CN110964682B

CN110964682B - L-赖氨酸耐受菌、生产菌及其用途

Info

Publication number: CN110964682B
Application number: CN201811160298.7A
Authority: CN
Inventors: 雷云凤; 刘修才
Original assignee: Cathay R&D Center Co Ltd; CIBT America Inc
Current assignee: Cathay R&D Center Co Ltd; CIBT America Inc
Priority date: 2018-09-30
Filing date: 2018-09-30
Publication date: 2021-09-03
Anticipated expiration: 2038-09-30
Also published as: CN110964682A

Abstract

本申请提供一种新的L‑赖氨酸耐受菌、由其产生的L‑赖氨酸生产菌及其生产L‑赖氨酸和1,5‑戊二胺的方法。

Description

L-赖氨酸耐受菌、生产菌及其用途

技术领域

本申请涉及一种L-赖氨酸高耐受菌、由其产生的L-赖氨酸生产菌及其用途，例如生产L-赖氨酸或1,5-戊二胺。

背景技术

通过DNA重组技术改造具有生产L-赖氨酸能力的棒杆菌属和埃希杆菌属的细菌，现已实现工业化的生产。这些细菌的L-赖氨酸生产率的提高是通过过表达L-赖氨酸合成途径的相关基因和反馈抑制脱敏的相关基因，或者从葡萄糖代谢开始的能量供应途径的强化而实现的。

在各种已知的生物体中，成熟的rRNA和tRNA分子，在核糖核酸的不同位置包含有多种修饰，这些修饰能够拓展它们的化学和功能多样性并且加强它们的结构稳定性。在RNA复合体成熟过程中，修饰酶能够专一识别RNA分子并在特定的位置进行甲基化修饰。在模式生物大肠杆菌和酿酒酵母中，已鉴定到多种甲基转移酶参与这一过程。从蛋白序列同源比对的结果来看，甲基转移酶编码基因yjtD、yfhQ、yibK和spoU的蛋白相似性较高，yggH、yaeB和yecP基因的蛋白序列相似性较高，rumT、yfiC、trmD和yfgB基因的蛋白序列相似性较高(序列比对结果见图1)。

据报道，通过对链球菌属肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)甲基转移酶编码基因trmD的下调表达，发现该基因是菌株生长所必需的(O'Dwyer Ket,al.J Bacteriol.2004Apr；186(8):2346-54.)。大肠杆菌中甲基转移酶编码基因trmD的敲除导致菌株生长速率有几倍的降低(Persson BC,et,al.J Bacteriol.1995Oct；177(19):5554-60.)。

目前，没有报道通过过表达甲基转移酶基因获得L-赖氨酸生产菌。赖氨酸脱羧酶可以将L-赖氨酸脱去一个羧基生成1,5-戊二胺(尸胺)和CO₂。而1,5-戊二胺的用途相当广泛，例如可以和二元酸进行聚合反应合成新型尼龙，在工业生产中具有很高的应用价值。

发明内容

一方面，提供了L-赖氨酸耐受菌，其于2018年07月06日保藏在位于武汉市武昌区八一路299号武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，是保藏编号为CCTCC NO：M2018456的大肠杆菌(Escherichia coli)菌株M11-A3。

另一方面，提供了L-赖氨酸生产菌，其通过在大肠杆菌(Escherichia coli)菌株M11-A3(保藏号为CCTCC NO:M 2018456)中过表达tRNA甲基转移酶基因而获得。

在本文中，术语“过表达”是指微生物中由相应的DNA编码的一或多种酶的胞内活性的提高，例如通过提高基因的拷贝数，或使用强启动子或编码高活性相应酶的基因，及任选地组合使用这些方法。

在一些实施方案中，tRNA甲基转移酶基因可以来源于微生物、动物或植物，如来源于大肠杆菌(Escherichia coli)、嗜热菌(Thermus thermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)、沙雷菌(Shewanella oneidensis)、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)、弗氏单胞菌(Aeromonas fluvialis)、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)或鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)。

在一些实施方案中，所述tRNA甲基转移酶基因是yjtD基因、yfhQ基因、yibK基因或spoU基因，例如SEQ ID No:1的yjtD基因，SEQ ID No:3的yfhQ基因、SEQ ID No:4的yibK基因或者SEQ ID No:5的spoU基因。

在一些实施方案中，所述tRNA甲基转移酶基因是yjtD基因、yfhQ基因、yibK基因或spoU基因，例如来自大肠杆菌的SEQ ID No:1的yjtD基因，来自大肠杆菌的SEQ ID No:3的yfhQ基因、来自大肠杆菌的SEQ ID No:4的yibK基因或者来自大肠杆菌的SEQ ID No:5的spoU基因，或者与之具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列。

