KR102649245B1 - L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 l-아미노산의 생산방법 - Google Patents

L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 l-아미노산의 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 출원은 Ｌ-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용하여 L-아미노산을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 L-아미노산의 생산방법 {A microorganism of the genus Corynebacterium producing L-amino acids and method for producing L-amino acids using the same}
본 출원은 Ｌ-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용하여 L-아미노산을 생산하는 방법에 관한 것이다.
L-아미노산은 단백질의 기본 구성단위로서, 약품 원료와 식품첨가제, 동물 사료, 영양제, 살충제, 살균제 등의 중요 소재로 사용된다. 그 중에서도, L-라이신은 생체 내에서 전혀 생합성되지 않는 필수 아미노산이며, 성장촉진, 칼슘 대사, 위액분비촉진, 병에 대한 저항력 증가에 필요하다고 알려져 있다. 상기 L-라이신은 사료, 의약품, 식품 등에 다양하게 쓰이고 있다. 또한, L-트립토판도 필수 아미노산 중 하나이며, 사료 첨가제, 수액제, 약품 원료 및 건강식품 소재 등으로 사용되고 있다.　
한편, 코리네박테리움 속 균주(Corynebacterium), 특히 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)은 L-아미노산 및 기타 유용물질 생산에 많이 이용되고 있는 그람 양성의 미생물이다. 상기 아미노산의 생산을 위해 고효율 생산 미생물 및 발효공정기술 개발을 위한 다양한 연구들이 수행되고 있다. 예를 들어, 코리네박테리움 속 균주에서 아미노산 생합성에 관여하는 효소를 암호화하는 유전자의 발현을 증가시키거나 또는 아미노산 생합성에 불필요한 유전자를 제거하는 것과 같은 목적 물질 특이적인 접근 방법이 주로 이용되고 있다(한국 등록특허공보 제10-0924065호, 제1208480호,). 또한, 이러한 방법 이외에 아미노산 생산에 관여하지 않는 유전자를 제거하는 방법, 아미노산 생산에 있어 구체적으로 기능이 알려지지 않은 유전자를 제거하는 방법 또한 활용되고 있다. 그러나, 여전히 효율적으로 고수율로 L-아미노산을 생산할 수 있는 방법에 대한 연구의 필요성이 대두되고 있다.
본 출원의 하나의 목적은 글루코스-6-포스페이트 디하이드로게나제(Glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase) 및 프럭토키나제(Fructokinase)의 활성이 강화된, L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 하나의 목적은 상기 미생물을 이용한 Ｌ-아미노산의 생산방법을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다. 또한, 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 출원의 하나의 양태는 글루코스-6-포스페이트 디하이드로게나제(Glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase) 및 프럭토키나제(Fructokinase)의 활성이 강화된, L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물을 제공한다.
본 출원에서 용어, "L-아미노산"은 미생물이 각종 탄소원으로부터 대사과정을 거쳐 생산될 수 있는 모든 L-아미노산을 포함하며, 구체적으로는 L-라이신, L-아르기닌, L-히스티딘 등의 염기성 아미노산, L-발린, L-류신, L-글리신, L-이소류신, L-알라닌, L-프롤린, L-메티오닌 등의 비극성 아미노산, L-세린, L-트레오닌, L-시스테인, L-아스파라긴산, L-글루타민 등의 극성 아미노산, L-페닐알라닌, L-티로신, L-트립토판 등의 방향족 아미노산, L-글루탐산, L-아스파르트산 등의 산성 아미노산일 수 있다. 보다 구체적으로 본 출원에서 L-아미노산은 L-라이신(L-lysine) 또는 L-트립토판(L-tryptophan)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 용어, "글루코스-6-포스페이트 디하이드로게나제(Glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase, 이하, "Zwf")"는 대사 경로인 오탄당 인산 경로(pentose phosphate pathway)에 관여하며, 포도당 6-인산을 산화시키면서 NADP+를 NADPH로 환원시키는 역할을 하는 것을 의미한다.
본 출원의 목적상 상기 단백질은 'G6PD', 'G6PDH', '포도당-6-인산 탈수소효소' 또는 'Zwf'로도 명명될 수 있다. 상기 단백질을 코딩하는 유전자는 그 예로 zwf 유전자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 출원에서 'zwf 유전자'는 '글루코스-6-포스페이트 디하이드로게나제'를 코딩하는 유전자'와 혼용되어 사용될 수 있다. 또한, 상기 단백질은 일 예로 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 단백질과 동일한 단백질일 수 있으나, L-아미노산의 생산을 증가시킬 수 있는 것이라면 이에 제한되지 않는다.
상기 Zwf는 서열번호 1 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지거나, 서열번호 1 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지거나, 또는 서열번호 1 또는 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 서열번호 1 또는 서열번호 3의 서열은 공지의 데이터 베이스인 NCBI Genbank에서 그 서열을 확인할 수 있다.
상기 Zwf는 서열번호 2 또는 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 서열번호 2 또는 서열번호 4의 서열은 공지의 데이터 베이스인 NCBI Genbank에서 그 서열을 확인할 수 있다.
구체적으로, 상기 Zwf은 서열번호 1, 서열번호 3 및/또는 상기 서열번호 1, 서열번호 3과 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성(homology) 또는 동일성(identity)을 가지는 아미노산 서열일 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 Zwf에 상응하는 기능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 Zwf도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
본 출원의 용어, "프럭토키나제(Fructokinase, 이하, "CscK")"는 ATP 존재하에서 인산을 전이하여 D-프룩토오스-6-인산과 ADP를 생성하는 반응을 촉매하는 효소를 의미한다.
본 출원의 목적상 상기 단백질은 '과당인산화 효소', '프룩토키나아제', 또는 'CscK'로도 명명될 수 있다. 상기 단백질을 코딩하는 유전자는 그 예로 csck 유전자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 출원에서 'csck 유전자'는 '프럭토키나제를 코딩하는 유전자'와 혼용되어 사용될 수 있다. 또한, 상기 단백질은 일 예로 에스케리키아 콜라이 (Echerichia coli) 유래의 단백질과 동일한 단백질일 수 있으나, L-아미노산의 생산을 증가시킬 수 있는 것이라면 이에 제한되지 않는다.
상기 CscK는 서열번호 5의 아미노산 서열을 가지거나, 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지거나 또는 서열번호 5로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 서열번호 5의 서열은 공지의 데이터 베이스인 NCBI Genbank에서 그 서열을 확인할 수 있다.
상기 CscK는 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 서열번호 6의 서열은 공지의 데이터 베이스인 NCBI Genbank에서 그 서열을 확인할 수 있다.
구체적으로, 상기 CscK는 서열번호 5 및/또는 상기 서열번호 5와 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성(homology) 또는 동일성(identity)을 가지는 아미노산 서열일 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 CscK에 상응하는 기능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 CscK도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
본 출원의 용어 "상동성(homology) 및 동일성(identity)"은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된(conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(homologous) 또는 동일한(identical) 서열은 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상으로 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.
상기 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 상동성 또는 동일성은 예를 들면, 문헌에 의한 알고리즘 BLAST[참조: Karlin 및 Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)], 또는 Pearson에 의한 FASTA(참조: Methods Enzymol., 183, 63, 1990)을 사용하여 결정할 수 있다. 이러한 알고리즘 BLAST에 기초하여, BLASTN이나 BLASTX라고 불리는 프로그램이 개발되어 있다(참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov). 또한, 임의의 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology)일 수 있다.
구체적으로, 상기 "L-아미노산을 생산하는 미생물"은 야생형 미생물이나 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함한다. 구체적으로, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 불활성화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물로서, 목적하는 L-아미노산 생산을 위하여 유전적 변이가 일어나거나 L-아미노산 생산 활성을 강화시킨 미생물일 수 있다. 본 출원의 목적상, 상기 L-아미노산을 생산하는 미생물은 상기 Zwf 및 Csck 단백질의 발현 또는 활성이 강화되어, 목적하는 L-아미노산 생산능이 증가된 것을 특징으로 하며, 유전적으로 변형된 미생물 또는 재조합 미생물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 용어 단백질의 "활성 강화"는, 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 증가되는 것을 의미한다. 상기 "내재적 활성"은 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 단백질의 활성을 의미한다. 이는 "변형전 활성"과 혼용되어 사용될 수 있다. 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 "증가"한다는 것은, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 단백질의 활성에 비하여 향상된 것을 의미한다.
상기 "활성 증가"는 외래의 단백질을 도입하거나, 내재적인 단백질의 활성 강화를 통해 달성할 수 있으나, 구체적으로는 내재적인 단백질의 활성 강화를 통해 달성하는 것일 수 있다. 상기 단백질의 활성 강화 여부는 해당 단백질의 활성 정도, 발현량 또는 해당 단백질로부터 생산되는 산물의 양의 증가로부터 확인할 수 있다.
상기 활성 강화는 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용이 가능하며, 목적 단백질의 활성을 변형전 미생물보다 강화시킬 수 있는 한, 제한되지 않는다. 구체적으로, 분자생물학의 일상적 방법인 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려진 유전자 공학 및/또는 단백질 공학을 이용한 것일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다(예컨대, Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol. 2. 1-16, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012 등).
