BRPI0413007B1 - método de produzir l-lisina ou l-treonina - Google Patents

Abstract

"bactéria escherichia e, método de produzir l-lisina ou l-treonina". uma bactéria pertencente ao gênero escherichia que apresenta uma capacidade de produzir l-lisina ou l-treonina e que é modificada de forma que uma enzima málica não funciona normalmente em uma célula, e um método de produzir l-lisina ou l-treonina, compreende cultivar a bactéria em um meio para produzir e causar acúmulo de l-lisina ou l-treonina, e coletar a l-lisina ou l-treonina do meio.

Description

“MÉTODO DE PRODUZIR L-LISINA OU L-TREONINA”

Campo Técnico

A presente invenção refere-se a um método de produzir Llisina ou L-treonina usando uma bactéria Escherichia. L-Lisina e L-treonina são conhecidas como sendo aminoácidos essenciais, e são úteis como componentes em composições farmacêuticas e diversas misturas nutritivas, como aditivos para ração animal.

Técnica Anterior

Aminoácidos L, como L-treonina e L-lisina, são produzidos industrialmente por meio de fermentação usando-se bactérias produtoras de aminoácido L, como bactérias corineformes ou Escherichia que apresentam uma capacidade de produzir aminoácidos L. Para aperfeiçoar a produtividade, usou-se como a bactéria produtora de aminoácido L, uma cepa isolada da natureza, um mutante artificial da mesma, ou um recombinante em que a atividade de enzima biossintética do aminoácido L é incrementada por meio de recombinação de gene. O método de produzir L-lisina foi exemplificado em documentos de Patentes de 1 a 4. O método de produzir L-treonina foi exemplificado em documentos de Patentes de 5 a 8.

Métodos de incrementar a capacidade de produzir aminoácidos, como L-treonina e L-lisina, incluem um método de incrementar eficiência de energia por meio de modificação de uma via de cadeia respiratória (documento de Patente 13), e um método de incrementar uma capacidade de produzir nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato por meio de amplificação de uma nicotinamida nucleotídeo transdesidrogenase (documento de Patente 9), e também um método de incrementar um quantidade de expressão de uma enzima da via biossintética endógena.

Adicionalmente, métodos de modificar vias comuns de sistemas biossintéticos de aminoácidos são conhecidos e incluem modificar vias anapleróticas de bactérias produtoras de aminoácido L, como uma bactéria corineforme produtora de L-lisina em que uma atividade de piruvato carboxilase é incrementada (documento de Patente 10), uma bactéria Escherichia produtora de L-lisina que é deficiente de piruvato quinase 5 (documento de Patente 11), e uma bactéria corineforme produtora de L-lisina que é deficiente de malato quinina oxidoredutase (documento de Patente 12).

Uma enzima málica é uma das enzimas de via anaplerótica. Na bactéria Escherichia, sabe-se que cada um dos genes sfcA e b2463 codifica a enzima málica (documento não-patente 9). No entanto, ainda não se reportou ,10 se um decréscimo da atividade das enzimas málicas codificada pelos genes sfcA e b2463 é ou não efetivo para incrementar produção de L-lisina ou L~ treonina.

Uma análise de fluxo metabólico, que também é referida como uma análise de balanço de fluxo, é uma técnica para predizer distribuições de 15 fluxo metabólico intracelular por meio de construção de um modelo estequiométrico de reações bioquímicas intracelulares e otimização linear. Esta técnica foi usada na pesquisa das capacidades de sistemas de reação bioquímicos em microorganismos ou para predizer distribuições de fluxo metabólico intracelular em diferentes condições externas (documentos não20 patente 1, 2 e 3). Também se reportou a construção de um modelo estequiométrico para Escherichia coli (documentos não-patente 4 e 5). Também se conhece um exemplo de uso de um referido modelo estequiométrico na engenharia metabólica da produção de lisina para Corynebacterium glutamicum, que é usada na produção de aminoácidos 25 (documento não-patente 6). Adicionalmente, reportou-se uma grande quantidade de métodos teóricos ou experimentais de análises de fluxo metabólico e suas aplicações foram reportadas (documentos não-patente 7, 8, documentos de Patente 14, 15 e 16). documento de Patente 14 revela um método de predizer um gene requerido para crescimento baseado em um modelo estequiométrico. Documento de Patente 15 revela uma técnica para * alterar, geneticamente e evolucionariamente, células para conferir funções ótimas às células. Adicionalmente, documento de Patente 16 revela um método de aplicando-se em um modelo estequiométrico limitações de 5 informação cinética qualitativa, limitações de informação de controle qualitativo e limitações baseadas em dados experimentais de micro-conjunto de DNA em condições diferentes em um modelo. Embora todos estes sejam métodos de predizer distribuições de fluxo metabólico intracelular mais estáveis, não se revelou qualquer método de predizer teoricamente um fluxo ► 10 específico como um alvo para aperfeiçoar diretamente produção de substância celular.

<Documento de Patente 1>

Divulgação de pedido de patente japonesa n° 10-165180 <Documento de Patente 2>

Divulgação de pedido de patente japonesa n° 11-192088 <Documento de Patente 3>

Divulgação de pedido de patente japonesa n° 2000-253879 <Documento de Patente 4>

Divulgação de pedido de patente japonesa n° 2001-57896 <Documento de Patente 5>

Divulgação de pedido de patente japonesa n° 5-304969 <Documento de Patente 6>

Publicação internacional n° WO98/04715 <Documento de Patente 7>

Divulgação de pedido de patente japonesa n° 5-227977 <Documento de Patente 8>

Publicação de pedido de patente U.S. n° 2002/0110876 <Documento de Patente 9>

Patente japonesa n° 2817400 • 9 ···· ♦ · · • ·· • · ·· «····· • ·· ·· <Documento de Patente 10>

* Divulgação de pedido de patente japonesa n° 2002-508921 <Documento de Patente 11>

' Publicação internacional n° W003/008600 <Documento de Patente 12>

Publicação de pedido de patente U.S. n° 2003/0044943 <Documento de Patente 13>

Divulgação de pedido de patente japonesa n° 2002-17363 <Documento de Patente 14>

. 10 Publicação internacional n° WO00/46405 <Documento de Patente 15>

Publicação internacional n° W002/061115 <Documento de Patente 16>

Publicação internacional n° WO02/055995 <Documento não-patente 1 >

Varma, A. e Palsson, B.O. Appl. Environ. Microbiol. 60:37243731, 1994 <Documento não-patente 2>

Schilling, C.H. et al., Biotechnol. Prog., 15:288-295, 1999 <Documento não-patente 3>

Schilling, C.H. et al., Biotechnol. Prog., 15:296-303, 1999 <Documento não-patente 4>

Pramanik, J. e Keasling, J.D., Biotechnol. Bioeng, 56:398421, 1997 <Documento não-patente 5>

Ibarra, R.U. et al., Nature, 420:186-189, 2002 <Documento não-patente 6>

Vallino, J.J. e Stephanopoulos, G., Biotechnol. Bioeng.,

41:633-646, 1993

MM

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Wiechert, W., Journal ofBiotechnology, 94:37-63,2002 <Documento não-patente 8>

Wiechert, W., Metabolic Engineering, 3:195-205,,2001 <Documento não-patente 9>

Van der Rest, M.E., Frank C., Molenaar, D.J., J. Bacteriol.,

182(24):6892-6899,2000

Revelação da Invenção

A presente invenção proporciona uma bactéria Escherichia * 10 que apresenta uma capacidade aperfeiçoada de produzir L-lisina ou Ltreonina, e um método de produzir L-lisina ou L-treonina usando a bactéria.

Os inventores da presente invenção estudaram assiduamente como resolver o problema e, como um resultado, eles verificaram que a produção de um fluxo metabólico que afeta produção de substância poderia 15 ser determinada (1) selecionando-se o mesmo número de fluxos livres como o grau de liberdade de uma matriz estequiométrica calculada com base em fórmulas de reações bioquímicas de um substrato através de uma substância desejada produzida, (2) calculando-se distribuições de fluxo metabólico a partir de combinações randômicas dos fluxos livres em uma quantidade 20 suficiente para uma análise estatística baseada na matriz estequiométrica, e (3) obtendo-se uma equação de regressão que inclui um número mínimo de fluxos livres que se correlacionam com a produção de substância a partir das distribuições calculadas de fluxo metabólico baseadas em análise estatística.

Determinações dos fluxos metabólicos de uma bactéria 25 produtora de L-lisina ou L-treonina por meio deste método revelaram que uma modificação tal que uma enzima málica não funcione normalmente é efetiva para incrementar a produtividade da bactéria. A presente invenção foi realizada com base nas verificações previamente indicadas; e proporciona o seguinte:

(1) Uma bactéria Escherichia que apresenta uma capacidade de produzir L-lisina ou L-treonina, e sendo que referida bactéria é modificada de tal forma que uma enzima málica não funcione normalmente numa célula.

(2) Uma bactéria de acordo com (1), sendo que um gene que codifica referida enzima málica no cromossomo bacteriano é mutada e/ou uma seqüência de controle de expressão da mesma é mutada de tal forma que a enzima málica não funciona normalmente na célula.

(3) A bactéria de acordo com (1), sendo que referida enzima málica não funciona normalmente por meio de rompimento de um gene que > 10 codifica referida enzima málica no cromossomo bacteriano.

(4) A bactéria de acordo com (1), sendo que o gene que codifica referida enzima málica compreende sfcA.

(5) A bactéria de acordo com (1), sendo que o gene que codifica referida enzima málica compreende b2463.

(6) A bactéria de acordo com (1), sendo que referida enzima málica é selecionada do grupo que consiste de:

(A) uma proteína apresentando uma seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 6, e (B) uma proteína que apresenta uma seqüência de aminoácidos compreende substituição, deleção, inserção ou adição de um ou vários radicais de aminoácidos na seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 6, e apresenta uma atividade de enzima málica.

(7) A bactéria de acordo com (1), sendo que referida enzima málica é selecionada do grupo que consiste de:

(C) uma proteína apresentando uma seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 8, e (D) uma proteína que apresenta uma seqüência de aminoácidos compreendendo substituição, deleção, inserção ou adição de um ou vários radicais de aminoácidos na seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID

NO: 8, e apresenta uma atividade de enzima málica.

(8) A bactéria de acordo com (1), sendo que o gene que codifica referida enzima málica é um DNA selecionado do grupo que consiste de:

(a) um DNA apresentando uma seqüência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO: 5, (b) um DNA que hibridiza com a seqüência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO: 5, ou uma sonda que pode ser preparada da seqüência de nucleotídeos, sendo que referida hibridização ocorre em condições estringentes, e sendo que referido DNA codifica uma proteína apresentando uma atividade de enzima málica.

(9) A bactéria de acordo com (1), sendo que um gene que codifica a enzima málica é um DNA selecionado do grupo que consiste de:

(c) um DNA apresentando uma seqüência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO: 7, e (d) um DNA que hibridiza com a seqüência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO: 7, ou uma sonda que pode ser preparada da seqüência de nucleotídeos, sendo que referida hibridização ocorre em condições estringentes, e sendo que referido DNA codifica uma proteína apresentando uma atividade de enzima málica.

(10) Um método de produzir L-lisina ou L-treonina, compreendendo cultivar a bactéria como definido em qualquer um de (1) a (9) em um meio de forma a produzir e secretar referida L-lisina ou L-treonina, e recolher a L-lisina ou L-treonina do meio.

Breve Descrição dos Desenhos

Fig. 1 é um gráfico apresentando produção de lisma como uma função de diferentes valores de fluxos livres por meio do uso de um conjunto de dados de 5000 distribuições de fluxo randômicas. Os rendimentos de lisina são mostrados para (a) fluxo de isocitrato liase, (b) fluxo de enzima málica e

(c) fluxo de carboxilase PEP.

Fig. 2 é um gráfico mostrando produção de lisina como uma função de valores na equação 2 para um conjunto de dados de 5000 distribuições de fluxo randômicas. O valor de entrada é um fluxo em mmol/h baseado em fluxo de glucose de 10 mmol/h glucose.

Fig. 3 mostra as estruturas de pMW118-attL-Tc-attR e pMWl 18-attL-Cm-attR.

Fig. 4 mostra a estrutura de pMW-intxis-ts.

Melhor Modo de Realizar a Invenção

A seguir, a presente invenção será explicada de maneira detalhada.

<1> Bactéria Escherichia da presente invenção

A bactéria Escherichia da presente invenção é uma bactéria pertencente ao gênero Escherichia que apresenta uma capacidade de produzir L-lisina ou L-treonina e que é modificada de tal forma que uma enzima málica não funciona normalmente. A bactéria Escherichia da presente invenção pode apresentar uma capacidade de produzir L-lisina ou L-treonina, ou pode apresentar uma capacidade de produzir ambas, L-lisina e L-treonina.

Uma cepa parental pertencente ao gênero Escherichia que é usada para se obter a bactéria Escherichia da presente invenção inclui, mas não se limita àquelas descritas em um livro escrito por Neidhardt et di/.,(Neidhardt, F. C. et ah, Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D. C., 1029, tabela 1). For exemplo, a cepa parental pode ser Escherichia coli. A Escherichia coli pode ser Escherichia coli W3110 (ATCC 27325) ou Escherichia coli MG1655 (ATCC 47076), que são, ambas, derivadas da cepa Kl 2 selvagem de protótipo.

