ES2313878T3 - Procedimiento para la produccion de l-lisina. - Google Patents
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Abstract
Bacteria Escherichia en la que: (1) son aumentadas las actividades intracelulares de la dihidrodipicolinato sintasa, la aspartocinasa y la dihidrodipicolinato reductasa, (2) es aumentada la actividad intracelular de la diaminopimelato deshidrogenasa, o son aumentadas las actividades intracelulares de la tetrahidrodipicolinato succinilasa y la succinil diaminopimelato deacilasa, y (3) es aumentada la actividad intracelular de la aspartato-semialdehído deshidrogenasa o la fosfoenolpiruvato carboxilasa, en la que las actividades intracelulares de las enzimas son aumentadas mediante la introducción de un plásmido que presenta un gen de la enzima, mediante el incremento del número de copias de un gen de la enzima en el cromosoma, o mediante la modificación de una secuencia de promotor de un gen de la enzima en el cromosoma.
Description
Procedimiento para la producción de
L-lisina.
La presente invención se refiere al campo de los
microbios. Más específicamente, la presente invención se refiere a
un procedimiento para la producción de L-lisina
mediante fermentación y a un microorganismo utilizado para el
procedimiento de producción.
En la producción de la L-lisina
mediante fermentación, se han utilizado convencionalmente las cepas
aisladas de mutantes naturales o artificiales de los mismos para
mejorar la productividad. Son conocidas muchas cepas mutantes
artificiales que producen L-lisina y muchas de ellas
son cepas resistentes de
S-2-aminoetilcisteína (AEC) y
pertenecen al género Brevibacterium, Corynebacterium,
Bacillus o Escherichia. Además, se han descrito
diversas técnicas para incrementar la producción de aminoácido, por
ejemplo, la utilización de un transformante obtenido utilizando ADN
recombinante.
En cuanto a las bacterias Escherichia,
por ejemplo, se han descrito los procedimientos para la producción
de L-lisina utilizando una cepa en la que se aumenta
la actividad de dihidrodipicolinato sintasa (DDPS) en la solicitud
de patente japonesa abierta al público (kokai) nº
56-18596, en la patente US nº 4.346.170 y en
Applied Microbiology and Biotechnology, 15, págs.
227-331 (1982). Además, se ha descrito en la
publicación de patente coreana nº 92-8382 un
procedimiento para la producción de L-lisina
utilizando una bacteria Escherichia en la que se introduce
una forma de DDPS derivada de la bacteria Corynebacterium.
Además, se describe en la publicación internacional nº WO95/16042
un procedimiento para la producción de L-lisina
utilizando una cepa que se transforma con un plásmido que contiene
ADN que codifica la dihidrodipicolinato sintasa que proviene de una
bacteria Escherichia que posee una mutación para la
insensibilización de la inhibición por retroalimentación mediante
L-lisina, ADN que codifica la aspartocinasa cuya
inhibición por retroalimentación mediante L-lisina
se insensibiliza, ADN que codifica la dihidrodipicolinato reductasa
y ADN que codifica la diaminopimelato deshidrogenasa derivada de
una bacteria corineforme.
En cuanto a las bacterias Brevibacterium,
la publicación internacional nº WO95/11985 describe que la
productividad de la L-lisina se puede mejorar
mediante el aumento de la actividad de la dinucleótido nicotinamida
adenina transhidrogenasa intracelular. Además, se describe en la
publicación de patente japonesa abierta al público (kokai) nº
60-87788 y en la publicación de patente japonesa
(kokoku) nº 6-102028, respectivamente, un
procedimiento para la producción de la L-lisina
utilizando una cepa en la que se aumenta únicamente la actividad de
la fosfoenolpiruvato carboxilasa y un procedimiento para la
producción de la L-lisina utilizando una cepa en la
que se aumenta únicamente la actividad de la deshidrogenasa
aspartato-semialdehído.
En la producción industrial de aminoácidos
mediante fermentación, la producción se lleva a cabo a gran escala.
Por lo tanto, incluso la mejora en el rendimiento de distintos
porcentajes puede proporcionar un valor industrial significativo, y
de este modo se desea la mejora del rendimiento independientemente
del grado de mejoría.
Un objetivo de la presente invención consiste en
proporcionar un procedimiento mejorado para la producción de la
L-lisina mediante fermentación comparado con los
procedimientos convencionales.
Los presentes inventores estudiaron
diligentemente para conseguir el objetivo mencionado anteriormente.
Como resultado, descubrieron que, si la actividad de la
aspartato-semialdehído deshidrogenasa o de la
fosfoenolpiruvato carboxilasa aumentaba en una bacteria
Escherichia que posee una propiedad especifica y si
aumentaban la actividad o actividades de una enzima o enzimas
específicas además de las enzimas mencionadas anteriormente en tal
bacteria Escherichia, se podría mejorar la productividad de
la bacteria para L-lisina y llevaron a cabo la
presente invención basándose en estos descubrimientos.
Esto es, la presente invención proporciona: en
un primer aspecto, una bacteria Escherichia en la que (1) se
aumentan las actividades intracelulares de dihidrodipicolinato
sintasa, la aspartocinasa y la dihidrodipicolinato reductasa y (2)
aumenta/n, la actividad intracelular de la diaminopimelato
deshidrogenasa o las actividades intracelulares de la
tetrahidrodipicolinato succinilasa y la succinildiaminopimelato
deacilasa, en la que aumenta la actividad intracelular de la
aspartato-semialdehído deshidrogenasa o la
fosfoenolpiruvato carboxilasa;
en un segundo aspecto, una bacteria
Escherichia en la que (1) aumentan las actividades
intracelulares de la dihidrodipicolinato sintasa, la aspartocinasa
y la dihidrodipicolinato reductasa y (2) aumenta/n la actividad
intracelular de la diaminopimelato deshidrogenasa o las actividades
intracelulares de la tetrahidrodipicolinato succinilasa y la
succinildiaminopimelato deacilasa, en la que aumentan la actividad
intracelular de la fosfoenolpiruvato carboxilasa y la actividad
intracelular de la nicotinamida adenina dinucleótido
transhidrogenasa o la aspartato-semialdehído
deshidrogenasa; y en un tercer aspecto, una bacteria
Escherichia en la que (1) aumentan las actividades
intracelulares de la dihidrodipicolinato sintasa, la aspartocinasa y
la dihidrodipicolinato reductasa y (2) aumenta/n la actividad
intracelular de la diaminopimelato deshidrogenasa o las actividades
intracelulares de la tetrahidrodipicolinato succinilasa y
succinildiaminopimelato deacilasa, en la que se aumentan las
actividades intracelulares de la fosfoenolpiruvato carboxilasa y
la nicotinamida adenina dinucleótido transhidrogenasa y la
actividad intracelular de la aspartato-semialdehído
deshidrogenasa o la aspartasa (en adelante se hará referencia a las
bacterias según los tres aspectos mencionados anteriormente en
conjunto como las "bacterias de la presente invención").
En las bacterias de la presente invención,
resulta preferido que aumenten las actividades intracelulares de la
aspartato-semialdehído deshidrogenasa y
aspartasa.
Además, en las bacterias de la presente
invención, se prefiere que la aspartocinasa, la dihidrodipicolinato
reductasa, la tetrahidrodipicolinato succinilasa, la
succinildiaminopimelato deacilasa, la fosfoenolpiruvato carboxilasa
y la aspartato-semialdehído deshidrogenasa deriven
cada una de una bacteria Escherichia, la nicotinamida
adenina dinucleótido transhidrogenasa y la aspartasa, si están
presentes, deriven cada una de una bacteria Escherichia, la
dihidrodipicolinato sintasa derive cada una de una bacteria
Escherichia o de una bacteria Brevibacterium y la
diaminopimelato deshidrogenasa derive de una bacteria
Brevibacterium.
En las bacterias de la presente invención
resulta preferido que la actividad intracelular de la enzima cuya
actividad intracelular se aumenta, se aumente mediante uno de los
puntos siguientes o cualquier combinación de los mismos.
(1) introducción de un plásmido que posee un
gen de la enzima.
(2) incrementar un número de copia de un gen de
la enzima en el cromosoma.
(3) modificación de una secuencia de un
promotor de un gen de la enzima en el cromosoma.
Además, en las bacterias de la presente
invención, resulta preferido que las actividades intracelulares de
la dihidrodipicolinato sintasa y la aspartocinasa aumenten mediante
el hospedaje de la dihidrodipicolinato sintasa cuya inhibición por
retroalimentación mediante L-lisina se insensibiliza
y la aspartocinasa cuya inhibición por retroalimentación mediante
L-lisina se insensibiliza y la actividad
intracelular de diaminopimelato deshidrogenasa aumenta mediante la
introducción de un gen de diaminopimelato deshidrogenasa.
La presente invención proporciona asimismo un
procedimiento para la producción de L-lisina, que
comprende cultivar cualquiera de las bacterias de la presente
invención en un medio adecuado para producir y acumular la
L-lisina en el cultivo y recoger la
L-lisina del cultivo (al que en adelante se hará
referencia asimismo como el "procedimiento de producción de la
presente invención").
\vskip1.000000\baselineskip
La fig. 1 representa un procedimiento para la
producción del plásmido RSF24P derivado de RSF1010 que contiene
dapA*24.
La fig. 2 representa un procedimiento para la
producción del plásmido RSFD80 que contiene dapA*24 y
lysC*80.
La fig. 3 representa un procedimiento para la
producción del plásmido pCAB1 que contiene dapA*24,
lysC*80 y dapB.
La fig. 4 representa un procedimiento para la
producción del plásmido pCABD2 que contiene dapA*24,
lysC*80, dapB y ddh.
La fig. 5 representa un procedimiento para la
producción del plásmido pCABDE1 que contiene dapA*24,
lysC*80, dapB, dapD y dapE.
La fig. 6 representa una estructura de plásmido
pppc que contiene ppc.
La fig. 7 representa una estructura de plásmido
pasd que contiene asd.
