BR112012030583B1

BR112012030583B1 - método para produzir um l-aminoácido

Info

Publication number: BR112012030583B1
Application number: BR112012030583-2A
Authority: BR
Inventors: Dmitriy Vladimirovich Filippov; Tatyana Viktorovna LEONOVA; Elvira Borisovna Voroshilova; Mikhail Markovich Gusyatiner; Mika Moriya; Yuri Nagai; Keiko Noguchi
Original assignee: Ajinomoto Co., Inc.
Priority date: 2010-06-03
Filing date: 2011-06-03
Publication date: 2020-12-08
Also published as: US20130078682A1; JP2013526841A; CN103003437B; EP2576802B1; EP2576802A1; CN103003437A; WO2011152565A1; US8722370B2; JP5846128B2; RU2010122647A; BR112012030583A2; RU2471870C2

Abstract

BACTÉRIA, E, MÉTODO PARA PRODUZIR UM L-AMINOÁCIDO A presente invenção fornece um método para produzir L-aminoácidos, tais como L-arginina, L-citrulina, e L-lisina, usando uma bactéria da família Enterobacteriaceare, particularmente uma bactéria que pertence ao gênero Escherichia ou Pantoea, que foi modificada para atenuar a expressão de um ou mais genes selecionadas do grupo que consiste dos genes pepA, pepB, e pepD.

Description

Campo técnico

A presente invenção se refere à indústria microbiológica, e especificamente a um método para produzir L-aminoácidos, tais como L- arginina, L-citrulina, e L-lisina. O método usa uma bactéria da família Enterobacteriaceae que foi modificada para atenuar expressão de gene(s) que codifica(m) peptidase.

Técnica Fundamental

Convencionalmente, L-aminoácidos são industrialmente produzidos pelos métodos de fermentação utilizando cepas de microrganismos a partir de fontes naturais, ou seus mutantes. Tipicamente, os microrganismos são modificados para realçar os rendimentos da produção de L-aminoácidos.

Muitas técnicas para realçar os rendimentos da produção de L- aminoácido foram relatados, incluindo pela transformação de microrganismos com DNA recombinante (ver, por exemplo, Patentes US N. 4.278.765). Outras técnicas para realçar os rendimentos de produção incluem aumentar as atividades de enzimas envolvidas na biossíntese de aminoácido e/ou dessensibilização das enzimas alvo da inibição de retroalimentação causada pelo L-aminoácido produzido (ver, por exemplo, a WO 95/16042 ou Patentes US Nos. 4.346.170; 5.661.012 e 6.040.160).

Outros modos para realçar os rendimentos da produção de L- aminoácido é atenuar a expressão de um gene ou vários genes que estão envolvidos na degradação do L-aminoácido alvo, genes que divergem dos precursores do L-aminoácido alvo do caminho biossintético do L-aminoácido, genes envolvidos na redistribuição dos fluxos de carbono, nitrogênio, e fosfato, e genes que codificam toxinas, etc.

O gene pepA (sinônimo carP) da Escherichia coli codifica a enzima multifuncional da aminopeptidase A (PepA), que combina propriedades catalíticas e reguladoras. Têm sido mostrado que, à parte da hidrólise de resíduos de aminoácido de terminal N de proteínas, a aminopeptidase A é requerida para a recombinação de DNA específica de sítio e monomerização de multímeros de plasmídeo (Stirling et al. (1989) EMBO J., 8, 1623-1627; Charlier et al (1995) J. Mol. Biol., 250, 392-406). Uma outra função da aminopeptidase A é a regulagem transcricional. PepA é uma proteína de ligação de DNA e está envolvida na repressão transcricional do operon carAB, que controla a síntese da carbamoil fosfato sintase (Roovers et al, (1988) J. Mol. Biol., 204, 857-865). A carbamoil fosfato é um intermediário dos caminhos sintéticos de L-arginina e pirimidina. A interação entre o fosfato de carbamoíla e L-ornitina resulta na formação da L-citrulina, que é convertida para L-arginina por intermédio da L-argininossuccinato.

O gene pepB (sinônimos yhfI, b2523, ECK2520) da Escherichia coli codifica a aminopeptidase B (PepB), que é uma das quatro cisteinilglicinases em E. coli. A aminopeptidase B cliva Leu-Gly, Leu-Gly- Gly, Cys-Gly e Leu-Gly in vitro (Miller et al. (1994) Journal of Bacteriology, 176, 610-619, Hermsdorf et al. (1979) International Journal of Peptide and Protein Research, 13, 146-151, Suzuki et al (2001) Bioscience. Biotechnology. Biochemistry., 5, 1549-1558). In vivo, a aminopeptidase B é, junto com as aminopeptidases A e N, e dipeptidase D, uma das quatro cisteinilglicinases (Suzuki et al., (2001) Journal of Bacteriology 2001; 183(4) 1489-1490). Os cátions bivalentes, incluindo alguns que não são estimuladores eficazes de atividade, estabilizam a aminopeptidase B contra a inativação por calor (Suzuki et al (2001) Bioscience. Biotechnology. Biochemistry., 5, 1549-1558).

O gene pepD (sinônimos pepH, carnosinase) de Escherichia coli codifica a peptidase D, que é uma dipeptidase capaz de decompor vários dipeptídeos com terminais N desbloqueados, incluindo a cisteinilglicina (Schroeder et al., (1994) FEMS Microbiology Letters, 123, 153-159, Suzuki et al., (2001) Journal of Bacteriology, 183, 1489-1490). As funções da peptidase D como um dímero de monômeros PepD (Klein et al., (1986) Journal of General Microbiology, 132, 2337-2343). A transcrição de pepD aumenta cinco vezes durante a privação de fosfato (Henrich et al., (1992) Molecular General Genetics, 232, 117-125).

Mas correntemente, não tem havido nenhum relato da atenuação da expressão do gene(s) que codifica(m) a peptidase para a produção de L-aminoácidos, tais como L-arginina, L-citrulina, e L-lisina.

Descrição da invenção

Os aspectos da presente invenção incluem realçar a produtividade de cepas que são capazes de produzir L-aminoácidos, tais como L-arginina, L-citrulina, ou L-lisina, e fornecer um método para produzir um tal L-aminoácido usando estas cepas.