É possível obter estas cepas da American Type Culture Collection (endereço: 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852,

Estados Unidos da América), por exemplo. Números de registro são atribuídos a cepas, respectivamente. É possível requisitar a cepa desejada por seu número de registro. Os números de registro que correspondem às cepas *

são listados no catálogo da American Type Culture Collection.

<1> 1. Conferindo a capacidade de produzir L-lisina ou L-treonina

Um método de conferir a capacidade de produzir L-Lisina ou

L-treonina à bactéria Escherichia encontra-se descrito abaixo. A expressão capacidade de produzir L-lisina como usada aqui significa uma capacidade de produzir e causar acúmulo de, ou secretar, L-lisina em um meio, isto é L► 10 lisina extracelular livre, quando a bactéria é cultivada no meio. Em particular, a expressão capacidade de produzir L-lisina significa uma capacidade de causar acúmulo de mais L-lisina em comparação com uma cepa de tipo selvagem, ou parental.

A expressão capacidade de produzir L-treonina como usada aqui significa uma capacidade de produzir e causar acúmulo de, ou secretar,

L-treonina em um meio, isto é L-treonina extracelular livre, quando a bactéria é cultivada no meio. Em particular, esta expressão significa uma capacidade de causar acúmulo de mais L-treonina em comparação com uma cepa de tipo selvagem, ou parental.

Para conferir capacidade de produzir L-lisina ou L-treonina, é possível usar métodos convencionais de cultura de bactérias de Escherichia e bactérias corineformes, como métodos de obter cepas mutantes auxotróficos, cepas resistentes a análogos, ou cepas mutantes de controle metabólico que apresentam uma capacidade de produzir L-lisina ou L-treonina, e métodos de produzir cepas recombinantes em que atividades de enzima biossintética de Llisina ou L-treonina são incrementadas. Na criação de bactérias produtoras de L-lisina ou L-treonina, características, como auxotrofia, resistência a análogo e mutações de controle metabólico, podem ser conferidas sozinhas ou em combinação. A atividade incrementada de enzima biossintética de L-lisina ou

L-treonina pode ser sozinha ou em combinação. Adicionalmente, o conferir de características, como auxotrofia, resistência a análogo e mutações de controle metabólico, pode ser combinado com incremento da atividade de enzima de biossíntese de L-lisina e/ou L-treonina.

Exemplos de métodos de conferir ou incrementar a capacidade de produzir L-lisina ou L-treonina por meio do incremento da Atividade de enzima biossintética de L-lisina ou L-treonina são descritos abaixo. O incremento da atividade enzima pode ser realizado, por exemplo, por meio da introdução de uma mutação num gene que codifica a enzima, ou amplificando o gene de tal forma que se aumenta uma atividade intracelular da enzima. Isto pode ser realizado por meio de recombinante de genes.

Genes que codificam as enzimas biossintéticas de L-treonina incluem, embora sem limitação, o gene da aspartoquinase III (lysC), o gene de aspartato semialdeído desidrogenase (asd), a aspartoquinase I codificada pelo óperon thr (thrA), o gene de homoserina quinase (thrB), e o gene de treonina sintase (thrC). O símbolo abreviado do gene é mostrado em parênteses. É possível usar dois ou mais destes genes. O gene de enzima biossintética de L-treonina pode ser introduzido numa bactéria Escherichia de que se suprimiu a degradação de treonina. Uma bactéria Escherichia de que a degradação de treonina é suprimida é exemplificada pela cepa TDH6, que é deficiente de uma atividade de treonina desidrogenase (divulgação de pedido de patente japonesa n° 2001-346578).

Genes que codificam as enzimas biossintéticas de L-lisina incluem, embora sem limitação, enzimas de via de diaminopimelato, como o gene da diidrodipicolinato sintase (dapA), o gene da aspartoquinase (lysC), o gene de redutase diidrodipicolinada (dapB), o gene de diaminopimelato descarboxilase (lysA), o gene de diaminopimelato desidrogenase (ddh) (todos os precedentes; publicação internacional n° 96/40934), o gene de fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc) (divulgação de pedido de patente japonesa n° 60-87788), o gene de aspartato aminotransferase (aspC) * (publicação de patente japonesa n° 6-102028), o gene de diaminopimelato epimerase (dapF) (divulgação de pedido de patente japonesa n° 2003A

135066), e o gene de aspartato semialdeldo desidrogenase (asd) (publicação 5 internacional n° 00/61723), e as enzimas da via de aminoadipato, como o gene de homoaconitato hidratase (divulgação de pedido de patente japonesa n° 2000-157276).

Além disso, a bactéria da presente invenção pode apresentar atividade diminuída de uma enzima que catalisa uma reação para gerar um - 10 composto diferente de L-lisina por meio de ramificação da via biossintética de L-lisina, ou pode ser deficiente de uma enzima do tipo referido. Enzimas que catalisam uma reação para gerar um composto diferente de L-lisina por meio de ramificação da via biossintética de L-lisina incluem homoserina desidrogenase e lisina descarboxilase. Cepas apresentando atividades 15 diminuídas das enzimas são descritas no WO95/23864 e WO 96/178930.

Aumento da atividade da enzima codificada pelo gene pode ser obtido por meio de amplificação do gene biossintético de L-lisina ou Ltreonina com um plasmídeo replicável autonomamente em bactérias de Escherichia, por exemplo. O gene biossintético pode ser integrado no 20 cromossomo bacteriano. Isto também pode ser obtido introduzindo-se um gene que inclui uma mutação que causa o aumento da atividade da enzima codificada pelo gene. Exemplos de uma mutação do tipo referido incluem mutação de uma seqüência promotora, de tal forma que a quantidade de transcrição do gene aumenta, e mutação na região codifícante do gene, de tal 25 forma que aumenta uma atividade específica da proteína de enzima.

Diferentemente da amplificação de gene como descrito acima, expressão gênica pode ser amplificada substituindo-se uma seqüência de controle de expressão, como um promotor do gene no plasmídeo ou DNA cromossômico, por um mais forte, (Publicação internacional n° WO «* ·«· ·· · · ««»· ·· ·» ··♦· «· · · · · · · ··«·*» · ···«·« • e · · · «««· · ♦♦ ♦♦ · * • · « · · · ♦ · · · ♦ ♦ ··· »♦ ♦ ·♦♦ ·· ·· w» *

00/18935). Promotores fortes são conhecidos e incluem, por exemplo, o promotor lac, o promotor trp, o promotor trc, o promotor tac, e o promotor PR do fago lambda. Expressão do gene pode ser incrementada substituindo-se o promotor endógeno, tanto no cromossomo ou plasmídeo, por um outro mais 5 forte, ou modificando-se o promotor endógeno. Modificação da seqüência de controle de expressão pode ser combinada com o aumento do número de cópias do gene.

Exemplos de bactérias de Escherichia a que se confere a capacidade de produzir L-lisina ou L-treonina, e que podem ser usadas na > 10 presente invenção, são mostrados abaixo. No entanto, a bactéria da presente invenção não é limitada a estes exemplos, mas compreende qualquer bactéria que tem a capacidade de produzir L-lisina ou L-treonina.

Exemplos específicos de cepas resistentes a análogos ou cepas mutantes de controle metabólico que apresentam uma capacidade de produzir 15 L-lisina incluem Escherichia coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B12185; divulgação de pedido de patente japonesa n° 56-18596 e U.S. Pat. n° 4,346,170) e Escherichia coli VL611. Cepa WC196 pode ser usada como uma bactéria Escherichia coli produtora de L-lisina (publicação internacional n° WO96/17930). A cepa WC196 foi criada conferindo-se resistência a AEC (S20 (2-aminoetil)cisteína) à cepa W3110, que foi derivada de Escherichia coli ΚΙ 2. Esta cepa foi denominada Escherichia coli AJ13069, e depositada no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (correntemente National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Intemational Patent Organism 25 Depositary, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibarakiken, 305-8566, Japão) em 6 de dezembro de 1994 e receberam um número de acesso FERM P-14690. Isto foi convertido a um depósito internacional sob as provisões do Tratado de Budapeste em 29 de setembro de 1995, e recebeu uma número de acesso FERM BP-5252.

Exemplos de bactérias Escherichia apresentando uma _w capacidade de produzir L-treonina incluem uma cepa mutante produtora de Ltreonina que é resistente à 6-dimetilaminopurina (divulgação de pedido de patente japonesa n° 5-304969), cepas recombinantes de Escherichia coli, 5 como uma cepa em que um gene biossintético de treonina apresentando uma mutação introduzida que causa excesso de produção de enzima biossintética de L-treonina é amplificado em um plasmídeo (publicação de patente japonesa n° 1-29559, e divulgação de pedido de patente japonesa n° 5227977), uma cepa em que um óperon de treonina é amplificado em um . 10 plasmídeo (pedido divulgado de patente japonesa n° 2-109985), e uma cepa em que genes que codificam piruvato carboxilase e nicotinamida nucleotídeo transidrogenase são amplificados (divulgação de pedido de patente japonesa n° 2002-51787).

Escherichia coli VKPM B-3996 (U.S. Patent n° 5,175,107) também é abrangida pela presente invenção. A cepa VKPM B-3996 foi depositada na Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika) em 19 de novembro de 1987 e recebeu um número de acesso VKPM B-3996. O VKPM B-3996 abriga plasmídeo pVIC40 (publicação internacional n° WO 90/04636), que é produzido inserindo-se genes biossintéticos de treonina (óperon de treonina: thrABC) em um vetor de faixa ampla de hospedeiro, por exemplo, plasmídeo pAYC32 (Chistoserdov, A. Ύ., Tsygankov, Y. D, Plasmid, 1986, 16, 161-167). No pVIC40, dessensibiliza-se a retro-inibição por L-treonina de aspartoquinase Ihomoserina desidrogenase I codificada por thrA no óperon de treonina.

Além disso, Escherichia coli B-5318 (patente européia n°

0593792) é compreendida pela presente invenção. A cepa B-5318 foi depositada na Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika) em 19 de novembro de 1987 e recebeu um número de acesso VKPM B-5318. O VKPM B-5318 é prototrófico com relação à isoleucina e abriga um DNA plasmídico recombinante. Este plasmídeo é * construído de forma que o óperon de treonina, incluindo os genes biossintéticos de treonina, seja deficiente de uma região de atenuação, por *

exemplo, a região de regulação de transcrição endógena. O óperon encontra5 se posicionado a jusante do repressor do fago lambda_Cl sensível a temperatura, o promotor PR, e a proteína N-teminal da proteína Cro, e é construído de tal forma que a expressão dos genes biossintéticos de treonina encontra-se sob o controle de um promotor e repressor de fago lambda. <2> Construção de bactéria Escherichia da presente invenção .10 A bactéria Escherichia da presente invenção é uma bactéria pertencente ao gênero Escherichia que apresenta uma capacidade de produzir L-lisina ou L-treonina, e que é modificada de tal forma que uma enzima málica não funciona normalmente.

Durante a criação da bactéria Escherichia da presente invenção, pode-se conferir inicialmente a capacidade de produzir L-lisina ou L-treonina, ou mutação em que a enzima málica (EC 1.1.1.38, EC 1.1.1.40) normalmente não funciona. Também, uma bactéria Escherichia apresentando a capacidade de produzir L-lisina ou L-treonina pode ser modificada de tal forma que a enzima málica não funciona normalmente, e a capacidade de produzir L-lisina ou L-treonina pode ser conferida a uma bactéria Escherichia em que a enzima málica ainda não funcionou normalmente.

A expressão atividade de uma enzima málica significa uma atividade para catalisar uma reação reversível para produzir dióxido de carbono e piruvato a partir de malato. Enzimas málicas que usam NAD (EC

1.1.1.38) e NADP (EC 1.1.1.40) como coenzimas são conhecidas. (EC

1.1.1.38 (S)-malato + NAD+ - piruvato + CO₂ + NADH + Η*) (EC 1.1.1.40 (S)-malato + NADP⁺ - piruvato + CO₂ + NADPH + H⁺). A enzima málica também é denominada malato desidrogenase, ou malato oxidoredutase.

A expressão modificada de tal forma que uma enzima málica não funciona normalmente em uma célula significa que é modificada de tal forma que a função da enzima málica deveria ser eliminada ou a atividade da enzima málica deveria ser reduzida ou atenuada, em comparação com uma cepa não-modificada, como uma cepa de tipo selvagem (parental). O estado 5 em que a enzima málica não funciona normalmente pode ser, por exemplo, um estado em que a transcrição ou tradução do gene que codifica a enzima málica é inibida, e, portanto, o produto gênico da mesma, a enzima málica, não é produzido, ou a produção é reduzida, ou um estado em que o gene que codifica referida enzima málica no cromossomo bacteriano é mutado e/ou

- 10 uma seqüência de controle de expressão do mesmo é mutada, e, assim, a atividade da enzima málica é reduzida ou eliminada. Exemplo da bactéria Escherichia em que a enzima málica não funciona normalmente inclui, tipicamente, uma cepa de gene rompido em que o gene que codifica a enzima málica no cromossomo bacteriano é rompido com técnica de recombinação 15 genética, e uma cepa mutante em que uma seqüência reguladora de expressão ou uma região do gene de enzima málica é mutada, e, portanto, uma enzima málica funcional não é mais produzida.

