CN100577794C - 生产l-赖氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
在合适的培养基中培养本发明的细菌,以便产生并且在培养基中积累L-赖氨酸,然后从培养物中收集赖氨酸,所述本发明的细菌是一种埃希氏菌属细菌,(1)具有其L-赖氨酸的反馈抑制作用被脱敏化的二氢吡啶二羧酸合成酶以及其L-赖氨酸的反馈抑制作用被脱敏化的天冬氨酸激酶,(2)二氢吡啶二羧酸还原酶的细胞内活性增强,(3)导入了二氨基庚二酸脱氢酶基因,或增强了四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶和琥珀酰二氨基庚二酸脱酰酶的细胞内活性,其中,天冬氨酸-半醛脱氢酶或磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的细胞内活性增强。
Description
技术领域
本发明涉及微生物工业。更具体地讲,本发明涉及通过发酵生产L-赖氨酸的方法,以及用于该生产方法的微生物。
背景技术
在通过发酵生产L-赖氨酸时,通常使用从天然或人工突变菌株中分离的菌株,以便提高其产量。有许多能产生L-赖氨酸的人工突变菌株是众所周知的,其中的很多是S-2-氨乙基半胱氨酸(AEC)抗性菌株,并且属于短杆菌属、棒杆菌属、芽孢杆菌属或埃希氏菌属。另外,业已披露了用于提高氨基酸产量的各种方法,例如,使用通过重组DNA获得的转化体。
例如,对于埃希氏菌属细菌来说,在以下文献中业已披露了用其中的二氢吡啶二羧酸合成酶(DDPS)活性增强了的菌株生产L-赖氨酸的方法:日本专利申请后期公开(Kokai)No.56-18596,US4,346,170和‘应用微生物学和生物技术’,15,pp.227-331(1982)。另外,韩国专利申请NO.92-8382中业已披露了通过用向其中导入了源于棒杆菌属细菌的DDPS的埃希氏菌属细菌生产L-赖氨酸的方法。另外,在国际公开NO.WO95/16042中披露了通过用一种质粒转化过的菌株生产L-赖氨酸的方法,所述质粒含有源于埃希氏菌属细菌的编码二氢吡啶二羧酸合成酶的DNA,它具有使L-赖氨酸的反馈抑制作用脱敏的突变;编码其L-赖氨酸的反馈抑制已经脱敏的天冬氨酸激酶的DNA;编码二氢吡啶二羧酸还原酶的DNA;以及编码源于棒状杆菌的二氨基庚二酸脱氢酶的DNA。
对于短杆菌属细菌来说,据国际公开NO.WO95/11985披露,通过增强细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸转氢酶的活性,可以提高L-赖氨酸产量。另外,在日本专利申请后期公开NO.60-87788和日本专利公开(Kokoku)NO.6-102028中分别披露了用仅仅增强了其磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性的菌株生产L-赖氨酸的方法,和用仅仅增强了天冬氨酸-半醛脱氢酶活性的菌株生产L-赖氨酸的方法。
在通过发酵进行的氨基酸工业生产中,生产是以大规模形式进行的。因此,即使是若干个百分点的产量提高,都可以产生显著的工业价值,并且,因此需要产量提高,而无论产量的提高如何。
发明内容
本发明的一个目的是,提供一种与常规方法相比改善了的通过发酵生产L-赖氨酸的方法。
为了实现上述目的,本发明人进行了不懈地研究。结果,本发明人发现,如果具有特定特性的埃希氏菌属细菌的天冬氨酸-半醛脱氢酶或磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的活性增强,并且,如果在上述埃希氏菌属细菌中,除了上述酶之外一种或几种酶的活性增强的话,所述细菌的L-赖氨酸产量可以提高,并且,他们根据这些发现完成了本发明。
就是说,本发明提供了:
第一方面,一种埃希氏菌属细菌,其中(1)二氢吡啶二羧酸合成酶、天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸还原酶的细胞内活性增强,和(2)二氨基庚二酸脱氢酶的细胞内活性或四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶和琥珀酰二氨基庚二酸脱酰酶的细胞内活性增强,其中,天冬氨酸-半醛脱氢酶或磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的细胞内活性增强;
第二方面,一种埃希氏菌属细菌,其中(1)二氢吡啶二羧酸合成酶、天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸还原酶的细胞内活性增强,和(2)二氨基庚二酸脱氢酶的细胞内活性或四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶和琥珀酰二氨基庚二酸脱酰酶的细胞内活性增强,其中,磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的细胞内活性和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸转氢酶或天冬氨酸-半醛脱氢酶的细胞内活性增强;
第三方面,一种埃希氏菌属细菌,其中(1)二氢吡啶二羧酸合成酶、天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸还原酶的细胞内活性增强,和(2)二氨基庚二酸脱氢酶的细胞内活性或四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶和琥珀酰二氨基庚二酸脱酰酶的细胞内活性增强,其中,磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸转氢酶的细胞内活性和天冬氨酸-半醛脱氢酶或天冬氨酸酶的细胞内活性增强(在下文中,上述三个方面的细菌被统称为“本发明的细菌”)。
在本发明的细菌中,优选天冬氨酸-半醛脱氢酶和天冬氨酸酶的细胞内活性增强。
另外,在本发明的细菌中,天冬氨酸激酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶、琥珀酰二氨基庚二酸脱酰酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和天冬氨酸-半醛脱氢酶优选分别源于埃希氏菌属细菌,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸转氢酶和天冬氨酸酶(如果有的话)优选分别源于埃希氏菌属细菌,二氢吡啶二羧酸合成酶优选源于埃希氏菌属细菌或短杆菌属细菌,而二氨基庚二酸脱氢酶优选源于短杆菌属细菌。
在本发明的细菌中,它的细胞内酶活性是通过下面的各项中的一项或其任意组合而增强的。
(1)导入具有所述酶的基因的质粒。
(2)增加染色体上所述酶的基因拷贝数量。
(3)改变染色体上所述酶的基因的启动子序列。
另外,在本发明的细菌中,优选通过获得其L-赖氨酸的反馈抑制作用被脱敏化的二氢庚二酸合成酶以及其L-赖氨酸的反馈抑制作用被脱敏化的天冬氨酸激酶,来增强二氢吡啶二羧酸合成酶和天冬氨酸激酶的细胞内活性,并且,通过导入二氨基庚二酸脱氢酶基因,来增强二氨基庚二酸脱氢酶的细胞内活性。
本发明还提供了生产L-赖氨酸的方法,该方法包括在合适的培养基中培养本发明的任何细菌,以便产生并且在培养基中积累L-赖氨酸,以及从培养物中收集赖氨酸(以下又称之为“本发明的生产方法”)。
附图说明