Os aspectos acima foram obtidos pela descoberta de que a inativação de gene que codifica peptidase, pepA, pepB, e/ou pepD, pode realçar a produção de L-aminoácido, tal como L-arginina, e L-lisina. Além disso, visto que a L-citrulina é um intermediário no caminho biossintético da L-arginina, a produção deste L-aminoácido também pode ser realçada.

A presente invenção fornece uma bactéria da família Enterobacteriaceae tendo uma capacidade aumentada para produzir um L- aminoácido tal como L-arginina e L-citrulina.

É um aspecto da presente invenção fornecer uma bactéria da família Enterobacteriaceae tendo a capacidade para produzir L-aminoácido, em que a dita bactéria foi modificada para atenuar a expressão de um ou mais genes selecionados do grupo que consiste dos genes pepA, pepB, e pepD.

É um outro aspecto da presente invenção fornecer a bactéria como descrita acima, em que a expressão do(s) gene(s) é/são atenuado(s) pela inativação do(s) gene(s).

É um outro aspecto da presente invenção fornecer a bactéria como descrita acima, em que a bactéria pertence ao gênero Escherichia.

É um outro aspecto da presente invenção fornecer a bactéria de acordo com a reivindicação 3, em que a dita bactéria é Escherichia coli.

É um outro aspecto da presente invenção fornecer a bactéria como descrita acima, em que a bactéria pertence ao gênero Pantoea.

É um outro aspecto da presente invenção fornecer a bactéria como descrita acima, em que o L-aminoácido é selecionado do grupo que consiste de L-arginina, L-citrulina, e L-lisina.

É um outro aspecto da presente invenção fornecer a bactéria como descrita acima, em que a bactéria foi modificada para atenuar a expressão dos genes pepA, pepB, e pepD, e o L-aminoácido é L-lisina.

É um outro aspecto da presente invenção fornecer um método para produzir um L-aminoácido que compreende: cultivar a bactéria como descrita acima em um meio, e coletar o L-aminoácido do meio de cultura.

É um outro aspecto da presente invenção fornecer um método como descrito acima, em que o dito L-aminoácido é selecionado do grupo que consiste de L-arginina, L-citrulina, e L-lisina.

Breve Descrição dos Desenhos

A Figura 1 mostra as posições relativas do par de iniciadores P1 e P2 no plasmídeo pMW118-attL-Cm-attR.

A Figura 2 mostra a construção do fragmento de DNA cromossômico que inclui o gene pepA inativado.

Descrição das Formas de Realização

A presente invenção é descrita em detalhes abaixo.

1. Bactéria

A bactéria de acordo com a matéria individual presentemente divulgada é uma bactéria da família Enterobacteriaceae tendo capacidade para produzir L-aminoácido, tais como L-arginina, L-citrulina, ou L-lisina, em que a bactéria foi modificada para atenuar a expressão de um ou mais genes selecionados do grupo que consiste dos genes pepA, pepB, e pepD que codificam a aminopeptidase.

O termo “bactéria tendo capacidade para produzir um L- aminoácido” pode significar uma bactéria que é capaz de produzir e secretar L-aminoácido em um meio, quando a bactéria é cultivada no meio.

O termo “bactéria tendo capacidade para produzir um L- aminoácido” também pode significar uma bactéria que é capaz de produzir e causar o acúmulo de L-aminoácido tal como L-arginina, L-citrulina, ou L- lisina em um meio de cultura em uma quantidade maior do que uma cepa do tipo selvagem ou precursora da E. coli, tal como E. coli K-12, e pode significar que o microrganismo é capaz de causar acúmulo em um meio de uma quantidade não menor do que 0,5 g/L, em um outro exemplo não menor do que 1,0 g/L de L-aminoácido. O termo “L-aminoácido” pode incluir L- arginina, L-citrulina, e L-lisina.

A família das Enterobacteriaceae inclui bactérias que pertencem aos gêneros Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Pantoea, Photorhabdus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, Morganella Yersinia, etc.. Especificamente, aquelas classificadas como Enterobacteriaceae de acordo com a taxonomia usada na base de dados da NCBI (National Center for Biotechnology Information) (http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=543) podem ser usadas. Uma bactéria que pertence ao gênero Escherichia ou Pantoea são exemplos particulares.

A frase “uma bactéria que pertence ao gênero Escherichia” pode significar que a bactéria é classificada no gênero Escherichia de acordo com a classificação conhecida por uma pessoa habilitada na técnica da microbiologia. Um exemplo de uma bactéria que pertence ao gênero Escherichia é, mas não é limitada a, Escherichia coli (E. coli). A bactéria que pertence ao gênero Escherichia não é particularmente limitada, entretanto por exemplo, as bactérias descrita por Neidhardt, F. C. et al. (Escherichia coli e Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Tabela 1) são abrangidos.

A frase “uma bactéria que pertence ao gênero Pantoea” pode significar que a bactéria é classificada como o gênero Pantoea de acordo com a classificação conhecida por uma pessoa habilitada na técnica da microbiologia. Algumas espécies de Enterobacter agglomerans foram recentemente reclassificadas em Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii ou os semelhantes, com base na análise da sequência de nucleotídeo de 16S rRNA, etc.

A frase “a bactéria foi modificada para atenuar a expressão do gene pepA que codifica a aminopeptidase A” pode significar que a bactéria foi modificada em um tal modo que a bactéria modificada contém uma quantidade reduzida da aminopeptidase A, ou t também pode significar que a bactéria é incapaz de sintetizar a aminopeptidase A.

A frase “a bactéria foi modificada para atenuar a expressão do gene pepB que codifica a aminopeptidase B” pode significar que a bactéria foi modificada em um tal modo que a bactéria modificada contém uma quantidade reduzida da aminopeptidase B, ou também pode significar que a bactéria é incapaz de sintetizar a aminopeptidase B.

A frase “a bactéria foi modificada para atenuar a expressão do gene pepD que codifica a dipeptidase D” pode significar que a bactéria foi modificada em um tal modo que a bactéria modificada contém uma quantidade reduzida da dipeptidase D, ou também pode significar que a bactéria é incapaz de sintetizar a dipeptidase D.