La fig. 8 representa un procedimiento para la
producción del plásmido pMW::THY que contiene pntAB
(pntA y pntB).
La fig. 9 representa un procedimiento para la
producción del plásmido pMW118::aspA que contiene aspA.
La fig. 10 representa un procedimiento para la
producción del plásmido ppcd que contiene ppc y
asd.
La fig. 11 representa un procedimiento para la
producción del plásmido pPTS que contiene ppc y pntAB.
La fig. 12 representa un procedimiento para la
producción del plásmido pAPW que contiene ppc y
aspA.
La fig. 13 representa un procedimiento para la
producción del plásmido pPTd que contiene ppc, pntAB
y asd.
La fig. 14 representa un procedimiento para la
producción del plásmido pAPT que contiene ppc, pntAB
y aspA.
La fig. 15 representa un procedimiento para la
producción del plásmido pAPTK que contiene ppc, pntAB
y aspA.
La fig. 16 representa un procedimiento para la
producción del plásmido pSd que contiene asd.
La fig. 17 representa un procedimiento para la
producción del plásmido pKD que contiene ppc, pntAB,
aspA y asd.
La fig. 18 representa un procedimiento para la
producción del plásmido pUTES que contiene tet^{pro}.
La fig. 19 representa un procedimiento para la
producción del plásmido pUEBL3, que contiene tet^{pro} y
dapA derivados de Brevibacterium lactofermentum
descendente de tet^{pro}.
La fig. 20 representa un procedimiento para la
producción del plásmido pCABD(B) que contiene dapA
derivado de Brevibacterium lactofermentum (Brev.
dapA), lysC, dapB y ddh.
\vskip1.000000\baselineskip
Las bacterias de la presente invención son
bacterias Escherichia en las que (1) aumentan las actividades
intracelulares de la dihidrodipicolinato sintasa, la aspartocinasa
y la dihidrodipicolinato reductasa y (2) aumenta/n la actividad
intracelular de diaminopimelato deshidrogenasa o las actividades
intracelulares de tetrahidrodipicolinato succinilasa y
succinildiaminopimelato deacilasa y aumentan también las actividades
intracelulares de las enzimas siguientes:
- (1)
- aspartato-semialdehído deshidrogenasa o fosfoenolpiruvato carboxilasa,
- (2)
- fosfoenolpiruvato carboxilasa y nicotinamida adenina dinucleótido transhidrogenasa a la que en adelante se hará referencia asimismo como "transhidrogenasa" o aspartato-semialdehído deshidrogenasa, o
- (3)
- fosfoenolpiruvato carboxilasa y transhidrogenasa y aspartato-semialdehído deshidrogenasa o aspartasa.
Las bacterias de la presente invención son
preferentemente bacterias Escherichia en las que aumentan
también las actividades intracelulares de la fosfoenolpiruvato
carboxilasa, de la transhidrogenasa, de la
aspartato-semialdehído deshidrogenasa y de la
aspartasa.
Las bacterias de la presente invención
pertenecen preferentemente a Escherichia coli (E.
coli).
En la presente memoria, la expresión de
"aumenta la actividad intracelular" significa que incrementa la
actividad enzimática intracelular comparada con la de una cepa
salvaje (por ejemplo, cepa W3110 de E. coli) o con la de una
cepa madre (cepa en la que no aumentan las actividades
intracelulares de todas las enzimas incluidas en las combinaciones
específicas de la presente invención) y significa también que una
bacteria que posee una actividad enzimática que no la posee una
cepa salvaje o una cepa madre. Son conocidos estos procedimientos
de medición para las actividades de las enzimas mencionadas
anteriormente y el aumento de las actividades intracelulares se
puede confirmar fácilmente por los expertos en la materia.
Los medios para aumentar las actividades
intracelulares incluyen los medios siguientes y las combinaciones
de los mismos, pero no está limitado a éstos.
En primer lugar, se pueden mencionar los medios
para incrementar la cantidad de expresión de las enzimas.
Específicamente, como medios para el incremento
de la cantidad de expresión de las enzimas, se pueden mencionar los
medios siguientes.
Se puede utilizar como el plásmido, el vector
autónomamente replicable en una célula de bacteria
Escherichia. Se puede introducir de una forma conocida. Esto
es, se puede insertar un gen de interés en el vector y se puede
transformar con ese vector una bacteria Escherichia. Este
vector es preferentemente un plásmido de tipo multicopia.
Los genes se pueden transportar mediante el
mismo plásmido o plásmidos diferentes. Algunos de los genes se
pueden transportar mediante el mismo plásmido. Cuando se utilizan
dos o más clases de plásmidos, resulta preferido utilizar plásmidos
que presenten sistemas de partición estables que capaciten la
coexistencia estable de estos plásmidos en una célula. El orden de
introducción de los genes no está limitado particularmente.
El número de copias se puede incrementar
mediante la amplificación del ADN en el ADN del cromosoma utilizando
el fago Mu o similar.
El ADN en el ADN del cromosoma puede ser uno de
los que originalmente posea la bacteria Escherichia o uno
incorporado en un cromosoma de un microorganismo huésped mediante un
procedimiento que utiliza la transducción, transposón (Berg, D.E.
and Berg C.M., Bio/Technol., 1, 417 (1983)), fago Mu (solicitud de
patente japonesa abierta al público nº 2-109985) o
una recombinación homóloga (Experiments in Molecular Genetics and
Cold Spring Harbor Lab. (1972)).
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Se puede modificar una secuencia de promotor
para incrementar la cantidad de transcripción de un gen y de este
modo incrementar la cantidad de expresión. Por ejemplo, se puede
aumentar un promotor mediante la introducción de una mutación en
el promotor para incrementar la cantidad de transcripción de un gen
localizado descendente en el promotor. Más que la introducción de
una mutación en el promotor, se puede introducir nuevamente un
promotor que puede funcionar en las bacterias Escherichia tal
como lac, trp, tac, trc y PL.
Alternativamente, la cantidad de transcripción de un gen se puede
incrementar mediante la introducción nuevamente de un aumentador.
Aunque la secuencia de promotor puede ser una para un gen de la
enzima en el cromosoma o una para un gen de la enzima en un
plásmido, resulta preferida una para el gen de la enzima en el
cromosoma. La introducción de genes tales como los promotores en el
ADN de cromosoma se describe en la solicitud de patente japonesa
abierta al público nº 1-215280, por ejemplo.
Los orígenes de los genes para las enzimas
mencionadas anteriormente no están limitados particularmente, y las
obtenidas de diversos orígenes se pueden utilizar siempre que se
puedan expresar los genes y los productos genéticos puedan
funcionar en las bacterias Escherichia.
En adelante, se ejemplificarán los
procedimientos para la obtención de los genes del sistema de
biosíntesis de la L-lisina y el gen de la
transhidrogenasa de E. coli y los genes de la
dihidrodipicolinato sintasa y de la diaminopimelato deshidrogenasa
de Brevibacterium lactofermentum.
Se puede obtener un gen de fosfoenolpiruvato
carboxilasa (ppc) del plásmido pS2 (Sabe, H. et al.,
Gene, 31, 279, (1984)) o pT2, que contiene este gen. Se puede
obtener un fragmento de ADN que contiene ppc mediante la
digestión de pS2 con AatII y AflII. Además, se puede
obtener también un fragmento de ADN que contiene ppc
mediante la digestión de pT2 con SmaI y ScaI. Se
depositó una cepa F15 de E. coli que hospeda pT2 (AJ12873)
en el National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency
of Industrial Science and Technology, Ministry of International
Trade and Industry (código postal 305-8566,
1-3 Higashi 1-chome,
Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japón) el
15 de julio de 1993 y se le asignó un número de registro de entrada
FERM P-13752. A continuación, se transfirió a un
depósito internacional bajo las disposiciones del Tratado de
Budapest del 11 de julio de 1994 y recibió el número de registro de
entrada FERM BP-4732.
Se puede obtener un gen de la aspartocinasa
(lysC) mediante la amplificación por PCR utilizando ADN de
cromosoma de E. coli como plantilla y dos clases de cebadores
de oligonucleótidos preparados basándose en la secuencia de
nucleótido conocida de lysC (Cassan, M., Parsot, C., Cohen,
G. N., y Patte, J.C., J. Biol. Chem., 261, 1052 (1986) (por
ejemplo, los mencionados en la publicación internacional nº
WO95/16042, nº de id. de sec. 5
y 6).
y 6).
Se puede obtener un gen de la
aspartato-semialdehído deshidrogenasa (asd) a
partir del plásmido pAD20 (Haziza, C. et al., EMBO, 1, 379
(1982)), que contiene este gen. Si se digiere pAD20 con AseI
y ClaI se obtendrá un fragmento de ADN que contiene
asd.
Se puede obtener un gen de la
dihidrodipicolinato sintasa (dapA) mediante la amplificación
por PCR utilizando ADN de cromosoma de E. coli como
plantilla y dos clases de cebadores de oligonucleótidos (por
ejemplo, los de los nº de id. de sec. 1 y 2 mencionados
anteriormente en la publicación internacional nº WO95/16042
preparados basándose en la secuencia de nucleótidos conocida de
dapA (Richaud, F. et al., J. Bacteriol., 297
(1986)).
Se puede obtener un gen de la
dihidrodipicolinato reductasa (dapB) mediante la
amplificación por PCR utilizando ADN de cromosoma de E. coli
como plantilla y dos clases de cebadores de oligonucleótido (por
ejemplo, los de los nº de id. de sec. 9 y 10 mencionados en la
publicación internacional nº WO95/16042) preparados basándose en la
secuencia de nucleótido conocida de dapB (Bouvier, J. et
al., J. Biol. Chem., 259, 14829 (1984)).
Se puede obtener un gen de la
tetrahidrodipicolinato succinilasa (dapD) mediante la
amplificación por PCR utilizando ADN de cromosoma de E. coli
como plantilla y dos clases de cebadores de oligonucleótido (por
ejemplo, los de los nº id. de sec. 15 y 16 mencionados en la
publicación internacional nº WO95/16042) preparados basándose en la
secuencia de nucleótidos conocida de dapD (Richaud, C. et
al., J. Biol. Chem., 259, 14824 (1984)).