图1表示源于RSF1010的质粒RSF24P的制备过程,它含有dapA*24。
图2表示含有dapA*24和lysC*80的质粒RSFD80。
图3表示含有dapA*24,lysC*80和dapB的质粒pCAB1。
图4表示含有dapA*24,lysC*80,dapB和ddh的质粒pCABD2。
图5表示含有dapA*24,lysC*80,dapB,dapD和dapE的质粒pCABDE1。
图6表示含有ppc的质粒pppc的结构。
图7表示含有asd的质粒pasd的结构。
图8表示含有pntAB(pntA和pntB)的质粒pMW::THY的制备过程。
图9表示含有aspA的质粒pMW::aspA的制备过程。
图10表示含有ppc和asd的质粒ppcd的制备过程。
图11表示含有ppc和pntAB的质粒pPTS的制备过程。
图12表示含有ppc和aspA的质粒pAPW的制备过程。
图13表示含有ppc,pntAB和asd的质粒pPTd的制备过程。
图14表示含有ppc,pntAB和aspA的质粒pAPT的制备过程。
图15表示含有ppc,pntAB和aspA的质粒pAPTK的制备过程。
图16表示含有asd的质粒pSd的制备过程。
图17表示含有ppc,pntAB,aspA和asd的质粒pKD的制备过程。
图18表示含有tetpro的质粒pUTES的制备过程。
图19表示含有tetpro和位于tetpro下游的、源于乳发酵短杆菌的dapA质粒pUEBL3的制备过程。
图20表示含有源于乳发酵短杆菌的dapA(Brev.dapA)、lysC、dapB和ddh的质粒pCABD(B)的制备过程。
实施本发明的最佳方式
<1>本发明的细菌
本发明的细菌是埃希氏菌属细菌,其中(1)二氢吡啶二羧酸合成酶、天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸还原酶的细胞内活性增强,和(2)二氨基庚二酸脱氢酶的细胞内活性或四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶和琥珀酰二氨基庚二酸脱酰酶的细胞内活性增强,并且,以下酶的细胞内活性增强:
(1)天冬氨酸-半醛脱氢酶或磷酸烯醇丙酮酸羧化酶,
(2)磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸转氢酶(以下又称之为“转氢酶”)或天冬氨酸-半醛脱氢酶,或
(3)磷酸烯醇丙酮酸羧化酶,转氢酶,天冬氨酸-半醛脱氢酶或天冬氨酸酶。
本发明的细菌优选是埃希氏菌属细菌,其中,磷酸烯醇丙酮酸羧化酶,转氢酶,天冬氨酸-半醛脱氢酶和天冬氨酸酶的细胞内活性进一步增强。
本发明的细菌优选属于大肠杆菌。
在本说明书中,短语“细胞内活性增强”表示与野生型菌株(例如,大肠杆菌W3110菌株)或亲本菌株(该菌株的本发明所特定的组合中所包括的所有酶的细胞内活性都没有增强)相比,细胞内酶促活性增强,还表示一种细菌具有一种野生型菌株或亲本菌株所没有的酶促活性。用于测定上述酶活性的方法是公知的,并且,本领域技术人员可以方便地证实其细胞内活性的增强。
增强所述细胞内活性的方法包括以下方法及其组合,但并不局限于这些。
首先,要提到提高所述酶的表达量的方法。
具体地讲,提高酶表达量的方法包括以下方法。
(1)导入含有酶基因的质粒
作为质粒,可以使用能在埃希氏菌属细菌细胞中自主复制的载体。可以用公知方法将其导入。就是说,可以将感兴趣的基因插入所述载体,并且可以用该载体转化埃希氏菌属细菌。该载体优选是多拷贝型质粒。
所述基因可以由相同质粒或不同质粒携带。某些基因可以由相同质粒携带。当使用两种或两种以上质粒时,优选使用具有稳定的分配系统的质粒,该系统使得这些质粒能在细胞中稳定的共存。导入所述基因的顺序没有特别限制。
(2)增加染色体上酶基因的拷贝数量
通过用Mu噬菌体等扩增染色体DNA上的DNA,增加所述拷贝数量。
染色体DNA上的DNA可以是埃希氏菌属细菌原来就有的,或是通过使用转导、转座子(Berg,D.E.和Burg C.M.,生物技术,1,417(1983)),Mu噬菌体(日本专利申请后期公开NO.2-109985)的方法,或同源重组方法(分子遗传学实验,冷泉港实验室(1972))插入宿主微生物染色体中的。
(3)改变酶基因的启动子序列
可以改变启动子序列,以便提高转录量,并进而提高表达量。例如,可以通过将一个突变导入启动子来增强该启动子,以便提高位于该启动子下游的基因的转录量。除了将突变导入所述启动子以外,可以新导入能在埃希氏菌属细菌中起作用的启动子,如lac,trp,tac,trc,和PL。另外,可以通过新导入增强子提高基因转录量。尽管所述启动子序列可以是染色体上酶基因的启动子或质粒上酶基因的启动子,但是优选染色体上酶基因的启动子。例如,日本专利申请后期公开NO.1-215280披露了将诸如启动子的基因导入染色体DNA。
上述酶基因的来源没有特别限制,因此,各种来源的都可以使用,只要该基因能够在埃希氏菌属细菌中表达,并且其遗传产物能在埃希氏菌属细菌中起作用就行。
下面将说明获得大肠杆菌的L-赖氨酸生物合成系统基因,和乳发酵短杆菌的二氢吡啶二羧酸合成酶和二氨基庚二酸脱氢酶基因的方法。
可以从含有磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(ppc)的质粒pS2(Sabe,H.等,基因,31,279(1984))或pT2获得该基因。可以通过用AatII和AflII消化pS2,获得含有ppc的DNA片段。另外,还可以通过用SmaI和ScaI消化pT2,获得含有ppc的DNA片段。具有pT2的大肠杆菌F15菌株于1993年7月15日保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(邮政编码305-8566,1-3Higashi 1-chome,Tsukuba-shi,Ibaraki-ken,日本),并且获得的保藏号为FERM P-13752。然后,按照布达佩斯条约的规定于1994年7月11日转为国际保藏,所获得的保藏号为FERM BP-4732。
通过PCR扩增可以获得天冬氨酸激酶基因(lysC),使用大肠杆菌染色体DNA做模板,并使用根据lysC的已知核苷酸序列制备的两种类型的寡核苷酸引物(Cassan,M.,Parsot,C.,Cohen,G.N.,和Patte,J.C.,生物学化学杂志261,1052(1986))(例如,在国际公开号WO95/16042中所披露的,SEQ ID NO:5和6)。
天冬氨酸-半醛脱氢酶基因(asd)可以从含有该基因的质粒pAD20中获得(Haziza,C.等,EMBO,1,379,1982)。如果用AseI和ClaI消化pAD20,就可以获得含有asd的DNA片段。
通过PCR扩增可以获得二氢吡啶二羧酸合成酶基因(dapA),使用大肠杆菌染色体DNA做模板,并使用根据dapA的已知核苷酸序列(Richaud,F.等,细菌学杂志,297,1986)制备的两种类型的寡核苷酸引物(例如,在国际公开号WO95/16042中所披露的SEQ ID NO:1和2)。
通过PCR扩增可以获得二氢吡啶二羧酸还原酶基因(dapB),使用大肠杆菌染色体DNA做模板,并使用根据dapB的已知核苷酸序列(Bouvier,J.等,生物学化学杂志,259,14829,1984)制备的两种类型的寡核苷酸引物(例如,在国际公开号WO95/16042中所披露的SEQ ID NO:9和10)。