A expressão modificada de tal forma que uma atividade de uma enzima málica é atenuada significa que a atividade da enzima málica é 20 reduzida, em comparação com aquela de uma cepa não-modificada, por exemplo,, uma cepa de tipo selvagem (parental) de bactérias de Escherichia. De preferência, a atividade da enzima málica é reduzido em, no máximo, 50%, mais preferivelmente no máximo 30%, ainda mais preferivelmente no máximo 10 % por célula, em comparação com a cepa não-modificada.

Exemplos da bactéria Escherichia que podem atuar como um controle incluem Escherichia coli W3110 (ATCC 27325) e Escherichia coli MG1655 (ATCC 47076). Estas cepas de tipo selvagem são derivadas da cepa Kl2 de tipo selvagem de protótipo. Atividade de enzima málica, usando NAD como coenzima, pode ser determinada de acordo com o método de Korkes, S., • ·· « * ·· • · ·» «····· • ·· ♦ ·· « ··*· *· ·· ·· • * ·»· • · · ·· *« · · ·· • · · ·« « · * *« ·· «· · et aL (Korkes, S. et al., (1950) J. Biol. Chem. 187, 891-905). Atividade de enzima málica usando NADP como coenzima pode ser determinada de acordo com o método de Ochoa, S. (Ochoa, S. et al (1947) J. Biol. Chem. 167, 871 872).

O termo atenuação” inclui, embora sem limitação, a eliminação completa da atividade. Atividade de enzima málica usando-se NAD ou NADP como coenzimas pode ser atenuada individualmente, ou conjuntamente. Para a presente invenção é suficiente que a bactéria Escherichia apresente a atividade atenuada de enzima málica, em comparação - 10 com uma cepa de tipo selvagem ou não-modificada. No entanto, prefere-se que a bactéria Escherichia da presente invenção também apresente uma capacidade incrementada de causar acúmulo, ou secretar L-lisina ou Ltreonina, em comparação com a cepa de tipo selvagem ou não-modificada, e/ou produtividade aperfeiçoada de L-lisina ou L-treonina em virtude de bom 15 desenvolvimento, ou seja, rendimento aperfeiçoado com subtração das células.

A enzima málica da presente inclui a proteína que apresenta a seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 6 ou 8. A enzima málica pode ser uma variante da seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ. ID 20 NO: 6 ou 8, pelo fato de que pode incluir substituição, deleção, inserção ou adição de um ou vários radicais de aminoácidos na seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 6 ou 8, desde que apresente uma atividade de enzima málica. Vários” como usado aqui, significa, por exemplo, de 2 a 20, de preferência de 2 a 10, mais preferivelmente de 2 a 5.

A substituição, deleção, inserção ou adição de um ou vários radicais de aminoácidos deveria ser mutação/mutações conservativa(s) de tal forma que a atividade de enzima málica é mantida. A mutação conservativa representativa é uma substituição conservativa. Exemplos de substituições conservativas incluem substituição de Ser ou Thr por Ala, substituição de

3/ ·· ··· ·· * · ····♦······?

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Gin, His ou Lys por Arg, substituição de Glu, Gin, Lys, His ou Asp por Asn, substituição de Asn, Glu ou Gin por Asp, substituição de Ser ou Ala por Cys, substituição de Asn, Glu, Lys, His, Asp ou Arg por Gin, substituição de Asn, Gin, Lys ou Asp por Glu, substituição de Pro por Gly; substituição de Asn, 5 Lys, Gin, Arg ou Tyr por His, substituição de Leu, Met, Vai ou Phe por Ile, substituição de Ile, Met, Vai ou Phe por Leu, substituição de Asn, Glu, Gin, His ou Arg por Lys, substituição de Ile, Leu, Vai ou Phe por Met, substituição de Trp, Tyr, Met, Ile ou Leu por Phe, substituição de Thr ou Ala por Ser, substituição de Ser ou Ala por Thr, substituição de Phe ou Tyr por Trp, - 10 substituição de His, Phe ou Trp por Tyr, e substituição de Met, Ile ou Leu por Vai.

A expressão modificada de tal forma que uma enzima málica não funcione normalmente pode significar diminuir o número de moléculas de enzima málica por célula e diminuir a atividade de enzima málica por 15 molécula. Especificamente, a modificação pode ser realizada preparando-se um gene que codifica a enzima málica no cromossomo deficiente, ou modificando-se uma seqüência de controle de expressão, como uma seqüência promotora ou de Shine-Dalgamo (SD). Também, a modificação pode ser realizada introduzindo-se substituição de um aminoácido (mutação missense), 20 ou um códon de interrupção (mutação nonsensé) numa região codificante, ou introduzindo-se inserção ou deleção de 1 a 2 bases numa região codificante (mutação de deslocamento de matriz) ou deletando-se parte do gene {Joumal ofBiological Chemistry 272:8611-8617(1997)).

Exemplos de um gene de enzima málica (gene mez), no 25 cromossomo incluem o gene sfcA, como um DNA apresentando a seqüência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO: 5. Este DNA codifica a enzima que utiliza NAD como uma coenzima. Outro exemplo é o gene b2463, como um DNA apresentando a seqüência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO: 7. Este DNA codifica a enzima que utiliza NADP como uma coenzima.

O gene mez pode ser um DNA que hibridiza com a seqüência

..· de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO: 5 ou 7, ou uma sonda que pode ser preparada da seqüência de nucleotídeos em condições estringentes, desde que codifique uma proteína que apresenta atividade de enzima málica. Condições 5 estringentes incluem aquelas sob as quais um híbrido específico se forma e um híbrido não-específico não se forma. Por exemplo, condições estringentes são exemplificadas por meio de lavagem uma vez, de preferência duas ou três vezes, a uma concentração de sal correspondente a lx SSC, 0,1 % de SDS, preferivelmente 0,lx SSC, 0,1 % de SDS a 60°C. O comprimento da sonda - 10 pode ser selecionado dependendo das condições de hibridização, e é usualmente de 100 bp [pares de bases] a 1 kbp.

O gene que codifica a enzima málica (sfcA, b2643) pode ser obtido por meio de PCR usando-se o cromossomo de Escherichia coli como um padrão, e oligonucleotídeos sintetizados com base nas seqüências de 15 Escherichia coli a seguir, registrados no GenBank como iniciadores: sfcA'.

AAC74552. NAD-linked malato... [gi: 1787754), complemento de AE000245.1:1208..2932, b2643; AAC75516. multimod putativo...[gi: 1788806], complemento de AE000333.1:141..2420.

É possível preparar DNA cromossômico a partir de uma bactéria para uso como um doador de DNA, por exemplo, por meio do método de Saito e Miura (referir a H. Saito e K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963), Text for Bioengineering Experiments, editado pela Society for Bioscience and Bioengineering, Japão, pp. 97-98, Baifukan, 1992) ou análogos.

O gene sfcA ou b2643 preparado como descrito acima, ou uma parte do mesmo, pode ser usado para rompimento de gene. O gene usado para rompimento de gene é suficiente se apresentar um grau de homologia que permite recombinação homóloga com o gene sfcA ou b2463 no cromossomo da bactéria Escherichia. Portanto, é possível usar um gene homólogo do tipo ··· «· ·· · · ·· • ·· ♦· * ·· •♦ • · · • « referido. O grau de homologia que deveria permitir recombinação homóloga é, de preferência, de 70% ou mais, mais preferivelmente de 80% ou mais, ainda mais preferivelmente de 90% ou mais, e, de forma particularmente preferível, de 95% ou mais. Também, pode ocorrer recombinação homóloga se for usado um DNA que é hibridizável com o gene em condições estringentes. As condições estringentes são condições sob as quais um híbrido específico se forma, e um híbrido não-específico não é formado. Por exemplo, condições estringentes são exemplificadas por meio de lavagem uma vez, de preferência duas ou três vezes, a uma a uma concentração de sal correspondente a lx SSC, 0,1% de SDS, preferivelmente 0,lx SSC, 0,1 % de SDS, a 60°C.

O gene sfcA ou b2463 pode ser rompido, por exemplo, preparando-se, a partir do gene como descrito acima, um gene sfcA ou b2463 de tipo deleção em que uma seqüência parcial é deletada, de tal forma a não 15 se produzir uma enzima málica que normalmente funciona. Este gene de tipo deleção, ou um DNA que inclui o gene, pode então ser transformado numa bactéria Escherichia, e recombinação causada entre o gene de tipo deleção e o gene no cromossomo. O rompimento de gene pela subestação de gene empregando recombinação homóloga já foi estabelecido, e é exemplificado 20 usando-se um DNA linear representado por um método desenvolvido por desenvolvido por Datsenko K. A., e Wanner B. L. (Proc. Natl. Acad. Sei.

USA, 2000, 97, 6640-6645) também denominado integração red-driven, e um método que usa um plasmídeo que abriga uma origem de replicação sensível à temperatura (U.S. Patent n° 6,303,383 e divulgação de pedido de 25 patente japonesa n° 5-7491). O rompimento de gene pela subestação de gene com o uso de recombinação homóloga também pode ser realizado empregando-se um plasmídeo que não apresenta capacidade replicação em um hospedeiro.

Adicionalmente, um método baseado numa combinação do • ·

método denominado integração red-driven e um sistema de excisão derivado de fago lambda (J. Bacteriol. setembro de 2002; 184(18): 5200-3 Interactions between integrase and excisionase in the phage lambda excisive nucleoprotein complex. Cho EH, Gumport RI, Gardner JF) pode ser usado 5 como o método para romper um gene em um cromossomo.

De acordo com o método de integração red-driven, é possível constmir em uma só etapa uma cepa com gene rompido por meio do uso de um produto de PCR, que é obtido usando-se oligonucleotídeos sintéticos como iniciadores que são projetados para constituir parte de um gene alvejado 10 em sua ponta 5', e parte de um gene de resistência a antibióticos em sua ponta 3'. Além disso, o gene integrado de resistência a antibióticos pode ser removido introduzindo-se attL e attR, que são sítios de ligação de fago lambda e do produto de PCR, e combinando-se o sistema de excisão derivado de fago lambda com o método de integração red-driven.

Especificamente, a cepa em que o gene alvejado é rompido e o gene de resistência a antibiótico é removido, pode ser obtida por meio do método a seguir.

Prepara-se inicialmente uma cassete de DNA linear compreendendo um gene de resistência a antibiótico, sítios de ligação de fago 20 lambda e um gene-alvo. Isto é preparado usualmente por meio de PCR usando-se um modelo preparado apropriadamente.

Um modelo em que attL e attR (SEQ ID. NO: 9 (acesso GenBank n° M12458 e SEQ ID NO: 10 (acesso GenBank n° M12459)), que são sítios de ligação de fago lambda, são inseridos em terminais respectivos 25 de um gene de resistência a antibiótico que é usado como um modelo da cassete de DNA linear. O padrão pode ser plasmídeo, um gene inserido em um cromossomo, ou um oligonucleotídeo sintético. Embora o gene de resistência a antibiótico seja, de preferência, um gene de resistência a cloranfenicol, um gene de resistência à estreptomicina, ou um gene de

resistência à ampicilina, é possível usar qualquer gene de resistência a antibiótico desde que o gene funcione como um gene de resistência a antibiótico em bactérias Escherichia e é diferente de um gene marcador que pode estar contido em dois plasmídeos auxiliares, como descrito abaixo. Para confirmar com facilidade a aquisição da resistência a antibiótico, o gene de resistência a antibiótico que é empregado pode ser um com o qual a quantidade de expressão é incrementada mediante substituição de uma seqüência promotora e análogos, ou um em que uma mutação é introduzida em sua seqüência de gene estrutural, de tal forma a incrementar uma atividade -10 de enzima. A cassete de DNA linear é preparada na seguinte ordem, a partir da ponta 5’:

(seqüência de gene alvejada a 5’)-(attL)-(gene de resistência a antibiótico)-(attR)-(seqüência de gene alvejada a 3’).

A cassete de DNA linear é integrada no cromossomo. Como 15 um plasmídeo auxiliar para integrar a cassete de DNA linear no cromossomo, é possível usar pKD46 (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2000, 97, 6640-6645). pKD46 mostra replicação sensível à temperatura e resistência à ampicilina, e inclui um fragmento de DNA com 2.154 nt de fago lambda (número de acesso GenBank/EMBL n° J02459, 31088-33241), que contém os genes (genes γ, β, 20 e exo) codificando recombinase Red do sistema de recombinação homóloga λ Red e que se encontra sob o controle do promotor induzível com arabinose.

É possível introduzir pKD46 em um hospedeiro por meio de eletroporação. A cepa amplificada com pKD46 é cultivada com arabinose. A 25 cassete de DNA linear é introduzido na fase de crescimento logarítmico e incubada a uma temperatura alta para se obter uma cepa com gene rompido que é resistente a um antibiótico por meio do gene de resistência a antibiótico na cassete de DNA linear. A confirmação do rompimento de gene pode ser realizada por meio de PCR ou medição da concentração de L-lisina ou L22

treonina produzida pela cepa.