A frase “inativação de um gene” pode significar que o gene modificado codifica uma proteína completamente não funcional. Também é possível que a região do DNA modificada é incapaz de expressar naturalmente o gene devido à deleção de uma parte do gene, à mudança da matriz de leitura do gene, à introdução(ões) com troca de sentido/mutação sem sentido, ou a modificação de uma região adjacente do gene, incluindo sequências que controlam a expressão do gene, tais como uma promotora, realçadora, atenuadora, sítio de ligação de ribossoma, etc.

A presença ou ausência de um gene no cromossoma de uma bactéria podem ser detectadas por métodos bem conhecidos, incluindo PCR, Southern blotting, e os semelhantes. Além disso, o nível de expressão do gene pode ser estimado pela medição da quantidade de mRNA transcrita a partir do gene usando vários métodos bem conhecidos, incluindo Northern blotting, RT-PCR quantitativa, e os semelhantes. A quantidade da proteína codificada pelo gene pode ser medida por métodos bem conhecidos, incluindo SDS- PAGE seguido por um ensaio de imunoblotting (análise de Western blotting), e os semelhantes.

O gene pepA (sinônimos: carP, b4260, ECK4253) que codificam a aminopeptidase A da Escherichia coli foi elucidado (nucleotídeos complementares para os nucleotídeos 4482463 a 4483974 na sequência do Acesso no GenBank NC_000913,2). O gene pepA da E. coli está localizado no cromossoma entre os genes holC e lptF. As sequências de nucleotídeo do gene pepA, e a sequência de aminoácido da proteína codificada PepA pelo gene pepA, são mostrados na SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, respectivamente.

O gene pepB (sinônimos: yfhI, b2523, ECK2520) que codificam a aminopeptidase B da Escherichia coli foi elucidado (nucleotídeos complementares aos nucleotídeos 2653097 a 2654380 na sequência do Acesso no GenBank EG12310). O gene pepB da E. coli está localizado no cromossoma entre os genes iscX e sseB. A sequência de nucleotídeos do gene pepB, e a sequência de aminoácido da proteína PepB codificada pelo gene pepB, são mostradas na SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, respectivamente.

O gene pepD (sinônimos: pepH, b0237, ECK0238) que codificam a peptidase D da Escherichia coli foi elucidado (nucleotídeos complementares aos nucleotídeos 254259 a 255716 na sequência do Acesso no GenBank 10695). O gene pepD da E. coli está localizado no cromossoma entre os genes gpt e prfH. As sequências de nucleotídeo do gene pepD, e a sequência de aminoácido da proteína PepD codificada pelo gene pepD, são mostradas na SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10, respectivamente.

Visto que pode haver alguma diferença nas sequências de DNA entre os gêneros ou cepas da família Enterobacteriaceae, o gene a ser inativado no cromossoma não é limitado ao gene mostrado na SEQ ID NO: 1, 7, ou 9, mas pode incluir genes homólogos para SEQ ID No: 1, 7, ou 9, e que codificam uma proteína variante. A frase “proteína variante” pode significar uma proteína que tem mudanças na sequência, sejam elas deleções, inserções, adições, ou substituições de aminoácidos, mas ainda mantém a atividade da proteína. O número de mudanças na variante de proteína depende da posição na estrutura tridimensional da proteína ou do tipo de resíduos de aminoácido. O mesmo pode ser de 1 a 30, em um outro exemplo de 1 a 15, e em um outro exemplo de 1 a 5. Estas mudanças nas variantes podem ocorrer nas regiões da proteína que não são críticas para a função da proteína. Isto é porque alguns aminoácidos têm alta homologia entre si de modo que a estrutura tridimensional ou atividade não seja afetada por uma tal mudança. Portanto, a variante de proteína codificada pelo gene pode ter uma homologia de não menos do que 80 %, em um outro exemplo não menor do que 90 %, em um outro exemplo não menor do que 95 %, em um outro exemplo não menor do que 98 %, e em um outro exemplo não menor do que 99 %, com relação à sequência de aminoácido inteira mostrada na SEQ ID NO. 2, 8, ou 10, contanto que a proteína antes da inativação seja capaz de funcionar como aminopeptidase ou dipeptidase. Neste relatório descritivo, o termo “homologia” também pode referir-se à “indentidade”.

Homologia entre duas sequências de aminoácido pode ser determinada usando métodos bem conhecidos, por exemplo, o programa de computador BLAST 2.0, que calcula três parâmetros: contagem, indentidade, e similaridade.

Além disso, os genes pepA, B, ou D podem ser uma variante, que hibridiza com a sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 1, 7, ou 9, ou uma sonda que pode ser preparada a partir da sequência de nucleotídeo, sob condições severas, contanto que a mesma codifique uma proteína funcional antes da inativação. As “condições severas” incluem aquelas, sob as quais um híbrido específico, por exemplo, um híbrido tendo homologia de não menos do que 60 %, em um outro exemplo não menor do que 70 %, em um outro exemplo não menor do que 80 %, em um outro exemplo não menor do que 90 %, em um outro exemplo não menor do que 95 %, em um outro exemplo não menor do que 98 %, e em um outro exemplo não menor do que 99 % é formado e um híbrido não específico, por exemplo, um híbrido tendo homologia mais baixa do que a acima, não é formado. Por exemplo, condições severas são exemplificadas lavando-se uma vez, em um outro exemplo duas ou três vezes em uma concentração salina que corresponde a 1x SSC, 0,1 % de SDS, preferivelmente 0,1x SSC, 0,1 % de SDS a 60° C. A duração da lavagem depende do tipo de membrana usada para o blotting e, como uma regra, deve ser a que é recomendada pelo fabricante. Por exemplo, a duração recomendada de lavagem para a membrana de náilon Hybond® N+ (Amersham) sob condições severas é de 15 minutos. A lavagem pode ser realizada de 2 a 3 vezes. O comprimento da sonda pode ser adequadamente selecionada dependendo das condições de hibridização, e é usualmente de 100 bp a 1 kbp.