본 출원에 있어서, 상기 활성 강화의 대상이 되는 단백질, 즉, 목적 단백질은 Zwf 및 Csck 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 본 출원의 단백질 활성 강화는,
1) 단백질을 코딩하는 유전자의 세포 내 카피수 증가;
2) 단백질을 암호화하는 염색체상의 유전자 발현 조절 서열을 활성이 강력한 서열로 교체;
3) 단백질을 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역의 염기서열의 변형;
4) 단백질 활성이 강화되도록 아미노산 서열을 변형;
5) 단백질 활성이 강화되도록 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형 (예를 들어, 활성이 강화되도록 변형된 단백질을 코딩하도록 상기 단백질을 코딩하는 유전자 서열의 변형);
6) 단백질의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드의 도입;
7) 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화;
8) 단백질의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식; 또는
9) 상기 1) 내지 8) 중 선택된 2 이상의 조합일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 1) 단백질을 코딩하는 유전자의 세포 내 카피수 증가는, 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 해당 단백질을 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터를 숙주세포 내에 도입됨으로써 수행될 수 있다. 또는, 상기 유전자가 작동가능하게 연결된, 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 유전자를 삽입시킬 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입됨으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 목적 단백질을 발현시키기에 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 형태로 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 발현 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 벡터는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pDZ계, pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pDC, pDCM2, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.
본 출원에서 용어, "형질전환"은 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 상기 형질전환 하는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열 또는 발현조절영역과 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 작동 가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당업계의 절단 및 연결 효소 등을 사용하여 제작할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 2) 단백질을 암호화하는 염색체상의 유전자 발현 조절 서열을 활성이 강력한 서열로 교체하는 방법은, 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상기 발현 조절 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 가지는 핵산 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다. 상기 발현 조절 서열은, 특별히 이에 제한되지 않으나 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다. 상기 방법은 구체적으로 본래의 프로모터 대신 강력한 이종 프로모터를 연결시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
공지된 강력한 프로모터의 예에는 CJ1 내지 CJ7 프로모터(미국등록특허 US 7662943 B2), lac 프로모터, Trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, 람다 파아지 PR 프로모터, PL 프로모터, tet 프로모터 및 rmf 프로모터가 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않고 내재적 활성에 비해 강력한 프로모터로 치환하는 것은 모두 포함한다.
상기 3) 단백질을 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역의 염기서열 변형은, 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상기 단백질의 내재적 개시코돈을 상기 내재적 개시코돈에 비해 단백질 발현율이 더 높은 다른 개시코돈으로 치환하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 4) 및 5)의 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 활성을 더욱 강화하도록 폴리뉴클레오티드 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다. 상기 교체는 구체적으로 상동재조합에 의하여 상기 유전자를 염색체내로 삽입하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이때 사용되는 벡터는 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커 (selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 도입하고자 하는 유전자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 선택제 (selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
상기 6) 단백질의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드의 도입은, 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상기 단백질과 동일/유사한 활성을 나타내는 단백질을 암호화하는 외래 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드를 숙주세포 내로 도입하여 수행될 수 있다. 상기 외래 폴리뉴클레오티드는 상기 단백질과 동일/유사한 활성을 나타내는 한 그 유래나 서열에 제한 없이 사용될 수 있다. 또한 도입된 상기 외래 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 최적화된 전사, 번역이 이루어지도록 이의 코돈을 최적화하여 숙주세포 내로 도입할 수 있다. 상기 도입은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 숙주 세포 내에서 상기 도입된 폴리뉴클레오티드가 발현됨으로써 단백질이 생성되어 그 활성이 증가될 수 있다.
상기 7) 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화는, 내재 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 전사 또는 번역이 증가하도록 코돈 최적화한 것이거나, 또는 외래 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 최적화된 전사, 번역이 이루어지도록 이의 코돈을 최적화한 것일 수 있다.
상기 8) 단백질의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식하는 것은, 예를 들어 분석하고자 하는 폴리펩티드의 서열정보를 기지 단백질들의 서열정보가 저장된 데이터베이스와 비교함으로써 서열의 유사성 정도에 따라 주형 단백질 후보를 결정하고 이를 토대로 구조를 확인하여, 변형하거나 화학적으로 수식할 노출 부위를 선택하여 변형 또는 수식하는 것일 수 있다.
이와 같은 단백질의 활성 강화는, 상응하는 단백질의 활성 또는 농도가 야생형이나 변형전 미생물 균주에서 발현된 단백질의 활성 또는 농도를 기준으로 하여 증가되거나, 해당 단백질로부터 생산되는 산물의 양의 증가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 출원에서 용어, "변형전 균주" 또는 "변형전 미생물"은 미생물에 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이를 포함하는 균주를 제외하는 것이 아니며, 천연형 균주 자체이거나, 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화되기 전 균주를 의미한다. 본 출원에 있어서, 상기 형질 변화는 PheA의 활성 강화일 수 있다. 상기 "변형전 균주" 또는 "변형전 미생물"은 "비변이 균주", "비변형 균주", "비변이 미생물", "비변형 미생물" 또는 "기준 미생물"과 혼용될 수 있다.
본 출원에 있어서, 상기 기준 미생물은 L-아미노산을 생산하는 미생물이라면 특별히 제한되지 않으며, 야생형에 비해 L-아미노산 생산능이 강화된 변이 균주 역시 제한 없이 포함된다. 그 예로, L-라이신을 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P(한국 등록특허 제10-0159812호), KCCM10770P(한국 등록특허 제10-0924065호), CJ3P(Binder et al. Genome Biology 2012, 13:R40)균주 또는 L-트립토판을 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM12218P (한국 등록특허 제10-2035844호) 균주의 생합성 경로를 강화하기 위하여 상기 균주에 하나 이상의 유전적 변형이 추가된 균주가 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 목적상, 상기 L-아미노산을 생산하는 미생물은 전술한 방법으로 Zwf 및 Csck 활성이 강화되어, L-아미노산을 생산할 수 있는 미생물이라면 모두 가능하다. 본 출원에서 상기 "L-아미노산을 생산하는 미생물"은 "L-아미노산 생산 미생물", "L-아미노산 생산능을 갖는 미생물"과 혼용되어 사용될 수 있으며, 구체적으로 코리네박테리움 속 미생물 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 "코리네박테리움 속 미생물"은 모든 코리네박테리움 속 미생물을 포함할 수 있다. 구체적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 크루디락티스(Corynebacterium crudilactis), 코리네박테리움 데세르티(Corynebacterium deserti), 코리네박테리움 이피시엔스(Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 칼루내(Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 스테셔니스(Corynebacterium stationis), 코리네박테리움 싱굴라레(Corynebacterium singulare), 코리네박테리움 할로톨레란스(Corynebacterium halotolerans), 코리네박테리움 스트리아툼(Corynebacterium striatum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 폴루티솔리(Corynebacterium pollutisoli), 코리네박테리움 이미탄스Cxorynebacterium imitans), 코리네박테리움 테스투디노리스(Corynebacterium testudinoris) 또는 코리네박테리움 플라베스센스(Corynebacterium flavescens)일 수 있고, 더욱 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있다.
한편, 코리네박테리움 속 미생물이 L-아미노산을 생산할 수 있음은 이미 알려져 있었으나, 이의 생산능이 현저히 낮으며 생산 기작에 작용하는 유전자나 기작 원리가 모두 밝혀지지는 않은 상태이다. 따라서, 본 출원의 'L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물'은 천연의 야생형 미생물 자체, L-아미노산 생산 기작과 관련된 유전자의 활성을 강화시키거나 불활성시켜 향상된 L-아미노산 생산능을 가지게 된 코리네박테리움 속 미생물, 또는 외부 유전자의 활성을 도입 또는 강화시켜 향상된 L-아미노산 생산능을 가지게 된 코리네박테리움 속 미생물을 의미한다.
본 출원은 다른 하나의 양태로서, 본 출원에 따른 상기 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 미생물 또는 배지로부터 L-아미노산을 회수하는 단계를 포함하는, L-아미노산 생산방법을 제공한다.
본 출원에 따른 상기 미생물은 앞서 설명한 바와 같다.
본 출원의 방법에 있어서, 코리네박테리움 속 미생물의 배양은 당업계에 알려진 임의의 배양 조건 및 배양 방법이 사용될 수 있다.
본 출원에서 용어 "배양"은 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원에서 L-아미노산을 생산하는 미생물을 이용하여 L-아미노산을 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로, 상기 배양은 배치 공정, 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 코리네박테리움 균주에 대한 배양 배지는 공지되어 있다(예를 들면, Manual of Methods for General Bacteriology by the American Society for Bacteriology, Washington D.C., USA, 1981).
배지 중에서 사용될 수 있는 탄소원으로는 포도당, 사카로즈, 유당, 과당, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함된다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 배지에 포함되는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨을 함유하는 염이 포함될 수 있다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유할 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 미생물의 배양 중 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입할 수 있다. 배양물의 온도는 보통 20℃내지 45℃, 구체적으로는 25℃ 내지 40℃일 수 있다. 배양 시간은 원하는 L-아미노산의 생성량이 얻어질 때까지 계속할 수 있으나, 구체적으로는, 10 내지 160 시간일 수 있다. 그러나 이들 예시에 제한되는 것은 아니다.
본 출원은 본 출원의 방법에서 상기 배양하는 단계 이전, 배지를 준비하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
배양물로부터의 L-아미노산의 분리는 당업계에 알려진 통상적인 방법에 의하여 분리될 수 있다. 이러한 분리방법에는, 원심분리, 여과, 크로마토그래피 및 결정화 등의 방법이 이용될 수 있다. 예를 들면, 배양물을 저속 원심분리하여 바이오매스를 제거하고 얻어진 상등액을, 이온교환 크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 회수 단계는 정제 공정을 포함할 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 수행될 수 있다.
