化反应。此外，菌体可以在进行适宜的处理后再用于转化反应。即，作为菌体，可以举出含有菌体的培养液、从该培养液中回收的菌体、它们的处理物。换言之，作为菌体，可以举出微生物的培养液中包含的菌体、从该培养液中回收的菌体、它们的处理物中包含的菌体。作为处理物，可以举出对菌体进行处理后的产物。作为处理物，具体而言，可以举出对含有菌体的培养液进行处理后的产物、对从该培养液中回收的菌体进行处理后的产物。这些形态的菌体可以适宜地组合使用。
从培养液中回收菌体的方法无特别限制，例如可以使用公知的方法。作为这样的方法，例如，可以举出自然沉降、离心分离、过滤。此外，也可以使用凝聚剂(flocculant)。这些方法可以适宜地组合使用。对回收的菌体可以用适当的介质进行适宜的清洗。此外，对回收的菌体，可以用适当的介质进行适宜的再悬浮。作为可以用于清洗、悬浮的介质，例如，可以举出水、水性缓冲液等水性介质(水性溶剂)。
作为菌体的处理，例如，可以举出稀释、浓缩、固定到丙烯酰胺、卡拉胶等载体上的固定化处理、冻结融解处理、提高膜的透过性的处理。膜的透过性例如可使用表面活性剂或有机溶剂来提高。这些处理可以适宜地组合使用。
就用于转化反应的菌体而言，只要具有目标物质生产能力就无特别限制。菌体优选保持有代谢活性。“保持有代谢活性”可以是指，菌体具有利用碳源而生成或再生目标物质的制造中所需要的物质的能力。作为这样的物质，可以举出ATP；NADH、NADP等电子供体；SAM等甲基供体。菌体可以具有生长繁殖的能力，也可以不具有。
转化反应可以在适当的反应液中实施。具体而言，转化反应可通过使菌体和前体在适当的反应液中共存而实施。转化反应可以以批次式的形式实施，也可以以柱式的形式实施。如果是批次式，则例如，可通过在反应容器内的反应液中，使微生物的菌体和前体混合，而实施转化反应。转化反应可以在静置条件下实施，也可以在搅拌、振荡条件下实施。如果是柱式，则例如，可通过使含有前体的反应液通过充填有固定化菌体的柱中，来实施转化反应。作为反应液，可以举出水、水性缓冲液等水性介质(水性溶剂)。
反应液在前体的基础上，也可以根据需要而含有前体以外的成分。作为前体以外的成分，可以举出ATP、NADH或NADPH等电子供体、SAM等甲基供体、金属离子、缓冲剂、表面活性剂、有机溶剂、碳源、磷酸源、其它各种培养基成分。即，例如，可以将含有前体的培养基作为反应液使用。即，对于生物转化的第2方式中的反应液，可比照适用关于生物转化的第1方式中的培养基的记载。反应液中含有的成分的种类、浓度可以根据使用的前体的种类、使用的菌体的形态等各条件而适宜设定。
就转化反应的条件(溶解氧浓度、反应液的pH、反应温度、反应时间、各种成分的浓度等)而言，只要能够生成目标物质就无特别限制。就转化反应而言，例如，可以在利用静止菌体等微生物菌体的物质转化中使用的通常条件下进行。转化反应的条件可以根据使用的微生物的种类等各条件而适宜设定。转化反应例如可以在好气条件下实施。“好气条件”可以是指，反应液中的溶解氧浓度为0.33ppm以上或1.5ppm以上的条件。具体而言，例如，氧浓度可以被控制在相对于饱和氧浓度为1～50％或5％左右。反应液的pH，例如，通常可以为6.0～10.0或6.5～9.0。反应温度，例如，通常可以为15～50℃、15～45℃、或20～40℃。反应时间，例如，可以为5分钟～200小时。如果是柱法，则反应液的通过速度，例如，可以是使得反应时间在所述例示的反应时间范围内的速度。此外，转化反应，例如，也可以在细菌、酵母等微生物的培养中使用的通常条件等培养条件下进行。在转化反应中，菌体可以生长繁殖，也可以不生长繁殖。即，对于生物转化的第2方式中的转化反应，除了该方式中菌体可以生长繁殖也可以不生长繁殖之外，可比照适用关于生物转化的第1方式中的培养的记载。此时，用于取得菌体的培养条件与转化反应的条件可以相同也可以不同。反应液中的前体浓度以游离体的重量计，例如，可以为0.1g/L以上、1g/L以上、2g/L以上、5g/L以上、10g/L以上、或15g/L以上，可以为200g/L以下、100g/L以下、50g/L以下、或20g/L以下，也可以是它们的组合。就反应液中的菌体的浓度而言，例如，以600nm处的光学密度(OD)计，可以为1以上，可以为300以下，也可以为它们的组合。
在转化反应的过程中、菌体、前体和其它的成分可以单独地或以任意的组合添加到反应液中。例如，随着目标物质的生成，发生前体的减少或枯竭，可以根据这些情况而向反应液中添加前体。这些成分可以分1次或多次添加，也可以连续地添加。
将前体等各种成分添加至反应液中的手段无特别限制。这些成分中的任一种都可以通过对反应液进行直接添加，而添加至反应液中。此外，例如，可通过将具有目标物质生产能力的微生物与具有前体生产能力的微生物共培养，使具有前体生产能力的微生物在反应液中生成前体，由此将前体添加至反应液中。此外，例如，就ATP、电子供体、甲基供体等成分中的任一种而言，它们可以在反应液中生成或再生，可以在微生物的菌体内生成或再生，也可以通过不同菌体之间的合作而生成或再生。例如，在微生物的菌体中保持有代谢活性情况下，可利用碳源在微生物的菌体内生成或再生ATP、电子供体、甲基供体等成分。例如，具体而言，微生物可以具有增强了的生成或再生SAM的能力，由该微生物生成或再生的SAM可以用于转化反应。SAM的生成或再生可通过与其他生成或再生SAM的方法组合而进一步增强。此外，作为生成或再生ATP的方法，例如，可以举出利用棒状杆菌属细菌，由碳源供给ATP的方法(Hori,H et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.48(6):693-698(1997))；利用酵母菌体和葡萄糖再生ATP的方法(Yamamoto,S et al.,Biosci.Biotechnol.Biochem.69(4):784-789(2005))；利用磷酸烯醇丙酮酸和丙酮酸激酶再生ATP的方法(C.Aug’e andCh.Gautheron,Tetrahedron Lett.29：789-790(1988))；利用聚磷酸和聚磷酸激酶再生ATP的方法(Murata,K et al.,Agric.Biol.Chem.52(6):1471-1477(1988))。“将某些成分添加至反应液中”中的“成分”也可以包含在反应液中生成或再生的物质。
此外，反应条件可以从转化反应开始到结束都保持一致，也可以在转化反应的过程中变化。“反应条件在转化反应的过程中变化”这一表达不限于反应条件随时间而变化的情况，也可以包含反应条件随空间而变化的情况。“反应条件随空间而变化”可以是指，例如，在以柱式实施转化反应的情况下，反应温度、菌体密度等反应条件根据流路上的位置而不同。
通过如此实施生物转化工序，目标物质在培养基中或反应液中积蓄，由此得到含有目标物质的发酵液(具体而言是培养液或反应液)。
目标物质的生成可通过化合物检测或用于鉴定的公知的方法来进行确认。作为这样方法，例如，可以举出HPLC、UPLC、LC/MS、GC/MS、NMR。这些方法可以适宜地组合使用。这些方法也可以用于确定培养基中或反应液中存在的目标物质以外的各种成分的浓度。
就发酵液中的目标物质的含量而言，只要能够用有机溶剂提取目标物质，就无特别限制。发酵液中的目标物质的含量，例如，可以为0.01g/L以上、0.05g/L以上、0.1g/L以上、0.5g/L以上、或1g/L以上，可以为100g/L以下、50g/L以下、20g/L以下、10g/L以下、5g/L以下、2g/L以下、或1g/L以下，也可以在以上不矛盾的组合的范围内。具体而言，发酵液中的目标物质的含量，例如，可以为0.01～100g/L、0.05～50g/L、或0.1～20g/L。