Se puede obtener un gen de la
succinildiaminopimelato deacilasa (dapE) mediante la
amplificación por PCR utilizando ADN de cromosoma de E. coli
como plantilla y dos clases de cebadores de oligonucleótidos (por
ejemplo, los de los nº de id. de sec. 17 y 18 mencionados en la
publicación internacional nº WO95/16042) preparados basándose en la
secuencia de nucleótidos conocida de dapE (Bouvier, J. et
al., J. Bacteriol., 174, 5265 (1992)).
Se puede obtener un gen de aspartasa
(aspA) mediante la amplificación por PCR utilizando ADN de
cromosoma de E. coli como plantilla y dos clases de
cebadores de oligonucleótidos (por ejemplo, los de los nº de id. de
sec. 5 y 6 mencionados en el listado de secuencias de la presente
invención) preparados basándose en la secuencia de nucleótidos
conocida aspA (Woods, S.A. et al., Biochem. J. 237
(2), 547-557 (1986)).
Se puede preparar un gen de la transhidrogenasa
(pntAB) basándose en la secuencia de nucleótido conocida del
gen de la transhidrogenasa (D.M. Clarke et al., Eur. J.
Biochem., 158, 647-653 (1986)). En la E.
coli, la transhidrogenasa está compuesta por dos subunidades,
que se codifican por pntA y pntB, respectivamente
(D.M. Clarke et al., supra). Por lo tanto, se preparan
ambos genes (ver, por ejemplo, publicación internacional nº
WO95/11985).
Se puede obtener asimismo a partir de un
plásmido que contiene pntAB. Al igual que el plásmido que
contiene pntAB, se puede mencionar el plásmido pMW::THY
mencionado en la publicación internacional nº WO/9511985. Este
plásmido es un plásmido recombinante obtenido ligando un fragmento
de ADN de 3,0 kb de una cepa MC1061 K-12 de E.
coli, que contiene pntA y pntB y un fragmento
BamHI y HindIII del vector de plásmido pMW118. Se
diseñó una cepa JM109 de Escherichia coli que hospeda
pMW::THY como cepa AJ12929 y se depositó en el National Institute
of Bioscience and Human-Technology, Agency of
Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade
and Industry (código postal 305-0046,
1-3 Higashi 1-chome,
Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japón) el
4 de octubre de 1993 y se le asignó un número de registro de entrada
FERM P-13890. A continuación, se transfirió a un
depósito internacional bajo las disposiciones del Tratado de
Budapest del 11 de septiembre de 1994 y se le asignó un número de
registro de entrada FERM BP-4798.
Se puede obtener un gen de la
dihidrodipicolinato sintasa (dapA) de Brevibacterium
lactofermentum mediante amplificación por PCR utilizando un ADN
de cromosoma de Brevibacterium lactofermentum como plantilla
y dos clases de cebadores de oligonucleótidos (por ejemplo, los de
los nº id. de sec. 3 y 4 mencionados en la lista de secuencias de
la presente invención) preparados basándose en la secuencia de
nucleótido de dapA (Bonassie, S. et al., N.A.R., 18
(21), 6421 (1990)).
Se puede obtener un gen de la diaminopimelato
deshidrogenasa (ddh) de Brevibacterium
lactofermentum mediante amplificación por PCR utilizando un
ADN de cromosoma de Brevibacterium lactofermentum como
plantilla y dos clases de cebadores de oligonucleótido (por ejemplo
los de los nº de id. de sec. 11 y 12 mencionados en la publicación
internacional nº WO95/16042) preparados basándose en la secuencia de
nucleótidos conocida de ddh de Corynebacterium
glutamicum (Ishino, S. et al., Nucleic Acids Res., 15,
3917 (1987)).
Como medios para el aumento de las actividades
intracelulares, se pueden mencionar asimismo los medios para el
incremento de las actividades específicas de las enzimas. Estos
medios se pueden combinar con los medios para el incremento de las
cantidades de expresión de las enzimas.
En cuanto a los medios para el incremento de las
actividades específicas de las enzimas, se pueden mencionar la
introducción de una enzima que posee una mutación para incrementar
la actividad específica, la inclusión de una enzima en la que se
insensibilize su inhibición por retroalimentación, cuando la enzima
reciba la inhibición por retroalimentación y así sucesivamente.
Los ejemplos de la enzima cuya inhibición por
retroalimentación se insensibiliza incluyen la dihidrodipicolinato
sintasa (DDPS) cuya inhibición por retroalimentación mediante
L-lisina se insensibiliza y la aspartocinasa (AK)
cuya inhibición por retroalimentación mediante
L-lisina se insensibiliza.
La expresión "la inhibición por
retroalimentación mediante L-lisina" se
insensibiliza significa que la insensibilización sustancial de la
inhibición es suficiente y no se requiere que la inhibición se
debería insensibilizar completamente. Además, se incluye asimismo
en la enzima cuya inhibición por retroalimentación mediante
L-lisina se insensibiliza una enzima derivada de un
organismo diferente de las bacterias Escherichia,
independientemente de si es una enzima de tipo salvaje o mutante
del organismo, si el grado de la inhibición por retroalimentación
mediante L-lisina es inferior al de la enzima de
tipo salvaje derivado de una bacteria Escherichia. Por lo
tanto, está incluida también una enzima que está libre
originalmente de la inhibición por retroalimentación mediante
L-lisina tal como DDPS derivada de las bacterias
Brevibacterium.
El grado de la inhibición por retroalimentación
mediante L-lisina se puede evaluar mediante
procedimientos conocidos tales como los procedimientos descritos en
la publicación Internacional nº WO95/16042, ejemplos 1 y 2.
Como la DDPS cuya inhibición por
retroalimentación mediante L-lisina se insensibiliza
(DDPS insensibilizada) y la AK cuya inhibición por
retroalimentación mediante L-lisina se insensibiliza
(AK insensibilizada), se pueden mencionar las descritas en la
publicación internacional nº WO95/16042 y la solicitud de patente
japonesa abierta al público nº 10-113183.
Esto es, los ejemplos de la DDPS insensibilizada
incluyen los que poseen una mutación insensibilizadora de la
inhibición por retroalimentación mediante L-lisina
encontrada en la DDPS de tipo salvaje. Como la DDPS de tipo
salvaje, se pueden mencionar la derivada de la bacteria
Escherichia, especialmente la DDPS derivada de E.
coli. Ejemplos de la mutación que insensibiliza la inhibición
por retroalimentación mediante L-lisina de DDPS
incluyen:
- (1)
- mutación para la sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde al residuo de alanina en la posición 81 con otro residuo de aminoácido (preferentemente residuo de valina),
- (2)
- mutación para la sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde al residuo de histidina en la posición 118 con otro residuo de aminoácido (preferentemente residuo de tirosina), y
- (3)
- mutación para la sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde al residuo de alanina en la posición 81 con otro residuo de aminoácido (preferentemente residuo de valina) y para la sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde al residuo de histidina en la posición 118 con otro residuo de aminoácido (preferentemente residuo de tirosina) en la secuencia de aminoácido de DDPS mostrada como el nº de id. de sec. 4 en la publicación internacional nº WO95/16042 en la que la posición es considerada a partir del N terminal de la DDPS. Es bien conocido que pueden existir entre las especies o cepas las diferencias en la secuencia de aminoácido que no afectan la actividad y los expertos en la materia podrán reconocer fácilmente un residuo de aminoácido que corresponde a los residuos de aminoácido específicos mencionados anteriormente.
Otros ejemplos de la DDPS insensibilizada
incluye la DDPS derivada de las bacterias corineformes, por ejemplo,
Brevibacterium lactofermentum (Cremer J. et al., J.
Gen. Microbiol., 134, 3221-3229 (1988)).
Para hacer insensible la DDPS que se va a
hospedar en las bacterias Escherichia, por ejemplo, se puede
introducir el ADN que codificada la DDPS insensibilizada.
Ejemplos de ADN que codifican la DDPS
insensibilizada incluyen los correspondientes al ADN que codifica
una DDPS de tipo salvaje que posee una mutación para insensibilizar
la inhibición por retroalimentación mediante
L-lisina de la DDPS codificada.
En adelante, un procedimiento para la obtención
de ADN que codifica la DDPS insensibilizada (gen de DDPS
insensibilizado) se explicará mediante la ejemplificación de la
DDPS derivada de las bacterias Escherichia. En cuanto a la
DDPS de otros organismos, se puede obtener ADN de forma similar.
Además, si la DDPS de tipo salvaje derivada de otro organismo es
una DDPS insensibilizada, el ADN que la codifica se puede utilizar
tal como es.
El ADN que codifica la DDPS de tipo salvaje no
se limita de forma particular siempre que codifique la DDPS
derivada de la bacteria Escherichia. Específicamente, se
puede mencionar el ADN que codifica la secuencia de aminoácido que
se muestra en la publicación internacional nº WO95/16042, nº de id.
de sec. 4. Más específicamente, se puede mencionar la secuencia
representada por los números de nucleótido 272-1147
dentro de la secuencia de nucleótido mostrada en el nº de id. de
sec. 3 de la misma. En estas secuencias, una que posee una mutación
de la secuencia de nucleótido que causa la sustitución de los
residuos de aminoácido mencionados anteriormente es el ADN que
codifica una DDPS insensibilizada. Además, el tipo de codon que
corresponde al residuo de aminoácido no se limita particularmente,
siempre que codifique el residuo de aminoácido. Además, se espera
asimismo que exista una ligera diferencia en la secuencia de
aminoácido de la DDPS contenida entre las especies y cepas de
bacterias. Sin embargo, las que poseen tal diferencia que causa la
sustitución, la deleción o la inserción de residuos de aminoácido
en las posiciones que no afectan la actividad de la enzima están
comprendidas dentro del alcance del gen DDPS
insensibilizado.
insensibilizado.