본 출원의 글루코스-6-포스페이트 디하이드로게나제(Glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase) 및 프럭토키나제(Fructokinase)의 활성이 강화된, L-아미노산을 생산하는 미생물은 L-아미노산을 고효율로 생산할 수 있다.
이하 본 출원을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 출원의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 강화 벡터의 제작
실시예 1-1. 코리네박테리움 글루타미쿰( Corynebacterium glutamicum ) ATCC13032 유래의 글루코스-6-포스페이트 디하이드로게나제 유전자(zwf)가 강화된 벡터의 제작
상기 유전자의 강화는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 트랜스포존(transposon)에 각각 SPL13 프로모터(미국 등록특허 US 10584338 B2 )와 코리네박테리움 암모니아게네스 유래의 CJ7 프로모터(미국 등록특허 US 7662943 B2)로 연결된 zwf를 넣어 효과를 확인하였다.
zwf는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 genomic DNA를 각각 주형으로 하였고, NCBI 염기서열(NC_003450.3) 정보를 바탕으로 서열번호 9, 10(표 1)와 서열번호 13, 14(표 2)의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 프라이머를 제작하고 표 4의 조건으로 PCR(SolgTM Pfu-X DNA polymerase)하여 벡터를 제작하기 위한 zwf 유전자 단편을 획득하였다.
pDZTn-Pspl13-zwf(C.gl13032) 프라이머 서열
No. 명칭 DNA 서열
서열번호 7 primer 1 GCAGAAGGAATGAGTTCCTCGGCGCTTCATGTCAACAATC
서열번호 8 primer 2 tgttttgatctcctccaataatc
서열번호 9 primer 3 tattggaggagatcaaaacaGTGAGCACAAACACG
서열번호 10 primer 4 GTTATTAGATGTCGGGCCCATTATGGCCTGCGCCAGGTGT
pDZTn-Pcj7-zwf(C.gl13032) 프라이머 서열
No. 명칭 DNA 서열
서열번호 11 primer 5 GCAGAAGGAATGAGTTCCTCagaaacatcccagcgctact
서열번호 12 primer 6 gagtgtttcctttcgttgggtac
서열번호 13 primer 7 cccaacgaaaggaaacactcGTGAGCACAAACACG
서열번호 14 primer 8 GTTATTAGATGTCGGGCCCATTATGGCCTGCGCCAGGTGT
벡터 및 균주 제작 확인 프라이머 서열
No. 명칭 DNA 서열
서열번호 47 primer 41 ACGACGCTGGTATTTCTCCC
서열번호 48 primer 42 TGATTGTCGATATGACCGGG
PCR 수행 조건
단계 온도 시간
Initialization 95℃ 10분
Denaturation 95℃ 30초
Annealing 62℃ 30초
Elongation 72℃ 1~2분
Post Elongation 72℃ 5분
SPL13 프로모터와 코리네박테리움 암모니아게네스 유래의 CJ7 프로모터를 얻기 위해서 서열번호 7과 8(표 1), 서열번호 11와 12(표 2) 프라이머를 이용하고 PCR(SolgTM Pfu-X DNA polymerase)을 수행하였다(표 4).
증폭된 SPL13, CJ7 프로모터 부위와 zwf 유전자 단편 및 ScaI 제한효소로 절단된 벡터 pDZTn (미국 등록특허 US 8932861 B2)를 깁슨 어셈블리 (DG Gibson et al., NATURE METHODS, VOL.6 NO.5, MAY 2009, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix) 방법을 이용하여 연결한 후, 대장균 DH5α에 형질전환하고 카나마이신 (25 mg/l) 이 포합된 LB 고체배지에 도말하였다. 목적한 유전자와 pDZTn이 연결된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별하기 위하여 서열번호 47와 48(표 3) 프라이머로 PCR을 수행하였다. 선별된 콜로니로부터 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였고, 상기 플라스미드를 pDZTn-Pspl13-zwf(C.gl13032), pDZTn-Pcj7-zwf(C.gl13032)으로 명명하였다.
실시예 1-2. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 유래의 글루코스-6-포스페이트 디하이드로게나제 유전자(zwf)가 강화된 벡터의 제작
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 유래의 zwf 강화 효과 확인은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 genomic DNA를 각각 주형으로 하였고, 미국 국립보건원 진뱅크(NIH GenBank)에 등록되어 있는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 유전자 및 주변 염기서열에 대한 정보를 바탕으로 서열번호 17, 18(표 5)와 서열번호 21, 22(표 6)의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 프라이머를 제작하고 표 4의 조건으로 PCR(SolgTM Pfu-X DNA polymerase)하여 벡터를 제작하기 위한 zwf 유전자 단편을 획득하였다.
pDZTn-Pspl13-zwf(C.gl13869) 프라이머 서열
No. 명칭 DNA 서열
서열번호 15 primer 9 GCAGAAGGAATGAGTTCCTCGGCGCTTCATGTCAACAATC
서열번호 16 primer 10 tgttttgatctcctccaataatc
서열번호 17 primer 11 tattggaggagatcaaaacaGTGAGCACAAACACG
서열번호 18 primer 12 GTTATTAGATGTCGGGCCCATTATGGCCTGCGCCAGGTGT
pDZTn-Pcj7-zwf(C.gl13869) 프라이머 서열
No. 명칭 DNA 서열
서열번호 19 primer 13 GCAGAAGGAATGAGTTCCTCagaaacatcccagcgctact
서열번호 20 primer 14 gagtgtttcctttcgttgggtac
서열번호 21 primer 15 cccaacgaaaggaaacactcGTGAGCACAAACACG
서열번호 22 primer 16 GTTATTAGATGTCGGGCCCATTATGGCCTGCGCCAGGTGT
SPL13 프로모터와 코리네박테리움 암모니아게네스 유래의 CJ7 프로모터를 얻기 위해서 서열번호 15과 16(표 5), 서열번호 19와 20(표 6) 프라이머를 이용하고 표 4의 조건으로 PCR(SolgTM Pfu-X DNA polymerase)을 수행하였다.
증폭된 SPL13, CJ7 프로모터 부위와 zwf 유전자 단편 및 ScaI 제한효소로 절단된 벡터 pDZTn (미국 등록특허 US 8932861 B2)를 깁슨 어셈블리 (DG Gibson et al., NATURE METHODS, VOL.6 NO.5, MAY 2009, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix) 방법을 이용하여 연결한 후, 대장균 DH5α에 형질전환하고 카나마이신 (25 mg/l) 이 포합된 LB 고체배지에 도말하였다. 목적한 유전자와 pDZTn이 연결된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별하기 위하여 서열번호 47와 48(표 3) 프라이머로 PCR을 수행하였다. 선별된 콜로니로부터 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였고, 이 플라스미드를 pDZTn-Pspl13-zwf(C.gl13869), pDZTn-Pcj7-zwf(C.gl13869) 으로 명명하였다.
실시예 1-3. 에스케리키아 콜라이 ( Echerichia coli ) 유래 프럭토키나제 유전자(cscK)가 강화된 벡터의 제작
에세리키아 유래의 프럭토키나제 유전자의 염기서열은 이미 명백하게 밝혀져 있으며 공개되어 있다. NCBI의 에스케리키아 콜라이 (Echerichia coli) W (CP002967)로부터 cscK 유전자 정보를 확보하였고, 이를 바탕으로 서열번호 25과 26(표 7), 서열번호 29와 30(표 8)의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 프라이머를 제작하고 표 4의 조건으로 PCR(SolgTM Pfu-X DNA polymerase)하여 벡터를 제작하기 위한 cscK 유전자 단편을 획득하였다.
SPL13 프로모터와 CJ7 프로모터를 얻기 위해서 서열번호 23과 24(표 7), 서열번호 27와 28(표 8) 프라이머를 이용하고 표 4의 조건으로 PCR(SolgTM Pfu-X DNA polymerase)을 수행하였다.
증폭된 SPL13, CJ7 프로모터 부위와 cscK(E.co) 유전자 단편 및 ScaI 제한효소로 절단된 벡터 pDZTn (미국 등록특허 US 8932861 B2)를 깁슨 어셈블리 (DG Gibson et al., NATURE METHODS, VOL.6 NO.5, MAY 2009, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix) 방법을 이용하여 연결한 후, 대장균 DH5α에 형질전환하고 카나마이신 (25 mg/l) 이 포합된 LB 고체배지에 도말하였다. 목적한 유전자와 pDZTn이 연결된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별하기 위하여 서열번호 47와 48(표 3) 프라이머로 PCR을 수행하였다. 선별된 콜로니로부터 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였고, 상기 플라스미드를 pDZTn-Pspl13-cscK(E.co), pDZTn-Pcj7-cscK(E.co)으로 명명하였다.
pDZTn-Pspl13-cscK(E.co) 프라이머 서열
No. 명칭 DNA 서열
서열번호 23 primer 17 GCAGAAGGAATGAGTTCCTCGGCGCTTCATGTCAACAATC
서열번호 24 primer 18 tgttttgatctcctccaataatc
서열번호 25 primer 19 tattggaggagatcaaaacaATGTCAGCCAAAGTA
서열번호 26 primer 20 GTTATTAGATGTCGGGCCCACTATTCCAGTTCTTGTCGAC
pDZTn-Pcj7-cscK(E.co) 프라이머 서열
No. 명칭 DNA 서열
서열번호 27 primer 21 GCAGAAGGAATGAGTTCCTCagaaacatcccagcgctact
서열번호 28 primer 22 gagtgtttcctttcgttgggtac
서열번호 29 primer 23 cccaacgaaaggaaacactcATGTCAGCCAAAGTATGGGT
서열번호 30 primer 24 GTTATTAGATGTCGGGCCCACTATTCCAGTTCTTGTCGAC
실시예 1-4. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 유래 zwf와 에스케리키아 콜라이 유래 cscK가 강화된 벡터의 제작
실시예 1-1과 실시예 1-3의 개별 유전자 강화효과를 확인하여, 두 유전자의 동시 강화 효과를 확인하고자 벡터를 제작하였다.