再一方面，提供了生产L-赖氨酸的方法，所述方法包括使用上述L-赖氨酸生产菌。

再一方面，提供了生产1,5-戊二胺的方法，所述方法包括使用上述L-赖氨酸生产菌。

附图说明

图1显示了大肠杆菌MG1655中tRNA甲基转移酶的蛋白序列相似性比对结果。

实施例

应当理解，尽管这些技术示例了实施本发明的优选实施方案，根据本公开，本领域技术人员会认识到，可以进行众多修改而不脱离本发明的精神和预期范围。还应当理解，本文所用的术语用于仅描述具体实施方案并且不意在是限制性的，因为本发明的范围将仅由所附的权利要求及其等同物限定。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：诱变获得酸耐受株

从大肠杆菌MG1655(E.coli MG1655K12，购自北京天恩泽基因科技有限公司)出发，通过ARTP物理诱变后L-赖氨酸类似物添加平板进行筛选。

具体地，接种MG1655菌株至50mL的LB培养基，待菌体浓度到OD600＝0.6时，收集菌体。将菌体转移至ARTP仪器(无锡源清天木生物科技有限公司)，选取70秒进行诱变处理(致死率达到98％)，收集诱变后的菌体，稀释10²和10³倍后，全部涂板M9培养基，其中该培养基中添加4mg/L的L-赖氨酸类似物S-(2-氨乙基)L-半胱氨酸(AEC)。在未添加AEC的平板上分别涂布未诱变的MG1655菌(稀释10⁵倍的菌液)，以及诱变处理后的菌体(稀释10³倍的菌液)。37℃培养两天后，获得AEC耐受能力提高的菌株共36株。挑取单菌落至30ul无菌生理盐水，获得浑浊的菌液。取3uL划线至不断增加浓度的AEC平板进行复筛，最后确认M11菌株耐受能力最强。

从新突变株M11出发，如上所述，通过ARTP物理诱变和高浓度AEC添加平板进行筛选，共获得24株新的突变菌株。将获得的24个新突变株和出发株M11，分别接种于不含抗生素的5ml种子培养基(含有4％葡萄糖,0.1％KH₂PO₄,0.1％MgSO₄,1.6％(NH₄)₂SO₄,0.001％FeSO₄,0.001％MnSO₄,0.2％酵母提取物，,0.01％L-苏氨酸,0.005％L-异亮氨酸，购自英格兰OXOID LTD.)进行培养，37℃、225rpm过夜。第二天，每个菌株再分别转接至50ml新鲜的含有30g/L葡萄糖、0.7％Ca(HCO₃)₂和100μg/mL氨苄青霉素的发酵培养基中，于37℃、170rpm继续培养72小时，利用核磁检测计算各培养基中的赖氨酸的含量(表1)。

表1.核磁检测24株新突变株与出发菌株M11相比的赖氨酸产量及OD₆₀₀

如表1所示，发酵72h后，突变株M11-A3的赖氨酸的产量为3.57g/kg，相比于出发株M11的L-赖氨酸产量提升26％，且突变株与对照相比生长无显著差异。为提高筛选条件，我们将发酵时间缩短为48h。三次重复发酵出发株和该突变株，确认突变株M11-A3的赖氨酸平均产量为3.0g/kg，相比于出发株M11的相对L-赖氨酸产量提升24～26％。

实施例2：构建表达载体pUC18-plac-yjtD并制备L-赖氨酸生产菌株

首先，构建重组表达质粒pUC8-plac-yjtD：根据多片段一步法克隆试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)产品说明书设计引物，在序列的两端引入与载体SacI/XbaI双酶切后重合20～30bp的DNA序列(分别是重复序列1，其序列为SEQ ID No：6，和重复序列2，其序列为SEQ ID No：7)，获得引物对yjtD-F和yjtD-R(SEQ ID NO：8和9)。以大肠杆菌MG1655基因组DNA作为模板，使用引物对yjtD-F和yjtD-R(SEQ ID NO：8和9)，通过PCR扩增SEQ ID No:1的yjtD，获得yjtD基因片段(SEQ ID NO：10)。将扩增产物和pUC18(购自宝生物工程(大连)有限公司)SacI/Xba酶切，进行切胶回收纯化，使用多片段一步法克隆试剂盒将上述两个片段进行连接。将连接产物转化至E.coli JM109(购自宝生物工程(大连)有限公司)感受态细胞中，在含有氨苄青霉素的LB平板上进行筛选，获得多个单菌落。通过菌落PCR和测序验证证实yjtD基因已插入到质粒载体pUC18的SacI/XbaI位点，得到正确的表达载体pUC18-plac-yjtD。