Tal gen de DDPS insensibilizado se puede
obtener, por ejemplo, como se expone a continuación. En primer
lugar, el ADN que contiene un gen de la DDPS de tipo salvaje u otro
gen de la DDPS que posee una mutación se somete a un tratamiento de
mutación in vitro y el ADN experimenta el tratamiento de
mutación y se liga un ADN de vector compatible con un huésped para
preparar un ADN recombinante. El ADN recombinante se introduce en
los microorganismos huésped para obtener transformantes y se
selecciona de entre los transformantes un transformante que llega a
expresar una DDPS insensibilizada. Tal transformante se hospeda el
gen de la DDPS insensibilizado. Alternativamente, se pueden ligar
el ADN que contiene un gen de la DDPS de tipo salvaje u otro gen de
DDPS que posee un mutación y un ADN de vector compatible con un
huésped para preparar un ADN recombinante. A continuación, el ADN
recombinante se puede someter a un tratamiento de mutación in
vitro e introducirse en microorganismos huésped para obtener
transformantes y se puede seleccionar un transformante que llega a
expresar una DDPS insensibilizada. Tal transformante hospeda
asimismo el gen de la DDPS insensibilizado.
Además, un microorganismo que produce una DDPS
de tipo salvaje se puede someter a un tratamiento de mutación para
preparar una cepa de mutante que produce una DDPS insensibilizada y
a continuación un gen de DDPS insensibilizado se puede obtener a
partir de la cepa mutante. De forma alternativa, si un
transformante, en el cual se introduce un ADN recombinante ligado
con un gen de tipo salvaje, se somete a un tratamiento de mutación
para preparar una cepa de mutante que produce una DDPS
insensibilizada y a continuación se recoge un ADN recombinante a
partir de una cepa mutante, se crea un gen de la DDPS
insensibilizado en ese ADN.
Los ejemplos de agentes para el tratamiento de
la mutación in vitro de ADN incluyen hidroxilamina y así
sucesivamente. La hidroxilamina es un agente de tratamiento de
mutación químico que causa la sustitución de la citosina con
tiamina mediante el cambio de citosina en
N^{4}-hidroxicitosina. Cuando un microorganismo
en sí mismo se somete a un tratamiento de mutación, se lleva a cabo
el tratamiento con irradiación ultravioleta o un agente
mutagenizante habitualmente utilizado para la mutación artificial
tal como
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina
(NTG) y ácido nitroso.
Como bacteria donadora del ADN que contiene un
gen DDPS de tipo salvaje u otro gen de DDPS que contiene una
mutación, se puede utilizar cualquiera de los microorganismos que
pertenecen al género Escherichia. Específicamente, se pueden
utilizar los mencionados en la literatura de Neidhardt et al.
(Neidhardt, F.C. et al., Escherichia coli and
Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology,
Washington D.C., 1208, tabla 1). Por ejemplo, se pueden mencionar
la cepa JM109 y la cepa MC1061 de E. coli. Cuando se utiliza
una cepa salvaje como un donador de ADN que contiene un gen de
DDPS, se puede obtener el ADN que contiene un gen de DDPS de
tipo
salvaje.
salvaje.
Los ejemplos de la AK insensibilizada incluyen
los que poseen una mutación insensibilizadora de la inhibición por
retroalimentación mediante L-lisina encontrada en la
AK de tipo salvaje. En cuanto a la AK de tipo salvaje, se pueden
mencionar las derivadas de las bacterias Escherichia,
especialmente la aspartocinasa III (AKIII) derivada de E.
coli. Los ejemplos de la mutación que insensibiliza la
inhibición por retroalimentación mediante L-lisina
de AKIII incluyen:
- (a)
- la mutación para la sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde al residuo de glicina en la posición 323 con otro residuo de aminoácido (preferentemente residuo de aminoácido aspártico),
- (b)
- la mutación para la sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde al residuo de glicina en la posición 323 con otro residuo de aminoácido (preferentemente residuo de aminoácido aspártico) y la sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde al residuo de glicina en la posición 408 con otro residuo de aminoácido (preferentemente residuo de aminoácido aspártico),
- (c)
- la mutación para la sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde al residuo de arginina en la posición 34 con otro residuo de aminoácido (preferentemente residuo de cisteína) y la sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde al residuo de glicina en la posición 323 con otro residuo de aminoácido (preferentemente residuo de aminoácido aspártico),
- (d)
- la mutación para la sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde al residuo de leucina en la posición 325 con otro residuo de aminoácido (preferentemente residuo de fenilalanina),
- (e)
- la mutación para la sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde al residuo de metionina en la posición 318 con otro residuo de aminoácido (preferentemente residuo de isoleucina),
- (f)
- la mutación para la sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde al residuo de metionina en la posición 318 con otro residuo de aminoácido (preferentemente residuo de isoleucina) y la sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde al residuo de valina en la posición 349 con otro residuo de aminoácido (preferentemente residuo de metionina),
- (g)
- la mutación para la sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde al residuo de serina en la posición 345 con otro residuo de aminoácido (preferentemente residuo de leucina),
- (h)
- la mutación para la sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde al residuo de valina en la posición 347 con otro residuo de aminoácido (preferentemente residuo de metionina),
- (i)
- la mutación para la sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde al residuo de treonina en la posición 352 con otro residuo de aminoácido (preferentemente residuo de isoleucina),
- (j)
- la mutación para la sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde al residuo de treonina en la posición 352 con otro residuo de aminoácido (preferentemente residuo de isoleucina) y la sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde al residuo de serina en la posición 369 con otro residuo de aminoácido (preferentemente residuo de fenilalanina),
- (k)
- la mutación para la sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde al residuo de ácido glutámico en la posición 164 con otro residuo de aminoácido (preferentemente residuo de lisina),
- (l)
- la mutación para la sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde al residuo de metionina en la posición 417 con otro residuo de aminoácido (preferentemente residuo de isoleucina) y la sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde al residuo de cisteína en la posición 419 con otro residuo de aminoácido (preferentemente residuo de tirosina) en la secuencia de aminoácido AKIII que se muestra como el nº de id. de sec. 8 en la publicación internacional WO95/16042 en la que la posición se cuenta desde el N terminal de AKIII. Además, se puede mencionar una mutación para la sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde al residuo de glicina en la posición 323 con otro residuo de aminoácido (preferentemente residuo de ácido aspártico) y la sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde al residuo de metionina en la posición 318 con otro residuo de aminoácido (preferentemente el residuo de isoleucina) (solicitud de patente japonesa abierta al público nº 10-113183). Es bien conocido que la diferencia en la secuencia de aminoácido que no afecta la actividad puede ocurrir entre especies o cepas y se puede reconocer fácilmente por los expertos en la materia un residuo de aminoácido que corresponde a los residuos de aminoácido específicos mencionados anteriormente.
Otros ejemplos de la AK insensibilizada incluyen
la AK de tipo mutante derivada de las bacterias corineformes
(solicitud de patente japonesa abierta al público nº
6-62866).
Para hacer una AK insensibilizada que se va a
hospedar mediante bacterias Escherichia, por ejemplo, el ADN
que codifica la AK insensibilizada se puede introducir en las
bacterias Escherichia.
Los ejemplos del ADN que codifica la AK
insensibilizada incluyen los correspondientes al ADN que codifica
una AK de tipo salvaje que posee una mutación para la
insensibilización de la inhibición por retroalimentación mediante
L-lisina para la AK codificada.
En adelante, se explicará un procedimiento para
la obtención de ADN que codifica una AK insensibilizada mediante la
ejemplificación de AKIII derivada de las bacterias
Escherichia. En cuanto a la AK de otros organismos, se puede
obtener el ADN de forma similar. Además, si la AK de tipo salvaje
derivada de otro organismo es una AK insensibilizada, el ADN que la
codifica se puede utilizar tal como es.
El ADN que codifica una AKIII de tipo salvaje no
está limitado particularmente. Por ejemplo, se puede mencionar el
ADN que codifica la AKIII derivada de una bacteria
Escherichia, especialmente E. coli. Específicamente,
se pueden mencionar el ADN que codifica la secuencia de aminoácido
que se muestra en la publicación internacional nº WO95/16042, nº de
id. de sec. 8 y la secuencia representada por los números de
nucleótidos 584-1930 dentro de la secuencia de
nucleótido del nº de id. de sec. 7 en la misma. La AKIII de E.
coli se codifica mediante el gen
lysC.
lysC.
Entre estas secuencias, una que posee una
mutación que causa la sustitución de los residuos de aminoácido
mencionados anteriormente es el ADN que codifica una AKIII de tipo
mutante. Además, el tipo de codon que corresponde al residuo de
aminoácido sustituido no está limitado particularmente, siempre que
codifique el residuo de aminoácido. Además, se espera asimismo que
exista una ligera diferencia en la secuencia de aminoácido de la
AKIII contenida entra las especies y cepas bacterianas. Sin embargo,
las que poseen tal diferencia causante de la sustitución, deleción
o inserción de los residuos de aminoácido en las posiciones que no
afectan la actividad de la enzima caen dentro del alcance del gen
de AKIII mutante. Por ejemplo, la secuencia de nucleótido del gen
lysC de tipo salvaje obtenido en el ejemplo 2 mencionado a
continuación (publicación internacional nº WO95/16042, nº de id. de
sec. 7) posee diferencias en la secuencia en las posiciones 6 con
respecto a la secuencia de nucleótido ya publicada de lysC
de la cepa K-12 JC411 de E. coli (Cassan M.,
Parsot, C., Cohen, G.N., y Patte, J.C., J. Biol. Chem., 261, 1052
(1986)), entre los cuales dos de las diferencias proporcionan
diferentes residuos de aminoácido codificados (lysC de la
cepa JC411 proporciona la sustitución del residuo de glicina en la
posición 58 con un residuo de cisteína y la sustitución del residuo
de glicina en la posición 401 con un residuo de alanina en la
secuencia de aminoácido codificada por lysC mostrada en el
nº de id. de sec 8 de la publicación internacional nº WO95/16042 en
la que la posición se cuenta a partir del N terminal del mismo). Se
espera que incluso lysC que posee la misma secuencia que
lysC de la cepa JC411 K-12 de la E.
coli pueda proporcionar lysC que posee una mutación que
insensibiliza la inhibición por retroalimentación mediante
L-lisina, si se introduce cualquiera de las
mutaciones mencionadas en los anteriores (a) a (I) o una mutación
para la sustitución de un residuo de aminoácido que corresponde al
residuo de glicina en la posición 323 con otro residuo de aminoácido
(preferentemente residuo de ácido aspártico) y la sustitución de un
residuo de aminoácido que corresponde al residuo de metionina en la
posición 318 con otro residuo de aminoácido.