发酵液可以在目标物质的基础上，含有目标物质以外的成分。也将目标物质以外的成分称为“杂质”。作为杂质，可以举出在溶剂提取时引起乳化的成分。作为在溶剂提取时引起乳化的成分，可以举出蛋白质。蛋白质例如可以来源于菌体、培养基、反应液、或它们的组合。蛋白质，例如，特别可以是来源于菌体。作为来源于菌体的蛋白质，可以举出在制造发酵液时从菌体游离的蛋白质、在发酵液的预处理时从菌体游离的蛋白质。
发酵液(培养液、反应液等)可以就这样直接用于之后的工序，或在进行了预处理之后再用于之后的工序(即，如果是本发明的方法的第1方式，则为蛋白酶处理；如果是本发明的方法的第2方式，则为溶剂提取)。即，就本发明的方法的第1方式而言，在蛋白酶处理前，可以包含对发酵液进行预处理的工序。此外，就本发明的方法的第2方式而言，在溶剂提取前，可以包含对发酵液进行预处理的工序。就预处理而言，只要不损害乳化防止效果，就无特别限制。作为预处理，可以举出浓缩、稀释、加热、除菌、pH调整。这些预处理可以单独地实施，或适宜地组合实施。即，作为在本发明的方法的第1方式中进行蛋白酶处理的发酵液或在本发明的方法的第2方式中进行溶剂提取的发酵液，可以举出通过利用具有目标物质生产能力的微生物而得到的发酵液本身(通过利用具有目标物质生产能力的微生物而得到的培养液、反应液本身等)或其处理物。作为处理物，可以举出进行了如上所述的预处理(例如，浓缩、稀释、加热、除菌、pH调整、或它们的组合)产物。即，具体而言，作为处理物，可以举出进行了浓缩、稀释、加热、除菌、pH调整或它们的组合后的发酵液。作为处理物，特别可以举出除菌后的发酵液。“某种预处理后的发酵液”是指至少实施了该某种预处理后的发酵液，还包含在该某种预处理的基础上还实施了其他预处理的产物。例如，“除菌后的发酵液”是指至少实施了除菌后的发酵液，还包含在除菌的基础上还实施了其他预处理的产物。也将除菌后的发酵液称为“发酵液的上清”或简单称为“上清”。“除菌”是指菌体的除去。除菌例如可以通过自然沉降、离心分离或过滤而实施。除菌后的发酵液中的菌体的残存量，例如，可以为10000cells/mL以下、1000cells/mL以下、100cells/mL以下、10cells/mL以下、或0。或者，发酵液也可以直接以含有菌体的状态进行之后的工序。特别是，在本发明的方法的第2方式中，发酵液可以直接以含有菌体的状态进行溶剂提取。即，作为进行溶剂提取的发酵液，可以举出含有菌体的发酵液。作为含有菌体的发酵液，可以举出未实施除菌的发酵液。作为含有菌体的发酵液，特别可以举出既没有实施离心分离也没有实施过滤的发酵液。含有菌体的发酵液例如可以是实施了除菌以外的预处理的发酵液。含有菌体的发酵液中的菌体的含量，例如，可以为10000cells/mL以上、100000cells/mL以上、1000000cells/mL以上、10000000cells/mL以上、100000000cells/mL以上，可以为1000000000000cells/mL以下，也可以为它们的组合。作为pH调整，可以举出pH的降低。通过pH的降低，例如，可以对发酵液中的菌体进行灭菌。pH的降低例如可通过添加硫酸等酸而实施。调整后的pH例如可以为2.5～4。作为加热，可以举出以80℃～130℃进行1分钟～60分钟的加热。通过加热，例如，可以对发酵液中的菌体进行灭菌。通过加热，例如，发酵液中的菌体可以凝聚。如果进行了浓缩等预处理，则所述例示的发酵液中的目标物质、菌体等成分的含量表示预处理后的发酵液中的该成分的含量。
<2>本发明的方法
<2-1>本发明的方法的第1方式
<工序(1A)>
工序(1A)是用蛋白酶处理含有目标物质的发酵液的工序。
工序(1A)可通过使发酵液和蛋白酶接触而实施。换言之，工序(1A)可通过使发酵液和蛋白酶共存而实施。工序(1A)例如可以以批次式的形式实施，也可以以柱式的形式实施。如果是批次式，则例如，可通过在反应容器内，使发酵液和蛋白酶混合，而实施工序(1A)。工序(1A)例如可以在静置条件下实施，也可以在搅拌条件或振荡条件下实施。关于搅拌条件，例如，可比照适用工序(1B)中的搅拌条件。蛋白酶可以以能够对发酵液发挥作用的任意形态进行使用。例如，可以将液体状的蛋白酶和发酵液混合，也可以将固体状(例如粉末、颗粒)的蛋白酶和发酵液混合。蛋白酶可以只供给到反应体系中1次，也可以供给2次或2次以上。例如，在蛋白酶失活的情况下可以追加供给蛋白酶到反应体系中。如果是柱式，则例如，可通过使发酵液通过充填有蛋白酶的柱(例如固定有蛋白酶的柱)中来实施工序(1A)。
就蛋白酶处理的条件(蛋白酶的种类、蛋白酶的使用量、处理时间、处理温度、处理pH等)而言，只要能够得到乳化防止效果，就无特别限制。蛋白酶处理例如可以以使发酵液中的蛋白质分解的形式而实施。即，例如，可以通过使发酵液中的蛋白质分解而得到乳化防止效果。作为通过蛋白酶处理而分解的蛋白质，具体而言，可以举出分子量为15kDa以下的蛋白质。作为通过蛋白酶处理而分解的蛋白质，更具体而言，可以举出分子量为10～15kDa的蛋白质。
“蛋白酶”是指，具有对蛋白质肽键的水解反应进行催化的活性的酶。也将该活性称为“蛋白酶活性”。也将蛋白酶称为“蛋白质酶(Proteinase)”。此外，“蛋白酶”中也包含被称为“肽酶”的酶。
蛋白酶选自来源于芽孢杆菌(Bacillus)属细菌的蛋白酶和来源于曲霉(Aspergillus)属真菌的蛋白酶。蛋白酶只要来源于芽孢杆菌属细菌或曲霉属真菌，且具有乳化防止能力，就无特别限制。“乳化防止能力”是指，达成乳化防止效果的功能，即，通过在溶剂提取前用其对发酵液进行处理，能够防止溶剂提取时的乳化的功能。蛋白酶是否具有乳化防止能力，可通过使用该蛋白酶并对乳化防止效果进行测定而确认。作为芽孢杆菌属细菌，可以举出解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、中间型芽孢杆菌(Bacillusintermedius)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和嗜热溶蛋白芽孢杆菌(Bacillus thermoproteolyticus)。作为芽孢杆菌属细菌，特别可以举出解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌。作为曲霉属真菌，可以举出烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、蜂蜜曲霉(Aspergillus melleus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉菌(Aspergillus oryzae)和酱油曲霉(Aspergillussojae)。作为曲霉属真菌，特别可以举出米曲霉菌。就蛋白酶而言，特别可以从来源于芽孢杆菌属细菌的蛋白酶中进行选择。蛋白酶例如可以是酸性蛋白酶、中性蛋白酶、或碱性蛋白酶。蛋白酶特别可以是中性蛋白酶或碱性蛋白酶。此外，蛋白酶例如可以是天冬氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、或金属蛋白酶。作为来源于芽孢杆菌属细菌的蛋白酶，可以举出枯草杆菌蛋白酶(subtilisin；EC 3.4.21.62)等丝氨酸蛋白酶、嗜热菌蛋白酶(thermolysin；EC3.4.24.27)、Bacillolysin(EC 3.4.24.28)等金属蛋白酶(metalloprotease)、其它各种酸性、中性或碱性的蛋白酶。作为来源于芽孢杆菌属细菌的蛋白酶，特别可以举出丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶。作为来源于芽孢杆菌属细菌的蛋白酶，进一步可以特别举出枯草杆菌蛋白酶、Bacillolysin。作为来源于曲霉属真菌的蛋白酶，可以举出NPI、NPII等中性蛋白酶、ALP等碱性蛋白酶、PEPO等天冬氨酸蛋白酶(酸性蛋白酶)。