실시예 1-1의 pDZTn-Pspl13-zwf(C.gl13032)와 실시예 1-3의 pDZTn-Pcj7-cscK(E.co)을 각각 주형으로 하고, 서열번호 31, 32와 서열번호 33, 34(표 9)의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 프라이머를 제작하고 표 4의 조건으로 PCR(SolgTM Pfu-X DNA polymerase)하여 Pspl13-zwf(C.gl13032)와 Pcj7-cscK(E.co)을 얻었다. 증폭된 Pspl13-zwf(C.gl13032)와 Pcj7-cscK(E.co) 유전자 단편 및 ScaI 제한효소로 절단된 벡터 pDZTn (미국 등록특허 US 8932861 B2)를 깁슨 어셈블리 (DG Gibson et al., NATURE METHODS, VOL.6 NO.5, MAY 2009, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix) 방법을 이용하여 연결한 후, 대장균 DH5α에 형질전환하고 카나마이신 (25 mg/l) 이 포합된 LB 고체배지에 도말하였다. 목적한 유전자와 pDZTn이 연결된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별하기 위하여 서열번호 47와 48(표 3) 프라이머로 PCR을 수행하였다. 선별된 콜로니로부터 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였고, 상기 플라스미드를 pDZTn-Pspl13-zwf(C.gl13032)_Pcj7-cscK(E.co)으로 명명하였다.
위의 방법과 동일하게 실시예 1-1의 pDZTn-Pcj7-zwf(C.gl13032)와 실시예 1-3의 pDZTn-Pspl13-cscK(E.co)을 각각 주형으로 하고, 서열번호 35, 36(표 10)와 서열번호 37, 38(표 10)의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 프라이머를 제작하고 표 4의 조건으로 PCR(SolgTM Pfu-X DNA polymerase)하여 Pcj7-zwf(C.gl13032)와 Pspl13-cscK(E.co)을 얻었다. 증폭된 Pcj7-zwf(C.gl13032)와 Pspl13-cscK(E.co) 유전자 단편 및 ScaI 제한효소로 절단된 벡터 pDZTn (미국 등록특허 US 8932861 B2)를 깁슨 어셈블리 (DG Gibson et al., NATURE METHODS, VOL.6 NO.5, MAY 2009, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix) 방법을 이용하여 연결한 후, 대장균 DH5α에 형질전환하고 카나마이신 (25 mg/l) 이 포합된 LB 고체배지에 도말하였다. 목적한 유전자와 pDZTn이 연결된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별하기 위하여 서열번호 47와 48(표 3) 프라이머로 PCR을 수행하였다. 선별된 콜로니로부터 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였고, 상기 플라스미드를 pDZTn-Pcj7-zwf(C.gl13032)_Pspl13-cscK(E.co)으로 명명하였다.
pDZTn-Pspl13-zwf(C.gl13032)_Pcj7-cscK(E.co) 프라이머 서열
No. 명칭 DNA 서열
서열번호 31 primer 25 GCAGAAGGAATGAGTTCCTCGGCGCTTCATGTCAACAATC
서열번호 32 primer 26 ggatgtttctTTATGGCCTGCGCCA
서열번호33 primer 27 CAGGCCATAAagaaacatcccagcg
서열번호 34 primer 28 GTTATTAGATGTCGGGCCCACTATTCCAGTTCTTGTCGAC
pDZTn-Pcj7-zwf(C.gl13032)_Pspl13-cscK(E.co) 프라이머 서열
No. 명칭 DNA 서열
서열번호 35 primer 29 GCAGAAGGAATGAGTTCCTCagaaacatcccagcgctact
서열번호 36 primer 30 atgaagcgccTTATGGCCTGCGCCA
서열번호 37 primer 31 CAGGCCATAAggcgcttcatgtcaa
서열번호 38 primer 32 GTTATTAGATGTCGGGCCCACTATTCCAGTTCTTGTCGAC
실시예 1-5. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 유래 zwf와 에스케리키아 콜라이 유래 cscK가 강화된 벡터의 제작
실시예 1-2과 실시예 1-3의 개별 유전자 강화효과를 확인하여, 두 유전자의 동시 강화 효과를 확인하고자 벡터를 제작하였다.
실시예 1-2의 pDZTn-Pspl13-zwf(C.gl13869)와 실시예 1-3의 pDZTn-Pcj7-cscK(E.co)을 각각 주형으로 하고, 서열번호 39, 40와 서열번호 41, 42(표 11)의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 프라이머를 제작하고 표 4의 조건으로 PCR(SolgTM Pfu-X DNA polymerase)하여 Pspl13-zwf(C.gl13869)와 Pcj7-cscK(E.co)을 얻었다. 증폭된 Pspl13-zwf(C.gl13869)와 Pcj7-cscK(E.co) 유전자 단편 및 ScaI 제한효소로 절단된 벡터 pDZTn (미국 등록특허 US 8932861 B2)를 깁슨 어셈블리 (DG Gibson et al., NATURE METHODS, VOL.6 NO.5, MAY 2009, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix) 방법을 이용하여 연결한 후, 대장균 DH5α에 형질전환하고 카나마이신 (25 mg/l) 이 포합된 LB 고체배지에 도말하였다. 목적한 유전자와 pDZTn이 연결된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별하기 위하여 서열번호 47와 48(표 3) 프라이머로 PCR을 수행하였다. 선별된 콜로니로부터 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였고, 상기 플라스미드를 pDZTn-Pspl13-zwf(C.gl13869)_Pcj7-cscK(E.co)으로 명명하였다.
위의 방법과 동일하게 실시예 1-2의 pDZTn-Pcj7-zwf(C.gl13869)와 실시예 1-3의 pDZTn-Pspl13-cscK(E.co)을 각각 주형으로 하고, 서열번호 43, 44와 서열번호 45, 46(표 12)의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 프라이머를 제작하고 표 4의 조건으로 PCR(SolgTM Pfu-X DNA polymerase)하여 Pcj7-zwf(C.gl13869)와 Pspl13-cscK(E.co)을 얻었다. 증폭된 Pcj7-zwf(C.gl13869)와 Pspl13-cscK(E.co) 유전자 단편 및 ScaI 제한효소로 절단된 벡터 pDZTn (미국 등록특허 US 8932861 B2)를 깁슨 어셈블리 (DG Gibson et al., NATURE METHODS, VOL.6 NO.5, MAY 2009, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix) 방법을 이용하여 연결한 후, 대장균 DH5α에 형질전환하고 카나마이신 (25 mg/l) 이 포합된 LB 고체배지에 도말하였다. 목적한 유전자와 pDZTn이 연결된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별하기 위하여 서열번호 47와 48(표 3) 프라이머로 PCR을 수행하였다. 선별된 콜로니로부터 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였고, 이 플라스미드를 pDZTn-Pcj7-zwf(C.gl13869)_Pspl13-cscK(E.co)으로 명명하였다.
pDZTn-Pspl13-zwf(C.gl13869)_Pcj7-cscK(E.co) 프라이머 서열
No. 명칭 DNA 서열
서열번호 39 primer 33 GCAGAAGGAATGAGTTCCTCGGCGCTTCATGTCAACAATC
서열번호 40 primer 34 ggatgtttctTTATGGCCTGCGCCA
서열번호 41 primer 35 CAGGCCATAAagaaacatcccagcg
서열번호 42 primer 36 GTTATTAGATGTCGGGCCCACTATTCCAGTTCTTGTCGAC
pDZTn-Pcj7-zwf(C.gl13869)_Pspl13-cscK(E.co) 프라이머 서열
No. 명칭 DNA 서열
서열번호 43 primer 37 GCAGAAGGAATGAGTTCCTCagaaacatcccagcgctact
서열번호 44 primer 38 atgaagcgccTTATGGCCTGCGCCA
서열번호 45 primer 39 CAGGCCATAAggcgcttcatgtcaa
서열번호 46 primer 40 GTTATTAGATGTCGGGCCCACTATTCCAGTTCTTGTCGAC
실시예 2. 강화 균주의 제작
실시예 2-1. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 유래의 zwf가 강화된 라이신 생산 균주의 제작
실시예 1-1에서 제작된 pDZTn-Pspl13-zwf(C.gl13032), pDZTn-Pcj7-zwf(C.gl13032) 벡터를 각각 이용하여 L-라이신을 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P(한국 등록특허 제10-0159812호), KCCM10770P(한국 등록특허 제10-0924065호), CJ3P(Binder et al. Genome Biology 2012, 13:R40)균주를 전기천공법 (Appl. Microbiol.Biotechnol. (1999) 52:541-545) 으로 형질 전환한 후, 2차 교차 과정을 거쳐 트랜스포존 유전자의 사이에 Pspl13-zwf(C.gl13032)와 Pcj7-zwf(C.gl13032)이 각각 삽입된 균주를 획득하였다. 해당 유전자가 삽입된 위치를 포함한 인접 부위를 증폭할 수 있는 서열번호 47와 서열번호 48의 프라이머(표 3)를 이용하여 PCR 및 염기서열 분석을 수행하였고, 해당 유전적 조작을 확인하였다. 이렇게 수득한 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P_Pspl13-zwf(C.gl13032), KCCM11016P_Pcj7-zwf(C.gl13032), KCCM10770P_Pspl13-zwf(C.gl13032), KCCM10770P_Pcj7-zwf(C.gl13032), CJ3P_Pspl13-zwf(C.gl13032), CJ3P_Pcj7-zwf(C.gl13032)로 명명하였다.