通过PCR扩增可以获得四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶基因(dapD),使用大肠杆菌染色体DNA做模板,并使用根据dapD的已知核苷酸序列(Richaud,F.等,生物学化学杂志,259,14829,1984)制备的两种类型的寡核苷酸引物(例如,在国际公开号WO95/16042中所披露的SEQ ID NO:15和16)。
通过PCR扩增可以获得琥珀酰二氨基庚二酸脱酰酶基因(dapE),使用大肠杆菌染色体DNA做模板,并使用根据dapE的已知核苷酸序列(Bouvier,J.等,细菌学杂志,174,5265,1992)制备的两种类型的寡核苷酸引物(例如,在国际公开号WO95/16042中所披露的SEQ ID NO:17和18)。
通过PCR扩增可以获得天冬氨酸酶基因(aspA),使用大肠杆菌染色体DNA做模板,并使用根据aspA的已知核苷酸序列(Woods,S.A.等,生物化学237,(2),547-557,1986)制备的两种类型的寡核苷酸引物(例如,在本说明书序列表中所披露的SEQ ID NO:5和6)。
可以根据转氢酶基因的已知核苷酸序列(D.M.Clark等,欧洲生物化学杂志,158,647-653,1986)制备转氢酶基因(pntAB)。在大肠杆菌中,转氢酶由两个亚基组成,这两个亚基分别由pntA和pntB编码(D.M.Clark等,同上)。因此,制备了这两个基因(例如,参见国际公开号WO95/11958)。
还可以从含有pntAB的质粒中获得它。由于该质粒含有pntAB,可以使用在国际公开号WO95/11958中披露的质粒pMW::THY。该质粒是通过连接大肠杆菌K-12MC1061菌株的含有pntA和pntB的3.0kbDNA片段和质粒载体Pmw118的BamHI和HindIII片段而获得的重组质粒。具有pMW::THY的大肠杆菌JM109菌株被命名为AJ12929菌株,并且于1993年10月4日保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(邮政编码305-0046,1-3Higashi 1-chome,Tsukuba-shi,Ibaraki-ken,日本),并且获得的保藏号为FERM P-13890。然后,按照布达佩斯条约的规定于1994年9月11日转为国际保藏,所获得的保藏号为FERM BP-4798。
通过PCR扩增可以获得乳发酵短杆菌的二氢吡啶二羧酸合成酶基因(dapA),使用乳发酵短杆菌染色体DNA做模板,并使用根据dapA的已知核苷酸序列(Bonassie等,N.A.R.,18(21),6421(1990))制备的两种类型的寡核苷酸引物(例如,在本说明书序列表中所披露的SEQ ID NO:3和4)。
通过PCR扩增可以获得乳发酵短杆菌的二氨基庚二酸脱氢酶基因(ddh),使用乳发酵短杆菌染色体DNA做模板,并使用根据谷氨酸棒杆菌ddh的已知核苷酸序列(Ishino等,核酸研究,15,3917(1987))制备的两种类型的寡核苷酸引物(例如,在国际公开号WO95/16042中所披露的SEQ ID NO:11和12)。
作为增强所述细胞内活性的方法,还包括提高所述酶比活性的方法。该方法可以与提高酶表达量的方法组合。
作为提高酶比活性的方法,包括导入具有增强比活性的突变的酶,包括其反馈抑制作用脱敏化的酶等,此时,所述酶受到了反馈抑制作用。
其反馈抑制作用脱敏化的酶的例子包括L-赖氨酸对它的反馈抑制作用脱敏化的二氢吡啶二羧酸合成酶(DDPS)和L-赖氨酸对它的反馈抑制作用脱敏化的天冬氨酸激酶(AK)。
短语“L-赖氨酸对它的反馈抑制作用脱敏化的”表示对抑制作用大体上脱敏就足够了,而不需要将抑制作用完全脱敏。另外,L-赖氨酸对它的反馈抑制作用脱敏化的酶还包括源于除了埃希氏菌属细菌之外的生物的酶,只要L-赖氨酸对它的反馈抑制作用程度低于源于埃希氏菌属细菌的野生型酶的程度就行,而无论它是该生物的野生型或突变型酶。因此,还包括诸如源于短杆菌属细菌的DDPS的原本没有L-赖氨酸的反馈抑制作用的酶。
可以用公知方法评估L-赖氨酸反馈抑制作用的程度,如披露于国际公开号WO95/16042、例1和例2中的方法。
作为L-赖氨酸对它的反馈抑制作用脱敏化的DDPS(脱敏化DDPS)和L-赖氨酸对它的反馈抑制作用脱敏化的AK(脱敏化AK),包括在国际公开号WO95/16042和日本专利申请后期公开NO.10-113183中所披露的这类物质。
就是说,脱敏化DDPS的例子包括在野生型DDPS上具有一个使L-赖氨酸对它的反馈抑制作用脱敏化的突变的DDPS。作为野生型DDPS,包括源于埃希氏菌属细菌的DDPS,特别是源于大肠杆菌的DDPS。使L-赖氨酸的反馈抑制作用脱敏化的DDPS的突变的例子包括:
(1)用另一种氨基酸残基(优选缬氨酸残基)取代相当于81号位置上的丙氨酸残基的氨基酸残基的突变,
(2)用另一种氨基酸残基(优选酪氨酸残基)取代相当于118号位置上的组氨酸残基的氨基酸残基的突变,
(3)用另一种氨基酸残基(优选缬氨酸残基)取代相当于国际公开号WO95/16042中SEQ ID NO:4所示的DDPS氨基酸序列的81号位置上的丙氨酸残基的氨基酸残基的,并且用另一种氨基酸残基(优选酪氨酸残基)取代相当于118号位置上的组氨酸残基的氨基酸残基的突变,其中,所述位置是从DDPS的N-末端开始计数的。众所周知的是,在种之间或菌株之间可能存在不影响其活性的氨基酸序列差异,并且,本领域技术人员能轻易识别相当于上述特定氨基酸残基的氨基酸残基。
脱敏化DDPS的其它例子包括源于棒状细菌,例如,乳发酵短杆菌的DDPS(Cremer J.等,遗传微生物学杂志,134,3221-3229,1988)。
例如,为了制备埃希氏菌属细菌所具有的脱敏化DDPS,可以导入编码脱敏化DDPS的DNA。
编码脱敏化DDPS的DNA的例子,包括相当于编码野生型DDPS的DNA的、具有一个使L-赖氨酸对所编码的DDPS的反馈抑制作用脱敏化的突变的DNA。
在下文中,将以源于埃希氏菌属细菌的DDPS为例,说明获得编码脱敏化DDPS的DNA(脱敏化DDPS基因)的方法。对于其它生物的DDPS来说,可以用类似方法获得DNA。另外,如果源于另一种生物的野生型DDPS是脱敏化DDPS,就可以原样使用编码它的DNA。
编码野生型DDPS的DNA没有特别限制,只要它编码源于埃希氏菌属细菌的DDPS就可以。具体地讲,包括编码国际公开号WO95/16042中SEQID NO:4所示的DDPS氨基酸序列的DNA。更具体地讲,包括该文献中SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的272-1147号核苷酸所代表的序列。在所述序列中,具有导致取代上述氨基酸残基的核苷酸序列突变的序列,是编码脱敏化DDPS的DNA。另外,相当于取代的氨基酸残基的密码子类型没有特别限制,只要它编码该氨基酸残基就行。另外,还预计细菌种和菌株之间,所含有的DDPS的氨基酸序列存在小的差异。不过,具有会导致在一些位置上发生不影响酶活性的氨基酸残基取代、缺失或插入的差异的序列,也属于脱敏化DDPS基因的范围。
例如,可以用以下方法获得脱敏化DDPS基因。首先,对含有野生型DDPS基因或具有突变的其它DDPS基因的DNA进行体外诱变处理,并且将进行过诱变处理的DNA与和宿主兼容的载体DNA连接,以便制备重组DNA。将重组DNA导入宿主微生物,获得转化体,并从这些转化体中筛选能脱敏化DDPS的转化体。这样的转化体具有脱敏化DDPS基因。或者,可以将含有野生型DDPS基因或具有突变的其它DDPS基因的DNA与和宿主兼容的载体DNA连接,以便制备重组DNA。然后,可以对重组DNA进行体外诱变处理,并且将其导入宿主微生物,获得转化体,并从这些转化体中筛选能脱敏化DDPS的转化体。这样的转化体同样具有脱敏化DDPS基因。