Introduz-se então um plasmídeo auxiliar para excisar o gene de resistência a antibiótico. O plasmídeo auxiliar abriga um gene codificando integrase (Int) (SEQ ID NO: 13, acesso GenBank n° J02459. B [gi:215104]) e um gene codificando excisionase (Xis) (SEQ ID NO: 15, acesso GenBank n° J02459 [gi:215104]) de fago lambda e apresenta replicação sensível à temperatura. Por meio da introdução do plasmídeo auxiliar, recombinação ocorre devido a reconhecimento de attL (SEQ ID NO: 11) e attR (SEQ ID

NO: 12) no cromossomo. O gene de resistência a antibiótico entre attL e attR -10 é excisado e, como um resultado, permanece no cromossomo uma estrutura que contém apenas a seqüência attL ou attR. Por meio de incubação a alta temperatura, perde-se o plasmídeo auxiliar. Assim, é possível obter uma cepa em que o gene alvejado é rompido e o gene de antibiótico é eliminado.

Diferentemente de métodos de engenharia genética, o método de modificar a bactéria de forma que uma enzima málica não funcione normalmente pode ser exemplificado por meio de um método de tratar uma bactéria Escherichia com irradiação UV ou um agente mutagênico comumente usado para mutagênese, como N-metil-N’-nitro-Nnitrosoguanidina e ácido nítrico, seguido de seleção das bactérias com a 20 atividade atenuada da enzima málica.

A presente invenção foi realizada com base na informação de fluxo metabólico. Esta informação foi calculada por meio do método a seguir, que visa determinar a produção de substância que afeta o fluxo metabólico, com o emprego de células. No entanto, a presente invenção não se limita ao 25 método de obter referida informação, ou seja, o método de determinação.

O método, de determinar uma produção de substância que afeta fluxo metabólico, com o emprego de células, inclui as etapas de:

1) criar uma matriz estequiométrica com base nas fórmulas de reações bioquímicas de um substrato através de uma substância desejada,

3?

• ··· ·· · ···*· ·· ·· ·

2) selecionar o mesmo número de fluxos metabólicos „ independentes de todos os fluxos metabólicos como o grau de liberdade da matriz estequiométrica como fluxos livres, * 3) criar um número suficiente de combinações randômicas dos fluxos livres para uma análise estatística, e calcular uma distribuição de fluxo metabólico de cada combinação criada com base na matriz estequiométrica,

4) obter uma equação de regressão, incluindo um número mínimo de fluxos livres que mostra uma correlação com produção de substância a partir das distribuições de fluxo metabólico calculadas por meio

- 10 de uma análise estatística multivariada, e

5) determinar pelo menos uma produção de substância que afeta fluxo metabólico com base em um coeficiente na equação de regressão obtida.

O fluxo metabólico usado na presente invenção é expresso como uma taxa de reação metabólica (fluxo) derivada de um modelo estequiométrico de reações bioquímicas intracelulares e a lei da ação de massa entre metabólitos; enquanto isso, a distribuição de fluxo metabólico usada aqui consiste de todos os fluxos metabólicos em que cada fluxo metabólico é designado para cada reação bioquímica.

Na primeira etapa do método de determinação, cria-se uma matriz estequiométrica com base nas fórmulas de reação bioquímica de um substrato através de um produto de substância desejado.

As reações bioquímicas referem-se a um processo em que metabólitos intracelulares são convertidos por meio de reações enzimáticas na célula, e que foram compilados em vários bancos de dados de acordo com o tipo de organismo. Por exemplo, para referência é possível acessar a Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG, www.genome.ad.jp/kegg/).

O substrato é uma substância comumente usada pela célula como uma fonte de carbono, e exemplos disso incluem glucose, sacarose, • · • ·

írutose e assim por diante.

O produto de substância inclui não só um único tipo de metabólito, mas também um agregado de metabólitos, como biomassa (corpo da célula). Produção de substância é avaliada usualmente como uma taxa de produção de uma substância. Em particular, quando a substância desejada é uma biomassa, isto é avaliado como rendimento de biomassa. O rendimento de biomassa representa eficiência de conversão de substratos, como glucose a componentes de células, como proteína, carboidrato, ácido nucleico ou lipídeo.

-10 A matriz estequiométrica é uma matriz usada comumente em uma análise de fluxo metabólico, e pode ser criada listando-se fórmulas de reações bioquímicas de um substrato através de uma substância de produto desejado por meio de métodos típicos usados em uma análise de fluxo metabólico. Referidos métodos, presumindo-se um estado quase estável de 15 um intermediário metabólico intracelular, são geralmente conhecidos (Savinell, J.M. e Palsson, Theor. Biol., 154:421-454, 1992; Vallino,

J.J. e Stephanopoulos, G., Biotechnol. Bioeng., 41:633-646, 1993). Quando se lista fórmulas de reação, vias de reação podem ser simplificadas presumindose uma série de reações sem ramificação, com uma reação, ou presumindo-se 20 metabólitos convertidos por uma reação a uma alta taxa metabólica antes e após a reação como um metabólito e assim por diante. Quando o produto de substância é biomassa, uma matriz estequiométrica pode ser descrita listandose reações bioquímicas que levam a componentes de células.

Na segunda etapa do método de determinação, seleciona-se como fluxos livres, de todos os fluxos metabólicos, o mesmo número de fluxos metabólicos independentes como o grau de liberdade da matriz estequiométrica previamente mencionada.

Fluxos independentes são um conjunto de fluxos que deveríam ser especificados de forma a definir unicamente fluxo no sistema de rede do

metabolismo, como definido por meio de uma equação estequiométrica.

O método de ajustar fluxos livres não é particularmente limitado, desde que seja possível selecionar o mesmo número de fluxos metabólicos independentes como o grau de liberdade do sistema a ser 5 analisado. Embora a independência de fluxos selecionados arbitrariamente possa ser confirmada, também é possível usar a matriz SIMS (matriz estequiométrica metabólica interna de estado estacionário) proposta por Reder (Reder, C.J., Theor. Biol., 135:175-201, 1988). Neste método, grupos específicos de fluxos metabólicos, com o mesmo número que o grau de liberdade da matriz estequiométrica previamente indicada são determinados dentre grupos de fluxo metabólico determinado como base nas fórmulas de reação bioquímica previamente indicadas, e um fluxo metabólico é selecionado como um fluxo livre de cada grupo de fluxo metabólico determinado. A determinação de grupos específicos entre os grupos de fluxo 15 assegura que qualquer fluxo em um grupo pode ser alterado sem afetar o fluxo em outros grupos. Portanto, isto toma possível selecionar um fluxo de cada grupo como um fluxo livre independente. Quando um fluxo livre é selecionado de um grupo de fluxo, seleciona-se, de preferência, um fluxo próximo de um ponto de ramificação.

Na terceira etapa do método de determinação, cria-se combinações randômicas de fluxos livres numa quantidade suficiente para uma análise estatística, e calcula-se uma distribuição de fluxo metabólico de cada combinação criada com base na matriz estequiométrica previamente mencionada.

É possível criar combinações randômicas de fluxos livres atribuindo-se valores randômicos aos fluxos livres selecionados na etapa precedente para criar um conjunto de dados de combinações de diferentes distribuições de fluxo. O método de atribuir valores randômicos aos fluxos livres não é particularmente limitado, desde que se selecione um método que

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« ·*4 • 4· • 4 ·· ·♦··· »44 *44· * 4 * t 4 4 * »44 4· 4 4 4 · * gera combinações de fluxos livres dentro ae uma margem específica. Referida

margem específica é ajustada para dar valores biologicamente exeqüíveis em cálculos posteriores. Se o número de fluxos livres for o mesmo que o grau de liberdade da matriz estequiométrica, é possível separar uma distribuição de fluxo metabólico único. Para a solução, realiza-se usualmente uma operação de matriz usando-se uma matriz invertida, e todos os fluxos são normalizados, de preferência, por exemplo, em determinadas quantidades de substrato. Quando o substrato é glucose, é possível representar todos os valores de fluxo, por exemplo, com valores por 10 mmol de captação de glucose. As

- 10 soluções de distribuições de fluxos metabólicos obtidas de valores de fluxo livre randômicos, como descrito acima, precisam ser biologicamente significativos. Ou seja, todos os fluxos de reações não-reversíveis precisam ser de 0 ou mais, e fluxos formadores de biomassa precisam ser de 0 ou mais. Para se obter combinações de fluxos livres mais desejáveis, também é possível adicionar condições com base em conhecimento teórico e/ou empírico na produção de substância com o emprego de células. O número de combinações a serem criadas, ou seja, o número de distribuições de fluxo biologicamente significativas a serem calculadas, não é particularmente limitado, desde que seja suficiente para uma análise estatística. Usa-se três ou cinco valores para um fluxo livre. Portanto, quando há n fluxos livres, então há aproximadamente uma potência n do número de valores para um fluxo livre de combinações. Por exemplo, quando se usa três valores para um fluxo livre, há 3 elevado à n-ésima potência (3ⁿ) de combinações. Ou seja, é possível usar cerca de 2.200 combinações para sete fluxos livres (n=7).

Altemativamente, como o número de valores para cada fluxo no conjunto de dados de distribuições de fluxo biologicamente significativas pode mudar dependendo dos fluxos livres selecionados ou de condições adicionais, o número de combinações que pode ser usado é de cerca de 3 a cerca de a nésima potência (3ⁿ), ou de cerca de 5 a cerca de a n-ésima potência (5ⁿ) no • * · • ···· «· ·*·« ·· *· ···· • · · · · · • · · < · · . i . . :: :: : · total para n fluxos livres. Para se obter‘soluções* de’ dísfribuiçoes*dé fluxo biologicamente significativas em tal número, é típico partir de combinações de fluxos livres randômicos usando-se de 6 a 10 valores para um fluxo livre, ou seja, combinações de fluxos livres de seis até a n-ésima potência (6ⁿ) ou de 10 até a n-ésima potência (10ⁿ).

Na quarta etapa do método de determinação, uma equação de regressão incluindo um número mínimo de fluxos livres que mostra uma correlação com a produção de substância é obtida da distribuições de fluxos metabólicos (conjunto de dados de distribuições de fluxos metabólicos) por meio de uma análise estatística multivariada.

Realizando-se uma análise estatística multivariada para o conjunto de dados de distribuições de fluxo calculado a partir de combinações randômicas dos fluxos livres obtidos na etapa prévia, pode-se obter uma equação de regressão que inclui um número mínimo de fluxos livres que 15 mostra uma correlação com a produção de substância. A análise estatística multivariada (incluindo análise de regressão não-linear multivariada e análise de regressão linear multivariada) pode ser realizada usando-se qualquer técnica, desde que se selecione uma técnica que possa examinar correlações de combinações de fluxo livre com produção de substância. No entanto, é útil 20 uma análise de regressão linear multivariada. Este método é descrito, por exemplo, em Kachigan, S.K.; capítulo 4, Regression Analyis in Multivariate Statistical Analysis, 2^a edição, Radius Press, New York, pp. 160-193.

A expressão mostra uma correlação com produção de substância significa que o coeficiente de determinação é significativamente 25 amplo, e ser significativamente amplo significa usualmente que o coeficiente de determinação R² é de 0,8 ou maior, de preferência de 0,9 ou maior.

Uma equação de regressão, incluindo um número mínimo de fluxos livres (termos) que permite uma correlação com produção de

substância, pode ser obtida alterando-se sucessivamente o número de termos para se obter uma equação de regressão, Uma equação do tipo referido que mostra o maior coeficiente de determinação, incluindo cada número de termos, permite selecionar uma equação de regressão incluindo um número mínimo de termos que mostra um coeficiente de determinação significativamente amplo. Altemativamente, é possível obter uma equação de regressão com os termos totais, exceto por um termo, para se examinar o grau de decréscimo do coeficiente de determinação devido à exclusão do termo; o mesmo procedimento pode ser repetido com termos, exceto quanto ao termo que mostra pequeno decréscimo do coeficiente de determinação, como os termos totais; e quando não é mais possível obter uma equação de regressão que mostra uma correlação com produção de substância, pode-se selecionar uma equação de regressão obtida imediatamente antes.

Embora estes procedimentos matemáticos possam ser programados individualmente, eles podem ser facilmente realizados com o uso de programas de computação matemáticos comercialmente obteníveis, como Mattab® (nome comercial, MathWorks) e Mathematica® (nome comercial, Wolfram Research).

Na quinta etapa do método de determinação, um fluxo metabólico que afeta produção de substância é determinado com base em coeficientes na equação de regressão obtida.

Contribuições de fluxos livres para produção de substância, com o emprego de células, como microorganismos, em particular, rendimento de biomassa ou rendimento de substância produto, que são importantes na produção de substância, podem ser determinadas por meio da utilização da equação de regressão obtida na etapa precedente. Ou seja, fluxos livres que aparecem na equação de regressão podem ser determinados como aqueles que afetam produção de substância. Além disso, porque coeficientes na equação de regressão representam a magnitude de contribuição, fluxos livres

......·* ···;.··..·*.