作为蛋白酶，可以使用市售品，也可以使用适宜制造而取得的酶。
蛋白酶例如可通过培养产生蛋白酶的微生物而制造。就产生蛋白酶的微生物而言，可以是本来就产生蛋白酶的微生物，也可以是以使得产生蛋白酶的方式进行了修饰的微生物。就产生蛋白酶的微生物而言，例如，可通过将编码蛋白酶的基因以能够表达的形式导入微生物而取得。就产生蛋白酶的微生物的培养条件而言，只要该微生物能够生长繁殖、产生蛋白酶，就无特别限制。就产生蛋白酶的微生物而言，例如，可以用培养细菌、真菌等微生物的通常条件进行培养。蛋白酶可以以期望的程度进行纯化。蛋白酶中也可以含有蛋白酶以外的成分。作为蛋白酶以外的成分，可以举出蛋白酶以外的酶。
作为蛋白酶的市售品，可以举出市售的蛋白酶制剂。
作为来源于芽孢杆菌属细菌的市售蛋白酶，具体而言，可以举出以下的产品。
作为中性蛋白酶：
蛋白酶N“天野”G(来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；Amano Enzyme(株式会社))
PROTIN SD-NY10(来源于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)；AmanoEnzyme(株式会社))
THERMOASE PC10F(来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)；Amano Enzyme(株式会社))
Brewers Protease(来源于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)；D.S.M.Japan(株式会社))
Axelazyme NP50.000(来源于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)；D.S.M.Japan(株式会社))
Neutrase(来源于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)；NovozymesJapan(株式会社))
Nucleicin(来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；H.B.I.(株式会社))
Orientase 90N(来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；H.B.I.(株式会社))
COROLASE N(来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；(株式会社)樋口商会)
Aloase NS(来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；YakultPharmaceuticalIndustry(株式会社))
Aloase AP-10(来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；YakultPharmaceutical Industry(株式会社))
Aloase NP-10(来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；YakultPharmaceutical Industry(株式会社))。
作为碱性蛋白酶：
PROTIN SD-AY10(来源于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)；AmanoEnzyme(株式会社))
Delbolase(来源于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)；D.S.M.Japan(株式会社))
Esperase(来源于芽孢杆菌(Bacillus sp.)；Novozymes Japan(株式会社))
Savinase(来源于芽孢杆菌(Bacillus sp.)；Novozymes Japan(株式会社))
Everlase(来源于芽孢杆菌(Bacillus sp.)；Novozymes Japan(株式会社))
ALCALASE 2.4L FG(来源于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)；NovozymesJapan(株式会社))
Bioplase OP(来源于芽孢杆菌(Bacillus sp.)；Nagase Chemtex(株式会社))
Bioplase SP-20FG(来源于芽孢杆菌(Bacillus sp.)；Nagase Chemtex(株式会社))
Orientase 22BF(来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；H.B.I.(株式会社))。
作为来源于芽孢杆菌属细菌而市售的蛋白酶，特别可以举出以下的产品：
PROTIN SD-NY10(来源于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens))
PROTIN SD-AY10(来源于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis))
ALCALASE 2.4L FG(来源于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis))。
PROTIN SD-NY10是含有Bacillolysin的蛋白酶制剂。PROTIN SD-AY10和ALCALASE2.4L FG是含有枯草杆菌蛋白酶的蛋白酶制剂。
作为来源于曲霉属真菌的市售蛋白酶，具体而言，可以举出以下的产品。
作为酸性蛋白酶：
Sumizyme AP(来源于黑曲霉(Aspergillus niger)；新日本化学工业(株式会社))
Denapsin 2P(来源于曲霉(Aspergillus sp.)；Nagase Chemtex(株式会社))
Orientase AY(来源于黑曲霉(Aspergillus niger)；H.B.I.(株式会社))
Tetradze S(来源于黑曲霉(Aspergillus niger)；H.B.I.(株式会社))
Brewers Clarex(来源于黑曲霉(Aspergillus niger)；D.S.M.Japan(株式会社))
Varidase AFP(来源于黑曲霉(Aspergillus niger)；D.S.M.Japan(株式会社))
蛋白酶YP-SS(来源于黑曲霉(Aspergillus niger)；Yakult PharmaceuticalIndustry(株式会社))。
作为中性蛋白酶：
ProteAX(来源于米曲霉菌(Aspergillus oryzae)；Amano Enzyme(株式会社))
Sumizyme ACP-G(来源于米曲霉菌(Aspergillus oryzae)；新日本化学工业(株式会社))
Sumizyme LP(来源于米曲霉菌(Aspergillus oryzae)；新日本化学工业(株式会社))
Sumizyme FP-G(来源于米曲霉菌(Aspergillus oryzae)；新日本化学工业(株式会社))
Varidase FP60(来源于米曲霉菌(Aspergillus oryzae)；D.S.M.Japan(株式会社))
Denazyme AP(来源于曲霉(Aspergillus sp.)；Nagase Chemtex(株式会社))
Orientase OP(来源于米曲霉菌(Aspergillus oryzae)；H.B.I.(株式会社))
Punchdase P(来源于曲霉(Aspergillus sp.)；Yakult PharmaceuticalIndustry(株式会社))
