JP2013526841A - ペプチダーゼをコードする遺伝子の弱化された発現を有する腸内細菌科の細菌を使用するl−アミノ酸の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
ド、例えばシステイニルグリシン、を分解することのできるジペプチダーゼである(非特許文献7、8)。ペプチダーゼDは、PepD単量体による二量体として機能する(非特許文献9)。pepDの転写は、リン酸飢餓の際に5倍に増加する(非特許文献10)。
ここに開示する主題に基づく細菌は、L-アルギニン、L-シトルリン、又はL-リジン等のL-アミノ酸を生産する能力を有する腸内細菌科の細菌であって、アミノペプチダーゼをコードするpepA、pepB、及びpepD遺伝子からなる群より選択される1またはそれ以上の遺伝子の発現が弱化されるように改変された細菌である。
属、エルビニア(Erwinia)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、パントエア(Pantoea)属、フォトラブダス(Photorhabdus)属、プロビデンシア(Providencia)属、サルモネラ(Salmonella)属、セラチア(Serratia)属、シゲラ(Shigella)属、モルガネラ(Morganella)属、エルシニア(Yersinia)属等に属する細菌を包含する。特に、NCBI(National Center for Biotechnology Information)データベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=543)で使用される分類により腸内細菌科(Enterobacteriaceae)に分類されるものを使用することができる。特定の例は、Escherichia属又はPantoea属に属する細菌である。
、SDS-PAGEとそれに続けてイムノブロッティングアッセイ(ウエスタンブロッティング分析)を行うこと等を含む周知の方法によって測定することができる。
ECK4253と同義)は既に明らかになっている(GenBank Accession NC_000913.2の配列中のヌクレオチド4482463〜4483974に相補的なヌクレオチド)。E. coli由来のpepA遺伝子は、染色体上のholC遺伝子とlptF遺伝子との間に位置する。pepA遺伝子の塩基配列及びpepA遺伝子によってコードされるPepAタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号1及び配列番号2に示す。
ECK2520と同義)は既に明らかになっている(GenBank Accession EG12310の配列中のヌクレオチド2653097〜2654380に相補的なヌクレオチド)。E. coli由来のpepB遺伝子は、染色体上のiscX遺伝子とsseB遺伝子との間に位置する。pepB遺伝子の塩基配列及びpepB遺伝子によってコードされるPepBタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号7及び配列番号8に示す。
ECK0238と同義)は既に明らかになっている(GenBank Accession 10695の配列中のヌクレオチド254259〜255716に相補的なヌクレオチド)。E. coli由来のpepD遺伝子は、染色体上のgpt遺伝子とprfH遺伝子との間に位置する。pepD遺伝子の塩基配列及びpepD遺伝子によってコードされるPepDタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号9及び配列番号10に示す。
70%以上、他の例では80%以上、他の例では90%以上、他の例では95%以上、他の例では98%以上、更に他の例では99%以上の相同性を有するハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッド、例えば、前記より低い相同性を有するハイブリッドが形成されないような条件を含む。例えば、ストリンジェントな条件としては、1×SSC、0.1%SDS、好ましくは0.1×SSC、0.1%SDSに相当する塩濃度で、60℃で、1回、他の例では2回又は3回、洗浄することが挙げられる。洗浄時間は、ブロッティングに使用する膜の種類に依存し、原則として、製造業者によって推奨されているものとすべきである。例えば、ストリンジェントな条件下でHybond(商標名)N+ナイロン膜(アマシャム)について推奨される洗浄時間は15分である。洗浄は、2〜3回行うことができる。プローブの長さは、ハイブリダイゼーション条件に応じて適宜選択することができ、通常は100 bp〜1kbpである。