··· « · ····· · ·· ·· · · • ·· ·· · ··· ·· ·· ·· · apresentando um coeficiente substancialmente amplo (quando fluxos são » normalizados, fluxos livres apresentando um valor absoluto grande de coeficiente relativo) podem ser determinados como fluxos metabólicos que afetam muito a produção de substância.

O método de determinação da presente invenção pode proporcionar informação que é importante para , melhorar cepas bacterianas, isto é, cujo fluxo livre influencia muito a produção de uma substância-alvo, e se um fluxo livre exerce um efeito positivo ou negativo sobre a produção de uma substância-alvo. Também é possível predizer um fluxo que precisa ser • 10 alterado para afetar de maneira favorável o rendimento e a produtividade de um produto-alvo.

Por exemplo, como mostrado nos exemplos aqui descritos, pode-se esperar criar cepas bacterianas com uma capacidade aperfeiçoada de produção de lisina mediante incremento da atividade de fosfoenolpiruvato 15 carboxilase na produção de lisina usando-se Escherichia coli. Publicação internacional n° WOO1/53459 divulga um exemplo de melhoramento de produção de lisina através do incremento da atividade de fosfoenolpiruvato carboxilase. Portanto, verificou-se que é possível criar uma cepa bacteriana apresentando uma capacidade produtora de substância com base no método de 20 determinação.

<3> Método de produção para produzir L-lisina ou L-treonina

O método da presente invenção é um método de produzir Llisina ou L-treonina, sendo que referido método compreende as etapas de cultivar a bactéria apresentando uma capacidade de produzir L-lisina ou L25 treonina em um meio, para causar acúmulo de L-lisina ou L-treonina no meio ou células da bactéria, e para recolher L-lisina ou L-treonina do meio ou das células.

O meio de cultura usado na presente invenção pode ser um meio usado tipicamente para produção de fermentação de L-lisina ou L30 ··· ··· ·* · · ···· ·· ·· ···· ····>· ·· · · r · · · ······· · ······ ··· · · ····· * ·· ·· · · • ···· ·· ······ • ··· ·· · ··· ·· ** ·· · treonina usando-se um microorganismo. É possível um meio ordinário „ incluindo uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, íons inorgânicos e os outros componentes orgânicos, se necessário. Como a fonte de carbono, é possível usar vários sacarídeos, como glucose, sacarose, lactose, galactose, frutose, e hidrolisado de amido, vários alcoóis, como glicerol e sorbitol, e l vários ácidos orgânicos, como ácido fumárico, ácido cítrico e ácido succínico. Como a fonte de nitrogênio, é possível usar vários sais de amônio inorgânico, como sulfato de amônio, cloreto de amônio e fosfato de amônio, nitrogênio orgânico, como hidrolisado de semente de soja, gás de amônia e amônia - 10 aquosa e análogos. Como um traço de nutriente orgânico, é desejável adicionar substâncias requeridas, como vitamina B_b homoserina, ou extrato de levedura e análogos. Adicionalmente, é possível usar uma quantidade em traços de fosfato de potássio, sulfato de magnésio, íon de ferro, íon de manganês. O meio usado para cultura pode ser um meio sintético ou um meio 15 natural, desde que o meio inclua uma fonte de carbono e uma fonte de nitrogênio e íons inorgânicos e, se necessário, traços de nutrientes orgânicos.

O cultivo é realizado, de preferência, em condições aeróbicas durante de um a sete dias a uma temperatura de 24 a 37°C, e um pH de 5 a 9. O pH da cultura pode ser ajustado com um ácido inorgânico ou orgânico ou 20 substância alcalina, por exemplo, gás de amônia e análogos. A coleta de Llisina ou L-treonina do meio de cultura pode ser realizada por meio de métodos usuais, como um método de resina de troca de íon, precipitação, e os outros métodos conhecidos, e combinações dos mesmos. Quando L-lisina ou L-treonina se acumula em células, é possível recolher L-lisina ou L-treonina 25 por meio de um método de resina de troca de íon ou análogos de um sobrenadante obtido rompendo-se as células por meio de ultra-som ou análogos, e removendo-se fragmentos de células por meio de centrifugação. Exemplos

A presente invenção é descrita mais detalhadamente com • · · · * · ♦ · ♦ · · · * · · · · ♦ ·«···: · ♦ ♦···· ·· 1 · ***** · · *· ·· · · ti· ·· · ♦♦· ·♦ ♦· ♦ · * referência aos exemplos.

« Exemplo 1

Determinação de fluxo metabólico com relação a L-lisina (1) Criação de matriz estequiométrica

Uma equação estequiométrica para calcular um fluxo metabólico foi construída assumindo-se um estado quase constante de intermediários metabólicos intracelulares (Savinell, J.M. e Palsson, B.O.J., Theor. BioL, 154:421-454, 1992; Vallino, J.J. e Stephanopoulos, G., Biotechnol. Bioeng., 41:633-646, 1993). As fórmulas de reação incluídas

- 10 neste modelo são mostradas na Tabela 2. Descrições das abreviaturas usadas na presente invenção encontram-se listadas na Tabela 1. Algumas reações sem ramificação foram consolidadas para simplificar as fórmulas. Como a via de fosfato de pentose é complicada, ela foi representada por duas fórmulas. Dados reportados foram usados para a relação de componentes de biomassa 15 (Neidhardt, F.C. et al., Physiology of the Bacterial Cell., Sinauer Associates,

Massachusetts, 1990) e a biomassa foi representada com o uso da fórmula de reação [68]. O grau de liberdade da matriz estequiométrica neste modelo foi de 7.

Tabela 1

3PG	ácido 3-fosfo-D-glicérico
AcCoA	acetil coenzima A
AcOH	ácido acético
alVA	ácido A-ceto-isovalérico
aKG	ácido 2-oxoglutárico
Ala	alanina
ALC	ácido acetoidróxi
Arg	arginina
ASA	semialdeído de ácido aspártico
Asn	asparagina
Asp	ácido aspártico
CHR	ácido corísmico
Cit	ácido cítrico
CO2	dióxido de carbono
COA	coenzima A
Cys	cisterna
DDP	ácido diidrodipicolínico
E4P	eritro se-4-fo sfato

F6P	frutose-6-fosfato ........
FBP	bisfosfato de frutose
Form	ácido fórmico
Fum	ácido fumárico
G6P	glucose-6-fosfato
GAP	gliceraldeído fosfato
Glc	glucose
Gin	glutamina
Glu	ácido glutâmico
Gly	glicina
Glyox	ácido glioxílico
His	histidina
Hse	homoserina
Ile	isoleucina
Ind	fosfato de indol glicerol
Isocit	ácido isocítrico
Leu	leucina
Lys	lisina
Lysext	produto de lisina (extracelular)
Mal	ácido málico
Met	metionina
mDAP	ácido meso-diaminopimélico
mTHF	tetraidrofolato de metila
NH3	amônia
OAA	ácido oxaloacetático
PEP	ácido fosfoenolpirúvico
Phe	fenilalanina
PPA	ácido prefênico
Pro	prolina
PRPP	pirofosfato de fosforibosila
Pyr	ácido pirúvico
R5P	ribose-5-fosfato
Ribu5P	ribulose-5-fosfato
SDAP	N-succinil-L-2,6-diarninoeptanodioato
SKA	ácido shiquímico
Sed7P	D-sedoeptulose-7~fosfato
Ser	serina
Suc	ácido succínico
SucCoA	succinil coenzima A
THDP	ácido tetraidrodipicolínico
THF	ácido tetraidrofólico
Thr	treonina
Trp	triptofano
Tyr	tirosina
Vai	valina
X5P	xilulose-5-fosfato

Tabela 2

Lista de fórmulas de reação usadas. Reações reversíveis são marcadas comr.

[1] Glc + PEP -> G6P + Pyr [2] G6P + 2NADP -> Ribu5P + 2NADPH + CO2

[3]r [4]r [5]r [6]r [7]r [8]r [9]r [10]r [11]r [12]r [13] [14] [15] [16] [17] [18]r [19]r [20] [21] [22]r [23]r [24]r [25]r [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] r [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40]r [41]r [42]r [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52]

RibuSP --> R5P

Ribu5P —>X5P

X5P + R5P ~> Sed7P + GAP

Sed7P + GAP --> E4P + F6P

X5P + E4P -> F6P + GAP

G6P -> F6P

F6P + ATP-> FBP+ADP

FBP --> 2GAP

GAP + NAD 4-ADP -> 3PG + NADH + ATP

3PG ->PEP

PEP + ADP -> Pyr + ATP

Pyr + NAD + CoA -> AcCoA + NADH +CO2

PEP + CO2 -> OAA

AcCoA 4- ADP -> AcOH + ATP + CoA

AcCoA + OAA --> Cit + CoA

Cit —> Isocit

Isocit + NADP -> aKG + NADPH + CO2 aKG + NADPH + NH3 -> Glu + NADP aKG + NAD + CoA --> SucCoA + NADH + CO2

SucCoA + ADP -> Suc + ATP + CoA

Suc + FAD -> Fum +FADH

Fum —> Mal

Mal + NAD --> OAA +NADH

OAA + Glu — > Asp + aKG

Asp + ATP + NADPH -> ASA + ADP + NADP

ASA + Pyr --> DDP

DDP + NADPH - > THDP + NADP

THDP + SucCoA + Glu —> SDAP + aKG + CoA

SDAP --> mDAP + Suc mDAP —> Lys + CO2

Glu + ATP + ΝΉ3 -> Gin + ADP

Glu + 2NADPH + ATP --> Pro + 2NADP + ADP

Glu 4- 5ATP + NADPH 4- Gin 4- Asp + AcCoA + C02->Arg + 5ADP 4- NADP + aKG + Fum

ASA + NADPH -> Hse + NADP

Hse + SucCoA + Cys + mTHF -> Met + Suc + CoA + THF+ Pyr 4- NH3

Hse + ATP -> Thr + ADP

Thr 4- Glu + NADPH + Pyr -> Ile 4- aKG + NADP + NH3 + CO2

3PG -> Ser

Ser 4- THF —> Gly + mTHF

PEP + E4P 4- NADPH -> SKA 4- NADP

CHR --> PPA

PPA + NAD + Glu --> Tyr + NADH + CO2 + Akg

PPA + Glu -> Phe + CO2 + aKG

CHR + R5P + 2ATP + Gin -> Ind + Glu + Pyr + C02 + GAP 4-2ADP

2Pyr --> ALC alVA + Glu -> Vai 4- aKG

Vai + Pyr ->ALA4-aIVA aFVA 4- AcCoA + NAD + Glu -> Leu + NADH + C02 + aKG + CoA

PRPP + ATP + Gin + Glu + 2NAD -> His + ADP 4- Glu + aKG + 2NADH

Ser + AcCoA + H2S -> Cys 4- AcOH ··· ··· ·♦ · ····»· · *****··’·

SKA + PEP + ATP-> CHR + ADP ^: ··*’**' ^: *

Ind + Ser -> Trp

ALC + NADPH -> alVA + NADP + CO2

NADH --> NADPH

2NADH + 02 + 2ADP -> 2ATP + 2NAD 2FADH + 02 +ADP -> ATP + 2FAD

Asp + 2 ATP + ΝΉ3 -> Asn + 2 ADP

Isocit —> Glyox + Succ AcCoA + Glyox —> Mal + CoA

Mal + NAD -> Pyr + CO2 + NADH

R5P + 2 ATP --> PRPP + 2 ADP mTHF + NADP -> NADPH + THF + Form

HAD + Gly + THF -> mTHF + NADH + CO2 + NH3 ATP --> ADP

Lys -> Lysext

Síntese de biomassa (descrito abaixo) •· ·· ·· «·· • · · · · · • · · · · ·

[53] [54] [55] [56]r [57] [58] [59]r [60] [61] [62] [63]r [64] [65] [66] [67] [68]

RNA (21,33 %)

3,47 PRPP + 5,02 Gin + -5,02 Glu + 3,08 Gly + 6,17 Asp + 32,41 ATP + -32,41 ADP + 6,17 mTHF + -6,17 THF + 3,09 NAD + -3,09 NADH + 6,17 NADP + -6,17 NADPH + 1,16 CO2 + -3,47 Fum + -3,86 NH3

DNA (3,23 %)

3,37 PRPP + 4,88 Gin + -4,88 Glu + 3 Gly + 6 Asp + 31,5 ATP + -31,5 ADP + 7,12 mTHF + -7,12 THF + 3 NAD + -3 NADH + 3,75 NADP + -3,75 NADPH + 1,12 CO2 + 3,37 Fum+ -3,75 NH3

Fosfolipídeo (9,47 %)

20,8 AcCoA + -20,8 CoA + 1,95 GAP + 0,65 Ser + 44,2 ATP + - 44,2 ADP + 38,35 NADH + -38,35 NAD + -0,65 CO2

Peptidoglicano (2,60 %)

1,94 F6P + 1,94 AcCoA + -1,94 CoA + 1,94 Gin + -1,94 Glu + 2,91 Ala + 0,97 PEP +

0,97 Lys + 6,97 ATP + -6,97 ADP + -0,97 NADPH + -0,97 NADP + -0,97 CO2 Lipopolissacarídeo (3,54 %)

0,91 R5P + 0,91 F6P + 0,91 PEP + 15,47 AcCoA + -0,91 AcOH + -0,91 Glu + 0,91 Gin + 32,76 ATP+ 12,74 NADH

Proteína (57,23 %)

0,77 Gly + 0,96 Ala + 0,67 Vai + 0,85 Leu + 0,44 Ile + 0,44 Ser + 0,48 Thr + 0,30 Phe + 0,26 Tyr + 0,01 Trp + 0,15 Cys + 0,22 Met + 0,54 Lys + 0,46 Arg + 0,16 His + 0,46 Asp + 0,52 Glu + 0,46 Asn + 0,52 Gin + 0,34 Pro

Glicogênio (2, 60 %)

F6P + ATP (2) Seleção de fluxos livres e criação de combinações randômicas dos mesmos

Grupos de fluxo específicos foram determinados de acordo com o método de Reder (Reder, C.J., Theor. Biol., 135:175-201, 1988).