Se puede obtener tal ADN que codifica una AKIII
de tipo mutante cuya inhibición por retroalimentación mediante
L-lisina se insensibiliza, por ejemplo, como se
expone a continuación. En primer lugar, el ADN que contiene un gen
de AKIII de tipo salvaje u otro gen de AKIII que posee una mutación
se somete a un tratamiento de mutación in vitro y el ADN
experimenta el tratamiento de mutación y se liga un ADN vector
compatible con un huésped para preparar un ADN recombinante. El ADN
recombinante se puede introducir en los microorganismos huésped
para obtener transformantes y se puede seleccionar de entre los
transformantes un transformante que logre expresar una AKIII de
tipo mutante. Tal transformante hospeda el gen de tipo mutante. De
forma alternativa, el ADN que contiene un gen AKIII de tipo salvaje
y otro gen AKIII que posee una mutación y un ADN vector compatible
con un huésped se pueden ligar para preparar un ADN recombinante. A
continuación, el ADN recombinante se puede someter a un tratamiento
de mutación in vitro e introducirse en microorganismos
huéspedes para obtener transformantes y se puede seleccionar de
entre los transformantes un transformante que logre expresar una
AKIII de tipo mutante. Tal transformante hospeda asimismo el gen de
tipo mutante.
Además, un microorganismo que produce una enzima
de tipo salvaje se puede someter a tratamiento de mutación para
preparar una cepa mutante que produce una enzima de tipo mutante y a
continuación se puede obtener a partir de la cepa mutante un gen de
tipo mutante. Los ejemplos de agentes para someter directamente ADN
a un tratamiento de mutación incluyen hidroxilamina y así
sucesivamente. La hidroxilamina es un agente de tratamiento de
mutación químico que causa la sustitución de citosina con tiamina
cambiando la citosina en N^{4}-hidroxicitosina.
Cuando un microorganismo en si mismo se somete a un tratamiento de
mutación, el tratamiento se lleva a cabo con irradiación
ultravioleta o un agente mutagenizante habitualmente utilizado para
la mutación artificial tal como
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina
(NTG).
Como bacteria donadora de ADN que contiene un
gen AKIII de tipo salvaje u otro gen AKIII que posee una mutación,
se pueden utilizar cualquiera de los microorganismos que pertenecen
al género Escherichia. De forma específica, se pueden
utilizar los mencionados en la literatura de Neidhardt et al.
(Neidhardt, F.C. et al., Escherichia coli and
Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology,
Washington D.C., 1208, tabla 1). Por ejemplo, se pueden mencionar
la cepa JM109, la cepa MC1061 de E. coli y así
sucesivamente.
En las bacterias de la presente invención,
resulta preferido que la aspartocinasa, dihidrodipicolinato
reductasa, tetrahidrodipicolinato succinilasa,
succinildiaminopimelato deacilasa, fosfoenolpiruvato carboxilasa y
aspartato-semialdehído deshidrogenasa deriven cada
una de las bacterias Escherichia, nicotinamida adenina
dinucleótido transhidrogenasa y aspartasa, si están presentes,
deriven cada una de las bacterias Escherichia,
dihidrodipicolinato sintasa derive de una bacteria
Escherichia o de una bacteria Brevibacterium y
diaminopimelato deshidrogenasa derive de la bacteria
Brevibacterium.
Los ejemplos de las bacterias
Brevibacterium incluyen, además de Brevibacterium
lactofermentum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium
divaricatum, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium
lilium y así sucesivamente.
Además, en las bacterias de la presente
invención, resulta preferido que aumenten las actividades
intracelulares de la dihidrodipicolinato sintasa y la aspartocinasa
mediante la inclusión de dihidrodipicolinato sintasa cuya
inhibición por retroalimentación mediante L-lisina
se insensibiliza y la aspartocinasa cuya inhibición por
retroalimentación mediante L-lisina se insensibiliza
y la actividad intracelular de diaminopimelato deshidrogenasa
aumenta mediante la introducción de un gen de diaminopimelato
deshidrogenasa. Tales bacterias preferidas de la presente invención
se pueden obtener mediante la introducción de los plásmido pCABD2 o
pCABDE1 mencionados en la publicación internacional nº WO95/16042
en una bacteria Escherichia.
\vskip1.000000\baselineskip
La L-lisina se puede producir de
forma eficiente mediante el cultivo de las bacterias de la presente
invención obtenida según se ha descrito anteriormente en un medio
adecuado para producir y acumular la L-lisina en el
cultivo y recoger la L-lisina del cultivo.
El medio utilizado para el cultivo de las
bacterias según la presente invención puede ser un medio habitual
que contiene una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, iones
inorgánicos y otros nutrientes traza orgánicos según se
requiera.
Como fuente de carbono, es posible utilizar
azúcares tales como glucosa, lactosa, galactosa, fructosa e
hidrolizado de almidón; alcoholes tales como glicerol y sorbitol; o
ácidos orgánicos tales como ácido fumárico, ácido cítrico y ácido
succínico.
Como fuente de nitrógeno, es posible utilizar
sales de amonio inorgánico tales como sulfato de sodio, cloruro de
amonio o fosfato de amonio, nitrógeno orgánico tal como hidrolizado
de soja; gas amoníaco o amoníaco acuoso.
En cuanto a los nutrientes traza orgánicos, se
prefiere añadir sustancias requeridas tales como la vitamina
B_{1} y L-isoleucina, extracto de levadura y así
sucesivamente en una cantidad adecuada. Además de estos, se añadió
una pequeña cantidad de fosfato de potasio, sulfato de magnesio,
iones de hierro, iones de manganeso y así sucesivamente.
El cultivo se lleva a cabo preferentemente bajo
una condición aeróbica durante 16-72 horas. La
temperatura de cultivo se puede controlar para que sea de 20ºC a
45ºC y el pH se puede controlar para que sea de 5 a 8 durante el
cultivo. Se pueden utilizar para el ajuste de pH las sustancias
inorgánicas u orgánicas, ácidas o alcalinas además del gas amoníaco
y así sucesivamente.
La recogida de la L-lisina a
partir del licor de fermentación se lleva a cabo habitualmente
mediante una combinación de un procedimiento de resina de
intercambio iónico, un procedimiento de precipitación y otras
técnicas conocidas.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se explicará
adicionalmente de forma específica en adelante haciendo referencia a
los ejemplos siguientes.
\newpage
Ejemplo
1
Los plásmidos mostrados a continuación se
introdujeron en E. coli W3110 (tyrA).
- Nombre del plásmido
- Gen contenido
- RSF24P
- dapA*
- RSFD80
- dapA*, lysC*
- pCAB1
- dapA*, lysC*, dapB
- pCABD2
- dapA*, lysC*, dapB, ddh
- pCABD(B)
- Brev. dapA, lysC*, dapB, ddh
- pCABDE1
- dapA*, lysC*, dapB, dapD, dapE
\vskip1.000000\baselineskip
Las abreviaciones utilizadas para los genes
poseen los significados siguientes.
ppc: fosfoenolpiruvato carboxilasa
lysC: aspartocinasa III
lysC*: aspartocinasa III insensibilizada
a la inhibición
asd:
aspartato-semialdehído deshidrogenasa
dapA: dihidrodipicolinato sintasa
dapA*: dihidrodipicolinato sintasa
insensibilizada a la inhibición
Brev. dapA: dihidrodipicolinato sintasa
insensibilizada a la inhibición (derivada de Brevibacterium
lactofermentum)
dapB: dihidrodipicolinato reductasa
dapD: tetrahidrodipicolinato
succinilasa
dapE: succinildiaminopimelato
deacilasa
ddh: diaminopimelato deshidrogenasa
(derivada de Brevibacterium lactofermentum)
\vskip1.000000\baselineskip
Los plásmidos RSF24P, RSFD80, pCAB1, pCABD2 y
pCABDE1 se describen en la publicación internacional nº WO95/16042.
Las construcciones de los mismos se describen asimismo en la
publicación internacional nº WO95/16042 y se describen a
continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Basándose en la secuencia de nucleótido conocida
dapA de E. coli (J. Bacteriol., 166, 297 (1986)), se
amplificó mediante PCR un fragmento que contenía la secuencia SD y
el marco de lectura abierto (ORF) de dapA. El fragmento
amplificado se ligó a un vector de clonación pCR1000 para obtener un
plásmido pdapA2, en el que dapA se ligó de forma que la
dirección de transcripción de dapA fuese al revés de la
dirección de transcripción mediante el promotor lacZ en el
pCR1000. El plásmido pdapA2 se sometió a un tratamiento de
mutagénesis utilizando hidroxilamina y el pdapA2 sometido a un
tratamiento de mutagénesis se introdujo en W3110 de E. coli.
A partir de los transformantes, se seleccionaron los que muestran la
resistencia AEC. Además, se midió el grado de inhibición mediante
L-lisina de DDPS codificada mediante los plásmidos
hospedados por las cepas resistentes seleccionadas y se seleccionó
una cepa que se insensibilizó a la inhibición mediante
L-lisina. El plásmido pdapA24, que se confirmó que
poseía el cambio de 597ºC a T mediante la secuenciación, se ligó a
pVIC40 en una posición descendente del promotor del gen de
resistencia a la tetraciclina para obtener RSF24P (fig. 1).