A expressão de um gene pode ser atenuada pela introdução de uma mutação no gene no cromossoma de modo que a atividade intracelular da proteína codificada pelo gene seja diminuída quando comparada com uma cepa não modificada. As mutações que resultam em atenuação da expressão do gene incluem a substituição de uma base ou mais para causar uma substituição de aminoácido na proteína codificada pelo gene (com mutação de troca de sentido), introdução de um códon de parada (mutação sem sentido), deleção de uma ou duas bases para causar uma mudança de matriz, inserção de um gene de resistência de medicamento, ou deleção de uma parte do gene ou do gene inteiro (Qiu, Z. e Goodman, M. F., J. Biol. Chem., 272, 8611-8617 (1997); Kwon, D. H. et al, J. Antimicrob. Chemother., 46, 793-796 (2000)). A expressão do gene pepA também pode ser atenuada pela modificação de uma sequência que regula a expressão tal como a promotora, a sequência de Shine- Dalgarno (SD), etc. (WO95/34672, Carrier, T. A. e Keasling, J. D., Biotechnol Prog 15, 58-64 (1999)).

Por exemplo, os métodos que seguem podem ser utilizados para introduzir uma mutação pela recombinação de gene. Um gene mutante que codifica uma proteína mutante com atividade diminuída pode ser preparada, e a bactéria a ser modificada pode ser transformada com um fragmento de DNA contendo o gene mutante. Depois, o gene nativo no cromossoma é substituído com o gene mutante pela recombinação de homólogos, e a cepa resultante pode ser selecionada. A substituição de gene usando recombinação de homólogos pode ser conduzida pela utilização de um DNA linear, que é conhecido como “integração Red-driven” (Datsenko, K. A. e Wanner, B. L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 12, p 6640-6645 (2000)), ou pela utilização de um plasmídeo contendo uma origem de replicação sensível à temperatura (Patente US 6.303.383 ou JP 05-007491A). Além disso, a mutação específica de sítio pela substituição de gene também pode ser incorporada usando recombinação de homólogos tal como apresentada acima usando um plasmídeo que é incapaz de replicar no hospedeiro.

A expressão do gene também pode ser atenuada pela inserção de um transposon ou um fator IS na região codificadora do gene (Patente US

No. 5.175.107), ou pelos métodos convencionais, tais como pela mutagênese com irradiação UV ou nitrosoguanidina (N-metil-N’-nitro-N- nitrosoguanidina), mutagênese loco dirigida, rompimento de gene usando recombinação de homólogos, e/ou mutagênse de inserção-deleção (Yu, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97: 12: 5978-83 e Datsenko, K. A. e Wanner, B. L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97: 12: 6640-45), também chamado “integração Red-driven”.

Métodos para a preparação de DNA plasmídico, digestão e ligação de DNA, transformação, seleção de oligonucleotídeos como iniciadores, e os semelhantes podem ser métodos comuns bem conhecidos por uma pessoa habilitada na técnica. Estes métodos são descritos, por exemplo, em Sambrook, J., Fritsch, E. F., e Maniatis, T., “Molecular Cloning A Laboratory Manual, Segunda Edição”, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

Bactérias que produzem L-aminoácido

As bactérias que são capazes de produzir um L-aminoácido tal como L-arginina, L-citrulina, ou L-lisina, podem ser utilizadas.

A bactéria de acordo com matéria individual presentemente divulgada pode ser obtida pela inativação de um ou mais genes que codificam peptidase em uma bactéria, que tem uma capacidade nativa ou inerente para produzir L-aminoácido. Alternativamente, a bactéria pode ser obtida pela comunicação da capacidade para produzir L-aminoácido a uma bactéria que já tem um gene(s) inativado(s) que codifica(m) peptidase.

Bactérias que produzem L-arginina

Os exemplos de bactérias que produzem L-arginina ou cepas precursoras, que podem ser usadas para derivar bactérias que produzem L- arginina incluem, mas não são limitados a, cepas que pertencem ao gênero Escherichia, tais como E. coli cepa 237 (VKPM B-7925) (Patente US Pedido 2002/058315 A1) e suas cepas derivadas que abrigam a N-acetilglutamato sintase mutante (Pedido de Patente Russa No. 2001112869), a cepa 382 da E. coli (VKPM B-7926) (EP1170358A1), uma cepa que produz arginina em que o gene argA que codifica a N-acetilglutamato sintetase foi introduzida (EP1170361A1), e os semelhantes.

Os exemplos de cepas precursoras que podem ser usadas para derivar L-arginina para produzir bactérias também incluem cepas em que a expressão de um ou mais genes que codificam enzimas biossintéticas de L- arginina é/são realçada(s). Os exemplos de tais genes incluem os genes que codificam a N-acetilglutamato sintase (argA), N-acetilglutamato cinase (argB), N-acetilglutamil fosfato redutase (argC), acetilornitina transaminase (argD), acetilornitina desacetilase (argE), ornitina carbamoiltransferase (argF/I), ácido argininossuccínico sintetase (argG), ácido argininossuccínico liase (argH), e carbamoil fosfato sintetase (carAB). As abreviações em parênteses depois dos nomes da enzima representam os nomes do gene. Bactérias que produzem L-citrulina

Os exemplos de bactérias que produzem L-citrulina ou cepas precursoras, que podem ser usadas para derivar bactérias que produzem L- citrulina que pertencem ao gênero Escherichia incluem, mas não são limitados a, cepa 333 (VKPM B-8084) e 374 (VKPM B-8086) da E. coli, ambas abrigando a carbamoil fosfato sintetase resistente à retroalimentação mutante (Patente Russa RU2264459 C2), cepas E. coli, em que a atividade da a-cetoglutarato sintase é aumentada, e as atividades da ferredoxina NADP+ redutase, piruvato sintase ou a-cetoglutarato desidrogenase são adicionalmente modificadas (EP 2133417 A1), e a cepa NA1sucAsdhA de P. ananantis, na qual as atividades da succinato desidrogenase e a-cetoglutarato desidrogenase são diminuídas (Pedido de Patente US No 2009286290), e os semelhantes.

Visto que a L-citrulina é um intermediário do caminho biossintético da L-arginina, os exemplos das cepas precursoras, que podem ser usadas para derivar bactérias que produzem L-citrulina, incluem cepas, em que a expressão de um ou mais genes que codificam uma enzima biossintética de L-arginina é realçada. Os exemplos de tais genes incluem, mas não são limitados a, genes que codificam a N-acetilglutamato sintase (argA), N- acetilglutamato cinase (argB), N-acetilglutamil fosfato redutase (argC), acetilornitina transaminase (argD), acetilornitina desacetilase (argE), ornitina carbamoiltransferase (argF/I), e carbamoil fosfato sintetase (carAB), ou combinações destes.