Acad. Sci. USA, 97, 12, p 6640-6645 (2000))。または、相同組換えを使用する遺伝子置換は、温度感受性複製開始点を有するプラスミドを用いて行うことができる(米国特許第6,303,383号又はJP 05-007491A)。更に、宿主中で複製できないプラスミドを使用する上記したような相同組換えを使用して、遺伝子置換による部位特異的変異を組込むこともできる。
L-アルギニン、L-シトルリン、又はL-リジン等のL-アミノ酸を生産することのできる細菌を用いることができる。
L-アルギニン生産細菌、又はL-アルギニン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株としては、限定されるものではないが、E. coli 237株 (VKPM B-7925)(米国特許出願第2002/058315A1号)及び変異型N-アセチルグルタミン酸合成酵素を保有するその誘導体株(ロシア連邦特許出願第2001112869号)、E. coli 382株 (VKPM B-7926)(EP1170358A1)、ならびにN-アセチルグルタミン酸合成酵素をコードするargA遺伝子が導入されたアルギニン生産株(EP1170361A1)等のEscherichia属に属する株が挙げられる。
L-シトルリン生産細菌、又はEscherichia属に属するL-シトルリン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株としては、限定されるものではないが、E. coli 333株 (VKPM B-8084)及び374株 (VKPM B-8086)(両者は、フィードバック耐性の変異型カルバモイルリン酸合成酵素を保有する)(ロシア連邦特許第RU2264459 C2号)、α‐ケトグルタル酸合成酵素の活性が増加し、さらにフェレドキシンNADP+レダクターゼ、ピルビン酸合成酵素、又はα‐ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの活性が改変されたE. coli株(EP 2133417 A1号)、ならびに、コハク酸デヒドロゲナーゼ及びα‐ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの活性が減少したP. ananatis NA1sucAsdhA株(米国特許出願第2009286290号)等が挙げられる。
シトルリンからL-アルギニンへの変換を触媒するアルギノコハク酸合成酵素(ArgG)の活性が親株と比較して低下したL-アルギニン生産株も挙げられる。アルギノコハク酸合成酵素の活性は、上記したような従来の方法によって、対応する遺伝子であるargGを不活化することにより減少させることができる。
Escherichia属に属するL-リジン生産細菌又は親株としては、L-リジンアナログに対する耐性を有する変異体が挙げられる。L-リジンアナログは、Escherichia属に属する細菌の生育を阻害するが、培地中にL-リジンが存在する場合、この阻害は完全に又は部分的に脱感作される。L-リジンアナログとしては、限定されるものではないが、オキサリジン、リジンハイドロキサメート、S-(2-アミノエチル)-L-システイン(AEC)、γ‐メチルリジン、α‐クロロカプロラクタム等が挙げられる。これらのリジンアナログに対する耐性を有する変異体は、Escherichia属に属する細菌を従来の人工的な変異誘発処理に供することによって得ることができる。L-リジンを製造するのに有用な細菌株としては、特に、Escherichia coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185;米国特許第4,346,170号参照)及びEscherichia coli VL611が挙げられる。これらの微生物においては、L-リジンによるアスパルトキナーゼのフィードバック阻害が脱感作されている。
酸配列を有するタンパク質をコードするDNAが挙げられる。L-リジンによるフィードバック阻害が脱感作された変異型アスパルトキナーゼをコードするDNAとしては、352位のスレオニン、323位のグリシン、及び318位のメチオニンが、それぞれイソロイシン、アパラギン、及びイソロイシンで置換されたアミノ酸配列を有するAKIIIをコードするDNAが挙げられる(これらの変異体については、米国特許第5,661,012号及び米国特許第6,040,160号を参照のこと)。このような変異型DNAは、PCR等を使用する部位特異的変異誘発によって得ることができる。
例示的な方法には、ここに記載した細菌を培地中で培養して、L-アルギニン、L-シトルリン、及び/又はL-リジン等のL-アミノ酸を生産して培地中に分泌し、培地からL-アミノ酸を回収することによりL-アミノ酸を製造することが含まれる。
エキス等を使用することができる。
1.pepA遺伝子の欠失