然后，使用实施例1筛选获得的M11-A3突变株，制备感受态。将表达载体pUC18-plac-yjtD转入受体菌M11-A3突变株中。涂布在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB抗性平板中进行筛选。挑取12个单菌落至添加有氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养3h后，取1μl菌体作为模板通过PCR筛选获得正确转化有pUC18-plac-yjtD的突变株，并甘油保种。

实施例3：生产L-赖氨酸

选取实施例2中获得3个转化子和出发株M11-A3，分别涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素和不含抗生素的种子培养基(含有4％葡萄糖,0.1％KH₂PO₄,0.1％MgSO₄,1.6％(NH₄)₂SO₄,0.001％FeSO₄,0.001％MnSO₄,0.2％酵母提取物(购自英格兰OXOID LTD)，,0.01％L-苏氨酸,0.005％L-异亮氨酸)平板上进行培养。进一步，分别各挑取3个单克隆，利用5ml种子培养基37℃、225rpm培养过夜。第二天，每个菌株再分别转接至50ml新鲜的含有30g/L葡萄糖、0.7％Ca(HCO₃)₂和100μg/mL氨苄青霉素的发酵培养基中于37℃、170rpm继续培养48小时，利用核磁检测并计算各培养基中的赖氨酸的含量(表2)。

表2.核磁检测3株yjtD过表达突变株与出发菌株相比的赖氨酸产量及OD₆₀₀。

如表2所示，含有质粒pUC18-plac-yjtD的转化株的赖氨酸的平均产量为3.84g/kg，是对照M11-A3菌株的128％，且转化株与对照相比生长无显著差异。由此分析是由于yjtD基因过表达导致其表达水平提高，从而引起了突变株M11-A3/pUC18-plac-yjtD细胞内赖氨酸转化率的提升。

实施例4：生产1,5-戊二胺

首先，构建重组表达质粒pUC8-plac-yjtD-plac-cadA：根据多片段一步法克隆试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)产品说明书设计引物，在plac序列的左侧引入与pUC18-plac-yjtD载体XbaI/PstI双酶切后酶切后上游重合20～30bp的DNA序列(重复序列3，其序列为SEQ ID No：11)获得引物plac-F(SEQ ID No：12)。在赖氨酸脱羧酶cadA基因序列的两端引入与plac序列及pUC18-plac-yjtD载体XbaI/PstI双酶切后重合20～30bp的DNA序列(重复序列4，其序列为SEQ ID No：14，和重复序列5，其序列为SEQ ID No：15)，获得引物对cadA-F和cadA-R(SEQ ID NO：16和17)。以pUC18质粒DNA作为模板，使用引物对plac-F和plac-R(SEQ ID NO：12和13)，通过PCR扩增获得plac片段(SEQ ID NO：18)。以MG1655的基因组DNA作为模板，使用引物对cadA-F和cadA-R，通过PCR扩增获得cadA序列(SEQ ID NO：19)。将plac、cadA片段和pUC18-plac-yjtD载体XbaI/PstI双酶切后进行切胶回收纯化，使用多片段一步法克隆试剂盒将上述两个片段和载体进行连接。连接后的产物转化至E.coliJM109(购自宝生物工程(大连)有限公司)感受态细胞中，在含有氨苄青霉素的LB平板上进行筛选，获得多个单菌落。通过菌落PCR和测序验证证实plac-cadA表达系列已插入到质粒载体pUC18-plac-yjtD的XbaI/PstI位点，得到正确的表达载体pUC18-plac-yjtD-plac-cadA。

然后，使用实施例1筛选获得的M11-A3突变株，制备感受态。将表达载体pUC18-plac-yjtD-plac-cadA转入受体菌M11-A3突变株中。涂布在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB抗性平板中进行筛选。挑取12个单菌落至添加有氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养3h后，取1μl菌体作为模板进行PCR验证正确转化有pUC18-plac-yjtD-plac-cadA的突变株，并甘油保种。