Selecionou-se um fluxo próximo de um ponto de ramificação foi selecionado de cada grupo. Sete fluxos livres selecionados são mostrados na Tabela 3. É possível usar uma única solução para um balanço de fluxo mediante

4·/

especificação destes 7 fluxos.

Tabela 3

Lista de fluxos livres para se obter distribuição randômica de fluxo

Número da reação	Nome da enzima ou nome da via de reação
2	glucose-6-fosfato desidrogenase
15	PEP carboxilase
ló	secreção de ácido acético
60	Isocitrato liase (ciclo de glioxilato)
62	Enzima málica
64	secreção de ácido fórmico
66	ATPase

Das cerca de 300.000 combinações de valores para 7 fluxos livres randômicos, aquelas que infringem qualquer limitação relativa a reatividade invertida e aquelas mostrando valores para ambas, lisina e biomassa, que não excedem valores de limiar a 20 % de cada valor máximo, foram excluídas. Como um resultado, criou-se um conjunto de dados de 5000 distribuições de fluxos metabólicos em uma região específica biologicamente 10 significativa. Os resultados foram representados por valores com base em absorção de 10 mmol de glucose, e criou-se uma matriz com 5000 fileiras correspondentes às distribuições de fluxo randômicas e 68 colunas, sendo que cada uma corresponde a um fluxo de reação.

(3) Análise de correlação por meio de análise multivariada e determinação de fluxos metabólicos que afetam produção de substância

Realizou-se regressão linear multivariada de uma matriz condensada incluindo resultados Z apenas de colunas correspondentes aos 7 fluxos livres. A função de regressão escalonada da caixa de ferramentas estatísticas MatLab foi usada para regressão linear multivariada. Com esta 20 técnica, produção de lisina ou biomassa pode ser derivada com uma função linear de 7 fluxos livres. Identificação destes 7 fluxos resulta em definição única do estado do sistema. Portanto, se todos os 7 termos forem usados como parâmetros, o coeficiente de correlação toma-se 1, indiciando um ajuste completo. No entanto, usualmente é possível obter um ajuste reíativamente

favorável com um número menor de termos do que na equação. Para experimentar várias combinações de termos, selecionou-se uma equação mostrando o melhor ajuste para cada número de termos contidos, por meio do uso da função escalonada do programa MatLab. Quanto ao rendimento de 5 biomassa, obteve-se um ajuste de R² = 0,980 com apenas 4 termos, isocitrato liase (ICL), enzima málica (MEZ), PEP carboxilase (PEPC) e ATPase.

Quando o número de termos é ainda mais diminuído, o valor R² é marcantemente diminuído, e não foi possível obter qualquer ajuste razoável.

Quando fluxos de reação são normalizados a um valor para 10 mmol de * 10 glucose e usados como a entrada, representou-se uma equação precisa como a seguir:

Equação 1) Rendimento de biomassa = 1,552 - 0,194 (ICL) + 0,184 (MEZ) - 0,194 (PEPC) - 0,011 (ATPase)

O rendimento de lisina pôde ser ajustado com um modelo incluindo os mesmos 4 parâmetros, e obteve-se o resultado de R² = 0,997. Além disso, mesmo que o termo para ATPase fosse excluído, R² diminui apenas a 0,856, e o ajuste ainda era favorável. Portanto, usou-se os seguintes 3 parâmetros para o modelo de lisina.

Equação 2) rendimento de lisina = -1,694 + 1,176 (ICL) - 1,095 (MEZ) + 1,162 (PEPC)

Finalmente, o rendimento total de carbono (átomos de C) definido com o número total de átomos de carbono que dirige para biomassa e lisina pôde ser ajustado com R² = 0,956 usando-se apenas o termo para 20 ATPase com a equação a seguir.

Equação 3) átomos de C = 34,3 - 0,314 (ATPase)

Estes resultados revelaram que o rendimento de biomassa se correlacionou positivamente com o fluxo de enzima málica, e que a produção de lisina se correlacionou positivamente com os fluxos de PEP carboxilase e 25 isocitrato liase (ciclo de glioxilato). A utilidade desta análise de regressão ··» ·· ·· ···· •» · * ·· • · · · · · «* · · ·· ♦» · · ·· ·· ·· ·· · ♦ »* ♦ * * · • ♦ · ♦ · ·· «94 _w J · · 4 9 - - pode ser mostrada nas Figs. 1 e 2. Quando os fluxos de isocitrato liase e enzima málica são considerados separadamente, não se observa qualquer correlação com produção de lisina como mostrado n a Fig. 1, (a) e (b). No entanto, quando estes fluxos são considerados como parte da equação de regressão 2), é possível observar uma correlação como mostrado na Fig. 2, e o efeito toma-se claro. Assim, pode-se revelar uma relação invisível entre fluxos metabólicos com esta técnica. Rendimento de um produto-alvo pode • 10 ser aperfeiçoado incrementando-se uma atividade responsável por um fluxo que mostra uma correlação positiva, e atenuando-se uma atividade responsável por um fluxo mostrando uma correlação negativa. Ou seja, a partir deste resultado é possível obter uma orientação para aperfeiçoar cepas bacterianas, e o incremento da PEP carboxilase ou isocitrato liase atividade ou atenuação da atividade de enzima málica mostrando uma correlação negativa é efetiva para produção de lisina. Com efeito, um exemplo de criação de uma cepa bacteriana mostrando uma capacidade aperfeiçoada de produção usando Escherichia coli foi divulgado na publicação internacional n° WOO1/53459, e, portanto, corroborou-se a utilidade da presente invenção.

Exemplo 2

Determinação do fluxo metabólico com relação à L-treonina

Por meio do mesmo exemplo do Exemplo 1, selecionou-se uma equação mostrando o melhor ajuste para cada número de termos, com relação à L-treonina. Quanto ao rendimento de biomassa, obteve-se um ajuste de R² = 0,986 com apenas 4 termos, isocitrato liase (ICL), enzima málica (MEZ), PEP carboxilase (PEPC) e ATPase.

Equação 4) Rendimento de biomassa = 1,260 - 0,101 (ICL) + 0,093 (MEZ) - 0,101 (PEPC) - 0,009 (ATPase)

O rendimento de treonina pôde ser ajustado com um modelo incluindo os mesmos 3 parâmetros, e obteve-se o resultado de R² = 0,937.

Equação 5) rendimento de treonina = -1,432 + 1,090 (ICL) - 1,080 o rendimento de biomassa (ΜΕΖ) + 1,087 (PEPC)

Estes resultados revelaram que correlacionou-se positivamente com o fluxo de enzima málica, e que a produção de treonina correlacionou-se positivamente com os fluxos de PEP carboxilase e isocitrato liase (ciclo de glioxilato). Portanto, com respeito à 5 produção de treonina, também foi possível obter uma orientação para aperfeiçoar cepas bacterianas, e o incremento da atividade de PEP carboxilase ou isocitrato liase ou atenuação da atividade de enzima málica apresentando uma correlação negativa é efetiva para produção de lisina.

* Exemplo 3 ^10 Construção de bactéria produtora de L-lisina deficiente de enzima málica

Cepa WC196 foi usada como a cepa de Escherichia coli produtora de L-lisina que é resistente a AEC (S-(2-aminoetil)cisteína) (publicação internacional n° WO 96/17930).

A enzima málica de Escherichia coli inclui o uso de NAD 15 como coenzima (EC 1.1.1.38) e o uso de NADP como coenzima (EC 1.1.1.40). Estas enzimas são codificadas pelos genes sfcA e b2463, respectivamente.

Os genes sfcA e b2463 são deletados por meio de uma combinação do método integração red-driven, que foi desenvolvido 20 originalmente por Datsenko e Wanner (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2000, 97, 6640-6645), e o método do sistema de excisão, derivado de fago lambda (J. Bacteriol. setembro de 2002; 184(18): 5200-3, Interactions between integrase and excisionase in the phage lambda excisive nucleoprotein complex. Cho EH, Gumport RI, Gardner JF.). De acordo com o método de integração red25 driven, a cepa com gene rompido pode ser construída em uma só etapa empregando-se o produto de PCR obtido com o uso de iniciadores de oligonucleotídeos sintéticos projetados para compreenderem uma parte de um gene alvejado em sua ponta 5' e uma parte de um gene de resistência a ·· · • ♦· • ·· · «··«·· ···* ·· ·· ···· • · · · · · • · · * · · • · · · · · • ·« · · · · • ··· »· · ··· *· ♦· ·· * antibiótico em sua ponta 3'. Além disso, o gene de resistência a antibiótico integrado pode ser removido combinando-se adicionalmente o sistema de excisão derivado de fago lambda com o método de integração red-driven.

(1) Rompimento do gene sfcA

Quanto ao modelo de PCR, usou-se o plasmídeo pMW118attL-Cm-attR (sua preparação é descrita abaixo). pMWl 18-attL-Cm-attR é um plasmídeo obtido por meio de inserção dos genes attL e attR que são os sítios de ligação de fago lambda, e um gene cat que é o gene de resistência a antibiótico para pMWl 18 (TaKaRa Bio). Os genes são inseridos na ordem de attL-cat-attR. A seqüência attL é mostrada na SEQ ID, NQ: 11 e a seqüência attR é mostrada na SEQ ID NO: 12.

Realizou-se PCR usando iniciadores mostrados nas SEQ ID

NOS: 1 e 2, e apresentando seqüências correspondentes a suas pontas 3' de attL e attR, e seqüências correspondentes a partes do gene sfcA em suas pontas 5', respectivamente.

O produto de PCR amplificado foi purificado em um gel de agarose e introduzido em Escherichia coli WC196 contendo plasmídeo pKD46 apresentando replicação sensível à temperatura, por meio de eletroporação. pKD46 (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2000, 97, 6640-6645) inclui um fragmento de DNA de 2.154 nt de fago lambda (acesso GenBank/EMBL n° J02459, 31088-33241) contendo genes (genes γ, β, e exo) codificando recombinase Red do sistema de recombinação homóloga de λ Red sob o controle do promotor P_araB induzível com arabinose. pKD46 é necessário para integrar o produto de PCR no cromossomo da cepa WC196.

Células competentes para eletroporação foram preparados como a seguir. A cepa de Escherichia coli WC196 que foi cultivada de um dia para o outro a 30°C em meio LB contendo 100 mg/1 de ampicilina, foi diluída 100 vezes com 5 ml de meio SOB (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, segundo edição, Cold Spring Harbor ♦

Laboratory Press (1989)) contendo ampicilina’‘(5Ü n^/17*e*L-âTabfrio*se (1 mM). O produto diluído foi cultivado a 30°C sob aeração até que a OD₆₀o se tomou cerca de 0,6, e, depois, concentrado, 100 vezes. Células foram lavadas três vezes com 10 % de glicerol para preparar células prontas para eletroporação. Eletroporação foi realizada com 70 μΐ de células competentes e cerca de 100 ng do produto de PCR. Adicionou-se 1 ml de meio SOC (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) às células submetidas a eletroporação. As células foram cultivadas a 37°C durante 2,5 horas, e, depois, cultivadas em placa sobre meio L-agar contendo 25 mg/1 de Cm (cloranfenicol) a 37°C para selecionar um recombinante resistente a Cm. Em seguida, para perder o plasmídeo pKD46, células foram subcultivadas duas vezes a 42°C em meio L-agar contendo Cm. As colônias obtidas são testadas quanto à resistência à ampicilina. Obtém-se uma cepa sensível à ampicilina sem pKD46.

A deleção do gene sfcA do mutante identificado pelo gene de resistência ao cloranfenicol foi confirmada por meio de PCR. A cepa deficiente de sfcA resultante foi denominada WC196Aá/c4 ::att-cat.