실시예 2-2. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 유래의 zwf가 강화된 트립토판 생산 균주의 제작
실시예 1-2에서 제작된 pDZTn-Pspl13-zwf(C.gl13869), pDZTn-Pcj7-zwf(C.gl13869) 벡터를 각각 이용하여 L-트립토판을 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM12218P (한국 등록특허 제10-2035844호) 균주를 전기천공법 (Appl. Microbiol.Biotechnol. (1999) 52:541-545) 으로 형질 전환한 후, 2차 교차 과정을 거쳐 트랜스포존 유전자의 사이에 Pspl13-zwf(C.gl13869)와 Pcj7-zwf(C.gl13869)이 각각 삽입된 균주를 획득하였다. 해당 유전자가 삽입된 위치를 포함한 인접 부위를 증폭할 수 있는 서열번호 47와 서열번호 48의 프라이머(표 3)를 이용하여 PCR 및 염기서열 분석을 수행하였고, 해당 유전적 조작을 확인하였다. 이렇게 수득한 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM12218P_Pspl13-zwf(C.gl13869), KCCM12218P_Pcj7-zwf(C.gl13869)로 명명하였다.
실시예 2-3. 에스케리키아 콜라이 유래 cscK가 강화된 라이신, 트립토판 생산 균주의 제작
실시예 1-3에서 제작된 pDZTn-Pspl13-cscK(E.co), pDZTn-Pcj7-cscK(E.co) 벡터를 각각 이용하여 L-라이신을 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P(한국 등록특허 제10-0159812호), KCCM10770P(한국 등록특허 제10-0924065호), CJ3P(Binder et al. Genome Biology 2012, 13:R40) 균주와 L-트립토판을 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM12218P (한국 등록특허 제10-2035844호) 균주를 전기천공법 (Appl. Microbiol.Biotechnol. (1999) 52:541-545) 으로 형질 전환한 후, 2차 교차 과정을 거쳐 트랜스포존 유전자의 사이에 Pspl13-cscK(E.co)와 Pcj7-cscK(E.co)이 각각 삽입된 균주를 획득하였다. 해당 유전자가 삽입된 위치를 포함한 인접 부위를 증폭할 수 있는 서열번호 47와 서열번호 48의 프라이머(표 3)를 이용하여 PCR 및 염기서열 분석을 수행하였고, 해당 유전적 조작을 확인하였다. 이렇게 수득한 라이신 생산 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P_Pspl13-cscK(E.co), KCCM11016P_Pcj7-cscK(E.co), KCCM10770P_Pspl13-cscK(E.co), KCCM10770P_Pcj7-cscK(E.co), CJ3P_Pspl13-cscK(E.co), CJ3P_Pcj7-cscK(E.co)로 명명하고, 트립토판 생산 균주는 KCCM12218P_Pspl13-cscK(E.co), KCCM12218P_Pcj7-cscK(E.co)로 명명하였다.
실시예 2-4. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 유래의 zwf와 에스케리키아 콜라이 유래 cscK가 강화된 라이신 생산 균주의 제작
실시예 1-4에서 제작된 pDZTn-Pspl13-zwf(C.gl13032)_Pcj7-cscK(E.co), pDZTn-Pcj7-zwf(C.gl13032)_Pspl13-cscK(E.co) 벡터를 각각 이용하여 L-라이신을 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P(한국 등록특허 제10-0159812호), KCCM10770P(한국 등록특허 제10-0924065호), CJ3P(Binder et al. Genome Biology 2012, 13:R40) 균주를 전기천공법 (Appl. Microbiol.Biotechnol. (1999) 52:541-545) 으로 형질 전환한 후, 2차 교차 과정을 거쳐 트랜스포존 유전자의 사이에 Pspl13-zwf(C.gl13032)_Pcj7-cscK(E.co)와 Pcj7-zwf(C.gl13032)_ Pspl13-cscK(E.co)이 각각 삽입된 균주를 획득하였다. 해당 유전자가 삽입된 위치를 포함한 인접 부위를 증폭할 수 있는 서열번호 47와 서열번호 48의 프라이머(표 3)를 이용하여 PCR 및 염기서열 분석을 수행하였고, 해당 유전적 조작을 확인하였다. 이렇게 수득한 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P_Pspl13-zwf(C.gl13032)_Pcj7-cscK(E.co), KCCM11016P_Pcj7-zwf(C.gl13032)_Pspl13-cscK(E.co), KCCM10770P_ Pspl13-zwf(C.gl13032)_Pcj7-cscK(E.co), KCCM10770P_Pcj7-zwf(C.gl13032)_Pspl13-cscK(E.co), CJ3P_Pspl13-zwf(C.gl13032)_Pcj7-cscK(E.co), CJ3P_Pcj7-zwf(C.gl13032)_Pspl13-cscK(E.co)로 명명하였다.
실시예 2-5. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 유래의 zwf와 에스케리키아 콜라이 유래 cscK가 강화된 트립토판 생산 균주의 제작
실시예 1-5에서 제작된 pDZTn-Pspl13-zwf(C.gl13869)_Pcj7-cscK(E.co), pDZTn-Pcj7-zwf(C.gl13869)_Pspl13-cscK(E.co) 벡터를 각각 이용하여 L-트립토판을 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM12218P 균주 (한국 등록특허 제10-2035844호) 균주를 전기천공법 (Appl. Microbiol.Biotechnol. (1999) 52:541-545)으로 형질 전환한 후, 2차 교차 과정을 거쳐 트랜스포존 유전자의 사이에 Pspl13-zwf(C.gl13869)_Pcj7-cscK(E.co)와 Pcj7-zwf(C.gl13869)_Pspl13-cscK(E.co)이 각각 삽입된 균주를 획득하였다. 해당 유전자가 삽입된 위치를 포함한 인접 부위를 증폭할 수 있는 서열번호 47와 서열번호 48의 프라이머(표 3)를 이용하여 PCR 및 염기서열 분석을 수행하였고, 해당 유전적 조작을 확인하였다. 이렇게 수득한 트립토판 생산 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM12218P_Pspl13-zwf(C.gl13869)_Pcj7-cscK(E.co), KCCM12218P_Pcj7-zwf(C.gl13869)_Pspl13-cscK(E.co)로 명명하였다.
실시예 3. zwf, cscK 강화 균주의 L-라이신 또는 L-트립토판 생산능 비교
실시예 3-1. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 유래 zwf, 에스케리키아 콜라이 유래 cscK 강화 균주의 L-라이신 생산능 비교
실시예 2-4에서 제작된 KCCM11016P, KCCM10770P, CJ3P 기반 zwf(C.gl13032), cscK(E.co) 동시 강화 균주와 실시예 2-1에서 제작된 KCCM11016P, KCCM10770P, CJ3P 기반 zwf(C.gl13032) 강화 균주, 실시예 2-3에서 제작된 KCCM11016P, KCCM10770P, CJ3P 기반 cscK(E.co) 강화 균주를 각각 아래와 같은 방법으로 배양하여, 균체량, 당소모능, 라이신 생산능을 비교하였다.
먼저, 종 배지 25 ml을 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 각 균주를 접종하고, 30℃에서 20시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 생산 배지 24 ml을 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 1 ml의 종 배양액을 접종하고 37℃에서 42 시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 배양 종료 후 HPLC에 의해 L-라이신의 생산량을 측정하였다. 상기 실험은 3번 반복되었으며, 배양 결과(평균값)는 표 13, 14, 15에 나타내었다.
<종배지 (pH 7.0)>
원당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8g, MgSO4·7H2O 0.5 g, 바이오틴 0.1 mg, 티아민 HCl 1 mg, 칼슘-판토텐산 22 mg, 니코틴아미드 2 mg (증류수 1 리터 기준)
<생산배지 (pH 7.0)>
원당 45 g, (NH4)2SO4 15 g, 대두 단백질 10 g, 당밀 10 g, KH2PO4 0.55 g, MgSO4·7H2O 0.6 g, 바이오틴 0.9 mg, 티아민 염산염 4.5 mg, 칼슘-판토텐산 4.5 mg, 니코틴아미드 30 mg, MnSO4 9 mg, FeSO4 9 mg, ZnSO4 0.45 mg, CuSO4 0.45 mg, CaCO3 30 g (증류수 1리터 기준).
상기 제작된 zwf(C.gl13032), cscK(E.co) 단독 강화 또는 동시 강화 라이신 생산 균주들은 하기 표 13에 나타낸 바와 같이 모균주 KCCM11016P 대비 수율 4.3~15.2%P 향상 효과를 확인하였다. 코리네박테리움에서 라이신 1mol 생산을 위해서는 NADPH 4mol이 필요하기 때문에 라이신 생산균주에서 NADPH 공급능의 증가는 곧 수율 증가와 밀접한 연관성을 가진다 (Kjeld Raunkjaer Kjeldsen at el., Biotechnol. Bioeng., 2009 Feb 1;102(2):583-97.). 본 출원에서는 KCCM1016P 균주에 zwf 유전자를 단독 강화하여 NADPH 공급능을 향상시켰고, 이로써 생산량 0.9g/L 향상 효과를 확인하였다. 추가적으로 코리네박테리움의 원당 이용 시 발생하는 세포 내부 과당을 바로 이용할 수 있도록 cscK(E.co) 유전자를 도입하여 모균주 KCCM11016P 대비 15.2% 증가된 2.1/L 향상 효과를 확인하였다. 최종적으로 cscK 와 zwf를 동시 강화함으로써 zwf 유전자를 통한 환원력 공급능이 극대화되어 라이신 수율 향상 효과가 단독강화 대비 크게 증가함을 KCCM11016P_Pspl13-zwf(C.gl13032)_Pcj7-cscK(E.co) 균주 평가를 통해 확인하였다.