Punchdase NP-2(来源于米曲霉菌(Aspergillus oryzae)；YakultPharmaceutical Industry(株式会社))。
作为碱性蛋白酶：
Sumizyme MP(来源于曲霉(Aspergillus sp.)；新日本化学工业(株式会社))。
作为来源于曲霉属真菌的市售蛋白酶，特别可以举出以下的产品：
ProteAX(来源于米曲霉菌(Aspergillus oryzae))。
需要说明的是，作为蛋白酶，可以将以下的产品排除。即，蛋白酶可以在以下的产品以外的范围内选择：
蛋白酶M“天野”SD(来源于曲霉(Aspergillus sp.)；Amano Enzyme(株式会社))
蛋白酶A“天野”SD(来源于曲霉(Aspergillus sp.)；Amano Enzyme(株式会社))
蛋白酶P“天野”3SD(来源于曲霉(Aspergillus sp.)；Amano Enzyme(株式会社))。
需要说明的是，所述各商品名所特定的蛋白酶并不限于本申请提出时以该商品名出售的蛋白酶，还可以包含其同等品。例如，即使由于商品更新等，商品名出现了变更，商品名变更后的同等商品也可以包含在所述例示的各商品名所特定的蛋白酶中。
此外，作为蛋白酶，也可以使用如所述例示的公知蛋白酶的同源体。就同源体而言，只要是在芽孢杆菌属细菌或曲霉属真菌中发现的、具有乳化防止能力的酶，就无特别限制。此外，作为蛋白酶，也可以使用对如所述例示的公知蛋白酶或它们的同源体进行了修饰的人工性修饰体。人工性修饰体只要是具有乳化防止能力的酶就无特别限制。即，“蛋白酶来源于芽孢杆菌属细菌或曲霉属真菌”中也包含该蛋白酶是芽孢杆菌属细菌或曲霉属真菌中发现的蛋白酶的人工性修饰体的情况。关于蛋白酶的同源体和人工性修饰体，可比照适用上述的关于具有目标物质生产能力的微生物的育种中使用的基因和蛋白质的变体的记载。
作为蛋白酶，可以使用1种蛋白酶，也可以将2种或2种以上的蛋白酶组合使用。
蛋白酶活性例如可以通过福林法进行测定。在通过福林法测定蛋白酶活性的情况下，将以下的酶量定义为1U(单位)：以酪蛋白为基质实施酶反应时，在37℃、pH8.0、1分钟的条件下，使福林试剂呈色物质增加相当于酪氨酸1μg的量的酶量。
通过福林法进行的蛋白酶活性测定，具体而言，例如，可通过以下的步骤实施。将蛋白酶加入乙酸钙·氯化钠试液(将0.2mol/L乙酸钙试液5ml和2mol/L氯化钠试液2.5ml混合，用蒸馏水加至500ml而调制)中并搅拌溶解，进行7000倍稀释以作为酶溶液。此外，向酪蛋白(乳制)1.2g中加入0.05mol/L磷酸氢二钠试液160ml，在水浴中加热使之溶解。在流水冷却之后，以氢氧化钠试液调整至pH8.0，用蒸馏水加至200ml，以此作为基质溶液。向试验管中量取基质溶液5ml，在37℃下加热10分钟后，加入酶溶液1ml并混合，在37℃下放置10分钟后，加入三氯乙酸试液(将三氯乙酸36g和无水乙酸钠36g溶解在蒸馏水1.6L中，与6mol/L乙酸试液110ml混合后，用蒸馏水加至2L而调制)5ml并震荡混匀，再次在37℃下放置30分钟，进行过滤。然后，向试验管中量取0.55mol/L碳酸钠试液5ml，加入滤液2ml以及以蒸馏水进行了3倍稀释的福林试剂(福林-西奥卡特酚试剂,和光纯药工业(株式会社)制)，混合后，在37℃下放置30分钟。然后，以蒸馏水为对照测定波长660nm的吸光度，以此作为酶反应液的吸光度。另外，在将酶溶液1ml和三氯乙酸试液5ml混合后，加入基质溶液5ml在37℃下放置30分钟，然后进行同样的操作，作为空白的吸光度。根据从酶反应液的吸光度中减去空白的吸光度的值算出单位反应时间的变化量，以计算蛋白酶活性。
此外，蛋白酶活性例如也可通过LNA法测定。在通过LNA法测定蛋白酶活性的情况下，将以下的酶量定义为1U(单位)：以L-亮氨酰-对硝基苯胺·盐酸盐为基质实施酶反应时，在37℃、pH7.0、1分钟的条件下，生成1μmol的对硝基苯胺的酶量。
此外，蛋白酶活性例如也可通过Anson法来测定。在Anson法测定蛋白酶活性的情况下，将以下的酶量定义为1Anson U(安森单位)：以血红蛋白作为基质实施酶反应时，在37℃、pH7.5、1分钟的条件下使1μmol的酪氨酸游离的酶量。
就蛋白酶的使用量而言，相对于发酵液100mL，例如，以用福林法测定的蛋白酶活性计，可以为10U以上、100U以上、500U以上、1000U以上、2000U以上、5000U以上、或10000U以上，可以为500000U以下、200000U以下、100000U以下、50000U以下、20000U以下、10000U以下、5000U以下、2000U以下、或1000U以下，也可以在以上不矛盾的组合的范围内。具体而言，蛋白酶的使用量相对于发酵液100mL，例如，以用福林法测定的蛋白酶活性计，可以为10～500000U、100U～200000U、或500U～100000U。
就蛋白酶的使用量而言，相对于发酵液100mL，例如，以用LNA法测定的蛋白酶活性计，可以为0.2U以上、2U以上、5U以上、10U以上、20U以上、50U以上、100U以上、或200U以上，可以为10000U以下、5000U以下、2000U以下、1000U以下、500U以下、200U以下、100U以下、500U以下、或200U以下，也可以在以上不矛盾的组合的范围内。具体而言，蛋白酶的使用量相对于发酵液100mL，例如，以用LNA法测定的蛋白酶活性计，可以为0.2～10000U、2U～5000U、或10U～2000U。
就蛋白酶的使用量而言，相对于发酵液100mL，例如，以用Anson法测定的蛋白酶活性计，可以为0.5mAU以上、5mAU以上、10mAU以上、20mAU以上、50mAU以上、100mAU以上、200mAU以上、200mAU以上、或500mAU以上，可以为20000mAU以下、10000mAU以下、5000mAU以下、2000mAU以下、1000mAU以下、500mAU以下、200mAU以下、100mAU以下、或500mAU以下，也可以在以上不矛盾的组合的范围内。具体而言，蛋白酶的使用量相对于发酵液100mL，例如，以用Anson法测定的蛋白酶活性计，可以为0.5～20000mAU、5mAU～10000mAU、或20mAU～5000mAU。
处理时间例如可以为5分钟以上、10分钟以上、15分钟以上、20分钟以上、30分钟以上、40分钟以上、50分钟以上、60分钟以上、或90分钟以上，可以为240分钟以下、180分钟以下、120分钟以下、90分钟以下、60分钟以下、50分钟以下、40分钟以下、30分钟以下、30分钟以下、或20分钟以下，也可以在以上不矛盾的组合的范围内。具体而言，处理时间例如可以为10～180分钟、20～120分钟、或30～90分钟。
处理温度例如可以为10℃以上、15℃以上、20℃以上、30℃以上、40℃以上、50℃以上、或60℃以上，可以为80℃以下、70℃以下、60℃以下、50℃以下、或40℃以下，也可以在以上不矛盾的组合的范围内。具体而言，处理温度例如可以为10～70℃、20～60℃、或30～50℃。可以对处理温度进行控制，也可以不控制。蛋白酶处理例如可以在室温(例如25℃)下实施。
处理pH例如可以为2.5以上、3以上、4以上、5以上、6以上、7以上、或8以上，可以为10以下、9以下、8以下、7以下、或6以下，也可以在以上不矛盾的组合的范围内。具体而言，处理pH例如可以为2.5～10。可以对处理pH进行控制，也可以不控制。
<工序(1B)>
工序(1B)是用有机溶剂从蛋白酶处理(工序(1A))后的发酵液中提取目标物质的工序。
即，工序(1B)在工序(1A)之后实施。即，工序(1B)中提及的“发酵液”是指工序(1A)实施后的发酵液。