Os exemplos de cepas precursoras que podem ser usadas para derivar bactérias que produzem L-citrulina da presente invenção também podem incluir as cepas que produzem L-arginina, em que a atividade da ácido argininossuccínico sintetase (ArgG), que catalisou a conversão de L-citrulina para L-arginina, é reduzida comparada com a cepa precursora. A atividade da ácido argininossuccínico sintetase pode ser diminuída pela inativação do gene argG correspondente pelos métodos convencionais como descrito acima.

Bactérias que produzem L-lisina

Os exemplos de Bactérias que produzem L-lisina ou cepas precursoras que pertencem ao gênero Escherichia incluem mutantes resistência a um análogo de L-lisina. Os análogos de L-lisina inibem o crescimento de bactérias que pertencem ao gênero Escherichia, mas esta inibição é total ou parcialmente dessensibilizada quando a L-lisina está presente no meio. Os exemplos dos análogos de L-lisina incluem, mas não são limitados a, oxalisina, hidroxamato de lisina, S-(2-aminoetil)-L-cisteína (AEC), y-metillisma, a-clorocaprolactama, e assim por diante. Mutantes tendo resistência a estes análogos de lisina podem ser obtidos pela individualização de bactérias que pertencem ao gênero Escherichia para um tratamento de mutagênese artificial convencional. Os exemplos específicos de cepas bacterianas úteis para produzir L-lisina incluem Escherichia coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185; ver Patente US No. 4.346.170) e Escherichia coli VL611. Nestes microrganismos, a inibição de retroalimentação da aspartocinase pela L-lisina é dessensibilizada.

A cepa WC196 pode ser usada como uma bactéria produtora de L-lisina da Escherichia coli. Esta cepa bacteriana foi criada a partir da cepa W3110, que foi derivada da Escherichia coli K-12, pela substituição do gene lysC tipo selvagem no cromossoma da cepa W3110 com um gene lysC mutante que codifica uma aspartocinase III mutante dessensibilizada para a inibição de retroalimentação pela L-lisina em que a treonina na posição 352 foi substituído com isoleucina, e conferindo resistência AEC à cepa resultante (Patente US No. 5.661.012). A cepa resultante foi designada Escherichia coli AJ13069 e foi depositada no National Institute of Bioscience and HumanTechnology, Agency of Industrial Science and Technology (correntemente National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1- Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japão) em 6 de Dezembro de 1994 e recebeu um número de acesso de FERM P-14690. Depois, a mesma foi convertida a um depósito internacional sob as condições do Tratado de Budapeste em 29 de Setembro de 1995, e receberam um número de acesso de FERM BP-5252 (Patente US No. 5.827.698).

Os exemplos de cepas precursoras que podem ser usadas para derivar bactérias que são capazes de produzir L-lisina também incluem cepas em que a expressão de um ou mais genes que codificam uma enzima biossintética é realçada. Os exemplos de tais genes incluem, mas não são limitados a, genes que codificam a di-hidrodipicolinato sintase (dapA), aspartocinase (lysC), di-hidrodipicolinato redutase (dapB), diaminopimelato descarboxilase (lysA), diaminopimelato desidrogenase (ddh) (Patente US No. 6.040.160), fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc), aspartato semialdeído desidrogenease (asd), e aspartase (aspA) (EP 1253195 A). Além disso, as cepas precursoras podem ter expressão aumentada do gene envolvido na eficiência de energia (cyo) (EP 1170376 A), o gene que codifica a nicotinamida nucleotídeo transidrogenase (pntAB) (Patente US No. 5.830.716), o gene ybjE (WO2005/073390), ou combinações destes.

É conhecido que a di-hidrodipicolinato sintetase do tipo selvagem derivada da Escherichia coli é individual para a inibição de retroalimentação pela L-lisina, enquanto que a aspartocinase do tipo selvagem derivada de Escherichia coli é individual para a supressão e inibição da retroalimentação pela L-lisina. Portanto, quando os genes dapA e lysC são usados, estes genes podem ser genes mutantes que codificam as enzimas que não são individuais para a inibição de retroalimentação pela L-lisina.

Os exemplos de DNA que codifica uma di-hidrodipicolinato sintetase mutante dessensibilizada para a inibição de retroalimentação pela L- lisina incluem um DNA que codifica uma proteína que tem a sequência de aminoácido da enzima na qual a histidina na posição 118 é substituída pela tirosina. Os exemplos de DNA que codifica uma aspartocinase mutante dessensibilizada para a inibição de retroalimentação pela L-lisina incluem um DNA que codifica um AKIII tendo a sequência de aminoácido na qual a treonina na posição 352, a glicina na posição 323, e a metionina na posição 318 são substituídas pela isoleucina, asparagina e isoleucina, respectivamente (para estes mutantes, ver a Patente US No. 5.661.012 e Patente US No. 6.040.160). Tais DNAs mutantes podem ser obtidos pela mutagênese específica de sítio usando PCR ou os semelhantes.

Os plasmídeos de faixa de hospedeiro ampla RSFD80, pCAB1, e pCABD2 são conhecidos como plasmídeos contendo um gene dapA mutante que codifica uma di-hidrodipicolinato sintetase mutante e um gene da lysC mutante que codifica uma aspartocinase mutante (Patente US No. 6.040.160). A cepa JM109 da Escherichia coli transformada com RSFD80 foi chamada de AJ12396 (Patente US No. 6.040.160), a cepa foi depositada no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (correntemente, International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) em 28 de outubro de 1993 e designada com um número de acesso de FERM P-13936, e o depósito foi depois convertido para um depósito internacional sob as condições do Tratado de Budapeste em 1 de novembro de 1994 e designado com um número de acesso de FERM BP-4859. RSFD80 pode ser obtido a partir da cepa AJ12396 por um método conhecido.

Os exemplos de cepas precursoras que podem ser usadas para derivar bactérias que são capazes de produzir L-lisina também incluem cepas tendo atividade diminuída ou nenhuma de uma enzima que catalisa uma reação que gera um composto outro que não L-lisina pela ramificação do caminho biossintético da L-lisina. Os exemplos de tais enzimas incluem homosserina desidrogenase, lisina descarboxilase (Patente US No. 5.827.698), e a enzima málica (WO2005/010175). De modo a reduzir ou eliminar a atividade da lisina descarboxilase, a expressão tanto do gene cadA quanto do gene ldcC que codificam a lisina descarboxilase pode ser reduzida (Publicação de Patente Internacional WO2006/038695).