상기 유전자의 강화 효과는 표 14 와 15와 같이 다른 라이신 생산균주 KCCM10770P, CJ3P 에서도 동일한 효과를 보였다. 모두 zwf(C.gl13032), cscK(E.co) 단독강화 균주보다 동시 강화를 하였을 때, 각각 모균주 대비 22.1%, 27.1% 증가된 생산량 1.9g/L, 1.6g/L 향상된 결과를 보였다.
L-라이신 생산능 비교 (KCCM11016P 기반)
균 주 OD562 소모당(g/L) 라이신 생산량(g/L) 모균주 대비 (%)
KCCM11016P 45.6 50 13.8 100
KCCM11016P_Pspl13-zwf(C.gl13032) 46.1 50 14.7 106.5
KCCM11016P_Pcj7-zwf(C.gl13032) 46.7 50 14.5 105.1
KCCM11016P_Pspl13-cscK(E.co) 45.8 50 14.4 104.3
KCCM11016P_Pcj7-cscK(E.co) 46.4 50 14.4 104.3
KCCM11016P_ Pspl13-zwf(C.gl13032)_Pcj7-cscK(E.co) 46.3 50 15.9 115.2
KCCM11016P_ Pcj7-zwf(C.gl13032)_Pspl13-cscK(E.co) 45.9 50 15.6 113.0
L-라이신 생산능 비교 (KCCM10770P 기반)
균 주 OD562 소모당
(g/L)		 라이신 생산량 (g/L) 모균주 대비 (%)
KCCM10770P 63.3 50 8.6 100%
KCCM10770P_Pspl13-zwf(C.gl13032) 60.1 50 9.2 107.0%
KCCM10770P_Pcj7-zwf(C.gl13032) 61.5 50 9 104.7%
KCCM10770P_Pspl13-cscK(E.co) 65.5 50 9.1 105.8%
KCCM10770P_Pcj7-cscK(E.co) 66.1 50 9.4 109.3%
KCCM10770P_ Pspl13-zwf(C.gl13032)_Pcj7-cscK(E.co) 64.9 50 10.5 122.1%
KCCM10770P_ Pcj7-zwf(C.gl13032) _Pspl13-cscK(E.co) 64.1 50 10.2 118.6%
L-라이신 생산능 비교 (CJ3P 기반)
균 주 OD562 소모당
(g/L)		 라이신 생산량 (g/L) 모균주 대비 (%)
CJ3P 48.8 50 5.9 100%
CJ3P_ Pspl13-zwf(C.gl13032) 46.7 50 6.4 108.5%
CJ3P_Pcj7-zwf(C.gl13032) 46.5 50 6.3 106.8%
CJ3P_Pspl13-cscK(E.co) 50.1 50 6.1 103.4%
CJ3P_Pcj7-cscK(E.co) 48.6 50 6.6 111.9%
CJ3P_Pspl13-zwf(C.gl13032)Pcj7-cscK(E.co) 49.4 50 7.5 127.1%
CJ3P_Pcj7_zwf(C.gl13032)_Pspl13-cscK(E.co) 50.3 50 7.2 122.0%
실시예 3-2. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 유래의 zwf와 에스케리키아 콜라이 유래 cscK 강화 균주의 L-트립토판 생산능 비교
실시예 2-5에서 제작된 KCCM12218P 기반 zwf(C.gl13869), cscK(E.co) 동시 강화 균주와 실시예 2-2에서 제작된 KCCM12218P 기반 zwf(C.gl13869) 강화 균주, 실시예 2-3에서 제작된 KCCM12218P 기반 cscK(E.co) 강화 균주를 각각 아래와 같은 방법으로 배양하여, 균체량, 당소모능, 트립토판 생산능을 비교하였다.
먼저, 종 배지 25 ml을 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 각 균주를 접종하고, 30℃에서 20시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 생산 배지 24 ml을 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 1 ml의 종 배양액을 접종하고 37℃에서 42 시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 배양 종료 후 HPLC에 의해 L-트립토판의 생산량을 측정하였다. 상기 실험은 3번 반복되었으며, 배양 결과(평균값)는 표 16에 나타내었다.
<종배지 (pH 7.0)>
원당 20g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4 7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)
<생산배지 (pH 7.0)>
원당 30g, (NH4)2SO4 15 g, MgSO4 7H2O 1.2 g, KH2PO4 1 g, 효모추출물 5 g, 바이오틴 900 ㎍, 티아민 염산염 4500 ㎍, 칼슘-판토텐산 4500 ㎍, CaCO3 30 g (증류수 1리터 기준).
상기 제작된 zwf(C.gl13869), cscK(E.co) 유전자가 단독 강화된 트립토판 생산 균주들은 하기 표 16에 나타낸 바와 같이 모균주인 KCCM12218P 와 비교해 트립토판의 수율이 7.9 ~ 23.3 % 향상되었다. 특히 cscK 유전자의 발현 강화가 zwf 유전자의 강화보다 트립토판 수율 향상에 더 큰 영향을 주었으며, 이는 세포 내부에서 원당이 분해되며 생성된 과당의 일부분이 세포 외부로 배출되지 않고 프럭토즈-6-포스페이트로 전환되어 해당과정으로 유입되었으며, 이러한 현상으로 인해 배출된 과당이 유입되면서 사용되는 PEP pool을 소모하지 않고 트립토판 전구체로 사용한 것으로 판단된다. 또한 zwf 유전자의 발현으로 인한 트립토판 수율 강화는 트립토판의 전구체로 사용되는 PRPP 및 E4P 의 세포내 농도를 향상시킨 것으로 판단된다. 상기 두 유전자 zwf 및 cscK 가 동시 강화된 균주에서는 트립토판 수율 향상 인자들이 통합되면서 모균주인 KCCM12218P 와 비교해 트립토판의 생산량이 34% ~ 45% 향상되었으며, 상기 두 유전자가 단독으로 강화되었을 때와 비교해 월등하게 향상된 트립토판 수율을 확인하였다.
L-트립토판 생산능 비교 (KCCM12218P 기반)
균 주 OD562 소모당 (g/L) 트립토판
생산량 (g/L)		 모균주 대비 (%)
KCCM12218P 69.7 30 2.15 100
KCCM12218P_Pspl13-zwf(C.gl13869) 64.1 30 2.33 108.4
KCCM12218P_Pcj7-zwf(C.gl13869) 68.5 30 2.32 107.9
KCCM12218P _Pspl13-cscK(E.co) 61.9 30 2.65 123.3
KCCM12218P_Pcj7-cscK(E.co) 62.1 30 2.44 113.5
KCCM12218P_Pspl13_zwf(C.gl13869)_Pcj7-cscK(E.co) 61.1 30 2.89 134.4
KCCM12218P_Pcj7_zwf(C.gl13869)_Pspl13-cscK(E.co) 59.8 30 3.12 145.1
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> CJ CheilJedang Corporation <120> A microorganism of the genus Corynebacterium producing L-amino acids and method for producing L-amino acids using the same <130> KPA210026-KR <160> 48 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 484 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> zwf (C.gl 13032) <400> 1 Met Val Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu 1 5 10 15 Pro Ala Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe 20 25 30 Ser Leu Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu 35 40 45 Lys Tyr Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg 50 55 60 Glu Asn Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly 65 70 75 80 Asn Phe Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys 85 90 95 Arg Ile Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu 100 105 110 Ser Ile Pro Pro Asp Ser Phe Thr Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg 115 120 125 Ser Gly Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile 130 135 140 Glu Lys Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln 145 150 155 160 Leu Val Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His 165 170 175 Tyr Leu Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala 180 185 190 Asn Gln Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val 195 200 205 Gln Ile Thr Met Ala Glu Asp Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr 210 215 220 Tyr Asp Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile 225 230 235 240 Gln Leu Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro 245 250 255 Ala Gln Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro 260 265 270 Cys Tyr Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly 275 280 285 Trp Gln Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe 290 295 300 Asn Pro Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile 305 310 315 320 Thr Ser Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys 325 330 335 Arg Leu Gly Arg Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala 340 345 350 Pro His Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn 355 360 365 Ala Ile Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe 370 375 380 Gly Ser Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met 385 390 395 400 Asp Phe Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr 405 410 415 Glu Arg Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro 420 425 430 Thr Asn Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu 435 440 445 Glu Ala Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr 450 455 460 Trp Gly Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr 465 470 475 480 Trp Arg Arg Pro <210> 2 <211> 1545 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> zwf (C.gl 13032) <400> 2 gtgagcacaa acacgacccc ctccagctgg acaaacccac tgcgcgaccc gcaggataaa 60 cgactccccc gcatcgctgg cccttccggc atggtgatct tcggtgtcac tggcgacttg 120 gctcgaaaga agctgctccc cgccatttat gatctagcaa accgcggatt gctgccccca 180 ggattctcgt tggtaggtta cggccgccgc gaatggtcca aagaagactt tgaaaaatac 240 gtacgcgatg ccgcaagtgc tggtgctcgt acggaattcc gtgaaaatgt ttgggagcgc 300 ctcgccgagg gtatggaatt tgttcgcggc aactttgatg atgatgcagc tttcgacaac 360 ctcgctgcaa cactcaagcg catcgacaaa acccgcggca ccgccggcaa ctgggcttac 420 tacctgtcca ttccaccaga ttccttcaca gcggtctgcc accagctgga gcgttccggc 480 atggctgaat ccaccgaaga agcatggcgc cgcgtgatca tcgagaagcc tttcggccac 540 aacctcgaat ccgcacacga gctcaaccag ctggtcaacg cagtcttccc agaatcttct 600 gtgttccgca tcgaccacta tttgggcaag gaaacagttc aaaacatcct ggctctgcgt 660 tttgctaacc agctgtttga gccactgtgg aactccaact acgttgacca cgtccagatc 720 accatggctg aagatattgg cttgggtgga cgtgctggtt actacgacgg catcggcgca 780 gcccgcgacg tcatccagaa ccacctgatc cagctcttgg ctctggttgc catggaagaa 840 ccaatttctt tcgtgccagc gcagctgcag gcagaaaaga tcaaggtgct ctctgcgaca 900 aagccgtgct acccattgga taaaacctcc gctcgtggtc agtacgctgc cggttggcag 960 ggctctgagt tagtcaaggg acttcgcgaa gaagatggct tcaaccctga gtccaccact 1020 gagacttttg cggcttgtac cttagagatc acgtctcgtc gctgggctgg tgtgccgttc 1080 tacctgcgca ccggtaagcg tcttggtcgc cgtgttactg agattgccgt ggtgtttaaa 