工序(1B)可通过使发酵液和有机溶剂接触而实施。换言之，工序(1B)可通过使发酵液和有机溶剂共存而实施。就工序(1B)而言，例如，可以在如果使用未实施工序(1A)的发酵液会发生乳化的条件下实施。作为这样的条件，可以举出搅拌条件、振荡条件。作为这样的条件，特别可以举出搅拌条件。“发生乳化”可以是指，例如，乳液产生量超过5[％/OL]、超过10[％/OL]、超过15[％/OL]、超过20[％/OL]、为30[％/OL]以上、50[％/OL]以上、70[％/OL]以上、90[％/OL]以上、或100[％/OL]。
就溶剂提取的条件(有机溶剂的种类、有机溶剂的使用量、处理时间、处理温度、处理pH、搅拌速度等)而言，只要能够提取目标物质，就无特别限制。作为溶剂提取的条件，例如，可以直接使用从发酵液等水层中提取化合物的通常的溶剂提取的条件，或对其进行适宜的更改后再使用。
就有机溶剂而言，只要能够从发酵液中提取目标物质，就无特别限制。换言之，作为有机溶剂，可以选择能够溶解目标物质，且与水层分层的溶剂。有机溶剂可以根据目标物质的种类等各条件而适宜设定。作为有机溶剂，可以举出甲苯等芳香族烃类；正己烷、环己烷等烷烃类；乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸异丙酯、乙酸丁酯、乙酸异戊酯等酯类；二乙基醚、甲基叔丁基醚(MTBE)的醚类；二氯甲烷。作为有机溶剂，特别是可以举出甲苯、乙酸乙酯、乙酸丁酯。作为有机溶剂，可以使用1种有机溶剂，也可以将2种或2种以上的有机溶剂组合使用。
就有机溶剂的使用量而言，相对于发酵液100mL，例如，可以为25mL以上、33mL以上、50mL以上、75mL以上、100mL以上、133mL以上、或200mL以上，可以为400mL以下、300mL以下、200mL以下、133mL以下、100mL以下、75mL以下、或50mL以下，也可以在以上不矛盾的组合的范围内。具体而言，有机溶剂的使用量相对于发酵液100mL，例如，可以为33～300mL、50～200mL、或75～133mL。
提取时间例如可以为5分钟以上、10分钟以上、15分钟以上、20分钟以上、30分钟以上、40分钟以上、50分钟以上、60分钟以上、或90分以上，可以为240分钟以下、180分钟以下、120分钟以下、90分钟以下、60分钟以下、50分钟以下、40分钟以下、30分钟以下、30分钟以下、或20分钟以下，也可以在以上不矛盾的组合的范围内。具体而言，提取时间例如可以为10～180分钟、20～120分钟、或30～90分钟。
提取温度例如可以为5℃以上、10℃以上、15℃以上、20℃以上、30℃以上、40℃以上、50℃以上、或60℃以上，可以为80℃以下、70℃以下、60℃以下、50℃以下、40℃以下、30℃以下、或20℃以下，也可以在以上不矛盾的组合的范围内。具体而言，提取温度例如可以为5～40℃或20～40℃。可以对提取温度进行控制，也可以不控制。溶剂提取例如可以在室温(例如25℃)下实施。
提取pH(具体而言是进行溶剂提取的发酵液的pH)例如可以为2.5以上、3以上、4以上、5以上、6以上、7以上、或8以上，可以为10以下、9以下、8以下、7以下、或6以下，也可以在以上不矛盾的组合的范围内。具体而言，提取pH例如可以为2.5～10。可以对提取pH进行控制，也可以不控制。
搅拌可通过搅拌叶片的旋转而实施。就搅拌叶片的形状而言，只要能够获得期望的搅拌状态，就无特别限制。作为搅拌叶片可以举出桨叶、涡轮叶片、螺旋桨叶、锚叶片、后掠叶片。就搅拌速度而言，例如，以搅拌动力计，可以为100～3000W/kL。搅拌动力例如可以通过永田公式算出。
通过如此实施溶剂提取，能够从发酵液中回收目标物质。具体而言，通过如此实施溶剂提取，使目标物质移动到有机层中，由此可以得到含有目标物质的有机层。即，目标物质例如可以以含有目标物质的有机层的形态而得到。换言之，制造的目标物质可以是含有目标物质的有机层。含有目标物质的有机层可以适宜地进行回收。即，本发明的方法(具体而言，本发明的方法的第1方式)可以在工序(1B)之后，包含回收含有目标物质的有机层的工序。回收有机层的时机无特别限制。就有机层而言，例如，可以在溶剂提取的操作(例如，搅拌或振荡)停止后立刻回收，或经过适宜的时间后再进行回收。
目标物质可以进一步从有机层中纯化。即，本发明的方法(具体而言，本发明的方法的第1方式)可以包含从含有目标物质的有机层中纯化目标物质的工序。目标物质可纯化至期望的程度。就目标物质的纯化而言，例如，可以通过对有机溶剂中的化合物进行分离纯化的公知方法来进行。作为这样的方法，可以举出清洗、结晶化、蒸馏、干燥、树脂处理、膜处理。这些方法可以单独使用，或适宜地组合使用。
<2-2>本发明的方法的第2方式
<工序(2A)>
工序(2A)是用有机溶剂从发酵液中提取目标物质的工序。
工序(2A)可通过使发酵液和有机溶剂接触而实施。换言之，工序(2A)可通过使发酵液和有机溶剂共存而实施。在使发酵液和有机溶剂接触时，例如，可以轻轻地将有机溶剂叠层在发酵液上并且不使其发生乳化。
在工序(2A)中，以经过调整的搅拌动力搅拌发酵液和有机溶剂。就溶剂提取的条件(有机溶剂的种类、有机溶剂的使用量、处理时间、处理温度、处理pH、搅拌速度等)而言，只要以经过调整的搅拌动力实施搅拌、提取目标物质，就无特别限制。作为溶剂提取的条件，除了以经过调整的搅拌动力实施搅拌之外，例如，可以直接使用从发酵液等水层中提取化合物的通常的溶剂提取的条件，或对其进行适宜的更改后再使用。
就有机溶剂而言，只要能够从发酵液中提取目标物质就无特别限制。换言之，作为有机溶剂，可以从能够溶解目标物质且与水层分层的溶剂中选择。有机溶剂可以根据目标物质的种类等各条件而适宜设定。作为有机溶剂，可以举出甲苯等芳香族烃类；正己烷、环己烷等烷烃类；乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸异丙酯、乙酸丁酯、乙酸异戊酯等酯类；二乙基醚、甲基叔丁基醚(MTBE)的醚类；二氯甲烷。作为有机溶剂，特别可以举出甲苯、乙酸乙酯、乙酸丁酯。作为有机溶剂，可以使用1种有机溶剂，也可以将2种或2种以上的有机溶剂组合使用。
就有机溶剂的使用量而言，相对于发酵液100mL，例如，可以为25mL以上、33mL以上、50mL以上、75mL以上、100mL以上、133mL以上、或200mL以上，可以为400mL以下、300mL以下、200mL以下、133mL以下、100mL以下、75mL以下、或50mL以下，也可以在以上不矛盾的组合的范围内。具体而言，有机溶剂的使用量相对于发酵液100mL，例如，可以为33～300mL、50～200mL、或75～133mL。
提取时间例如可以为30分钟以上、1小时以上、2小时以上、3小时以上、4小时以上、5小时以上、或6小时以上，可以为120小时以下、96小时以下、72小时以下、48小时以下、36小时以下、24小时以下、21小时以下、18小时以下、15小时以下、12小时以下、9小时以下、6小时以下、5小时以下、4小时以下、3小时以下、2小时以下、或1小时以下，也可以在以上不矛盾的组合的范围内。具体而言，提取时间例如可以为30分钟～120小时、1～72小时、或2～36小时。
提取温度例如可以为5℃以上、10℃以上、15℃以上、20℃以上、30℃以上、40℃以上、50℃以上、或60℃以上，可以为80℃以下、70℃以下、60℃以下、50℃以下、40℃以下、30℃以下、或20℃以下，也可以在以上不矛盾的组合的范围内。具体而言，提取温度例如可以为50～80℃。可以对提取温度进行控制，也可以不控制。溶剂提取例如可以在室温(例如25℃)下实施。
提取pH(具体而言，是进行溶剂提取的发酵液的pH)例如可以为2.5以上、3以上、4以上、5以上、6以上、7以上、或8以上，可以为10以下、9以下、8以下、7以下、或6以下，也可以在以上不矛盾的组合的范围内。具体而言，提取pH例如可以为2.5～10。可以对提取pH进行控制，也可以不控制。