另外,可以对能产生野生型DDPS的微生物进行诱变处理,以便制备能产生脱敏化DDPS的突变菌株,然后,可以从该突变菌株中获得脱敏化DDPS基因。另外,如果对向其中导入了与野生型基因连接的重组DNA的转化体进行诱变处理,以便制备能产生脱敏化DDPS的突变菌株,然后,从这些突变菌株中收集重组DNA,就可以根据该DNA制备出脱敏化DDPS基因。
用于DNA体外诱变处理的制剂的例子包括羟胺等。羟胺是能通过将胞嘧啶变成N4-羟基胞嘧啶导致胞嘧啶被胸腺嘧啶取代的化学诱变处理剂。当对微生物本身进行诱变处理时,该处理是用紫外线辐射或常用于人工诱变的诸如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)和亚硝酸的诱变剂进行的。
作为能提供含有野生型DDPS基因或具有突变的其它DDPS基因的DNA的细菌,可以使用属于埃希氏菌属的任何微生物。具体地讲,可以使用在以下文献中提到过的微生物:Neidhardt等(Neidhardt,F.C.等,大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌,美国微生物学协会,华盛顿特区,1208,表1)。例如,可以使用大肠杆菌JM109菌株和MC1061菌株。当野生型菌株被用做含有DDPS基因的DNA的供体时,可以获得含有DDPS基因的DNA。
脱敏化AK的例子包括具有出现在野生型AK上的能使L-赖氨酸的反馈抑制作用脱敏化的突变的AK。作为野生型AK可以是源于埃希氏菌属细菌的,特别是源于大肠杆菌的天冬氨酸激酶(AKIII)。能使得L-赖氨酸对AKIII的反馈抑制作用脱敏化的突变的例子包括:
(a)用另一种氨基酸残基(优选天冬氨酸残基)取代相当于323号位置上的甘氨酸残基的氨基酸残基的突变,
(b)用另一种氨基酸残基(优选天冬氨酸残基)取代相当于323号位置上的甘氨酸残基的氨基酸残基,并且用另一种氨基酸残基(优选天冬氨酸残基)取代相当于408号位置上的甘氨酸残基的氨基酸残基的突变,
(c)用另一种氨基酸残基(优选半胱氨酸残基)取代相当于34号位置上的精氨酸残基的氨基酸残基,并且用另一种氨基酸残基(优选天冬氨酸残基)取代相当于323号位置上的甘氨酸残基的氨基酸残基的突变,
(d)用另一种氨基酸残基(优选苯丙氨酸残基)取代相当于325号位置上的亮氨酸残基的氨基酸残基的突变,
(e)用另一种氨基酸残基(优选异亮氨酸残基)取代相当于318号位置上的甲硫氨酸残基的氨基酸残基的突变,
(f)用另一种氨基酸残基(优选异亮氨酸残基)取代相当于318号位置上的甲硫氨酸残基的氨基酸残基,并且用另一种氨基酸残基(优选甲硫氨酸残基)取代相当于349号位置上的缬氨酸残基的氨基酸残基的突变,
(g)用另一种氨基酸残基(优选亮氨酸残基)取代相当于345号位置上的丝氨酸残基的氨基酸残基的突变,
(h)用另一种氨基酸残基(优选甲硫氨酸残基)取代相当于347号位置上的缬氨酸残基的氨基酸残基的突变,
(i)用另一种氨基酸残基(优选异亮氨酸残基)取代相当于352号位置上的苏氨酸残基的氨基酸残基的突变,
(j)用另一种氨基酸残基(优选异亮氨酸残基)取代相当于352号位置上的苏氨酸残基的氨基酸残基,并且用另一种氨基酸残基(优选苯丙氨酸残基)取代相当于369号位置上的丝氨酸残基的氨基酸残基的突变,
(k)用另一种氨基酸残基(优选赖氨酸残基)取代相当于164号位置上的谷氨酸残基的氨基酸残基的突变,
(l)用另一种氨基酸残基(优选异亮氨酸残基)取代相当于417号位置上的甲硫氨酸残基的氨基酸残基,并且用另一种氨基酸残基(优选酪氨酸残基)取代相当于419号位置上的半胱氨酸残基的氨基酸残基的突变,上述突变均以国际公开号WO95/16042中SEQ ID NO:8所示的AKIII氨基酸序列为基础,其中,所述位置是从N-末端开始计数的。另外,还包括用另一种氨基酸残基(优选天冬氨酸残基)取代相当于323号位置上的甘氨酸残基的氨基酸残基,并且用另一种氨基酸残基(优选异亮氨酸残基)取代相当于318号位置上的甲硫氨酸残基的氨基酸残基的突变(日本专利申请后期公开NO.10-113183),众所周知的是,在种之间或菌株之间可能存在不影响其活性的氨基酸序列差异,并且,本领域技术人员能轻易识别相当于上述特定氨基酸残基的氨基酸残基。
脱敏化AK的其它例子包括源于棒状细菌的突变型AK(日本专利申请后期公开NO.6-62866)。
例如,为了制备埃希氏菌属细菌所具有的脱敏化AK,可以将编码脱敏化AK的DNA导入埃希氏菌属细菌。
编码脱敏化AK的DNA的例子,包括相当于编码野生型AK的DNA的、具有一个使L-赖氨酸对所编码的AK的反馈抑制作用脱敏化的突变的DNA。
在下文中,将以源于埃希氏菌属细菌的AKIII为例,说明获得编码脱敏化AK的DNA(脱敏化DDPS基因)的方法。同样,对于其它生物的AK来说,可以用类似方法获得DNA。另外,如果源于另一种生物的野生型AK是脱敏化AK,就可以原样使用编码它的DNA。
编码野生型AKIII的DNA没有特别限制。例如,可以是编码源于埃希氏菌属细菌的,特别是大肠杆菌的AKIII的DNA。具体地讲,包括编码国际公开号WO95/16042中SEQ ID NO:8所示AKIII氨基酸序列的DNA,以及该文献中SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的584-1930号核苷酸所代表的序列。大肠杆菌的AKIII是由lysC基因编码的。
在所述序列中,具有导致取代上述氨基酸残基的核苷酸序列突变的序列,是编码突变型AKIII的DNA。另外,相当于取代的氨基酸残基的密码子类型没有特别限制,只要它编码该氨基酸残基就行。另外,还预计细菌种和菌株之间,所含有的AKIII的氨基酸序列存在小的差异。不过,具有会导致在一些位置上发生不影响酶活性的氨基酸残基取代、缺失或插入的差异的序列,也属于突变型AKIII基因的范围。例如,在下面的将要提到的例2中获得的野生型lysC基因的核苷酸序列(国际公开号WO95/16042,SEQ ID NO:7)在6号位置上与业已公开的大肠杆菌K-12 JC411菌株的lysC核苷酸序列的相应位置存在差异(Cassan M.,Parsot,C.,Cohen,G.N.,和Patte,J.C.,生物学化学杂志,261,1052,1986),其中的两种差异能提供不同的编码氨基酸残基(JC411菌株的lysC提供了用半胱氨酸残基取代国际公开号WO95/16042中SEQ ID NO:8所示lysC编码的氨基酸序列的58号位置上的甘氨酸残基,并且用丙氨酸残基取代401号位置上的甘氨酸残基的突变,其中,所述位置是从N-末端开始计数的)。预计,即使是具有与大肠杆菌K-12 JC411菌株的lysC相同的序列的lysC,也可以提供具有能使L-赖氨酸的反馈抑制作用脱敏化的突变的lysC,前提是导入了在上述(a)-(l)中提到过的任意一种突变,或用另一种氨基酸残基(优选天冬氨酸残基)取代相当于323号位置上的甘氨酸残基的氨基酸残基,并且用另一种氨基酸残基取代相当于318号位置上的甲硫氨酸残基的氨基酸残基的突变。