Os exemplos da cepa rompida nos genes cadA e ldcC incluem a cepa WC196LC (WC196ΔcadAΔldc) da Escherichia coli. A cepa WC196LC, que foi designada AJ110692, foi depositada no National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary (Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki- ken, 305-8566, Japão) em 7 de outubro de 2008 como um depósito internacional, e designada com um número de acesso de FERM BP-11027.

2. Método da Presente Invenção

Os métodos exemplares incluem produzir um L-aminoácido pelo cultivo da bactéria aqui descrita em um meio de cultura para produzir e secretar L-aminoácido, tal como L-arginina, L-citrulina, e/ou L-lisina no meio, e coletar L-aminoácido do meio.

O cultivo, coleta, e purificação de L-aminoácido do meio pode ser realizada pelos métodos de fermentação convencionais em que um aminoácido é produzido usando uma bactéria.

O meio usado para a cultura pode ser um meio sintético ou natural, contanto que o meio inclua uma fonte de carbono e uma fonte de nitrogênio e minerais e, se necessário, quantidades apropriadas de nutrientes que a bactéria escolhida requer para o crescimento. A fonte de carbono pode incluir vários carboidratos tais como glicose e sacarose, e vários ácidos orgânicos. Dependendo do modo de assimilação do microrganismo escolhida, álcool, incluindo etanol e glicerol, pode ser usado. Como a fonte de nitrogênio, vários sais de amônio tais como amônia e sulfato de amônio, outros compostos de nitrogênio tais como aminas, uma fonte de nitrogênio natural tal como peptona, hidrolisado de soja, e microrganismo fermentativo digerido podem ser usados. Como minerais, monofosfato de potássio, sulfato de magnésio, cloreto de sódio, sulfato ferroso, sulfato de manganês, cloreto de cálcio, e os semelhantes podem ser usados. Como vitaminas, tiamina, extrato de levedura, e os semelhantes, podem ser usados.

O cultivo pode ser preferivelmente realizado sob condições aeróbicas, tais como por uma cultura sob agitação, e por uma cultura sob agitação com aeração, em uma temperatura de 20 a 40°C, preferivelmente de 30 a 38°C. O pH da cultura é usualmente entre 5 e 9, preferivelmente entre 6,5 e 7,2. O pH da cultura pode ser ajustado com amônia, carbonato de cálcio, vários ácidos, várias bases, e tampões. Usualmente, de 1 a 5 dias de cultivo leva ao acúmulo de L-aminoácido no meio líquido.

Depois do cultivo, os sólidos tais como células podem ser removidos do meio líquido pela centrifugação ou filtração com membrana, e depois o L-aminoácido pode ser coletado e purificado pelos métodos de troca de íon, concentração, e/ou cristalização.

Exemplos

A presente invenção será mais concretamente explicada abaixo com referência aos seguintes Exemplos não limitantes.

Exemplo 1. Construção de uma cepa com um gene pepA inativado. 1. Deleção do gene pepA.

O gene pepA em uma cepa bacteriana foi deletada pelo método inicialmente desenvolvido por Datsenko, K. A. e Wanner, B. L. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12), 6640-6645) chamado “integração Red-driven”. De acordo com este procedimento, os iniciadores de PCR P1 (SEQ ID NO: 3) e P2 (SEQ ID NO: 4), que são homólogos tanto para a região adjacente ao gene pepA quanto para o gene que confere resistência a antibiótico no padrão plasmídico, foram construídos. O plasmídeo pMW118-attL-Cm-attR (WO 05/010175) foi usado como o padrão na reação de PCR. As condições para PCR foram como segue: a desnaturação de DNA inicial por 30 s a 94°C, seguido por 25 ciclos de desnaturação a 94°C por 30 s, recozendo a 55°C por 30 s, alongamento a 72°C por 1 min 30 s; e o alongamento final por 2 min a 72°C.

O produto de PCR de 1,7 kb (Fig. 1) foi purificado a partir de um gel de agarose e usado para a eletroporação da cepa MG1655 da E. coli (ATCC 700926), que contém o plasmídeo pKD46. O plasmídeo pKD46 (Datsenko, K. A. e Wanner, B. L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97: 12: 6640-45) contém uma origem de replicação sensível à temperatura, e inclui um fragmento de DNA de 2.154 nucleotídeos de fago À (posições de nucleotídeo 31088 a 33241, Acesso no GenBank no. J02459), assim como os genes do sistema À Red de recombinação de homólogos (genes y, β, exo), que estão sob o controle do promotor ParaB indutível pela arabinose. O plasmídeo pKD46 é necessário para a integração do produto de PCR no cromossoma da cepa MG1655. A cepa MG1655 pode ser obtida da American Type Culture Colection. (P.O. Box 1549 Manassas, VA 20108, USA).

As células eletrocompetentes foram preparadas como segue: as células MG1655/pKD46 da E. coli foram cultivadas durante a noite a 30°C em meio LB contendo ampicilina (100 mg/l), e a cultura foi diluída 100 vezes com 5 ml de meio SOB (Sambrook et al, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) contendo ampicilina e L-arabinose (1 mM). As células foram cultivadas com aeração a 30°C a uma OD600 de -0,6 e depois foram feitas eletrocompetentes pela concentração 100 vezes e lavagem três vezes com H2O deionizada gelada. A eletroporação foi realizada usando 70 μl de células e -100 ng do produto de PCR. As células depois da eletroporação foram incubadas com 1 ml de meio SOC (Sambrook et al, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) a 37°C por 2,5 horas e depois foram plaqueadas em L-agar contendo cloranfenicol (30 μg/ml) e cultivadas a 37°C para selecionar recombinantes CmR. Depois, para eliminar o plasmídeo pKD46, duas passagens sobre L-agar com Cm a 42°C foram realizadas e as colônias foram testadas quanto a sensibilidade à ampicilina.