搅拌可通过搅拌叶片的旋转而实施。就搅拌叶片的形状而言，只要能够得到期望的搅拌状态，就无特别限制。作为搅拌叶片，可以举出桨叶、涡轮叶片、螺旋桨叶、锚叶片、后掠叶片。
搅拌以经过调整的搅拌动力实施。
就搅拌动力而言，例如，可以对搅拌动力进行调整以使得液液界面(水层和有机层的界面)得以保持。“液液界面得以保持”是指，例如，搅拌时液液界面的高低差(液液界面的最高的部分和最低的部分的差)与包含乳液层的有机层(Organic Layer；OL)的高度的比率，可以保持在[％/OL]、20[％/OL]以下、10[％/OL]以下、5[％/OL]以下、2[％/OL]以下、1[％/OL]以下、或0。
搅拌动力超过0。搅拌动力例如可以为，超过0、0.001W/kL以上、0.01W/kL以上、0.1W/kL以上、0.2W/kL以上、0.5W/kL以上、0.7W/kL以上、1W/kL以上、1.2W/kL以上、1.5W/kL以上、2W/kL以上、3W/kL以上、4W/kL以上、或5W/kL以上，可以为25W/kL以下，20W/kL以下，17W/kL以下、15W/kL以下、12W/kL以下、10W/kL以下、7W/kL以下、或5W/kL以下、也可以在以上不矛盾的组合的范围内。具体而言，搅拌动力例如可以为超过0且为20W/kL以下、0.5～20W/kL、或1.5～20W/kL，可以为超过0且为15W/kL以下、0.5～15W/kL、或1.5～15W/kL，也可以为超过0且为10W/kL以下、0.5～10W/kL、或1.5～10W/kL。就搅拌动力而言，例如，在有机溶剂是甲苯的情况下，可以为超过0且为20W/kL以下、0.5～20W/kL、或1.5～20W/kL。就搅拌动力而言，例如，在有机溶剂为乙酸乙酯的情况下，可以为超过0且为10W/kL以下、0.5～10W/kL、或1.5～10W/kL。
以通过以下的公式(永田公式)算出的值作为搅拌动力。
[数学式1]
P＝Np·ρ·n3·d5
Np：动力数[-]
ρ：液密度[kg/m3]
n：转速[1/s]
d：叶径[m]
Figure BDA0003342264470000611
A＝14+(b′/D){670(d/D-0.6)2+185}
Figure BDA0003342264470000612
p＝1.1+4(b′/D)-2.5(d/D-0.5)2-7(b′/D)4
Re：雷诺数[-]
H：液深[m]
D：槽直径[m]
b：叶宽[m]
b′＝(叶片数×b)/2(修正为2片叶片)
在工序(2A)中，搅拌例如可以暂时停止。即，在工序(2A)中，搅拌可以连续地进行，也可以间歇地进行。就工序(2A)中的“暂时”的长度而言，只要能够提取目标物质，就无特别限制。工序(2A)中的“暂时”可以是指，例如，工序(2A)的整个期间的20％以下、15％以下、10％以下、5％以下、3％以下、或1％以下的期间。
通过如此地实施溶剂提取，能够从发酵液中回收目标物质。具体而言，通过如此地实施溶剂提取，可使目标物质移动到有机层中，由此得到含有目标物质的有机层。即，目标物质例如可以以含有目标物质的有机层的形态而得到。换言之，制造的目标物质可以是含有目标物质的有机层。含有目标物质的有机层可以适宜地回收。即，本发明的方法(具体而言，本发明的方法的第2方式)可以在工序(2A)之后包含回收含有目标物质的有机层的工序。回收有机层的时机无特别限制。就有机层而言，例如，可以在溶剂提取的操作(例如，搅拌或渗透)停止后立刻回收，或经过适宜的时间后再回收。
目标物质可以进一步从有机层中纯化。即，本发明的方法(具体而言，本发明的方法的第2方式)可以包含从含有目标物质的有机层中纯化目标物质的工序。目标物质可以纯化至期望的程度。就目标物质的纯化而言，例如，可以通过对有机溶剂中的化合物进行分离纯化的公知方法来进行。作为这样的方法，可以举出清洗、结晶化、蒸馏、干燥、树脂处理、膜处理。这些方法可以单独使用，或适宜地组合使用。
实施例
以下，将通过非限定的实施例，更具体地对本发明进行说明。
<1>蛋白酶的乳化防止效果的评价(1)
在本实施例中，通过在使用蛋白酶对含有香兰素的发酵液进行处理后再进行使用了有机溶剂的溶剂提取，对蛋白酶处理的乳化防止效果进行了评价。作为蛋白酶，使用了ALCALASE 2.4L FG(来源于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)；Novozymes Japan(株式会社))。作为有机溶剂，使用了甲苯。
以含有香兰素酸的培养基培养导入了来源于扩展戈登氏菌(Gordonia effusa)的aromatic carboxylic acid reductase(ACAR)基因(WO2018/079705)的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)，得到了含有5.2g/L香兰素的培养液。向培养液中添加98％硫酸将其调整至pH 3，在50℃下保持30分钟，由此得到了杀菌液。将杀菌液在120℃下保持3分钟，由此得到了加热凝聚液。以得到的加热凝聚液作为“1612BP加热凝聚液”。
逐次向螺旋盖瓶中量取1612BP加热凝聚液的离心上清(9190×g,5分钟)10mL。在将离心上清的pH调整至7.0后，添加ALCALASE 2.4L FG 0～1wt％，在40℃下静置1小时。将反应液冷却至室温后，添加甲苯10mL，在室温下使用搅拌器进行强搅拌。1小时后停止搅拌，静置约5分钟后对乳化的程度进行了观察。乳化的程度以乳液层的高度与包含乳液层的有机层(Organic Layer；OL)高度的比率[％/OL]的形式而测定。也将该比率称为“乳液产生量”。此外，还分取了甲苯添加前的反应液并进行SDS-PAGE，对杂蛋白进行了解析。
乳化的观察结果如图1所示。在无ALCALASE 2.4L FG处理的样品中，有机层整体都观察到了乳化，与之相对，在以ALCALASE 2.4L FG处理了的样品中未观察到乳化。即使在只对发酵液添加了0.05％的ALCALASE 2.4L FG的情况下也得到了充分的乳化防止效果。
SDS-PAGE的结果如图2所示。图2中，泳道1为ALCALASE 2.4L FG(将蛋白质浓度调整至为约0.8mg-as BSA/mL的样品)，泳道2为无ALCAL ASE 2.4L FG处理的样品，泳道3为以0.05％ALCALASE 2.4L FG处理的样品，泳道4为以0.5％ALCALASE 2.4L FG处理的样品。在以ALCALASE 2.4L FG处理的样品中，观察到了发酵液中的蛋白质(特别是分子量为10～15kDa的蛋白质)的分解(泳道3～4)。
根据以上结果，可以明确看出，通过在使用蛋白酶对含有香兰素的发酵液进行处理后再进行使用了有机溶剂的溶剂提取，能够防止溶剂提取时的乳化。具体而言，存在由于发酵液中蛋白质(特别是分子量为10～15kDa的蛋白质)的分解，而能够防止溶剂提取时的乳化的可能性。
<2>蛋白酶的乳化防止效果的评价(2)
在本实施例中，通过在使用蛋白酶对含有香兰素的发酵液进行处理后再进行使用了有机溶剂的溶剂提取，对蛋白酶处理的乳化防止效果进行了评价。作为蛋白酶，使用了ALCALASE 2.4L FG(来源于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)；Novozymes Japan(株式会社))。作为有机溶剂，使用了乙酸乙酯和乙酸丁酯。
通过对1612BP加热凝聚液进行减压过滤，得到了菌体过滤液。将得到的菌体过滤液浓缩，得到了过滤浓缩液(浓缩倍率以培养液计为1.70wt/wt倍)。使用过滤浓缩液5mL，以与实施例<1>同样的步骤，添加0.1％的ALCALASE 2.4L FG进行蛋白酶处理后，添加乙酸乙酯5mL或乙酸丁酯5mL实施溶剂提取，对乳化的程度进行了观察。