例如,可以用以下方法获得编码其L-赖氨酸的反馈抑制作用脱敏化的突变型AKIII的DNA。首先,对含有野生型AKIII基因或具有突变的其它AKIII基因的DNA进行体外诱变处理,并且将进行过诱变处理的DNA与和宿主兼容的载体DNA连接,以便制备重组DNA。将重组DNA导入宿主微生物,获得转化体,并从这些转化体中筛选能表达突变型AKIII的转化体。这样的转化体具有突变型AKIII基因。或者,可以将含有野生型AKIII基因或具有突变的其它AKIII基因的DNA与和宿主兼容的载体DNA连接,以便制备重组DNA。然后,可以对重组DNA进行体外诱变处理,并且将其导入宿主微生物,获得转化体,并从这些转化体中筛选能表达突变型AKIII的转化体。这样的转化体同样具有该突变型基因。
另外,可以对能产生野生型酶的微生物进行诱变处理,以便制备能产生突变型酶的突变菌株,然后,可以从该突变菌株中获得突变型基因。用于对DNA直接进行体外诱变处理的制剂的例子包括羟胺等。羟胺是能通过将胞嘧啶变成N4-羟基胞嘧啶导致胞嘧啶被胸腺嘧啶取代的化学诱变处理剂。当对微生物本身进行诱变处理时,该处理是用紫外线辐射或常用于人工诱变的诸如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)的诱变剂进行的。
作为能提供含有野生型AKIII基因或具有突变的其它AKIII基因的DNA的细菌,可以使用属于埃希氏菌属的任何微生物。具体地讲,可以使用在以下文献中提到过的微生物:Neidhardt等(Neidhardt,F.C.等,大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌,美国微生物学协会,华盛顿特区,1208,表1)。例如,可以使用大肠杆菌JM109菌株和MC1061菌株等。
在本发明的细菌中,天冬氨酸激酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶、琥珀酰二氨基庚二酸脱酰酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和天冬氨酸-半醛脱氢酶优选分别源于埃希氏菌属细菌,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸转氢酶和天冬氨酸酶(如果有的话)优选分别源于埃希氏菌属细菌,二氢吡啶二羧酸合成酶优选源于埃希氏菌属细菌或短杆菌属细菌,而二氨基庚二酸脱氢酶优选源于短杆菌属细菌。
短杆菌属细菌的例子除了乳发酵短杆菌之外,还包括黄色短杆菌、Brevibacterium divaricatum、谷氨酸棒杆菌、和百合花棒杆菌等。
另外,在本发明的细菌中,优选通过获得其L-赖氨酸的反馈抑制作用被脱敏化的二氢庚二酸合成酶以及其L-赖氨酸的反馈抑制作用被脱敏化的天冬氨酸激酶,来增强二氢吡啶二羧酸合成酶和天冬氨酸激酶的细胞内活性,并且,通过导入二氨基庚二酸脱氢酶基因增强二氨基庚二酸脱氢酶的细胞内活性。本发明的上述优选细菌可以通过将国际公开号WO95/16042中提到过的质粒pCABD2和pCABDE1导入埃希氏菌属细菌而获得。
<2>本发明的生产方法
通过以下方法可以有效生产L-赖氨酸:在合适培养基中培养按上述方法获得的本发明的细菌,以便产生并在培养物中积累L-赖氨酸,以及从培养物中回收L-赖氨酸。
用于培养本发明细菌的培养基,可以是含有碳源、氮源、无机离子和其它所需有机微量元素的常用培养基。
作为碳源,可以使用诸如葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖和淀粉水解产物的糖类;诸如甘油和山梨糖醇的醇类;或诸如富马酸、柠檬酸和琥珀酸的酸类。
作为氮源,可以使用诸如硫酸铵、氯化铵或磷酸铵的无机氨盐;诸如大豆水解产物的有机氮;氨气;或氨水。
作为有机微量养分,优选添加合适量的诸如维生素B1和L-异亮氨酸、酵母提取物等的必须物质。除此之外,还要添加少量磷酸钾、硫酸镁、铁离子、和锰离子等。
培养优选在有氧条件下进行16-72小时。培养期间,可以将培养温度控制在20-45℃,PH可以控制在5-8之间。可以将无机或有机、酸性或碱性物质,以及氨气用于PH调节。
从发酵液中收集L-赖氨酸通常是通过离子交换树脂方法、沉淀方法和其它已知技术的组合进行的。
实施例
下面将结合以下实施例对本发明作进一步具体说明。
例1
<1>制备具有各种特征的埃希氏菌属细菌
将下面的质粒导入大肠杆菌W3110(tyrA)。
质粒名称 所包含的基因
RSF24P dapA*
RSFD80 dapA*,lysC*
pCAB1 dapA*,lysC*,dapB
pCABD2 dapA*,lysC*,dapB,ddh
pCABD(B) Brev.dapA*,lysC*,dapB,ddh
pCABDE1 dapA*,lysC*,dapB,dapD,dapE
用于基因的缩略语具有以下含义。
ppc:磷酸烯醇丙酮酸羧化酶
lysC:天冬氨酸激酶III
lysC*:对抑制作用脱敏化的天冬氨酸激酶III
asd:天冬氨酸-半醛脱氢酶
dapA:二氢吡啶二羧酸合成酶
dapA*:对抑制作用脱敏化的二氢吡啶二羧酸合成酶
Brev.dapA:对抑制作用脱敏化的二氢吡啶二羧酸合成酶(源于乳发酵短杆菌)
dapB:二氢吡啶二羧酸还原酶
dapD:四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶
dapE:琥珀酰二氨基庚二酸脱酰酶
ddh:二氨基庚二酸脱氢酶(源于乳发酵短杆菌)
质粒RSF24P,RSFD80,pCAB1,pCABD2和pCABDE1披露于国际公开号WO95/16042中。这些质粒的结构同样披露于国际公开号WO95/16042中,如下文所述。
(1)RSF24P
根据已知的大肠杆菌dapA核苷酸结构(细菌学杂志,166,297,1986),通过PCR扩增含有dapA的SD序列和开放读框(ORF)的片段。将扩增的片段连接到克隆载体pCR1000上,获得质粒pdapA2,其中,连接了dapA,使得dapA的转录方向与pCR1000上lacZ启动子指导的转录方向相反。用羟胺对质粒pdapA2进行诱变处理,并将进行过诱变处理的pdapA2导入大肠杆菌W3110。从转化体中筛选具有AEC抗性的转化体。另外,测定了L-赖氨酸对筛选的抗性菌株所具有的质粒编码的DDPS的抑制程度,并且筛选将L-赖氨酸的抑制作用脱敏化的菌株。将质粒pdapA24(通过测序证实第597号位置上的C变成了T)连接到pVIC40上,位于四环素抗性基因启动子下游,以便获得RSF24P(图1)。
向其中导入了pdapA24的大肠杆菌JM109菌株被命名为AJ12395,并且于1993年10月28日保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(邮政编码305-8566,1-3Higashi 1-chome,Tsukuba-shi,Ibaraki-ken,日本),获得的保藏号为FERM P-12935。然后,按照布达佩斯条约的规定于1994年11月1日转为国际保藏,所获得的保藏号为FERM BP-4858。
(2)RSFD80
根据已知的大肠杆菌lysC核苷酸序列(细菌学杂志,166,297,1986),通过PCR扩增含有lysC的SD序列和开放读框(ORF)的片段。将扩增的片段连接到多拷贝载体pUC18上,获得质粒pLYSC1,其中,连接了lysC,使得lysC的转录方向与pUC18上lacZ的转录方向相反。用羟胺对质粒pLYSC1进行诱变处理,并将进行过诱变处理的pLYSC1导入大肠杆菌GT3。从转化体中筛选具有AEC抗性的转化体。另外,将pLYSC1导入大肠杆菌MC1061,然后,用羟胺对细胞进行诱变处理,从转化体中筛选具有AEC抗性和L-赖氨酸抗性的转化体。另外,测定了L-赖氨酸对筛选的抗性菌株所具有的质粒编码的AK的抑制程度和热稳定性,并且筛选将L-赖氨酸的抑制作用脱敏化、具有卓越稳定性的菌株。将质粒pLYSC1*80(通过测序证实第352号位置上的C变成了T)连接到pHSG399上,位于lacZ启动子下游,以便获得pLLC*80。如图2所示,由pLLC*80和RSF24P构建RSFD80。