細菌株のpepA遺伝子は、Datsenko, K. A.とWanner, B. L. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12), 6640-6645)によって最初に開発された「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法により欠失させた。この手順に従い、pepA遺伝子に隣接する領域及びテンプレートプラスミド中の抗生物質耐性を与える遺伝子の両者に相同のPCRプライマーP1(配列番号3)及びP2(配列番号4)を構築した。プラスミドpMW118-attL-Cm-attR(WO05/010175)をPCR反応におけるテンプレートとして使用した。PCRの条件は次の通りである:94℃で30秒の最初のDNA変性の後;94℃で30秒の変性、55℃で30秒のアニーリング、および72℃で1分30秒の伸長反応、を25サイクル;ならびに72℃で2分の最後の伸長反応。
Harbor Laboratory Press, 1989)を用いて37℃で2.5時間インキュベートした後、クロラムフェニコール(30μg/ml)を含有するL-寒天上にプレーティングし、37℃で生育させてCmR組換え体を選択した。その後、pKD46プラスミドを除去するために、Cmを有するL-寒天上で42℃で2回継代(passages)を行い、コロニーのアンピシリン感受性を試験した。
pepA遺伝子を欠失した変異体は、Cm耐性遺伝子で標識されており、部位特異的(locus-specific)プライマーP3(配列番号5)及びP4(配列番号6)を使用するPCRによって検証した。この目的のために、新たに(freshly)単離したコロニーを20μlの水に懸濁した後、1μlの懸濁液をPCRに使用した。PCRの条件は次の通りである:94℃で30秒の最初のDNA変性の後;94℃で30秒の変性、55℃で30秒のアニーリング、及び72℃で2分の伸長反応、を30サイクル;ならびに72℃で2分の最後のエ伸長反応。親のpepA+株であるMG1655の細胞をテンプレートとして用いたPCR反応で取得したPCR産物は、1.65 kbの長さであった。変異体であるMG1655ΔpepA::cat株の細胞をテンプレートとして用いたPCR反応で取得したPCR産物は、長さ1.71 kbのヌクレオチドであった(図2)。
int-xis系を使用し、E. coli MG1655 pepA::cat株の染色体からCm耐性遺伝子を除去した。この目的のために、pMWts-Int/Xisプラスミド(WO05/010175)でE. coli MG1655 pepA::cat株を形質転換した。形質転換体クローンは、100μg/mlのアンピシリンを含有するLB培地上で選択した。プレートを30℃で一夜インキュベートした。単離したコロニーを37℃(この温度では、リプレッサーCItsは部分的に不活化され、int/xis遺伝子の転写は脱抑制(derepress)される)で塗り広げ、次いでCmSApRなバリアントを選抜することにより、形質転換体クローンのcat遺伝子及びpMWst-Int/Xisプラスミドを除去した。当該株の染色体からのcat遺伝子の除去は、部位特異的プライマーP3(配列番号5)及びP4(配列番号6)を用いるPCRによって検証した。PCRの条件は次の通りである:94℃で30秒の最初のDNA変性の後;94℃で30秒の変性、55℃で30秒のアニーリング、及び72℃で2分の伸長反応、を30サイクル;ならびに72℃で2分の最後の伸長反応。MG1655ΔpepA::cat株の細胞をテンプレートとして用いた反応で得られたPCR産物は、1.71 kbの長さであった。cat遺伝子を有さない細胞をテンプレートとして用いた反応で得られたPCR産物は、160 bpの長さであった。こうして、pepA遺伝子が不活化され、cat遺伝子を欠失した株が得られた。
L-アルギニン生産におけるpepA遺伝子の不活化の効果を試験するために、上記のE. coli MG1655ΔpepA株の染色体由来のDNA断片を、E. coliアルギニン生産株382にP1トランスダクション(Miller, J. H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY)によって導入し、E. coli 382ΔpepA株を得た。382株は、Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Russia, 117545 Moscow, 1 Dorozhny proezd, 1)に2000年4月10日に受託番号VKPM B-7926の下で寄託され、その後、2001年5月18日にブダペスト条約に基づく寄託に移管された。
グルコース 48.0
(NH4)2SO4 35.0
KH2PO4 2.0
MgSO4・7H2O 1.0
チアミンHCl 0.0002
酵母エキス 1.0
L-イソロイシン 0.1
CaCO3 5.0