结果如图3所示。在使用乙酸乙酯和乙酸丁酯中的任一种实施溶剂提取的情况下，都没有观察到乳化。这说明通过在使用蛋白酶对含有香兰素的发酵液进行处理后再进行使用了有机溶剂的溶剂提取，无论有机溶剂的种类如何，都能够防止溶剂提取时的乳化的效果。
<3>蛋白酶的乳化防止效果的评价(3)
在本实施例中，通过在使用蛋白酶对含有香兰素的发酵液进行处理后再进行使用了有机溶剂的溶剂提取，对蛋白酶处理的乳化防止效果进行了评价。作为蛋白酶，使用了表1所示的各种蛋白酶。这些蛋白酶的目录规格的概要如表2所示。作为有机溶剂，使用了乙酸丁酯。
使用含有香兰素酸的培养基培养导入了来源于扩展戈登氏菌(Gordonia effusa)的aromatic carboxylic acid reductase(ACAR)基因(WO2018/079705)的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)，得到了含有9.4g/L香兰素的培养液。向培养液中添加98％硫酸将其调整至pH 3，在50℃下保持30分钟，由此得到了杀菌液。将杀菌液在120℃下保持3分钟，由此得到了加热凝聚液。使用压滤机过滤加热凝聚液，将其分离为菌体等固体成分和滤液。用与加热凝聚液等量的水清洗得到的固体成分，再次进行过滤，并再度实施清洗操作。将3次份量的滤液混合得到了除菌液。将得到的除菌液作为“1706BP除菌液”。
将1706BP除菌液浓缩至以培养液计为1.76wt/wt倍，得到了除菌浓缩液。将得到的除菌浓缩液5mL的pH调整至7.0后，添加各蛋白酶0.1wt％，在40℃下搅拌1小时。然后，将反应液的pH调整至6.0后，添加等量的乙酸丁酯，用搅拌器进行了强搅拌。在1小时后停止搅拌，静置约5分钟后对乳化的程度进行了观察。
结果如表1～2和图4所示。有表现出乳化防止效果的蛋白酶和未表现出乳化防止效果的蛋白酶。由此在蛋白酶的起源和有无乳化防止效果之间发现了关联性，来源于芽孢杆菌(Bacillus)属的蛋白酶全都显示出了乳化防止效果。另一方面，在蛋白酶的起源以外的性质和有无乳化防止效果之间未发现明确的关联性。
[表1]
酶名称 乳液产生量
Run 1 不添加 100％/OL
Run 2 ALCALASE 2.4L FG 0％/OL
Run 3 蛋白酶A“天野”SD 60％/OL
Run 4 蛋白酶M“天野”SD 100％/OL
Run 5 蛋白酶P“天野”3SD 80％/OL
Run 6 木瓜蛋白酶W-40 85％/OL
Run 7 肽酶R 100％/OL
Run 8 ProteAX 0％/OL
Run 9 THERMOASE PC10F 100％/OL
Run 10 菠萝蛋白酶F 100％/OL
Run 11 胰酶F 100％/OL
Run 12 PROTIN SD-AY10 0％/OL
Run 13 PROTIN SD-NY10 0％/OL
Run 14 Newlase F3G 100％/OL
[表2]
Figure BDA0003342264470000661
<4>香兰素和有机溶剂的回收率的评价
在本实施例中，对在规模放大了的体系中蛋白酶处理的乳化防止效果、香兰素和有机溶剂的回收率进行了评价。作为蛋白酶，使用了ALCALASE 2.4L FG(来源于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)；Novozymes Japan(株式会社))。作为有机溶剂，使用了乙酸乙酯和乙酸丁酯。
将1706BP除菌液浓缩至以培养液计为1.76wt/wt倍，得到了除菌浓缩液。将除菌浓缩液80mL的pH调整至7.5后，添加0.1wt％的ALCALASE 2.4L FG，在40℃下搅拌1小时。然后，添加与反应液等量的乙酸乙酯或乙酸丁酯，用搅拌器进行了强搅拌。在1小时后停止搅拌，对乳化的程度进行了观察。用分液漏斗将水层和有机层分液，对香兰素和有机溶剂的回收率进行了评价。
结果如表3所示。即使在本规模下，也与5mL规模(实施例<2>)相同，乳液产生量为0％/OL，观察到了乳化防止效果。香兰素的回收率无论在哪种溶剂中，1次提取都在95％以上。此外，由于在水中的溶解度不同，乙酸乙酯在有机层中的回收率为95％左右，与之相对，乙酸丁酯在有机层中的回收率为99％以上。
[表3]
乙酸乙酯 乙酸丁酯
香兰素回收率 95.7％ 96.6％
有机溶剂回收率 94.7％ 99.7％
<5>蛋白酶以外的酶的乳化防止效果的评价
在本实施例中，通过在用蛋白酶以外的酶对含有香兰素的发酵液进行处理之后再进行使用了有机溶剂的溶剂提取，对蛋白酶以外的酶处理的乳化防止效果进行了评价。作为酶，使用了表4所示的各种酶。作为有机溶剂，使用了乙酸丁酯。
将1706BP除菌液浓缩至以培养液计为1.76wt/wt倍，得到了除菌浓缩液。将得到的除菌浓缩液5mL的pH调整至7.0后，添加0.1wt％的各种酶，在40℃下搅拌1小时。然后，将反应液的pH调整至6.0后，添加等量的乙酸丁酯，用搅拌器进行了强搅拌。在1小时后停止搅拌，静置约5分钟后对乳化的程度进行了观察。
无论使用表4中的哪种酶，乳液产生量都为100％/OL，未观察到乳化防止效果。以上结果显示了发酵液中的杂蛋白存在特异性地有助于溶剂提取时的乳化的可能性。
[表4]
Figure BDA0003342264470000681
<6>溶剂提取时的搅拌动力的影响的评价(1)
在本实施例中，对通过使用了有机溶剂的溶剂提取从含有香兰素的发酵液中回收香兰素时的搅拌动力的影响进行了评价。作为有机溶剂，使用了甲苯。
使用含有香兰素酸的培养基培养导入了来源于扩展戈登氏菌(Gordonia effusa)的aromatic carboxylic acid reductase(ACAR)基因(WO2018/079705)的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)，得到了含有5.2g/L、9.4g/L、或11g/L香兰素的培养液。向培养液中添加98％硫酸将其调整至pH 3，在50℃下保持30分钟，由此得到了杀菌液。将杀菌液在120℃下保持3分钟，由此得到了加热凝聚液。
将加热凝聚液500mL加入到带夹套的分液漏斗(内径110mm)中，调整至pH 6.0。向其中轻轻地加入甲苯500mL后，向夹套中通入温水，将内部温度加热至70℃。使用后掠叶片(4片、叶径90mm，叶宽10mm)、锚叶片(4片、叶径90mm，叶宽45mm)、或半月桨叶(2片、叶径90mm，叶宽20mm)以保持液液界面(水层和有机层的界面)的搅拌速度进行搅拌，随时间推移对水层和有机层的香兰素浓度进行了分析。需要说明的是，在后掠叶片的情况下，如果将搅拌速度提至120rpm(相当于27.4W/kL)以上，则液液界面的混乱会变得显著。在24小时后，将水层和有机层分液，根据各自的重量和香兰素浓度算出了收率。将有机层的香兰素浓度达到平衡的时间视为提取时间。
搅拌动力通过永田公式而算出。
传质系数通过以下的步骤算出。
假设提取的速率决定阶段为液液界面的物质移动，通过下述式而算出了传质系数k。
[数学式2]
J＝k·ΔC……(1)
J：传质通量[g/m2/s]
k：传质系数[m/s]
ΔC：浓度差[g/m3]
ΔC＝Cwater·P-Ctol……(2)
Cwater：水层的香兰素浓度[g/m3]
Ctol：甲苯层的香兰素浓度[g/m3]
P：分配比
k＝D/δ……(3)
D：扩散系数[m2/s]
δ：界膜厚度[m]
通过式(1)，在Excel上根据界面面积、液量和初始浓度，对每1min的物质移动量进行计算，计算出了浓度。以求解器算出了各时间点处的浓度的计算值和实测值之差的平方和最小的传质系数k。