向其中导入了RSFD80的大肠杆菌JM109菌株被命名为AJ12396,并且于1993年10月28日保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(邮政编码305-8566,1-3 Higashi 1-chome,Tsukuba-shi,Ibaraki-ken,日本),获得的保藏号为FERM P-13936。然后,按照布达佩斯条约的规定于1994年11月1日转为国际保藏,所获得的保藏号为FERM BP-4859。
(3)pCAB1
根据已知的dapB核苷酸序列(Bouvier,J.等,生物学化学杂志,259,14829,1984),通过PCR由大肠杆菌W3110菌株染色体DNA扩增dapB。用AseI和DraI消化获得的扩增DNA片段,将获得的片段末端补平,并插入pMW119的SmaI位点,以便获得质粒pdapB。然后,如图3所示,将dapB导入RSFD80,以便获得pCAB1。
(4)pCABD2
根据已知的谷氨酸棒杆菌ddh核苷酸序列(Ishino,S.等,核酸研究,15,3917,1987),通过PCR由乳发酵短杆菌ATCC13869染色体DNA扩增ddh。用EcoT22I和AvaI消化获得的扩增DNA片段,将获得的片段末端补平,并插入pMW119的SmaI位点,以便获得质粒pddh。然后,如图4所示,将ddh导入pCAB1,以便获得pCABD2。
(5)pCABDE1
根据已知的dapD核苷酸序列(Richaud,C.等,生物学化学杂志,259,14829,1984),通过PCR由大肠杆菌W3110菌株染色体DNA扩增dapD。用EcoO109I和SacI消化获得的扩增DNA片段,将获得的片段末端补平,并插入pMW118的SmaI位点,以便获得质粒pdapD。另外,根据已知的dapE核苷酸序列(Bouvier,J.等,细菌学杂志,174,5265,1992),通过PCR由大肠杆菌W3110菌株染色体DNA扩增dapE。用MunI和BgII消化获得的扩增DNA片段,将获得的片段末端补平,并插入pMW118的SmaI位点,以便获得质粒pdapE。另外,将dapE从pdapE上切除,并插入pdapD,以便获得含有dapE和dapD的质粒pMWpdapDE1。如图5所示,将含有dapE和dapD的片段从质粒pMWdapDE1上切除,并插入pCAB1,以便获得pCABDE1。
Pcabd(B)是按照以下方法构建的。
首先,用具有以下序列的引物,由pBR322扩增含有四环素抗性基因的启动子位点的DNA片段。
5’-TCAAGAATTCTTCATGTTTGA-3’(SEQ ID NO:1)
5’-GTTAGATTTGGTACCCGGTGCCTGACTGCGTTAGC-3’(SEQ IDNO:2)
用KpnI和EcoRI消化扩增的DNA片段,并插入pUC18的KpnI和EcoRI裂解位点之间,获得pUTES(图18)。
使用具有以下序列的引物,以乳发酵短杆菌Ysr菌株的染色体DNA作模板扩增Brev.dapA基因。
5’-GGTTGTGGTACCCCCAAATGAGGGAAGAAG-3’(SEQ ID NO:3)
5’-TGGAACCTCTGTTGCTGCAG-3’(SEQ ID NO:4)
用KpnI和BamHI消化扩增的Brev.dapA基因,并插入pUTES的KpnI和BamHI裂解位点之间,获得pUEBL3(图19)。
然后,用EcoRI和XbaI消化pUEBL3,并将两端补平,获得含有Brev.dapA的片段。然后,用NheI和SpeI消化在国际公开号WO95/16042中披露的pCABD2,并将两端补平。收集含有lysC,dpaB和ddh的片段,再将前面获得的含有Brev.dapA的片段插入其中,获得pCABD(B)(图20)。
尽管在欧洲专利公开号488424中对大肠杆菌W3110(tyrA)进行了详细说明,下面还是要对其制备方法作扼要说明。大肠杆菌W3110菌株是从国家遗传学研究所(Shizuoka-ken,Mshima-shi)获得的。将该菌株接种到含有壮观霉素的LB平板上,并筛选能形成菌落的菌株,获得壮观霉素抗性菌株。将筛选的壮观霉素抗性菌株与大肠杆菌K-12ME8424菌株混合,并且以静止培养物形式在完全培养基(L-营养液:1%细菌用胰化蛋白胨,0.5%酵母提取物,0.5%氯化钠)中,在37℃下培养15分钟,以便诱导接合。大肠杆菌K-12 ME8424菌株具有HfrPO45,thi,relA1,tyrA::Tn10,ung-1和nadB的性状,并且可以从国家遗传学研究所获得。
然后,将接种物接种到含有壮观霉素、四环素和L-赖氨酸的完全培养基(L-营养液:1%细菌用胰化蛋白胨,0.5%酵母提取物,0.5%氯化钠,1.5%琼脂)中,并筛选形成菌落的菌株。该菌株被命名为大肠杆菌W3110(tyrA)菌株。
在欧洲专利公开号488424中披露了通过将质粒导入W3110(tyrA)菌株所产生的很多菌株。例如,通过导入质粒pHATerm所获得的菌株被命名为大肠杆菌W3110(tyrA)/pHATerm菌株(大肠杆菌AJ12662菌株),并且于1991年11月16日作为国际保藏保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(邮政编码305-8566,1-3 Higashi 1-chome,Tsukuba-shi,Ibaraki-ken,日本),所获得的保藏号为FERM BP-3653。也可以通过从大肠杆菌W3110(tyrA)/pHATerm菌株中消除质粒pHATerm获得W3110(tyrA)菌株。质粒的消除可以用常规方法完成。
<2>导入天冬氨酸-半醛脱氢酶基因(asd),磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(ppc),或天冬氨酸酶基因(aspA),并评估L-赖氨酸产量
作为含有asd的质粒和含有ppc的质粒,可以使用披露于国际公开号WO95/16042中的ppc,pasd,和pppc。在国际公开号WO95/16042中详细披露了这些质粒的结构。
(1)pasd
质粒asd是从含有所述基因的质粒pAD20(Haziza等,1,379,1982)中获得的。用AseI和ClaI消化质粒pAD20,将末端补平,并插入pMW118的SmaI位点,获得质粒pasd(图8)。
(2)pppc
质粒pppc是从含有所述基因的质粒pT2中获得的。用SmaI和ScaI消化质粒pT2,将末端补平,并插入pMW118的SmaI位点,获得质粒pppc(图9)。具有pT2的大肠杆菌F15菌株(AJ12873)于1993年7月15日保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(邮政编码305-8566,1-3Higashi 1-chome,Tsukuba-shi,Ibaraki-ken,日本),获得的保藏号为FERMP-13752。然后,按照布达佩斯条约的规定于1994年7月11日转为国际保藏,所获得的保藏号为FERM BP-4732。
按以下方法构建含有aspA的质粒.