グルコース及び硫酸マグネシウムは別々に滅菌する。CaCO3は、180℃で2時間乾熱滅菌する。pHは7.0に調整する。
L-アルギニン生産におけるpepA遺伝子の不活化の効果を試験するために、上記E. coli MG1655ΔpepA株の染色体由来のDNA断片を、E. coliシトルリン生産株382ΔargGにP1トランスダクション(Miller, J. H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY)によって導入し、E. coli 382ΔargGΔpepA株を得ることができる。382ΔargG株は、Datsenko, K. A.とWanner, B. L. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12), 6640-6645)によって最初に開発された「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法によって、382株(VKPM B-7926)の染色体上のargG遺伝子を欠失させることにより取得することができる。この手順に従い、argG遺伝子に隣接する領域及びテンプレートプラスミド中の抗生物質耐性を与える遺伝子の両者に相同なPCRプライマーを構築することができる。プラスミドpMW118-attL-Cm-attR(WO05/010175)を、PCR反応におけるテンプレートとして使用することができる。
グルコース 48.0
(NH4)2SO4 35.0
KH2PO4 2.0
MgSO4・7H2O 1.0
チアミンHCl 0.0002
酵母エキス 1.0
L-イソロイシン 0.1
L-アルギニン 0.1
CaCO3 5.0
グルコース及び硫酸マグネシウムは別々に滅菌する。CaCO3は、180℃で2時間乾熱滅菌する。pHは7.0に調整する。
アミノペプチダーゼA、B、又はDを発現しない株(WC196ΔcadAΔldcCΔpepA::Km, WC196ΔcadAΔldcCΔpepB::Km及びWC196ΔcadAΔldcCΔpepD::Km株)をWC196ΔcadAΔldcC株から構築した。
各株のグリセロールストックを解凍し、それぞれ100μLをLプレートに均等に塗布し、37℃で24時間培養した。上記グリセロールストックを解凍し、L-プレートに均一に塗布し、37℃で24時間培養を行った。得られた細胞懸濁液を101倍に希釈し、希釈した懸濁液のOD620値(n)を測定し、50/nに相当する容量の細胞懸濁液を、500 mLの坂口フラスコ中の20mLの発酵培地に接種し、往復振盪培養装置(115 rpm)で37℃で48時間培養を行った。培養後、培地中に蓄積したL-リジンの量を公知の手法で測定した(バイオテックアナライザー(Biotec Analyzer) AS210、サクラ精機)。
L-リジン発酵培地の組成:
グルコース 40
(NH4)2SO4 24
K2HPO4 1.0
MgSO4・7H2O 1.0
FeSO4・7H2O 0.01
MnSO4・5H2O 0.01
酵母エキス 2.0
CaCO3(日本薬局方) 30
蒸留水 1Lの最終容量とする
培地は、KOHを用いてpH 7.0に調整し、115℃で10分間オートクレーブした。グルコース及びMgSO4・7H2Oは別々に180℃で2時間乾熱滅菌した。
Claims (9)
- L-アミノ酸を生産する能力を有する腸内細菌科の細菌であって、
pepA、pepB、及びpepD遺伝子からなる群より選択される1またはそれ以上の遺伝子の発現が弱化されるように改変された、細菌。 - 前記遺伝子の発現が、遺伝子の不活化により弱化された、請求項1記載の細菌。
- エシェリヒア(Escherichia)属に属する、請求項1または2に記載の細菌。
- エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)である、請求項3に記載の細菌。
- パントエア(Pantoea)属に属する、請求項1または2に記載の細菌。
- 前記L-アミノ酸が、L-アルギニン、L-シトルリン、及びL-リジンからなる群より選択される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の細菌。
- pepA、pepB、及びpepD遺伝子の発現が弱化されるように改変され、且つ、前記L-アミノ酸がL-リジンである、請求項1〜6のいずれか1項に記載の細菌。
- L-アミノ酸を製造する方法であって、
請求項1〜7のいずれか1項に記載の細菌を培地中で培養すること、および
L-アミノ酸を培地から回収すること
を含む、方法。 - 前記L-アミノ酸が、L-アルギニン、L-シトルリン、及びL-リジンからなる群より選択される、請求項8に記載の方法。
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