Una cepa JM109 de E. coli a la que se
introdujo RSF24P se designó como AJ12395 y se depositó en el
National Institute of Bioscience and
Human-Technology, Agency of Industrial Science and
Technology, Ministry of International Trade and Industry (código
postal 305-8566, 1-3 Higashi
1-chome, Tsukuba-shi,
Ibaraki-ken, Japón) el 28 de octubre de 1993 y
recibió el número de registro de entrada FERM
P-13935. A continuación, se transfirió a un
depósito internacional bajo las disposiciones del Tratado de
Budapest del 1 de noviembre de 1994 y recibió el número de registro
de entrada FERM BP-4858.
Basándose en la secuencia de nucleótido conocida
lysC de E. coli (J. Biol. Chem, 261, 1052 (1986)), se
amplificó mediante PCR un fragmento que contenía la secuencia SD y
ORF de lysC. El fragmento amplificado se ligó a un vector
multicopia pUC18 para obtener un plásmido pLYSC1, en el que se ligó
lysC de forma que la dirección de transcripción de
lysC era al revés de la dirección de transcripción mediante
el promotor lacZ en pUC18. El plásmido pLYSC1 se sometió a
un tratamiento de mutagénesis utilizando hidroxilamina y el pLYSC1
sometido a un tratamiento de mutagénesis se introdujo en GT3 de
E. coli. A partir de los transformantes, se seleccionaron
las que mostraban resistencia a AEC y resistencia a la
L-lisina. Adicionalmente, pLYSC1 se introdujo en
MC1061 de E. coli, a continuación las células se sometieron a
un tratamiento de mutagénesis mediante la utilización de
hidroxilamina y se seleccionaron los que mostraban resistencia a AEC
y a la L-lisina. Además, se midió el grado de
inhibición mediante L-lisina y la estabilidad
térmica de la AK codificada por los plásmidos hospedados por las
cepas resistentes seleccionadas y se seleccionó una cepa que se
insensibilizó a la inhibición mediante L-lisina y
que mostró una estabilidad superior. El plásmido pLYSC1*80, que se
confirmó que había cambiado a 352ºC a T mediante la secuenciación,
se ligó a pHSG399 en una posición descendente a partir del promotor
lacZ para obtener pLLC*80. A partir de pLLC*80 y RSF24P, se
construyó RSFD80 según se muestra en la fig. 2.
Una cepa JM109 de E. coli a la que se
introdujo RSFD80 se designó como AJ12396 y se depositó en el
National Institute of Bioscience and
Human-Technology, Agency of Industrial Science and
Technology, Ministry of International Trade and Industry (código
postal 305-8566, 1-3 Higashi
1-chome, Tsukuba-shi,
Ibaraki-ken, Japón) el 28 de octubre de 1993 y
recibió el número de registro de entrada FERM
P-13936. A continuación, se transfirió a un
depósito internacional bajo las disposiciones del Tratado de
Budapest del 1 de noviembre de 1994 y recibió el número de registro
de entrada FERM BP-4859.
Basándose en la secuencia de nucleótido conocida
dapA (Bouvier, J. et al., J. Biol. Chem, 259, 14829
(1984)), dapA se amplificó a partir del ADN de cromosoma de
la cepa W3110 de E. coli. El fragmento de ADN amplificado
obtenido se digirió con AseI y DraI y se hicieron los
extremos romos al fragmento obtenido y se insertó en el sitio
SmaI de pMW119 para obtener un plásmido pdapB.
Posteriormente, se introdujo dapB en RSFD80 según se muestra
en la fig. 3 para obtener pCAB1.
Basándose en la secuencia de nucleótido conocida
ddh de Corynebacterium glutamicum (Ishino, S.
et al., Nucleic Acids Res., 15, 3917 (1987)), se amplificó
mediante PCR la ddh a partir del ADN de cromosoma de
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869. El fragmento de ADN
amplificado obtenido se digirió con EcoT22I y AvaI y
se hicieron los extremos romos al fragmento obtenido y se insertó en
el sitio SmaI de pMW119 para obtener el plásmido
pddh. Posteriormente, se introdujo ddh en pCAB1 según
se muestra en la fig. 4 para obtener el plásmido pCABD2.
Basándose en la secuencia de nucleótido conocida
dapD (Richaud, C. et al., J. Biol. Chem., 259,14824
(1984)), se amplificó mediante PCR la dapD a partir de ADN
de cromosoma de la cepa W3110 de E. coli. El fragmento de
ADN amplificado obtenido se digirió con Eco0109I y
SacI, se hicieron los extremos romos del fragmento obtenido
y se insertó en el sitio SmaI de pMW118 para obtener un plásmido
pdapD. Adicionalmente, basándose en la secuencia de nucleótido
conocida dapE (Bouvier, J. et al., J. Bacteriol., 174,
5265 (1992)) se amplificó dapE mediante PCR a partir de ADN
de cromosoma de la cepa W3110 de E. coli. El fragmento de ADN
amplificado obtenido se digirió con MunI y Bg1II, se
hicieron romos los extremos del fragmento obtenido y se insertó en
el sitio SmaI de pMW118 para obtener un plásmido pdapE.
Adicionalmente, se extirpó dapE a partir de pdapE y se insertó en
pdapD para obtener un plásmido pMWdapDE1 que contenía tanto
dapE como dapD. Según se muestra en la fig. 5 un
fragmento que contenía dapE y dapD se extirpó de pMWdapDE1 y
se insertó en pCAB1 para obtener pCABDE1.
Se construyó un plásmido pCABD(B) como se
expone a continuación.
En primer lugar, un fragmento de ADN que
contenía un promotor de sitio del gen de resistencia Tet se
amplificó a partir de pBR322 mediante cebadores que poseían las
secuencias siguientes.
| 5'-TCAAGAATTCTCATGTTTGA-3' | (Nº DE ID. DE SEC.: 1) |
| 5'-GTTAGATTTGGTACCCGGTGCCTGACTGCGTTAGC-3' | (Nº DE ID. DE SEC.: 2) |
El fragmento de ADN amplificado se digirió con
KpnI y EcoRI y se insertó entre los sitios de escisión
KpnI y EcoRI de pUC18 para obtener pUTES (fig.
18).
A continuación, el gen dpaA de
Brev. se amplificó utilizando cebadores que poseían las
secuencias siguientes y el ADN de cromosoma de la cepa
Brevibacterium lactofermentum Ysr como plantilla.
| 5'- GGTTGTGGTACCCCCAAATGAGGGAAGAAG-3' | (Nº DE ID. DE SEC.: 3) |
| 5'- TGGAACCTCTGTTGCTGCAG-3' | (Nº DE ID. DE SEC.: 4) |
\vskip1.000000\baselineskip
El gen dapA de Brev. amplificado
se digirió con KpnI y BamHI y se insertó entre los
sitios de escisión KpnI y BamHI de pUTES para obtener
pUEBL3 (fig. 19).
A continuación, pUEBL3 se digirió con
EcoRI y XbaI y se hicieron romos ambos extremos para
obtener un fragmento que contenía dapA Brev. A continuación,
pCABD2 mencionado en la publicación internacional nº WO95/16042 se
digirió con NheI y SpeI y se hicieron romos ambos
extremos. Se recogió un fragmento que contenía lysC,
dapB y ddh y a continuación se le insertó el fragmento
obtenido previamente que contenía dapA Brev. para obtener
pCABD(B) (fig. 20).
Mientras W3110 de E. coli (tyrA)
se detalla en la publicación de patente europea nº 488424, el
procedimiento de preparación se explicará por lo tanto brevemente a
continuación. La cepa W3110 de E. coli se obtuvo a partir
del National Institute of Genetics (Shizuoka-ken,
Mishima-shi). La cepa se inoculó en una placa LB
que contenía estreptomicina y se seleccionó la cepa que formaba una
colonia para obtener una cepa resistente a la estreptomicina. La
cepa resistente a la estreptomicina seleccionada y la cepa ME8424
K-12 de E. coli se mezclaron y se cultivaron
en un medio completo (L-Broth: 1% de Bactotriptona,
0,5% de extracto de levadura, 0,5% de NaCl) como cultivo
estacionario a 37ºC durante 15 minutos para inducir la conjugación.
La cepa ME8424 K-12 de E. coli posee unas
características genéticas de HfrPO45, thi, relA1,
tyrA::Tn10, ung-1 y nadB y se puede obtener a
partir del National Institute of Genetics.
A continuación, se inoculó el cultivo en un
medio completo (L-Broth: 1% de Bacto trypton, 0,5%
de extracto de levadura, 0,5% de NaCl, 1,5% de agar), que contenía
estreptomicina, tetraciclina y L-tirosina y se
seleccionó una cepa que formó una colonia. Esta cepa se designó
como cepa W3110 (tyrA) de E. coli.
Muchas cepas formadas mediante la introducción
de un plásmido en la cepa W3110 (tyrA) se describen en la
publicación de patente europea nº 488424. Por ejemplo, se designó
una cepa obtenida mediante la introducción de un plásmido pHATerm
como cepa W3110 (tyrA) de E. coli/pHATerm (cepa
AJ12662 de E. coli) y se depositó en el National Institute
of Bioscience and Human-Technology, Agency of
Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade
and Industry (código postal 305-8566,
1-3 Higashi 1-chome,
Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japón) de
16 de noviembre de 1991 como un depósito internacional y recibió un
número de registro de entrada FERM BP-3653. La cepa
(tyrA) W3110 se puede obtener asimismo mediante la
eliminación del plásmido pHATerm a partir de la cepa W3110
(tyrA) de E. coli/ pHATerm. La eliminación de plásmido
se puede llevar a cabo de una forma
convencional.
convencional.