Para eliminar o gene att-cat que havia sido integrado no gene sfcA, usou-se um plasmídeo auxiliar pMW-intxis-ts (sua preparação é descrita abaixo). pMW-intxis-ts abriga um gene que codifica integrase (Int) (SEQ ID NO: 13) e um gene que codifica excisionase (Xis) (SEQ ID NO: 15) de fago lambda e mostra replicação sensível à temperatura. Por meio da introdução do pMW-intxis-ts, a recombinação ocorre devido ao reconhecimento de attL (SEQ ID NO: 11) e attR (SEQ ID NO: 12) no cromossomo, e o gene de resistência a antibiótico entre attL e attR é excisado, resultando em uma estrutura com que apenas seqüência attL ou attR permanece no cromossomo.

Células competentes da cepa WC196A5/cA: att-cat foram preparadas de acordo com um método ordinário, transformadas com o plasmídeo auxiliar pMW-intxis-ts, e cultivadas em placa a 30°C sobre meio de L-agar contendo 50 mg/1 de ampicilina para selecionar uma cepa resistente à ampicilina.

* Para perder o plasmídeo pMW-intxis-ts, células foram subcultivadas duas vezes a 42°C em meio L-agar. As colônias obtidas são testadas quanto à resistência à ampicilina e resistência ao cloranfenicol. Obtém-se uma cepa sensível à ampicilina e ao cloranfenicol sem att-cat e pMW-intxis-ts. Esta cepa foi denominada WC196As/íl4.

(2) Rompimento do gene b2463 * 10 Deleção do gene b2463 em cepas WC196 e WC196Ay/L4 foi * realizada de acordo com o método de (1) exceto que se usou iniciadores da SEQ ID NOS: 3 e 4 como iniciadores para romper b2463. Assim, obteve-se as cepas WC196Aà24d3 e WC196As/cz4A&2463. A cepa WC196Ay/^AZ?2465 obtida foi denominada WC196Amez.

(3) Preparação de modelo de PCR e plasmídeo auxiliar

O modelo de PCR pMW 118-attL-Cm-attR e o plasmídeo auxiliar pMW-intxis-ts foram preparados como a seguir:

(3-1) pMWl 18-attL-Cm-attR

Para construção do plasmídeo pMWll 8-attL-Cm-attR, usou20 se pMW118-attL-Tc-attR inicialmente. Quatro fragmentos de DNA foram ligados:

1) BgZII-EcoRI - o fragmento de DNA (120 bp) (SEQ ID NO: 11) portando attL que foi obtido por meio de amplificação com PCR da seqüência correspondente de cromossomo de E. coli W335O (continha pró-fago λ) usando-se os oligonucleotídeos PI e P2 (SEQ

ID NOS: 17 e 18) como iniciadores (estes iniciadores continham os sítios de reconhecimento subsidiários para endonucleases Bgfll e EcoRI);

2) Pstl-HindlII - o fragmento de DNA (182 bp) portando attR (SEQ

ID NO: 12) que foi obtido por meio de amplificação com PCR da seqüência correspondente do cromossomo de E. coli W3350 (continha pró-fago λ) usando-se os oligonucleotídeos P3 e P4 (SEQ ID NOS: 19 e 20) como iniciadores (estes iniciadores continham os sítios de reconhecimento subsidiários para endonucleases Psfl e

Hindlllf

3) o fragmento BgRl-HindlII grande (3916 bp) de pMWl 18-ter_rrnP. pMWl 18-ter_rrwR foi obtido por meio de ligação de três fragmentos de DNA:

• o fragmento grande (2359 bp) portando o fragmento ^tollEcoRIpol do pMW118, pMW118 foi digerido com endonuclease de restrição £coRI, tratado com fragmento de Klenow de DNA polimerase I e, depois, foi digerido com endonuclease de restrição Aatíl;

• o fragmento AatlI-BgUI pequeno (1194 bp) de pUC19 portando o gene bla para resistência à ampicilina (Ap^R) foi obtido por meio de amplificação com PCR da seqüência correspondente do plasmídeo pUC19 usando-se oligonucleotídeos P5 e P6 (SEQ ID NOS: 21 e 22) como iniciadores (estes iniciadores continham os sítios de reconhecimento subsidiários para endonuclease Aatíl e BgllT);

• o fragmento Bg/II-Püdpol pequeno (363 bp) do terminador de transcrição ter_rrnR foi obtido por meio de amplificação com PCR da região correspondente do cromossomo de E. coli MG1655 usando-se os oligonucleotídeos P7 e P8 (SEQ ID NOS: 23 e 24) como iniciadores (estes iniciadores continham os sítios de reconhecimento subsidiários durante endonucleases Bglíí e Pstí);

4) o fragmento EcóRI-PstI pequeno (1388 bp) (SEQ ID NO: 29) do pML-Tc-ter_thrL incluindo o gene de resistência à tetraciclina e o . terminador de transcrição ter_thrL, o pML-Tc-ter_thrL foi obtido da seguinte maneira:

• o pML-MSC (2001 #5) foi digerido com endonucleases de restrição Xbdí e BamHX e, depois, o fragmento grande (3342 bp) foi ligado com o fragmento (68 bp) Xbal-BamH\ portando terminador ter__thrL que foi obtido por meio de amplificação com PCR da região correspondente do cromossomo de E. coli MG1655 usando-se os oligonucleotídeos P9 e PIO (SEQ ID • 10 NOS: 25 e 26) como iniciadores (estes iniciadores continham os sítios de reconhecimento subsidiários para endonucleases A&óeI e BamHE), o produto desta reação foi o plasmídeo pMLter_thrL;

• em seguida, o pML-ter_thrL foi digerido com endonucleases de restrição Kpn\ e Xba\, depois tratado com fragmento de

Klenow de DNA polimerase I e, depois, foi ligado com o fragmento £<%>RI- Van91I pequeno (1317 bp) de pBR322 incluindo o gene para resistência à tetraciclina (pBR322 foi digerido com endonucleases de restrição £bc>RI e Van9R, depois tratado com fragmento de Klenow de DNA polimerase

I), o produto desta reação foi o plasmídeo pML-Tc-terJhrL;

de modo que se obteve pMWl 18-attL-Tc-attR.

pMW118-attL-Cm-attR foi construído por meio de ligação do fragmento BamHi-Xbal grande (4413 bp) de pMWl 18-attL-Tc-attR e BglU25 Xbal o fragmento de DNA artificial (1162 bp) incluindo o promotor P_A2 (o promotor precoce do fago T7), o gene cat para resistência ao cloranfenicol (Cm^R), obteve-se o terminador de transcrição ter_thrL e attR. Obteve-se o fragmento de DNA artificial (SEQ ID NO: 30) da seguinte maneira:

1. o pML-MSC (2001 #5) foi digerido com endonucleases de restrição «444 ♦ · · ···· k · · « ·· • · · · · · · • · · · 4 ··

4 <4 4· ··· ·:

• ·

Kpnl e 22>ízI e ligado com o fragmento Kpnl-Xbal pequeno (120 bp) que inclui o promotor P_A2 (o promotor precoce do fago T7) obtido por meio de amplificação com PCR da região correspondente do DNA de fago T7 os oligonucleotídeos PI 1 e P12 (SEQ ID NOS: 27 • 10 e 28) como iniciadores (estes iniciadores continham os sítios de reconhecimento subsidiários para endonucleases Kprií e Aúbózl), o produto desta reação foi o plasmídeo pML-P_A2-MCS;

2. em seguida, o sítio áM foi deletado do pML-P_A2-MCS, o produto desta reação foi o plasmídeo pML-P_A2-MCS (Α&αΓ) ;

3. em seguida, o fragmento BglWHindIII pequeno (928 bp) do pMLP_a2-MCS (XbaT) incluindo o promotor P_A2 (o promotor precoce do fago T7) e gene cat para resistência ao cloranfenicol (Cm^R) foi ligado com o fragmento HindlII-HindlII pequeno (234 bp) do pMW 118-attL-Tc-attR incluindo o terminador de transcrição ter_thrL e attR;

4. o fragmento de DNA artificial requerido (1156 bp) foi obtido por meio de amplificação com PCR com a mistura de reação de ligação usando-se os oligonucleotídeos P9 e P4 (SEQ ID NOS: 25 e 20) como iniciadores (estes iniciadores continham os sítios de reconhecimento subsidiários para endonucleases de restrição HindIII e Xbal).

(3-2) pMW-intxis-ts

Inicialmente, dois fragmentos de DNA foram amplificados usando-se DNA de fago λ (''Fermentas”) como um modelo. O primeiro 25 incluiu a região de nt 37168 a 38046 (SEQ ID NO: 39) e também continha o gene que codifica o repressor ci, promotores Prm e Pr, e seqüência líder do gene cro. Este fragmento foi obtido usando-se os oligonucleotídeos ΡΓ e P2' (SEQ ID NOS: 31 e 32) como iniciadores. O segundo fragmento portou genes xis-int do fago λ e compreendia a região do nt 27801 ao 29100 (SEQ ID NO:

^BB • Λ · · · ···· ·* ·· ··»>

‘.d£ :

• * *

η. ·

40). Oligonucleotídeos P3' e P4' (SEQ ID NOS: 33 e 34) foram usados como iniciadores para sua amplificação. Todos os iniciadores continham sítios de reconhecimento de endonuclease apropriados.

O fragmento amplificado com PCR que se obteve, portando o

repressor cl, foi digerido com endonuclease de restrição Ciai, tratado com fragmento de Klenow de DNA polimerase I, e, depois, digerido com endonuclease de restrição £c6»RI. O segundo fragmento amplificado com PCR foi digerido com endonucleases de restrição £coRI e PstfL Em seguida, o plasmídeo pMWPlac/acI-ts foi digerido com endonuclease BgAI, tratado com fragmento de Klenow de DNA polimerase I e, depois, digerido com endonuclease de restrição Ps 11. Um fragmento de vetor de pMWPlacUcI-ts foi eluído do gel de agarose e ligado com os fragmentos amplificados com

PCR digeridos.

Plasmídeo pMWPlac/acI-ts é um derivado do pMWPlac/^cI que consiste das seguintes partes: 1) BglA-HindlH - fragmento de DNA artificial incluindo o gene lacl sob o controle do promotor Pi_acuv5 e RBS de gene 10 do bacteriófago T7; 2) fragmento de DNA de Aatll-Bglll portando o gene para resistência à ampicilina (Ap^R) que foi obtido por meio de amplificação com PCR da seqüência correspondente do plasmídeo pUC19 20 usando-se oligonucleotídeos P5' e P6' (SEQ ID NOS: 35 e 36) como iniciadores (estes iniciadores continham os sítios de reconhecimento subsidiários para endonucleases Aatll e BgllT); 3) fragmento AatlA-HindlII compreendendo fragmento Aatll-Pvül do plasmídeo recombinante previamente construído - pMW118-terjrnB. O último plasmídeo foi 25 construído da seguinte maneira: o fragmento de DNA Pstl-HindlII portando o terminador terjrnB foi obtido por meio de amplificação com PCR da região correspondente do cromossomo de E. coli MG1655 usando-se os oligonucleotídeos P7' e P8' (SEQ ID NOS: 37 e 38) contendo sítios de reconhecimento de endonuclease apropriados como iniciadores. Antes da ligação, plasmídeo pMW118 e fragmento de DNA cL ter_rrnB „ (complemento, SEQ ID NO: 41) foram restritos com endonuclease Pvul ou

PstI respectivamente, tratados com fragmento de Klenow de DNA polimerase I para se obter as pontas rombudas e, depois, restrito com endonuclease AatU 5 ou HindIIL Para construir o pMWPlacZael-ts variante o fragmento AafllEcoBN do plasmídeo pMWPlac/acI foi substituído pelo fragmento AatlV EcóBN do plasmídeo pMAN997 incluindo os locus par, ori e gene repó do repliconpSClOl.

Exemplo 4 *10 Construção de bactéria produtora de L-treonina deficiente de enzima málica

Cepas deficientes de sfcA e b2463 foram construídas a partir da cepa VKPM B-5318. A cepa VKPM B-5318 foi depositada na Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika) em 19 de novembro de 1987, e recebeu um número de acesso of VKPM B15 5318.

Uma cepa que foi deficiente de um dos genes de enzima málica (mez) (sfcA, b2463) foi obtida da mesma maneira que no Exemplo 3 usando-se o método integração red-driven. Ou seja, isto foi realizado da mesma maneira usando-se o método integração red-driven no Exemplo 3, 20 exceto que a cepa B-5318 foi usada em lugar d cepa WC196 para se obter a cepa deficiente de sfcA ou b2463 como um mutante identificados por meio do gene de resistência ao cloranfenicol. A cepa B-5318 em que sfcA foi rompido, foi denominada B-5318As/c/t. A cepa B-5318 em que b2463 foi rompido, foi denominada B-531 %Nb2463. Uma cepa B-5318 com genes sfcA e b2463 25 rompidos, B-531 %NsfcANb2463 foi obtida da mesma maneira usando-se integração red-driven e o método do sistema de excisão como no Exemplo 3. A cepa 3-53\%ksfcANb2463 foi denominadaB-5318Amez.