选取上述3个转化子和出发株M11-A3，分别涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素和不含抗生素的种子培养基(含有4％葡萄糖,0.1％KH₂PO₄,0.1％MgSO₄,1.6％(NH₄)₂SO₄,0.001％FeSO₄,0.001％MnSO₄,0.2％酵母提取物(购自英格兰OXOID LTD.),0.01％L-苏氨酸,0.005％L-异亮氨酸)平板上进行筛选。进一步，分别各挑取3个单克隆，利用5ml种子培养基37℃、225rpm培养过夜。第二天，每个菌株再分别转接至50ml新鲜的含有30g/L葡萄糖、0.7％Ca(HCO₃)₂和100μg/mL氨苄青霉素的发酵培养基中于37℃、170rpm继续培养48小时，利用核磁检测并计算各培养基中的戊二胺的含量(表3)。表3.核磁检测3株yjtD和CadA过表达突变株与出发菌株相比的戊二胺产量及OD₆₀₀。

如表3所示，含有质粒pUC18-plac-yjtD-plac-cadA的转化株的戊二胺的产量为1.82g/kg。该转化株的L-赖氨酸转化率为84.9％，且转化株与对照相比生长无显著差异。由此分析yjtD和cadA基因同时过表达能够将L-赖氨酸高效转化为戊二胺，转化有pUC18-plac-yjtD-plac-cadA的突变株M11-A3能够应用于戊二胺的生产。