2. Verificação da deleção do gene pepA pela PCR.

Mutantes em que o gene pepA foi deletado foram marcados com um gene de resistência Cm e foram verificados pela PCR usando os iniciadores específicos de local P3 (SEQ ID NO: 5) e P4 (SEQ ID NO: 6). Para este propósito, uma colônia recém isolada foi colocada em suspensão em 20 μl de água e depois 1 μl da suspensão foi usada para a PCR. As condições para a PCR foram como segue: desnaturação de DNA inicial por 30 s a 94°C; depois 30 ciclos de desnaturação a 94°C por 30 s, recozimento a 55°C por 30 s e alongamento a 72°C por 2 min; o alongamento final por 2 min a 72°C. O produto da PCR obtido na reação da PCR usando as células da cepa pepA+ precursora MG1655 como o padrão foi de 1,65 kb no comprimento. O produto de PCR obtido na reação de PCR usando as células da cepa MG1655 ΔpepA::cat mutante como o padrão foi de 1,71 kb nucleotídeos no comprimento (Fig. 2).

3. Eliminação do gene da resistência a Cm (gene cat) do cromossoma da cepa MG1655 ΔpepA::cat da E. coli

O gene da resistência a Cm foi eliminado do cromossoma da cepa MG1655 pepA::cat da E. coli usando o sistema int-xis. Para este propósito, a cepa MG1655 pepA::cat da E. coli foi transformada com o plasmídeo pMWts-Int/Xis (WO 05/010175). Os clones transformantes foram selecionados no meio LB contendo 100 μg/ml de ampicilina. As placas foram incubadas durante a noite a 30°C. Os clones transformantes foram curados a partir do gene cat e do plasmídeo pMWts-Int/Xis pelo espalhamento das colônias separadas a 37°C (nesta temperatura o repressor CIts é parcialmente inativado e a transcrição dos genes int/xis é desreprimida) seguido pela seleção de variantes CmSApR. A eliminação do gene cat do cromossoma da cepa foi verificado pela PCR com os iniciadores específicos de local P3 (SEQ ID NO: 5) e P4 (SEQ ID NO: 6). As condições para a PCR foram como segue: desnaturação de DNA inicial por 30 s a 94°C; depois de 30 ciclos de desnaturação a 94°C por 30 s, recozimento a 55°C por 30 s e alongamento a 72°C por 2 min; o alongamento final por 2 min a 72°C. O produto da PCR obtido na reação com as células da cepa MG1655ΔpepA::cat como um padrão, foi de 1,71 kb no comprimento. O produto de PCR obtido na reação com células sem gene cat como um padrão foi de 160 bp no comprimento. Assim, a cepa com o gene pepA inativado e gene cat deletado foi obtida. Exemplo 2. Produção de L-arginina pela cepa 382ΔpepA da E. coli.

Para testar o efeito da inativação do gene pepA sobre a produção de L-arginina, o fragmento de DNA do cromossoma da cepa MG1655 ΔpepA da E. coli descrita acima foi transferida para a cepa 382 da E. coli que produz L-arginina pela transdução de P1 (Miller, J. H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY) para se obter a cepa 382ΔpepA da E. coli. A cepa 382 foi depositada no Russian National Colection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Rússia, 117545 Moscou, 1 Dorozhny proezd, 1) em 10 de abril de 2000 sob o número de acesso VKPM B-7926 e depois convertido a um depósito sob o Tratado de Budapeste em 18 de maio de 2001.

As cepas da E. coli, 382 e 382pepA, foram separadamente cultivadas com agitação a 37°C por 18 horas em 3 ml de caldo nutriente, e 0,3 ml das culturas foram inoculadas em 2 ml de um meio de fermentação em tubos de teste de 20 x 200 mm e cultivadas a 32°C por 48 horas em um agitador rotativo.

Depois do cultivo, a quantidade de L-arginina que acumulou no meio foi determinada pela cromatografia em papel usando a seguinte fase móvel: butanol:ácido acético:água = 4:1:1 (v/v). Uma solução de ninhidrina (2 %) em acetona foi usada como um reagente de visualização. Uma mancha contendo L-arginina foi cortada, a L-arginina foi eluída com 0,5 % de solução aquosa de CdCl2, e a quantidade de L-arginina foi estimada espectrofotometricamente a 540 nm.

A composição do meio de fermentação (g/l) é como segue: Glicose 48,0 (NH4)2SO4 35,0 KH2PO4 2,0 MgS(V7IH) 1,0 Tiamina HCl 0,0002 Extrato de levedura 1,0 L-isoleucina 0,1 CaC)3 5,0

A glicose e o sulfato de magnésio são esterilizados separadamente. CaC)3 é esterilizado por calor seco a 180°C por 2 horas. ) pH é ajustado para 7,0. )s resultados das fermentações em tubo de teste são mostrados na Tabela 1. Como pode ser observado a partir da Tabela 1, a cepa com um gene pepA inativado foi capaz de produzir uma quantidade mais alta de L- arginina quando comparada com a cepa 382 da E. coli que produz L-arginina precursora. Tabela 1

Exemplo 3. Produção de citrulina pela cepa 382ΔpepA da E. coli.

Para testar o efeito da inativação do gene pepA sobre a produção de L-arginina, o fragmento de DNA do cromossoma da cepa MG1655 ΔpepA da E. coli descrita acima pode ser transferida para a cepa 382ΔargG da E. coli pela transdução de P1 (Miller, J. H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY) para se obter a cepa 382ΔargGΔpepA da E. coli. A cepa 382ΔargG pode ser obtida pela deleção do gene argG no cromossoma da cepa 382 (VKPM B-7926) pelo método inicialmente desenvolvido pela Datsenko, K. A. e Wanner, B. L. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12), 6640-6645) chamado “integração Red-driven”. De acordo com este procedimento, os iniciadores de PCR homólogos tanto à região adjacente ao gene argG quanto ao gene que confere resistência a antibiótico no plasmídeo padrão podem ser construídos. O plasmídeo pMW118-attL-Cm-attR (WO 05/010175) pode ser usado como o padrão na reação de PCR.

Ambas as cepas da E. coli, 382ΔargG e 382ΔargGΔpepA, podem ser separadamente cultivadas com agitação a 37°C por 18 horas em 3 ml de caldo nutriente, e 0,3 ml da cultura obtida foram inoculados em 2 ml de um meio de fermentação em tubos de teste de 20 x 200 mm e cultivados a 32°C por 48 horas em um agitador rotativo.