Exemplo 5

Avaliação da cepa deficiente de enzima málica

<5-l> Avaliação da bactéria produtora de L-treonina que é cepa deficiente de b2463

Cada uma das cepas Β-5318Δ62463 e B-5318 foi cultivada sobre meio de agar LB (10 g/1 de triptona, 5 g/1 de extrato de levedura, 5 g/1 de NaCl e 15 g/1 de agar) contendo 20 mg/1 de sulfato de estreptomicina e 25 mg/1 de sulfato de canamicina a 37°C durante 24 horas, e células bacterianas foram tomadas de uma quinta parte da placa e inoculadas em 50 ml de meio líquido LB (10 g/1 de triptona, 5 g/1 de extrato de levedura, e 5 g/1 de NaCl) contendo 20 mg/1 de sulfato de estreptomicina e 25 mg/1 de sulfato de canamicina para realizar pré-cultura a 40°C e 144 rpm durante 3,5 horas.

Após o término da pré-cultura, o caldo de pré-cultura foi inoculado em 300 ml de um meio de cultura principal contido em um fermentador de jarro com volume de 1 litro numa quantidade de 10 % do volume do meio de cultura principal para realizar a cultura principal a 40°C e pH 7,0. A composição do meio de cultura principal é mostrada abaixo.

Tabela 4 [Composição do meio de cultura principal]

Glucose	100 g/1
Extrato de levedura	1,8 g/1
FeSO4 7H2O	18 mg/1
MnSO4 4H2O	18 mg/1
kh2po4	1,0 g/1
MgS04 7H20	0,36 g/1
(NH4) 2so4	4,5 g/1
NaCl	0,6 g/1
Sulfato de estreptomicina	20 mg/1
Sulfato de canamicina	25 mg/1

pH durante a cultura foi ajustado em 7,0 por meio da adição de gás de amônia.

Após o açúcar adicionado ter sido consumido, mediu-se a quantidade de L-treonina por meio de cromatografia líquida. Os resultados são mostrados na Tabela 5.

Quando se usou a cepa Β-5318ΔΖ>24ό3 deficiente de b2463, o são mostrados na Tabela 5.

Quando se usou a cepa Β-5318Δ02453 deficiente de b2463, o rendimento de treonina foi incrementado em comparação com a cepa de controle B-5318.

Tabela 5

Cepa	Rendimento de fermentação de L-treonina (%)
B-5318	31,4
Β-5318Δ&2463	32,1

<5-2> Avaliação de bactéria produtora de L-treonina que é cepa deficiente de

As cepas B-5318As/L4 e B5318 foram cultivadas da mesma maneira que em <5-l>.

Após o açúcar adicionado ter sido consumido, mediu-se a quantidade de L-treonina por meio de cromatografía líquida. Os resultados são mostrados na Tabela 6.

Quando se usou a cepa B-5318As/cA deficiente de sfcA, o rendimento de treonina foi incrementado, em comparação com a cepa de controle B-5318,

Tabela 6

Cepa	Rendimento de fermentação de L-treonina (%)
B-5318	31,4
B-5318A#cX	32,2

<5-3> Avaliação de bactéria produtora de L-lisina que é cepa deficiente de sfcA- e b2463

As cepas WC196, WC196As/L4 e WC196AÓ2453 foram transformadas de acordo com um método ordinário usando-se um plasmídeo para produção de lisina que abrigou genes dapA, dapB e dapC genes, pCABD2 (publicação internacional n° WO 01/53459) para se obter cepas WC196/pCABD2, WC196As/cA/pCABD2 e WC196Aò2463/pCABD2.

As cepas WC196/pCABD2, WC196As/cri/pCABD2 e WC196A62463/pCABD2 foram cultivadas a 37°C com meio L (como descrito abaixo) contendo 20 mg/1 de estreptomicina até OD₆₀o no meio

é dispensada em frações apropriadas e armazenada a -80°C. As frações armazenadas são denominadas estoques de glicerol.

Os estoques de glicerol foram descongelados, e 100 μΐ de cada um foram espalhados uniformemente sobre uma placa de L contendo 20 mg/1 5 de estreptomicina e cultivados a 37°C durante 24 horas. As células bacterianas foram tomadas de um oitavo da placa obtida e inoculadas em 20 ml de um meio de fermentação (como descrito abaixo) contendo 20 mg/1 de estreptomicina para cultivo a 37°C durante cerca de 16 horas em um agitador altemante. Após a cultura, mediu-se quantidades de lisina que se acumularam *10 no meio e a glucose remanescente com analisador Biotech Analyzer AS210 (Sakura Seiki).

Os resultados do acúmulo de L-lisina e o rendimento com subtração das células são mostrados na Tabela 7. O rendimento com subtração das células, que é um rendimento acumulado subtraindo-se a quantidade de 15 açúcar usada para formação de células bacterianas, é calculado com base assumindo-se que 50 % do açúcar consumido é usado para formação de células bacterianas.

Como se pode ver nos resultados, os rendimentos com subtração das células das cepas WC196Ay/o4/pCABD2 e 20 WC196AZ?2463/pCABD2 aumentam, em comparação com a cepa de controle

WC196/pCABD2.

Tabela 7

Cepa	Peso de células secas (g/l)	Rendimento com subtração das células (%)
hospedeiro	plasmídeo
WC196	pCABD2	2,5	100,0
WC196As/L4	pCABD2	2,3	101,6
WC196Aá2463	pCABD2	2,2	104,7

Os meios usados para avaliação da cepa produtora de L-lisina deficiente de sfcA ou b2463 são descritos abaixo. Os reagentes usados foram obtidos da Wako Pure Chemicals ou Nakarai Tesque, exceto se observado de outra forma. As composições dos meios usados são mostradas abaixo. pH foi

• * • 9 • · * · *

Ο ajustado com NaOH ou HC1 para todos os meios.

Tabela 8

(Meio L)
Bacto triptona (DIFCO)	10 g/1
Extrato de levedura (DIFCO)	5 g/1
NaCl	5 g/1
pH 7,0
[Esterilizado com vapor a 120°C durante 20 minutos]
(Meio de agar L)
Meio L
Agar bacto (DIFCO)	15 g/1
[Esterilizado com vapor a 120°C durante 20 minutos]
(Meio de produção de L-lisina para bactérias de Escherichia)
Glucose	40 g/1
Sulfato de amônio	24 g/1
Diidrogeno fosfato de potássio	1,0 g/1
Heptaidrato de sulfato de magnésio	1,0 g/1
Heptaidrato de sulfato de ferro (II)	0,01 g/1
Tetraidrato de sulfato manganoso	0,01 g/1
Extrato de levedura	2,0 g/1
Carbonato de cálcio (Pharmacopeia)	30 g/1
[Ajustado em pH 7,0 com hidróxido de potássio e esterilizado com vapor a 115°C durante 10 minutos desde que glucose e MgSOcdEO fossem esterilizados separadamente]

Exemplo 6

Avaliação de cepa (Amez) deficiente de enzima málica <6-l> Avaliação de bactéria produtora de L-treonina que é cepa deficiente de enzima málica

Cada uma das cepas B-5318Amez e B-5318 foram cultivadas em meio de agar LB (10 g/1 de triptona, 5 g/1 de extrato de levedura, 5 g/1 de NaCl e 15 g/1 de agar) contendo 20 mg/1 de sulfato de estreptomicina e 25 mg/1 de sulfato de canamicina a 37°C durante 24 horas, e células bacterianas foram tomadas de uma das placas e suspensas em 5 ml de meio LB líquido (10 g/1 de triptona, 5 g/1 de extrato de levedura, e 5 g/1 de NaCl). 0,5 ml da suspensão foi inoculado em 50 ml de meio LB líquido contendo 20 mg/1 de sulfato de estreptomicina e 25 mg/1 de sulfato de canamicina para realizar précultura a 39°C e 144 rpm durante 4 horas.

Após o término da pré-cultura, o caldo de pré-cultura foi inoculado em 300 ml de um meio de cultura principal contido em um fermentador de jarro com volume de 1 1 numa quantidade de 10 % do volume do meio de cultura principal para realizar a cultura principal a 39°C e pH 7,0.

A composição do meio de cultura principal é mostrada abaixo.

Tabela 9

[Composição do meio de cultura principal)
Glucose	27 g/1
Extrato de levedura	1,8 g/1
FeSO4 7H2O	18 mg/1
MnSO4 4H2O	18 mg/1
kh2po4	L5 g/1
MgSO4 7H2O	0,36 g/1
(NH4)2SO4	4,5 g/1
NaCl	0,6 g/1
Sulfato de estreptomicina	20 mg/1
Sulfato de canamicina	25 mg/1

pH durante a cultura foi ajustado em 7,0 por meio da adição de gás de amônia.

Após o açúcar adicionado ter sido consumido e exaurido, adicionou-se 600 g/1 de solução de glucose aquosa.

Após 24 horas de cultura principal, a quantidade de L-treonina foi medida por meio de cromatografia líquida. Os resultados são mostrados na Tabela 10.

Quando se usou a cepa B-5318Amez deficiente de enzima málica, o rendimento de treonina foi incrementado, em comparação com a cepa de controle B-5318.

Tabela 10

cepa	Rendimento de fermentação de L-treonina (%)
B-5318	35,9
B-5318Amez	38,3

<6-2> Avaliação de bactéria produtora de L-lisina que é cepa deficiente de enzima málica

As cepas WC196 e WC196Amez foram transformadas de acordo com um método ordinário com plasmídeo para produção de lisina, pCABD2 (publicação internacional n° WO 01/53459) para se obter WC196/pCABD2 e WC196Amez/pCABD2.

♦ ·♦ ♦· · ·

As cepas WC196/pCABD2 e WC196Amez/pCABD2’ foram * 10 cultivadas a 37°C com meio L (o mesmo usado no Exemplo 5 <5-3>) contendo 20 mg/1 de estreptomicina até OD₆₀o no meio tomou-se cerca 0,6. Em seguida, adicionou-se à cultura uma quantidade equivalente à cultura, de solução de glicerol a 40 %. Após agitação, a mistura é dispensada em frações apropriadas e armazenada a -80°C. As frações armazenadas são denominadas estoques de glicerol.

Os estoques de glicerol das cepas foram descongelados, e 100 μΐ de cada um foram espalhados uniformemente numa placa de L contendo 20 mg/1 de estreptomicina e cultivados a 37°C durante 24 horas.

As células bacterianas foram tomadas de um oitavo da placa obtida e inoculadas em 20 ml de um meio de fermentação (o mesmo usado no Exemplo 5 <5-3>) contendo 20 mg/1 de estreptomicina para cultivo a 37°C durante cerca de 48 horas com um agitador altemante. Após a cultura, quantidades de lisina que se haviam acumulado no meio e a glucose remanescente foram medidas com analisador Biotech Analyzer AS210 (Sakura Seiki).

Os resultados do acúmulo de L-lisina e rendimento com subtração das células são mostrados na Tabela 11. O rendimento com subtração das células é calculado com base numa suposição de que 50 % do açúcar consumido são usados para formação de células bacterianas. Como se pode ver nos resultados, o rendimento com subtração das células da cepa WC196Amez/pCABD2 aumenta, em comparação com aquele da cepa de controle WC196/pCABD2.

Tabela 11

Cepa	Peso de células secas (g/1)	Rendimento com subtração das células (%)
hospedeiro	plasmídeo
WC196	pCABD2	5,2	100,0
WC196Amez	pCABD2	5,8	103;4

Aplicabilidade Industrial

De acordo com a presente invenção, o rendimento de fermentação de L-lisina e/ou L-treonina é incrementado em um método de produzir L-lisina ou L-treonina por meio de fermentação usando-se uma bactéria Escherichia. Além disso, a presente invenção pode ser usada para 5 criar bactérias produtoras de L-lisina e/ou L-treonina pertencentes ao gênero Escherichia.

Claims (11)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método de produzir L-lisina ou L-treonina, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar uma bactéria em um meio de forma a produzir e secretar referida L-lisina ou L-treonina, e recolher a L-lisina ou Ltreonina do meio, em que a bactéria é uma bactéria Escherichia que apresenta uma capacidade de produzir L-lisina ou L-treonina, e sendo que referida bactéria é modificada de forma que uma enzima málica seja eliminada, em que o gene que codifica referida enzima málica compreende sfcA e/ou b2463.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que cada uma das enzimas málicas codificadas por sfcA e b2463 é eliminada.
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que um gene que codifica referida enzima málica no cromossomo bacteriano é mutado e/ou uma sequência de controle de expressão do mesmo é mutada de forma que a enzima málica seja eliminada.
4. 4. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que um gene que codifica referida enzima málica no cromossomo bacteriano é rompido.
5. 5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que referida enzima málica é uma proteína apresentando uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 6.
6. 6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que referida enzima málica é uma proteína apresentando uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 8.
7. 7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que um gene que codifica referida enzima málica é um DNA tendo uma sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO: 5.
8. 8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

   4, caracterizado pelo fato de que um gene que codifica referida enzima málica é um DNA tendo uma sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO: 7.
9. 9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a

   4, caracterizado pelo fato de que dita enzima málica compreende uma proteína tendo uma sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 6 e 5 uma proteína tendo uma sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO:

   8.
10. 10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, caracterizado pelo fato de que um gene que codifica dita enzima málica compreende um DNA tendo uma sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ

    10 ID NO: 5 e um gene que codifica a enzima málica é um DNA tendo uma sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO: 7.
11. 11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que dita bactéria é Escherichia coli.