1140 gacgcaccac accagccttt cgacggcgac atgactgtat cccttggcca aaacgccatc 1200 gtgattcgcg tgcagcctga tgaaggtgtg ctcatccgct tcggttccaa ggttccaggt 1260 tctgccatgg aagtccgtga cgtcaacatg gacttctcct actcagaatc cttcactgaa 1320 gaatcacctg aagcatacga gcgcctcatt ttggatgcgc tgttagatga atccagcctc 1380 ttccctacca acgaggaagt ggaactgagc tggaagattc tggatccaat tcttgaagca 1440 tgggatgccg atggagaacc agaggattac ccagcgggta cgtggggtcc aaagagcgct 1500 gatgaaatgc tttcccgcaa cggtcacacc tggcgcaggc cataa 1545 <210> 3 <211> 514 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> zwf(C.gl 13869) <400> 3 Met Ser Thr Asn Thr Thr Pro Thr Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp 1 5 10 15 Pro Gln Asp Lys Arg Leu Pro Arg Ile Ala Gly Pro Ser Gly Met Val 20 25 30 Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala 35 40 45 Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu 50 55 60 Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr 65 70 75 80 Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg Glu Asn 85 90 95 Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe 100 105 110 Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg Ile 115 120 125 Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser Ile 130 135 140 Pro Pro Asp Ser Phe Thr Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg Ser Gly 145 150 155 160 Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile Glu Lys 165 170 175 Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln Leu Val 180 185 190 Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His Tyr Leu 195 200 205 Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gln 210 215 220 Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gln Ile 225 230 235 240 Thr Met Ala Glu Asp Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp 245 250 255 Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile Gln Leu 260 265 270 Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro Ala Gln 275 280 285 Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr 290 295 300 Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly Trp Gln 305 310 315 320 Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro 325 330 335 Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile Thr Ser 340 345 350 Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu 355 360 365 Gly Arg Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His 370 375 380 Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn Ala Ile 385 390 395 400 Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe Gly Ser 405 410 415 Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe 420 425 430 Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg 435 440 445 Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Thr Asn 450 455 460 Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu Glu Ala 465 470 475 480 Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Trp Gly 485 490 495 Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg 500 505 510 Arg Pro <210> 4 <211> 1545 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> zwf(C.gl 13869) <400> 4 gtgagcacaa acacgacccc caccagctgg acaaacccac tgcgcgaccc gcaggataaa 60 cgactccccc gcatcgctgg cccttccggc atggtgatct tcggtgtcac tggcgacttg 120 gctcgaaaga agctgcttcc cgccatttat gatctagcaa accgcggatt gctgccccca 180 ggattctcgt tggtaggtta cggccgccgc gaatggtcca aagaagactt tgaaaaatac 240 gtacgcgatg ccgcaagtgc tggtgctcgt acggaatttc gtgaaaatgt ttgggagcgc 300 ctcgccgagg gtatggaatt tgttcgcggc aactttgatg atgatgcagc tttcgacaac 360 ctcgctgcaa cactcaagcg catcgacaaa acccgcggca ccgccggcaa ctgggcttac 420 tacctgtcca ttccaccaga ttccttcaca gcggtctgcc accagctgga gcgttccggc 480 atggctgaat ccaccgaaga agcatggcgc cgcgtgatca tcgagaagcc tttcggccac 540 aacctcgaat ccgcacacga gctcaaccag ctggtcaacg cagtcttccc agaatcttct 600 gtgttccgca tcgaccacta tttgggcaag gaaacagttc aaaacatcct ggctctgcgt 660 tttgctaacc agctgtttga gccactgtgg aactccaact acgttgacca cgtccagatc 720 accatggctg aagatatcgg cttgggtgga cgtgctggtt actacgacgg catcggtgca 780 gcccgcgacg tcatccagaa ccacctgatc cagctcttgg ctctggttgc catggaagaa 840 ccaatttctt tcgtgccagc gcagctgcag gcagaaaaga tcaaggtgct ctctgcgaca 900 aagccatgct acccattgga taaaacctcc gctcgtggtc agtacgctgc cggttggcag 960 ggctctgagt tagtcaaggg acttcgcgaa gaagatggct tcaaccctga gtccaccact 1020 gagacttttg cggcttgtac cttagagatc acgtctcgtc gctgggctgg tgtgccgttc 1080 tacctgcgca ccggtaagcg tcttggtcgc cgtgttactg agattgccgt ggtgtttaaa 1140 gacgcaccac accagccttt cgacggcgac atgactgtat cccttggcca aaacgccatc 1200 gtgattcgcg tgcagcctga tgaaggtgtg ctcatccgct tcggttccaa ggttccaggt 1260 tctgccatgg aagtccgtga cgtcaacatg gacttctcct actcagaatc cttcactgaa 1320 gaatcacctg aagcatacga gcgcctcatt ttggatgcgc tgttggatga atccagcctc 1380 ttccccacca acgaggaagt ggaactgagc tggaagattc tggatccaat tcttgaagca 1440 tgggacgccg atggagaacc agaggattac ccagcaggta cgtggggtcc aaagagcgct 1500 gatgaaatgc tttcccgcaa cggtcacacc tggcgcaggc cataa 1545 <210> 5 <211> 304 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cscK(E.coli) <400> 5 Met Ser Ala Lys Val Trp Val Leu Gly Asp Ala Val Val Asp Leu Leu 1 5 10 15 Pro Glu Ser Asp Gly Arg Leu Leu Pro Cys Pro Gly Gly Ala Pro Ala 20 25 30 Asn Val Ala Val Gly Ile Ala Arg Leu Gly Gly Thr Ser Gly Phe Ile 35 40 45 Gly Arg Val Gly Asp Asp Pro Phe Gly Ala Leu Met Gln Arg Thr Leu 50 55 60 Leu Thr Glu Gly Val Asp Ile Thr Tyr Leu Lys Gln Asp Glu Cys His 65 70 75 80 Arg Thr Ser Thr Val Leu Val Asp Leu Asn Asp Gln Gly Glu Arg Ser 85 90 95 Phe Thr Phe Met Val Arg Pro Ser Ala Asp Leu Phe Leu Glu Thr Thr 100 105 110 Asp Leu Pro Cys Trp Arg His Gly Glu Trp Leu His Leu Cys Ser Ile 115 120 125 Ala Leu Ser Ala Glu Pro Ser Arg Thr Ser Ala Phe Thr Ala Met Thr 130 135 140 Ala Ile Arg His Ala Gly Gly Phe Val Ser Phe Asp Pro Asn Ile Arg 145 150 155 160 Glu Asp Leu Trp Gln Asp Glu His Leu Leu Arg Leu Cys Leu Arg Gln 165 170 175 Ala Leu Gln Leu Ala Asp Val Val Lys Leu Ser Glu Glu Glu Trp Arg 180 185 190 Leu Ile Ser Gly Lys Thr Gln Asn Asp Gln Asp Ile Cys Ala Leu Ala 195 200 205 Lys Glu Tyr Glu Ile Ala Met Leu Leu Val Thr Lys Gly Ala Glu Gly 210 215 220 Val Val Val Cys Tyr Arg Gly Gln Val His His Phe Ala Gly Met Ser 225 230 235 240 Val Asn Cys Val Asp Ser Thr Gly Ala Gly Asp Ala Phe Val Ala Gly 245 250 255 Leu Leu Thr Gly Leu Ser Ser Thr Gly Leu Ser Thr Asp Glu Arg Glu 260 265 270 Met Arg Arg Ile Ile Asp Leu Ala Gln Arg Cys Gly Ala Leu Ala Val 275 280 285 Thr Ala Lys Gly Ala Met Thr Ala Leu Pro Cys Arg Gln Glu Leu Glu 290 295 300 <210> 6 <211> 915 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cscK(E.coli) <400> 6 atgtcagcca aagtatgggt tttaggggat gcggtcgtag atctcttgcc agaatcagac 60 gggcgcctac tgccttgtcc tggcggcgcg ccagctaacg ttgcggtggg aatcgccaga 120 ttaggcggaa caagtgggtt tataggtcgg gtgggggatg atccttttgg tgcgttaatg 180 caaagaacgc tgctaactga gggagtcgat atcacgtatc tgaagcaaga tgaatgtcac 240 cggacatcca cggtgcttgt cgatctgaac gatcaagggg aacgttcatt tacgtttatg 300 gtccgcccca gtgccgatct ttttttagag acgacagact tgccctgctg gcgacatggc 360 gaatggttac atctctgttc aattgcgttg tctgccgagc cttcgcgtac cagcgcattt 420 actgcgatga cggcgatccg gcatgccgga ggttttgtca gcttcgatcc taatattcgt 480 gaagatctat ggcaagacga gcatttgctc cgcttgtgtt tgcggcaggc gctacaactg 540 gcggatgtcg tcaagctctc ggaagaagaa tggcgactta tcagtggaaa aacacagaac 600 gatcaggata tatgcgccct ggcaaaagag tatgagatcg ccatgctgtt ggtgactaaa 660 ggtgcagaag gggtggtggt ctgttatcga ggacaagttc accattttgc tggaatgtct 720 gtgaattgtg tcgatagcac gggggcggga gatgcgttcg ttgccgggtt actcacaggt 780 ctgtcctcta cgggattatc tacagatgag agagaaatgc gacgaattat cgatctcgct 840 caacgttgcg gagcgcttgc agtaacggcg aaaggggcaa tgacagcgct gccatgtcga 900 caagaactgg aatag 915 <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 1 <400> 7 gcagaaggaa tgagttcctc ggcgcttcat gtcaacaatc 40 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 2 <400> 8 tgttttgatc tcctccaata atc 23 <210> 9 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 3 <400> 9 tattggagga gatcaaaaca gtgagcacaa acacg 35 <210> 10 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 4 <400> 10 gttattagat gtcgggccca ttatggcctg cgccaggtgt 40 <210> 11 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 5 <400> 11 gcagaaggaa tgagttcctc agaaacatcc cagcgctact 40 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 6 <400> 12 gagtgtttcc tttcgttggg tac 23 <210> 13 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 7 <400> 13 cccaacgaaa ggaaacactc gtgagcacaa acacg 35 <210> 14 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 8 <400> 14 gttattagat gtcgggccca ttatggcctg cgccaggtgt 40 <210> 15 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 9 <400> 15 gcagaaggaa tgagttcctc ggcgcttcat gtcaacaatc 40 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 10 <400> 16 tgttttgatc tcctccaata atc 23 <210> 17 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 11 <400> 17 tattggagga gatcaaaaca gtgagcacaa acacg 35 <210> 18 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 12 <400> 18 gttattagat gtcgggccca ttatggcctg cgccaggtgt 40 <210> 19 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 13 <400> 19 gcagaaggaa tgagttcctc agaaacatcc cagcgctact 40 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 14 <400> 20 gagtgtttcc tttcgttggg tac 23 <210> 21 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 15 <400> 21 cccaacgaaa ggaaacactc gtgagcacaa acacg 35 <210> 22 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 16 <400> 22 gttattagat gtcgggccca ttatggcctg cgccaggtgt 40 <210> 23 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 17 <400> 23 gcagaaggaa tgagttcctc ggcgcttcat gtcaacaatc 40 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 18 <400> 24 tgttttgatc tcctccaata atc 23 <210> 25 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 19 <400> 25 tattggagga gatcaaaaca atgtcagcca aagta 35 <210> 26 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 20 <400> 26 gttattagat gtcgggccca ctattccagt tcttgtcgac 40 <210> 27 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 21 <400> 27 gcagaaggaa tgagttcctc agaaacatcc cagcgctact 40 <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 22 <400> 28 gagtgtttcc tttcgttggg tac 23 <210> 29 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 23 <400> 29 cccaacgaaa ggaaacactc atgtcagcca aagtatgggt 40 <210> 30 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 24 <400> 30 gttattagat gtcgggccca ctattccagt tcttgtcgac 40 <210> 31 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 25 <400> 31 gcagaaggaa tgagttcctc ggcgcttcat gtcaacaatc 40 <210> 32 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 26 <400> 32 ggatgtttct ttatggcctg cgcca 25 <210> 33 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 27 <400> 33 caggccataa agaaacatcc cagcg 25 <210> 34 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 28 <400> 34 gttattagat gtcgggccca ctattccagt tcttgtcgac 40 <210> 35 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 29 <400> 35 gcagaaggaa tgagttcctc agaaacatcc cagcgctact 40 <210> 36 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 30 <400> 36 atgaagcgcc ttatggcctg cgcca 25 <210> 37 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 31 <400> 37 caggccataa ggcgcttcat gtcaa 25 <210> 38 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 32 <400> 38 gttattagat gtcgggccca ctattccagt tcttgtcgac 40 <210> 39 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 33 <400> 39 gcagaaggaa tgagttcctc ggcgcttcat gtcaacaatc 40 <210> 40 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 34 <400> 40 ggatgtttct ttatggcctg cgcca 25 <210> 41 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 35 <400> 41 caggccataa agaaacatcc cagcg 25 <210> 42 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 36 <400> 42 gttattagat gtcgggccca ctattccagt tcttgtcgac 40 <210> 43 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 37 <400> 43 gcagaaggaa tgagttcctc agaaacatcc cagcgctact 40 <210> 44 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 38 <400> 44 atgaagcgcc ttatggcctg cgcca 25 <210> 45 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 39 <400> 45 caggccataa ggcgcttcat gtcaa 25 <210> 46 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 40 <400> 46 gttattagat gtcgggccca ctattccagt tcttgtcgac 40 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 41 <400> 47 acgacgctgg tatttctccc 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 42 <400> 48 tgattgtcga tatgaccggg 20

Claims (8)

  1. 글루코스-6-포스페이트 디하이드로게나제(Glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase) 및 프럭토키나제(Fructokinase)의 활성이 강화된, L-라이신(L-lysine) 또는 L-트립토판(L-tryptophan)을 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 글루코스-6-포스페이트 디하이드로게나제는 서열번호 1 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성되는, L-라이신(L-lysine) 또는 L-트립토판(L-tryptophan)을 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 프럭토키나제는 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성되는, L-라이신(L-lysine) 또는 L-트립토판(L-tryptophan)을 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 미생물 또는 배지로부터 L-라이신(L-lysine) 또는 L-트립토판(L-tryptophan)을 회수하는 단계를 포함하는, L-라이신(L-lysine) 또는 L-트립토판(L-tryptophan)의 생산방법.
  7. 삭제
  8. 삭제
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CN202280020233.0A CN117460831A (zh) 2021-03-08 2022-02-21 生产l-氨基酸的棒状杆菌属微生物和使用其生产l-氨基酸的方法
BR112023018087A BR112023018087A2 (pt) 2021-03-08 2022-02-21 Micro-organismo do gênero corynebacterium que produz l-aminoácido, método para produzir l-aminoácido, uso da produção do l-aminoácido e composição para produzir l-aminoácido
JP2023546556A JP2024505267A (ja) 2021-03-08 2022-02-21 Ｌ－アミノ酸を生産するコリネバクテリウム属微生物及びこれを用いたｌ－アミノ酸の生産方法
PCT/KR2022/002505 WO2022191467A1 (ko) 2021-03-08 2022-02-21 L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 l-아미노산의 생산방법
CA3211373A CA3211373A1 (en) 2021-03-08 2022-02-21 Microorganism of genus corynebacterium, producing l-amino acid, and method for producing l-amino acid using same
MX2023010584A MX2023010584A (es) 2021-03-08 2022-02-21 Microorganismo del genero corynebacterium para la produccion de l-aminoacido y procedimiento para la produccion de l-aminoacido utilizando el mismo.
EP22767363.9A EP4269598A1 (en) 2021-03-08 2022-02-21 Microorganism of genus corynebacterium, producing l-amino acids, and method for producing l-amino acids using same
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR0159812B1 (ko) 1995-12-20 1998-11-16 손경식 코리네박테리움 글루타미컴 씨에이치 77 및 이 균주를 이용한 l-라이신의 제조 방법
KR101073370B1 (ko) 2003-07-29 2011-10-17 아지노모토 가부시키가이샤 물질 생산에 영향을 미치는 대사 흐름을 결정하는 방법
KR100620092B1 (ko) 2004-12-16 2006-09-08 씨제이 주식회사 코리네박테리움 속 세포로부터 유래된 신규한 프로모터서열, 그를 포함하는 발현 카세트 및 벡터, 상기 벡터를포함하는 숙주 세포 및 그를 이용하여 유전자를 발현하는방법
WO2008033001A1 (en) 2006-09-15 2008-03-20 Cj Cheiljedang Corporation A corynebacteria having enhanced l-lysine productivity and a method of producing l-lysine using the same
US8932861B2 (en) 2008-04-10 2015-01-13 Cj Cheiljedang Corporation Transformation vector comprising transposon, microorganisms transformed with the vector, and method for producing L-lysine using the microorganism
KR101294935B1 (ko) * 2011-04-01 2013-08-08 씨제이제일제당 (주) 에세리키아 속 균주에서 유래된 프락토키나제 유전자가 도입된 코리네박테리움 속 균주 및 상기 균주를 이용하여 ｌ-아미노산을 생산하는 방법
JP6679803B2 (ja) 2016-08-31 2020-04-15 シージェイ チェイルジェダン コーポレーション 新規プロモーター及びその用途
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