\vskip1.000000\baselineskip
Como plásmido que contiene asd y como plásmido
que contiene ppc, se utilizaron pasd y pppc descritos en la
publicación internacional nº WO95/16042. Las construcciones de estos
plásmidos se detallaron en la publicación internacional nº
WO95/16042. Los esquemas son como se exponen a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvo el plásmido asd a partir de un
plásmido pAD20 (Haziza, C. et al., EMBO, 1, 379, (1982)) que
contenía el gen. El plásmido pAD20 se digirió con AseI y
ClaI, se hicieron los extremos romos y se insertó en el
sitio SmaI de pMW118 para obtener un plásmido pasd (fig.
8).
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pppc se obtuvo a partir de un
plásmido pT2 que contenía el gen. El plásmido pT2 se digirió con
SmaI y ScaI, se hicieron los extremos romos y se
insertó en el sitio SmaI de pMW118 para obtener un plásmido
pppc (fig. 9). Se depositó una cepa F15 de E. coli (AJ12873)
que hospeda pT2 en el National Institute of Bioscience and
Human-Technology, Agency of Industrial Science and
Technology, Ministry of International Trade and Industry (código
postal 305-8566, 1-3 Higashi
1-chome, Tsukuba-shi,
Ibaraki-ken, Japón) del 15 de julio de 1993 y
recibió el número de registro de entrada FERM
P-13752. A continuación, se transfirió a un
depósito internacional bajo las disposiciones del Tratado de
Budapest del 11 de julio de 1994 y recibió el número de registro de
entrada FERM BP-4732.
Se construyó como sigue un plásmido que contenía
aspA.
El gen aspA de E. coli se
amplificó utilizando cebadores que poseen las secuencias
siguientes.
| 5'-TGATCAGCGAAACACTTTTA-3' | (Nº DE ID. DE SEC.: 5) |
| 5'-CAGCAAACTATGATGAGAA-3' | (Nº DE ID. DE SEC.: 6) |
A continuación, el fragmento amplificado
obtenido se insertó en el sitio de escisión SmaI de pMW118
(Nippon Gene) para obtener pMW118::aspA (fig. 9).
Cada uno de pMW118 (plásmido de control), pasd,
pppc y pMW118::aspA (plásmido comparativo) se introdujeron en cada
una de W3110 de E. coli (tyrA) y los transformantes
que se obtuvieron en el <1> mencionado anteriormente. Los
transformantes obtenidos, excepto los obtenidos mediante la
introducción de pMW118, pasd, pppc o pMW118::aspA en W3110 de E.
coli (tyrA), contenían dos clases de plásmidos, es decir,
uno de pMW118, pasd, pppc y pMW118::aspA y uno de RSF24P, RSFD80,
pCAB1, pCABD2, pCABD(B) y pCABDE1. Se examinaron estos
transformantes para ver la productividad de L-lisina
mediante el procedimiento descrito en la publicación internacional
nº WO95/16042. El procedimiento específico fue como sigue.
Las células se cultivaron en 20 ml de un medio
que poseía la composición siguiente contenida en un matraz
Sakaguchi de 500 ml a una temperatura de 37ºC durante 30 horas con
agitación a 114-116 rpm.
\vskip1.000000\baselineskip
(Composición del
medio)
- Glucosa
- 40 g/l
- MgSO_{4}\cdot7H_{2}O
- 1 g/l
- (NH_{4})_{2}SO_{4}
- 16 g/l
- KH_{2}PO_{4}
- 1 g/l
- FeSO_{4}\cdot7H_{2}O
- 0,01 g/l
- MnSO_{4}\cdot5H_{2}O
- 0,01 g/l
- Extracto de levadura (Difco)
- 2 g/l
- L-tirosina
- 0,1 g/l
\vskip1.000000\baselineskip
Se ajustaron a un pH de 7,0 con KOH, y se
pusieron en un autoclave a 115ºC durante 10 min (glucosa y
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O se esterilizaron de forma separada).
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O se esterilizaron de forma separada).
- CaCO_{3}
- 25 g/l
(según la farmacopea de Japón,
esterilizado mediante aire seco a 180ºC durante 2
días).
\vskip1.000000\baselineskip
Antibiótico (20 mg/l de estreptomicina, 50 mg/l
de ampicilina o 25 mg/l de canamicina dependiendo de la clase de
plásmido que se va a introducir).
La L-lisina en el caldo de
cultivo (medio posterior al cultivo) se cuantificó utilizando el
Biotech Analyzer AS210 fabricado por Asahi Chemical Industry Co.,
Ltd.
\newpage
Los resultados se muestran en la tabla 1. En la
tabla, la cantidad de L-lisina se indica en términos
de mg por el del medio.
Según se puede ver a partir de los resultados
que se muestran en la tabla 1, cuando asd o ppc
aumentaron cada uno solos o juntos con dapA (RSF24P),
dapA + lysC (RSFD80) o dapA + lysC +
dapB (pCAB1) en E. coli, la cantidad de producción de
L-lisina (cantidad acumulada) no cambió o solo
cambió ligeramente y, en cuanto a asd, se podría reducir
comparada con el caso en que asd o ppc no aumentaron
(de -180 a 20 mg/dl en cuanto a asd, de 10 a 30 mg/dl en
cuanto a ppc). En contraste, si se aumentaron juntos con
dapA + lysC + dapB + ddh (pCABD2) o
dapA + lysC + dapB + dapD + dapE
(pCABDE1) se observó un incremento notable de la cantidad de la
producción de la L-lisina comparada con el caso en
que asd o ppc no aumentó (70 mg/dl en cuanto a
asd, 90 mg/dl en cuanto a ppc). Sin embargo, cuando
aspA se incrementó con dapA + lysC +
dapB + ddh (pCABD2) no se observó un notable
incremento de la cantidad de producción de L-lisina.
Además, incluso cuando se utilizó dapA derivado de
Brevibacterium lactofermentum en lugar de dapA
derivado de Escherichia coli (pCABD (B)), se obtuvo el mismo
efecto que el caso en que se utilizó dapA derivado de
Escherichia coli (pCABD2). Por lo tanto, el origen de
los genes no se considera importante, pero es importante la
combinación de los mismos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se construyeron como sigue un plásmido que
contenía ppc y asd, un plásmido que contenía
ppc y pntAB y un plásmido que contenía ppc y
aspA.
El plásmido pasd descrito en la publicación
internacional nº WO95/16042 se digirió con KpnI y SphI
y se hicieron romos ambos extremos del fragmento de ADN que
contenía asd. A continuación, el ppc descrito en la
publicación internacional nº WO95/16042 se digirió con XbaI y
se hicieron romos ambos extremos y el fragmento asd obtenido
anteriormente se insertó en el mismo para obtener ppcd (fig.
10).
El plásmido pMW::THY descrito en la publicación
internacional nº WO95/11985 se digirió con SmaI y
HindIII y se recogió el fragmento de ADN que contenía
pntAB. A continuación, el ppc descrito en la
publicación internacional nº WO95/16042 se digirió con XbaI,
se hicieron romos ambos extremos y se digirió con HindIII y
el fragmento pntAB obtenido anteriormente se insertó en el
sitio de escisión para obtener pPTS (fig. 11).
La construcción del plásmido pMW::THY se detalló
en la publicación internacional nº WO95/11985. Se describirá a
continuación.
Basándose en las secuencias de nucleótidos
conocidas pntA y pntB de E. coli (D. M. Clarke
et al., Eur. J. Biochem., 158, 647-653
(1986)), se amplificó mediante PCR un fragmento que contenía ambos
genes incluyendo las regiones que poseían actividad de promotor. El
fragmento de ADN amplificado se digirió con BamHI y
HindIII y el fragmento de ADN obtenido se ligó al vector
plásmido pMW118 (Nippon Gene) digerido con BamHI y
HindIII para obtener pMW::THY (fig. 8).
La cepa JM109 de E. coli en la que se
introdujo pMW118::THY se designó como AJ12929 y se depositó en el
Nacional Institute of Bioscience and
Human-Technology, Agency of Industrial Science and
Technology, Ministry of Internacional Trade and Industry (código
postal 305-8566, 1-3 Higashi
1-chome, Tsukuba-shi,
Ibaraki-ken, Japón) el 4 de octubre de 1993 y
recibió el número de entrada FERM P-13890. A
continuación, se transfirió a un depósito internacional bajo las
disposiciones del Tratado de Budapest del 14 de septiembre de 1994,
y recibió el número de registro de entrada FERM
BP-4798.
El plásmido pMW118::aspA descrito en el ejemplo
1 mencionado anteriormente se digirió con SacI, se hicieron
romos ambos extremos y a continuación se digirió con HindIII
para obtener un fragmento de ADN que contenía aspA. A
continuación, el pppc descrito en la publicación internacional nº
WO95/16042 se digirió con XbaI, se hicieron romos ambos
extremos y a continuación se digirió con HindIII y el
fragmento aspA obtenido anteriormente se insertó en el sitio
de escisión de HindIII para obtener pAPW (fig. 12).
Se introdujeron pppc (plásmido de referencia),
ppcd, pPTS y pAPW (plásmido comparativo) cada uno en un
transformante introducido en pCABD2 que se obtuvo en el ejemplo 1
mencionado anteriormente. Los transformantes obtenidos contenían
dos clases de plásmidos, es decir, uno de pppc, ppcd, pPTS, pAPW y
pCABD2. Estos transformantes se examinaron para la productividad de
L-lisina de la misma manera que en el ejemplo 1
<2>.
Los resultados se muestran en la tabla 2.
Según se ve claramente a partir de los
resultados que se muestran en la tabla 2, cuando asd o
pntAB se aumentaron junto con dapA + lysC +
dapB + ddh + ppc (ppcd o pPTS),
se observó un notable incremento de la cantidad de producción de
L-lisina (80 mg/dl en cuanto a
asd, 70 mg/dl en cuanto a pntAB). En cuanto a
aspA, sin embargo, incluso cuando aspA se incrementó
junto con dapA + lysC + dapB + ddh +
ppc (pAPW), no se observó un notable aumento de la
cantidad de producción de la L-lisina.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se construyó tal como sigue un plásmido que
contenía los genes de ppc, pntAB y asd y un
plásmido que contenía ppc, pntAB y aspA.