Depois do cultivo, a quantidade de citrulina que acumula no meio pode ser determinada pela cromatografia em papel usando a seguinte fase móvel: butanol:ácido acético:água = 4:1:1 (v/v). Uma solução de ninhidrina (2 %) em acetona pode ser usada como um reagente de visualização. Uma mancha contendo citrulina pode ser cortada, a citrulina pode ser eluída com 0,5 % de solução aquosa de CdCl2, e a quantidade de citrulina pode ser estimada espectrofotometricamente a 540 nm.

A composição do meio de fermentação (g/l) pode ser como segue: Glicose 48,0 (NH4)2SçO4 35,0 KH2PO4 2,0 MgS(V7IH) 1,0 Tiamina HCl 0,0002 Extrato de levedura 1,0 L-isoleucina 0,1 L-arginina 0,1 CaC)3 5,0

A glicose e o sulfato de magnésio são esterilizados separadamente. CaC)3 é esterilizado por calor seco a 180°C por 2 horas. ) pH é ajustado para 7,0.

Exemplo 4: Construção de bactéria que produz L-lisina tendo atividade de amino-peptidase diminuída

As cepas que não expressam amino-peptidase A ou B ou D (as cepas WC196ΔcadAΔldcCΔpepA::Km, WC196ΔcadAΔldcCΔpepB::Km e WC196ΔcadAΔldcCΔpepD::Km) foram construídas a partir da cepa WC196ΔcadAΔldcC.

A cepa WC196ΔcadAΔldcC é capaz de produzir L-lisina e foi usada para derivar a cepa deficiente no gene pep objeto. Cada gene pep na WC196ΔcadAΔldcC foi deletado pelo método chamado “integração Red- driven”, na maneira similar à mostrada no Exemplo 1. )s genes pepA, pepB ou pepD foram deletados pelo uso dos iniciadores das SEQ ID NOS: 11 e 12 para pepA, os iniciadores das SEQ ID NOS: 13 e 14 para pepB, os iniciadores das SEQ ID NOS: 15 e 16 para pepD, respectivamente. As cepas WC196ΔcadAΔldcCΔpepA::Km,

WC196ΔcadAΔldcCΔpepB::Km e WC196ΔcadAΔldcCΔpepD::Km em que cada gene da amino-peptidase foi deletado, foram deste modo obtidos. O gene cadA e o gene IdcC na cepa WC196196ΔcadAΔldcC também pode ser deletado em uma maneira similar.

Além disso, cada cepa foi cultivada a 37°C em meio L até que a OD600 final da cultura tornasse de cerca de 0,6. Depois, um volume igual de uma solução a 40 % de glicerol foi adicionada à cultura, a mistura foi agitada, e depois dividida em volumes apropriados e armazenados a -80°C. Estes são chamados estoques de glicerol.

Exemplo 5: Avaliação da capacidade de produzir L-lisina da cepa que diminuiu a atividade da amino-peptidase

Cada um dos estoques de glicerol das cepas foi descongelado, e 100 μL de cada um foi uniformemente aplicado a uma placa L e cultivados a 37°C por 24 horas. Os estoques de glicerol acima foram descongelados, e uniformemente aplicados a uma placa L e a cultura foi realizada a 37°C por 24 horas. A suspensão das células obtidas foi diluída 101 vezes, o valor OD620 (n) da suspensão diluída foi medida, e a suspensão de célula em um volume que corresponde a 50/n foi inoculada em 20 mL de um meio de fermentação em um frasco de Sakaguchi de 500 mL, e a cultura foi realizada a 37°C por 48 horas em uma máquina de cultura agitando reciprocamente (115 rpm). Depois da cultura, a quantidade de L-lisina acumulada no meio foi medida em uma maneira conhecida (Biotec Analyzer AS210, SAKURA SEIKI).

A composição do meio de fermentação (g/l) é como segue: Composição do meio de fermentação da L-lisina: Glicose 40 (NH4)2SO4 24 K2HPO4 1,0 MgSO4‘7H2O 1,0 FeSO4‘7H2O 0,01 MnSO4‘5H2O 0,01 Extrato de levedura 2,0 CaCO3 (Farmacopéia Japonesa) 30 Água destilada Até o volume final de 1 L

O meio foi ajustado para pH 7,0 com KOH, e autoclavado a 115°C por 10 minutos. A Glicose e MgSOrV^O) foram separadamente esterilizados por calor seco a 180°C por 2 horas.

Os resultados são mostrados na Tabela 2. O rendimento (%) representa o rendimento de L-lisina com base na glicose. Como pode ser observado a partir da Tabela 2, as cepas WC196ΔcadAΔldcCΔpepA, WC196ΔcadAΔldcCΔpepB, WC196ΔcadAΔldcCΔpepD, foram capazes de produzir uma quantidade mais alta de L-lisina quando comparada com a L- lisina precursora para produzir a cepa WC196ΔcadAΔldcC da E. coli. Tabela 2

Embora a invenção tenha sido descrita em detalhes com referência às suas formas de realização preferidas, estará evidente a uma pessoa habilitada na técnica que várias mudanças podem ser feitas, e os equivalentes utilizados, sem divergir do escopo da invenção. Todas as referências aqui citadas 15 são aqui incorporadas como uma parte deste pedido por referência.

Aplicabilidade Industrial

De acordo com a presente invenção, a produção de L-arginina, L-citrulina, e L-lisina por uma bactéria da família das Enterobacteriaceae pode ser melhorada.

Claims

1. Método para produzir um L-aminoácido, caracterizado pelo fato de que compreende: cultivar uma bactéria da família Enterobacteriaceae tendo capacidade para produzir o L-aminoácido em um meio de cultura, e coletar o L-aminoácido do meio de cultura, em que a referida bactéria foi modificada para inativar um ou mais genes selecionados do grupo que consiste dos genes pepA, pepB, e pepD, em que a dita bactéria é Escherichia coli, em que o dito L-aminoácido é selecionado do grupo que consiste de L-arginina, L-citrulina e L-lisina.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o L-aminoácido é L-lisina.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a bactéria foi modificada para inativar os genes pepA, pepB e pepD.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a bactéria foi modificada para inativar o gene pepA e o L- aminoácido é L-arginina ou L-citrulina.