结果如表5和图5～6所示。通过对溶剂提取时的搅拌动力进行调整以使得液液界面(水层和有机层的界面)得到保持，能够防止乳化，能够以较高收率提取香兰素。特别是，搅拌动力为1.1～16.6W/kL时得到了优选的结果。此外，根据图5～6，作为搅拌动力的优选范围，例如，可以预想为1.5～20W/kL的范围。
[表5]
表5使用甲苯从发酵液中提取香兰素的结果
Figure BDA0003342264470000711
<7>溶剂提取时的搅拌动力的影响的评价(2)
在本实施例中，对通过使用了有机溶剂的溶剂提取从含有香兰素的发酵液中回收香兰素时的搅拌动力的影响进行了评价。作为有机溶剂，使用了乙酸乙酯。
使用含有香兰素酸的培养基培养导入了来源于扩展戈登氏菌(Gordonia effusa)的aromatic carboxylic acid reductase(ACAR)基因(WO2018/079705)的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)，得到了含有11g/L香兰素的培养液。向培养液中添加98％硫酸将其调整至pH 3，在50℃下保持30分钟，由此得到了杀菌液。
将杀菌液500mL添加到带夹套的分液漏斗(内径110 mm)中，将其调整至pH 6.0。向其中轻轻地添加乙酸乙酯500mL后，向夹套中通入温水，将内部温度升温至60℃。使用后掠叶片(4片，叶径90mm，叶宽10 mm)以表6所述的搅拌速度进行搅拌，随时间推移对水层和有机层的香兰素浓度进行了分析。24小时后，将水层和有机层分液，根据各自的重量和香兰素浓度算出了收率。
结果如表6和图7所示。即使在使用乙酸乙酯作为有机溶剂的情况下，通过对溶剂提取时的搅拌动力进行调整以使得液液界面(水层和有机层的界面)得到保持，能够防止乳化，能够以较高收率提取香兰素(3.89W/kL或8.64W/kL)。此外，根据图7，作为搅拌动力的优选范围，例如，可以预想为1.5～10W/kL的范围。
[表6]
表6使用乙酸乙酯从发酵液中提取香兰素的结果
Figure BDA0003342264470000721
工业实用性
根据本发明，能够防止用有机溶剂从发酵液中提取香兰素等目标物质时的乳化。

Claims (30)

1.一种目标物质的制造方法，其包含下述工序(1A)和(1B)：
(1A)用蛋白酶处理含有目标物质的发酵液的工序；和
(1B)用有机溶剂从所述处理后的发酵液中提取该目标物质的工序，
所述蛋白酶为选自来源于芽孢杆菌(Bacillus)属细菌的蛋白酶和来源于曲霉(Aspergillus)属真菌的蛋白酶中的1种或1种以上的蛋白酶。
2.如权利要求1所述的方法，其中，
所述目标物质为芳香族醛。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，
所述目标物质为香兰素。
4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，
所述蛋白酶为蛋白酶M“天野”SD、蛋白酶A“天野”SD或蛋白酶P“天野”3SD的情况除外。
5.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，
所述蛋白酶为选自丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶中的1种或1种以上的蛋白酶。
6.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，
所述蛋白酶为选自枯草杆菌蛋白酶和Bacillolysin中的1种或1种以上的蛋白酶。
7.如权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，
所述蛋白酶为选自来源于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的蛋白酶、来源于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的蛋白酶和来源于米曲霉菌(Aspergillus oryzae)的蛋白酶中的1种或1种以上的蛋白酶。
8.如权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，
所述蛋白酶为选自ALCALASE(注册商标)2.4L FG、PROTIN SD-NY10、PROTIN SD-AY10和ProteAX(注册商标)中的1种或1种以上的蛋白酶。
9.如权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，
相对于发酵液100mL，所述蛋白酶的使用量以用福林法测定的蛋白酶活性计为10～500000U、以用LNA法测定的蛋白酶活性计为0.2～10000U或以用Anson法测定的蛋白酶活性计为0.5～20000mAU。
10.如权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，
所述有机溶剂为选自甲苯、乙酸乙酯和乙酸丁酯中的1种或1种以上的成分。
11.如权利要求1～10中任一项所述的方法，其中，
所述工序(1A)中的所述发酵液为除菌后的发酵液。
12.如权利要求1～11中任一项所述的方法，其中，
所述工序(1B)在搅拌条件下实施。
13.如权利要求1～12中任一项所述的方法，其在所述工序(1A)之前，进一步包含：利用具有目标物质生产能力的微生物生成所述目标物质，从而获得所述发酵液的工序。
14.如权利要求1～13中任一项所述的方法，其在所述工序(1B)之后，进一步包含：对含有所述目标物质的有机层进行回收的工序。
15.如权利要求14所述的方法，其进一步包含：从所述有机层中纯化出所述目标物质的工序。
16.一种目标物质的制造方法，其包含下述工序(2A)：
(2A)用有机溶剂从含有目标物质的发酵液中提取该目标物质的工序，
所述工序(2A)通过以经过调整的搅拌动力搅拌所述发酵液和所述有机溶剂来实施。
17.如权利要求16所述的方法，其中，
所述目标物质为芳香族醛。
18.如权利要求16或17所述的方法，其中，
所述目标物质为香兰素。
19.如权利要求16～18中任一项所述的方法，其中，
所述经过调整的搅拌动力为使液液界面得到保持的搅拌动力。
20.如权利要求16～19中任一项所述的方法，其中，
所述经过调整的搅拌动力超过0且为20W/kL以下。
21.如权利要求16～20中任一项所述的方法，其中，
所述经过调整的搅拌动力超过0且为15W/kL以下。
22.如权利要求16～21中任一项所述的方法，其中，
所述经过调整的搅拌动力超过0且为10W/kL以下。
23.如权利要求20～22中任一项所述的方法，其中，
所述经过调整的搅拌动力为1.5W/kL以上。
24.如权利要求16～23中任一项所述的方法，其中，
所述有机溶剂为选自甲苯、乙酸乙酯和乙酸丁酯中的1种或1种以上的成分。
25.如权利要求16～24中任一项所述的方法，其中，
所述有机溶剂为甲苯，所述经过调整的搅拌动力超过0且为20W/kL以下。
26.如权利要求16～24中任一项所述的方法，其中，
所述有机溶剂为乙酸乙酯，所述经过调整的搅拌动力超过0且为10W/kL以下。
27.如权利要求16～26中任一项所述的方法，其中，
所述发酵液为含有菌体的发酵液。
28.如权利要求16～27中任一项所述的方法，其在所述工序(2A)之前，进一步包含：利用具有目标物质生产能力的微生物生成所述目标物质，从而获得所述发酵液的工序。
29.如权利要求16～28中任一项所述的方法，其在所述工序(2A)之后，进一步包含：对含有所述目标物质的有机层进行回收的工序。
30.如权利要求29所述的方法，其进一步包含：从所述有机层中纯化出所述目标物质的工序。
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