El plásmido pasd descrito en la publicación
internacional nº WO95/16042 se digirió con KpnI y SphI
y se hicieron romos ambos extremos en el fragmento de ADN que
contenía asd. A continuación, pPTS descrito en el ejemplo 2
mencionado anteriormente se digirió con HindIII y se hicieron
romos los extremos y se insertó el fragmento asd obtenido
anteriormente en el sitio de escisión de HindIII para obtener
pPTd (fig. 13).
El plásmido pMW::THY descrito en la publicación
internacional nº WO95/11985 se digirió con SmaI y
HindIII para obtener un fragmento de ADN que contenía
pntAB. A continuación, el pAPW descrito en el ejemplo 2
mencionado anteriormente se digirió con XbaI, se hicieron
romos ambos extremos y se digirió además con HindIII. El
fragmento obtenido anteriormente que contenía pntAB se
insertó en el sitio de escisión de HindIII para obtener pAPT
(fig. 14).
Se introdujeron pPTS (plásmido de referencia),
pPTd o pAPT en un transformante introducido en un pCABD2 que se
obtuvo en el ejemplo 1 mencionado anteriormente. Los transformantes
obtenidos contenían dos clases de plásmidos, es decir, uno de pPTS,
pPTd y pAPT y pCABD2. Estos transformantes se examinaron para la
productividad de la L-lisina de la misma manera que
en el ejemplo 1 <2>.
Los resultados se muestran en la tabla 3.
Según se aprecia claramente a partir de los
datos que se muestran en la tabla 3, cuando asd o aspA
se aumentaron juntos con dapA + lysC + dapB +
ddh + ppc + pntAB (pPTd o pAPT) se apreció un
notable incremento de la cantidad de producción de
L-lisina (60 mg/dl en cuanto a asd, 50 mg/dl
en cuanto a aspA).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Se construyó un plásmido que contenía
ppc, pntAB, asd y aspA como sigue.
El plásmido pAPT descrito en el ejemplo 3
mencionado anteriormente se digirió con HindIII, se hicieron
romos ambos extremos y se digirió adicionalmente con SmaI
para obtener un fragmento de ADN que contenía ppc,
aspA y pntAB. A continuación, pMW218 (Nippon gene) se
digirió con EcoRI y se hicieron romos ambos extremos y el
fragmento de ADN obtenido anteriormente que contenía ppc,
aspA y pntAB se insertó en el sitio de escisión de
EcoRI de extremos romos para obtener pAPTK (fig. 15).
A continuación, el pasd descrito en la
publicación internacional nº WO95/16042 se digirió con KpnI,
se hicieron romos ambos extremos y se digirió a continuación con
BamHI para obtener un fragmento de ADN que contenía
asd. A continuación, pSTV29 se digirió con PstI, se
hicieron romos ambos extremos y se insertó con el fragmento
asd obtenido anteriormente en el sitio de escisión de
BamHI para obtener pSd (fig. 16).
A continuación, pSd se digirió con SphI,
se hicieron romos ambos extremos y se digirió a continuación con
XbaI para obtener un fragmento de ADN que contenía asd
otra vez. A continuación, pAPTK se digirió con SacI y se
hicieron romos ambos extremos, y el fragmento asd obtenido
anteriormente se insertó en el sitio de escisión de XbaI
para obtener pKD (fig. 17).
\vskip1.000000\baselineskip
Se introdujeron en un transformante en el que se
habían introducido pCABD2, pCABD(B) o pCABDE1, que se habían
obtenido en el ejemplo 1 mencionado anteriormente, pAPT (plásmido de
referencia 1), pAPTK (plásmido de referencia 2) o pKD. Los
transformantes obtenidos contenían las dos clases de plásmidos, es
decir, uno de pAPT, pAPTK y pKD y uno de pCABD2, pCABD(B) y
pCABDE1. Estos transformantes se examinaron para la productividad de
la L-lisina de la misma manera que en el ejemplo 1
<2>.
Los resultados se muestran en la Tabla 4.
Según se puede ver claramente a partir de los
resultados que se muestran en la tabla 4, cuando asd se
aumentó junto con dapA + lysC + dapB +
ddh + ppc + pntAB + aspA, se observó un
notable incremento de la cantidad de producción de
L-lisina. Se obtuvo un resultado similar cuando
pCABD(B) o pCABDE1 se utilizó en lugar de pCABD2.
El plásmido pAPTK mencionado anteriormente en la
tabla 4 correspondía a pAPT del cual el gen de la resistencia al
fármaco se cambió del de la ampicilina al de canamicina (porque el
vector se cambió de pMW118 a pMW218). Ya que pKD se preparó
mediante la inserción de asd en pAPTK se consideró que como
control de pKD, pAPTK era mucho más adecuado que pAPT. Por lo
tanto, se muestran asimismo los datos de pAPTK. Se confirmó asimismo
que no se influenciaba la cantidad de producción de
L-lisina incluso si el gen de resistencia al fármaco
se cambiaba.
La presente invención proporciona bacterias
Escherichia coli con una productividad de
L-lisina elevada y la L-lisina se
puede obtener con un rendimiento elevado utilizando estas
bacterias.
<110> Ajinomoto Co., Ltd.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento para la producción de
L-lisina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> EPA-_53933
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador para la amplificación de una
porción de promotor de tet
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador para la amplificación de una
porción de promotor de tet
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador para la amplificación de
dapA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador para la amplificación de
dapA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador para la amplificación de
aspA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador para la amplificación de
aspA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm
Claims (8)
1. Bacteria Escherichia en la que:
- (1)
- son aumentadas las actividades intracelulares de la dihidrodipicolinato sintasa, la aspartocinasa y la dihidrodipicolinato reductasa,
- (2)
- es aumentada la actividad intracelular de la diaminopimelato deshidrogenasa, o son aumentadas las actividades intracelulares de la tetrahidrodipicolinato succinilasa y la succinil diaminopimelato deacilasa, y
- (3)
- es aumentada la actividad intracelular de la aspartato-semialdehído deshidrogenasa o la fosfoenolpiruvato carboxilasa, en la que las actividades intracelulares de las enzimas son aumentadas mediante la introducción de un plásmido que presenta un gen de la enzima, mediante el incremento del número de copias de un gen de la enzima en el cromosoma, o mediante la modificación de una secuencia de promotor de un gen de la enzima en el cromosoma.
2. Bacteria Escherichia en la que:
- (1)
- son aumentadas las actividades intracelulares de la dihidrodipicolinato sintasa, la aspartocinasa y la dihidrodipicolinato reductasa,
- (2)
- es aumentada la actividad intracelular de la diaminopimelato deshidrogenasa, o son aumentadas las actividades intracelulares de la tetrahidrodipicolinato succinilasa y la succinil diaminopimelato deacilasa, y
- (3)
- es aumentada la actividad intracelular de la fosfoenolpiruvato carboxilasa, y es aumentada la actividad intracelular de la nicotinamida adenina dinucleótido transhidrogenasa o la aspartato-semidaldehído deshidrogenasa, en la que son aumentadas las actividades intracelulares de las enzima mediante la introducción de un plásmido que presenta un gen de la enzima, mediante el aumento del número de copias de un gen de la enzima en el cromosoma, o mediante la modificación de una secuencia de promotor de un gen de la enzima en el cromosoma.
3. Bacteria Escherichia en la que:
- (1)
- son aumentadas las actividades intracelulares de la dihidrodipicolinato sintasa, la aspartocinasa y la dihidrodipicolinato reductasa,
- (2)
- es aumentada la actividad intracelular de la diaminopimelato deshidrogenasa, o son aumentadas las actividades intracelulares de la tetrahidrodipicolinato succinilasa y la succinildiaminopimelato deacilasa, y
- (3)
- son aumentadas las actividades intracelulares de la fosfoenolpiruvato carboxilasa y de la nicotinamida adenina dinucleótido transhidrogenasa, y es aumentada la actividad intracelular de la aspartato-semialdehído deshidrogenasa o aspartasa, en la que las actividades intracelulares de las enzimas son aumentadas mediante la introducción de un plásmido que presenta un gen de la enzima, mediante el incremento del número de copias de un gen de la enzima en el cromosoma, o mediante la modificación de una secuencia de promotor de un gen de la enzima en el cromosoma.
4. Bacteria según la reivindicación 3, en la que
son aumentadas las actividades intracelulares de la
aspartato-semialdehído deshidrogenasa y la
aspartasa.
5. Bacteria según la reivindicación 3 ó 4, en la
que la aspartocinasa, la dihidrodipicolinato reductasa, la
tetrahidrodipicolinato succinilasa, la succinil diaminopimelato
deacilasa, la fosfoenolpiruvato carboxilasa y la
aspartato-semialdehído deshidrogenasa provienen cada
una de una bacteria Escherichia, la nicotinamida adenina
dinucleótido transhidrogenasa y la aspartasa, si están presentes,
provienen cada una de la bacteria Escherichia, la
dihidrodipicolinato sintasa provienen de una bacteria
Escherichia o de una bacteria Brevibacterium y la
diaminopimelato deshidrogenasa proviene de una bacteria
Brevibacterium.
6. Bacteria según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en la que son aumentadas las actividades
intracelulares de la dihidrodipicolinato sintasa y la aspartocinasa
mediante el hospedaje de la dihidrodipicolinato sintasa cuya
inhibición por retroalimentación por la L-lisina es
insensibilizada y la aspartocinasa cuya inhibición por
retroalimentación por la L-lisina es
insensibilizada, y la actividad intracelular de la diaminopimelato
deshidrogenasa es aumentada mediante la introducción de un gen de la
diaminopimelato deshidrogenasa.
7. Bacteria según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, que es la Escherichia coli.
8. Procedimiento para la producción de
L-lisina, que comprende cultivar la bacteria según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en un medio adecuado para
producir y acumular la L-lisina en el cultivo, y
recoger la L-lisina del cultivo.
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