使用具有以下序列的引物扩增大肠杆菌aspA基因。
5’-TGATCAGCGAAACACTTTTA-3’(SEQ ID NO:5)
5’-CAGCAAACTATGATGAGAA-3’(SEQ ID NO:6)
然后,将获得的扩增片段插入pMW118(Nippon Gene)的SmaI裂解位点,获得pMW118::aspA(图9)。
将pMW118(对照质粒)、pasd、pppc和pMW118::aspA(比较质粒)中的每一个分别导入大肠杆菌W3110(tyrA)和在上述<1>中所获得的转化体。除了通过将pMW118、pasd、pppc或pMW118::aspA导入大肠杆菌W3110(tyrA)所获得的转化体之外,所获得的转化体都含有两类质粒,即,一类是pMW118、pasd、pppc和pMW118::aspA,而另一类是RSF24P、RSFD80、pCAB1、pCABD2、pCABD(B)、和pCABDE1。通过披露于国际公开号WO95/16042中的方法,测定所述转化体的L-赖氨酸产量。具体方法如下。
在37℃下,在装有20毫升具有以下配方的培养基的500毫升Sakaguchi烧瓶中培养细胞30小时,以114-116rpm的速度搅拌。
(培养基配方)
葡萄糖 40g/l
7水硫酸镁 1g/l
硫酸铵 16g/l
磷酸二氢钾 1g/l
7水硫酸铁 0.01g/l
5水硫酸锰 0.01g/l
酵母提取物(Difco) 2g/l
L-酪氨酸 0.1g/l
用KOH调整到PH7.0,并在115℃下高压灭菌10分钟(葡萄糖和7水硫酸镁是分别灭菌的)。
碳酸钙 25g/l
(按照日本药典,在118℃下干热灭菌2天)
抗生素(根据要导入质粒的类型添加20mg/l壮观霉素,50mg/l氨苄青霉素或25mg/l卡那霉素)
用Asahi Chemicai Industry Co.,Ltd生产的Biotech AnalyzerAS210对培养液中的L-赖氨酸进行定量测定。
结果如表1所示。在表中,L-赖氨酸的量以每dl培养基中的毫克数表示。
表1
n.d.:未测定
从表1中可以清楚地看到,当在大肠杆菌中用dapA(RSF24P)、dapA+lysC(RSFD80),或dapA+lysC+dapB(pCAB1)单独或同时增强asd或ppc时,L-赖氨酸的产量(积累量)没有改变或只有小的改变,并且,对于asd来说,与asd或ppc不增强相比,它有可能减少(asd的为-180-20mg/dl,ppc的为10-30mg/dl)。相反,如果用dapA+lysC+dapB+ddh(pCABD2)或dapA+lysC+dapB+dapD+dapE(pCABDE1)同时增强它们,与asd或ppc不增强相比,发现L-赖氨酸的产量显著提高(asd的为70mg/dl,ppc的为90mg/dl)。不过,当用dapA+lysC+dapB+ddh(pCABD2)增强aspA时,没有发现L-赖氨酸产量显著提高。另外,即使用源于乳发酵短杆菌的dapA取代源于大肠杆菌的dapA(pCABD(B)),所获得的效果也与使用源于大肠杆菌的dapA(pCABD2)相同。因此,该基因的来源不被认为是重要的,但是,它们的组合是重要的。
例2
<1>构建含有磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(ppc)和天冬氨酸-半醛脱氢酶基因(asd),转氢酶基因(pntAB)或天冬氨酸酶基因(aspA)的质粒
按照以下方法构建含有ppc和asd的质粒,含有asd和pntAB的质粒,和含有ppc和aspA的质粒。
(1)含有ppc和asd的质粒(ppcd)
用KpnI和SphI消化披露于国际公开号WO95/16042中的质粒pasd,将含有asd的DNA片段的两个末端补平。然后,用XbaI消化披露于国际公开号WO95/16042中的质粒pppc,将两个末端补平,并将事先获得的asd片段插入其中,以便获得ppcd(图10)。
(2)含有asd和pntAB的质粒(pPTS)
用SmaI和HindIII消化披露于国际公开号WO95/11985中的质粒pMW::THY,并且收集含有pntAB的DNA片段。然后,用XbaI消化披露于国际公开号WO95/16042中的质粒pppc,将两个末端补平,并用HindIII进一步消化,将前面获得的pntAB片段插入裂解位点,以便获得pPTS(图11)。
质粒pMW::THY的构建详细披露于国际公开号WO95/11985中。大致方法如下。
根据已知的大肠杆菌pntA和pntB核苷酸序列(D.M.Clarke等,欧洲生物化学杂志,158,647-653,1986),通过PCR扩增含有包括具有启动子活性的这两个基因的片段。用BamHI和HindHI消化扩增的DNA片段,并将所获得的DNA片段连接到用BamHI和HindIII消化过的质粒载体pMW118(Nippon Gene)上,以便获得pMW::THY(图8)
向其中导入了pMW::THY的大肠杆菌JM109菌株被命名为AJ12929,并且于1993年10月4日保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(邮政编码305-8566,1-3Higashi 1-chome,Tsukuba-shi,Ibaraki-ken,日本),获得的保藏号为FERM P-13890。然后,按照布达佩斯条约的规定于1994年9月14日转为国际保藏,所获得的保藏号为FERM BP-4798。
(3)含有ppc和aspA的质粒(pAPW)
用SacI消化披露于上述例1中的中的质粒pMW118::aspA,将两个末端补平,并用HindIII进一步消化以便获得含有aspA的DNA片段。然后,用XbaI消化披露于国际公开号WO95/16042中的质粒pppc,将两个末端补平,并用HindIII进一步消化,将前面获得的aspA片段插入HindIII裂解位点,以便获得pAPW(图12)。
<2>导入两种类型的基因,并评估L-赖氨酸产量
分别向上述例1所获得的导入了pCABD2的转化体中导入pppc(参考质粒),ppcd,pPTS和pAPW(比较质粒)。所获得的转化体含有两类质粒,即pppc,ppcd,pPTS,pAPW和pCABD2中的一个。用与例1<2>相同的方法测定所述转化体的L-赖氨酸产量。
结果如表2所示。
表2
赖氨酸积累量(mg/dl) | |
pCABD2+pppc | 1380 |
pCABD2+ppcd | 1460 |
pCABD2+pPTS | 1450 |
pCABD2+pAPW | 1390 |
从表2中可以清楚地看到,在用dapA+lysC+dapB+ddh+ppc(ppcd或pPTS)同时增强asd或pntAB时,发现L-赖氨酸的产量显著提高(asd的为80mg/dl,pntAB的为70mg/dl)。不过,对于aspA来说,即使用dapA+lysC+dapB+ppc(pAPW)同时增强aspA,也没有发现L-赖氨酸产量显著提高。
例3
<1>构建含有磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(ppc),转氢酶基因(pntAB)和天冬氨酸-半醛脱氢酶基因(asd)或天冬氨酸酶基因(aspA)的质粒
按照以下方法构建含有ppc,pntAB和asd的质粒,含有ppc,pntAB和aspA的质粒。
(1)含有ppc,pntAB和asd的质粒(pPTd)
用KpnI和SphI消化披露于国际公开号WO95/16042中的质粒pasd,将含有asd的DNA片段的两个末端补平。然后,用HindIII消化披露于上述例2中的质粒pPTS,将两个末端补平,并将事先获得的asd片段插入HindIII裂解位点,以便获得pPTd(图13)。
(2)含有ppc,pntAB和aspA的质粒(pAPT)
用SmaI和HindIII消化披露于国际公开号WO95/11985中的质粒pMW::THY,并且收集含有pntAB的DNA片段。然后,用XbaI消化披露于上述例2中的质粒pAPW,将两个末端补平,并用HindIII进一步消化。将前面获得的pntAB片段插入HindIII裂解位点,以便获得pAPT(图14)。
<2>导入两种类型的基因,并评估L-赖氨酸产量
分别向上述例1所获得的导入了pCABD2的转化体中导入pPTS(参考质粒),pPTd和pAPT。所获得的转化体含有两类质粒,即pPTS,pPTd和pAPT,和pCABD2中的一个。用与例1<2>相同的方法测定所述转化体的L-赖氨酸产量。
结果如表3所示。
表3
赖氨酸积累量(mg/dl) | |
pCABD2+pPTS | 1450 |
pCABD2+pPTd | 1510 |
pCABD2+pAPT | 1500 |
从表3中可以清楚地看到,在用dapA+lysC+dapB+ddh+ppc+pntAB(pPTd或pAPT)同时增强asd或aspA时,发现L-赖氨酸的产量显著提高(asd的为60mg/dl,aspA的为50mg/dl)。
例4
<1>构建含有磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(ppc),转氢酶基因(pntAB),天冬氨酸-半醛脱氢酶基因(asd)和天冬氨酸酶基因(aspA)的质粒
按照以下方法构建含有ppc,pntAB,asd和aspA的质粒。
用HindIII消化披露于上述例3中的质粒pAPT,将两个末端补平,用SmaI进一步消化,以便获得含有ppc,pntAB和aspA的DNA片段。然后,用EcoRI消化pMW218(Nippon Gene),将两个末端补平,并将事先获得的含有ppc,pntAB和aspA的DNA片段插入EcoRI裂解位点,以便获得pAPTK(图15)。
然后,用KpnI消化披露于国际公开号WO95/16042中的质粒pasd,将两个末端补平,用BamHI进一步消化,以便获得有asd的DNA片段。然后,用PstI消化pTV29,将两个末端补平,并将事先获得的asd片段插入BamHI裂解位点,以便获得pSd(图16)。
然后,用SphI消化pSd,将两个末端补平,用XbaI进一步消化,以便再次获得有asd的DNA片段。然后,用SacI消化pAPTK,将两个末端补平,并将事先获得的asd片段插入XbaI裂解位点,以便获得pKD(图17)。
<2>导入四种类型的基因,并评估L-赖氨酸产量
分别向上述例1所获得的导入了pCABD2、pCABD(B)或pCABDE1的转化体中导入pAPT(参考质粒1),pAPTK(参考质粒2)或pKD。所获得的转化体含有两类质粒,即pAPT,pAPTK和pKD中的一个,和pCABD2,pCABD(B)和pCABDE1中的一个。用与例1<2>相同的方法测定所述转化体的L-赖氨酸产量。
结果如表4所示。
表4
赖氨酸积累量(mg/dl) | |
pCABD2+pAPT | 1500 |
pCABD2+pAPTK | 1500 |
pCABD2+pKD | 1600 |
pCABD(B)+pKD | 1590 |
pCABDE1+pKD | 1580 |
从表4中可以清楚地看到,在用dapA+lysC+dapB+ddh+ppc+pntAB+aspA同时增强asd时,发现L-赖氨酸的产量显著提高。用pCABD(B)或pCABDE1取代pCABD2时,获得了类似结果。
表4中的质粒pAPTK相当于将抗氨苄青霉素的抗药基因改变成抗卡那霉素抗药基因的质粒pAPT(因为该载体从pMW118变成了pMW218)。由于pKD是通过将asd插入pAPTK制备成的,因此认为pAPTK比pAPT更适合作为pKD的对照。因此,同时提供了pAPTK的数据。还证实了即使改变抗药基因也不会影响L-赖氨酸的产量。
工业应用性
本发明提供了具有高L-赖氨酸产量的埃希氏菌属细菌,并且,通过该细菌可以获得高产量的L-赖氨酸。
序列表
<110>味之素株式会社(Ajinomoto Co.,Ltd.)
<120>生产L-赖氨酸的方法
<130>B-603MSOP956
<160>6
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增tet启动子部分的引物
<400>1
tcaagaattc tcatgtttga 20
<210>2
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增tet启动子部分的引物
<400>2
gttagatttg gtacccggtg cctgactgcg ttagc 35
<210>3
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增dapA的引物
<400>3
ggttgtggta cccccaaatg agggaagaag 30
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增dapA的引物
<400>4
tggaacctct gttgctgcag 20
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增aspA的引物
<400>5
tgatcagcga aacactttta 20
<210>6
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增aspA的引物
<400>6
cagcaaacta tgatgagaa 19
Claims (9)
1.一种埃希氏菌属细菌,其中(1)二氢吡啶二羧酸合成酶、天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸还原酶的细胞内活性增强,和(2)二氨基庚二酸脱氢酶的细胞内活性或四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶和琥珀酰二氨基庚二酸脱酰酶的细胞内活性增强,其中,天冬氨酸-半醛脱氢酶或磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的细胞内活性增强,
其中所述细菌包含:
(A)插入了每种酶的基因的多拷贝型质粒,
(B)在染色体上扩增的每种酶的基因,或
(C)在染色体上的每种酶的基因的修饰的启动子。
2.一种埃希氏菌属细菌,其中(1)二氢吡啶二羧酸合成酶、天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸还原酶的细胞内活性增强,和(2)二氨基庚二酸脱氢酶的细胞内活性或四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶和琥珀酰二氨基庚二酸脱酰酶的细胞内活性增强,其中,磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的细胞内活性和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸转氢酶或天冬氨酸-半醛脱氢酶的细胞内活性增强,
其中所述细菌包含:
(A)插入了每种酶的基因的多拷贝型质粒,
(B)在染色体上扩增的每种酶的基因,或
(C)在染色体上的每种酶的基因的修饰的启动子。
3.一种埃希氏菌属细菌,其中(1)二氢吡啶二羧酸合成酶、天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸还原酶的细胞内活性增强,和(2)二氨基庚二酸脱氢酶的细胞内活性或四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶和琥珀酰二氨基庚二酸脱酰酶的细胞内活性增强,其中,磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸转氢酶的细胞内活性和天冬氨酸-半醛脱氢酶或天冬氨酸酶的细胞内活性增强,
其中所述细菌包含:
(A)插入了每种酶的基因的多拷贝型质粒,
(B)在染色体上扩增的每种酶的基因,或
(C)在染色体上的每种酶的基因的修饰的启动子。
4.如权利要求3的细菌,其中,所述天冬氨酸-半醛脱氢酶和天冬氨酸酶的细胞内活性增强,
其中所述细菌包含:
(A)插入了每种酶的基因的多拷贝型质粒,
(B)在染色体上扩增的每种酶的基因,或
(C)在染色体上的每种酶的基因的修饰的启动子。
5.如权利要求3的细菌,其中,天冬氨酸激酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶、琥珀酰二氨基庚二酸脱酰酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和天冬氨酸-半醛脱氢酶分别源于大肠杆菌,如果存在,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸转氢酶和天冬氨酸酶分别源于大肠杆菌,二氢吡啶二羧酸合成酶源于大肠杆菌或乳发酵短杆菌,而二氨基庚二酸脱氢酶源于乳发酵短杆菌。
6.如权利要求4的细菌,其中,天冬氨酸激酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶、琥珀酰二氨基庚二酸脱酰酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和天冬氨酸-半醛脱氢酶分别源于大肠杆菌,如果存在,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸转氢酶和天冬氨酸酶分别源于大肠杆菌,二氢吡啶二羧酸合成酶源于大肠杆菌或乳发酵短杆菌,而二氨基庚二酸脱氢酶源于乳发酵短杆菌。
7.如权利要求1-6中任一项的细菌,其中,通过获得其L-赖氨酸的反馈抑制作用被脱敏化的二氢庚二酸合成酶以及其L-赖氨酸的反馈抑制作用被脱敏化的天冬氨酸激酶,来增强二氢吡啶二羧酸合成酶和天冬氨酸激酶的细胞内活性,并且,通过导入二氨基庚二酸脱氢酶基因,来增强二氨基庚二酸脱氢酶的细胞内活性。
8.一种生产L-赖氨酸的方法,该方法包括在合适的培养基中培养权利要求1-6中任一项的细菌,以便产生并且在培养基中积累L-赖氨酸,以及从培养物中收集赖氨酸。
9.一种生产L-赖氨酸的方法,该方法包括在合适的培养基中培养权利要求7的细菌,以便产生并且在培养基中积累L-赖氨酸,以及从培养物中收集赖氨酸。
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