序列表

<110> 上海凯赛生物技术研发中心有限公司

凯赛生物产业有限公司

<120> L-赖氨酸耐受菌、生产菌及其用途

<130> LZ1804510CN01

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 687

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<220>

<223> yjtD

<400> 1

atgcgtataa cgattattct ggtcgcaccc gccagagcag aaaatattgg ggcagcggcg 60

cgggcaatga aaacgatggg gtttagcgat ctgcggattg tcgatagtca ggcacacctg 120

gagccagcca cccgctgggt cgcacatgga tctggtgata ttattgataa tattaaagtt 180

ttcccgacat tggctgaatc gttacacgat gtcgatttca ctgtcgccac cactgcgcgc 240

agtcgggcga aatatcatta ctacgccacg ccagttgaac tggtgccgct gttagaggaa 300

aaatcttcat ggatgagcca tgccgcgctg gtgtttggtc gcgaagattc cgggttgact 360

aacgaagagt tagcgttggc tgacgttctt actggtgtgc cgatggtggc ggattatcct 420

tcgctcaatc tggggcaggc ggtgatggtc tattgctatc aattagcaac attaatacaa 480

caaccggcga aaagtgatgc aacggcagac caacatcaac tgcaagcttt acgcgaacga 540

gccatgacat tgctgacgac tctggcagtg gcagatgaca taaaactggt cgactggtta 600

caacaacgcc tggggctttt agagcaacga gacacggcaa tgttgcaccg tttgctgcat 660

gatattgaaa aaaatatcac caaataa 687

<210> 2

<211> 228

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<220>

<223> yjtD蛋白序列

<400> 2

Met Arg Ile Thr Ile Ile Leu Val Ala Pro Ala Arg Ala Glu Asn Ile

1 5 10 15

Gly Ala Ala Ala Arg Ala Met Lys Thr Met Gly Phe Ser Asp Leu Arg

20 25 30

Ile Val Asp Ser Gln Ala His Leu Glu Pro Ala Thr Arg Trp Val Ala

35 40 45

His Gly Ser Gly Asp Ile Ile Asp Asn Ile Lys Val Phe Pro Thr Leu

50 55 60

Ala Glu Ser Leu His Asp Val Asp Phe Thr Val Ala Thr Thr Ala Arg

65 70 75 80

Ser Arg Ala Lys Tyr His Tyr Tyr Ala Thr Pro Val Glu Leu Val Pro

85 90 95

Leu Leu Glu Glu Lys Ser Ser Trp Met Ser His Ala Ala Leu Val Phe

100 105 110

Gly Arg Glu Asp Ser Gly Leu Thr Asn Glu Glu Leu Ala Leu Ala Asp

115 120 125

Val Leu Thr Gly Val Pro Met Val Ala Asp Tyr Pro Ser Leu Asn Leu

130 135 140

Gly Gln Ala Val Met Val Tyr Cys Tyr Gln Leu Ala Thr Leu Ile Gln

145 150 155 160

Gln Pro Ala Lys Ser Asp Ala Thr Ala Asp Gln His Gln Leu Gln Ala

165 170 175

Leu Arg Glu Arg Ala Met Thr Leu Leu Thr Thr Leu Ala Val Ala Asp

180 185 190

Asp Ile Lys Leu Val Asp Trp Leu Gln Gln Arg Leu Gly Leu Leu Glu

195 200 205

Gln Arg Asp Thr Ala Met Leu His Arg Leu Leu His Asp Ile Glu Lys

210 215 220

Asn Ile Thr Lys

225

<210> 3

<211> 741

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<220>

<223> yfhQ

<400> 3

atgctgcaaa atattcgaat tgtgctggtg gagacgtcac acaccggcaa tatgggttct 60

gttgcccgtg ccatgaaaac aatgggatta accaatctgt ggctggttaa tccactggtg 120

aaacccgact cccaggcgat tgccctggca gcaggggcca gcgatgtgat tggtaatgct 180

cacatcgtcg atacgctcga cgaagcgtta gccggttgta gcctggtggt gggcaccagc 240

gcacgttccc gcacgctgcc atggccgatg ctcgacccgc gcgaatgcgg cctgaaaagc 300

gtcgctgaag cggcaaatac cccggtggcg ctggtgtttg gtcgcgagcg cgtcggcttg 360

accaatgaag agttgcagaa atgccattat catgtcgcga ttgcggctaa cccggaatac 420

agctcgctga acctggcgat ggcggttcag gttattgcct atgaagtgcg catggcctgg 480

ctggcaactc aggaaaacgg cgagcaggtc gagcatgaag agacgccgta tccgctggtc 540

gatgatctgg agcgttttta tggtcatctg gaacaaacgc tgctggcaac cggttttatc 600

cgtgaaaacc atccggggca ggtgatgaat aaattgcgcc gtctgtttac ccgtgcgcgc 660

ccggaaagcc aggagttgaa tatcctgcgc gggattctgg cttctattga gcagcagaat 720

aaaggtaaca aggccgaata a 741

<210> 4

<211> 474

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<220>

<223> yibk

<400> 4

atgctaaaca tcgtacttta cgaaccagaa attccgccaa atactggcaa catcatccgt 60

ctttgcgcta ataccggctt tcgtctgcat atcatcgaac cgatgggatt tgcctgggac 120

gataagcgcc tgcgccgcgc ggggctggac tatcacgagt ttaccgccgt tacgcgtcat 180

catgactatc gcgcgttcct cgaagcagaa aatccccagc gcctgttcgc cctcaccacg 240

aaaggtacac ctgctcacag cgccgtaagc tatcaggatg gcgattatct gatgttcggc 300

ccggaaacac gcggcctgcc agcgagcatt cttgatgccc tgcccgctga acaaaaaatt 360

cgcattccga tggtgccgga cagccgcagc atgaatctgt ccaatgcggt gtcggtagtg 420

gtgtatgaag cctggcggca gttggggtat ccgggagcgg tattgagaga ttag 474

<210> 5

<211> 690

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<220>

<223> spoU

<400> 5

atgaacccaa cacgttatgc acgcatctgc gaaatgctcg ccaggcggca gcctgatctg 60

accgtctgca tggagcaggt ccacaaacct cataacgttt ctgcgattat tcgtaccgca 120

gatgccgttg gcgtacatga agttcacgcc gtctggcctg gtagccgcat gcgcaccatg 180

gcttcggcag cggcgggtag taacagctgg gtacaggtga aaacacaccg caccattggc 240

gatgccgtcg ctcatctcaa aggccagggc atgcagattc tggcaaccca tctttctgat 300

aacgctgtcg atttccgcga aattgattac actcgcccga cctgcatttt gatgggacag 360

gagaaaacgg gcatcacgca ggaagcattg gccctggcgg atcaggacat catcattccg 420

atgatcggca tggtgcagtc gctgaatgtt tccgttgcct cagccctcat tctttacgaa 480

gcccagcgtc agcggcaaaa tgcaggcatg tacctgcgtg aaaacagcat gttgccggaa 540

gcagagcaac aacgcctgtt gtttgaaggc ggctatccgg tgctggcgaa agtcgcaaaa 600

cgcaaaggcc tgccttatcc ccacgtcaat cagcaaggcg agatcgaagc tgatgccgac 660

tggtgggcta ctatgcaggc tgcagggtaa 690

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> yjtD扩增引物与载体重复序列1

<400> 6

ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggag gagctc 36

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> yjtD扩增引物与载体重复序列2

<400> 7

tctagagtcg acctgcaggc atgcaagctt 30

<210> 8

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> yjtD-F

<400> 8

ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggag gagctcatgc gtataacgat tattctggtc 60

<210> 9

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> yjtD-R

<400> 9

aagcttgcat gcctgcaggt cgactctaga ttatttggtg atattttttt caatatcat 59

<210> 10

<211> 753

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PCR扩展获得yjtD基因序列

<400> 10

ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggag gagctcatgc gtataacgat tattctggtc 60

gcacccgcca gagcagaaaa tattggggca gcggcgcggg caatgaaaac gatggggttt 120

agcgatctgc ggattgtcga tagtcaggca cacctggagc cagccacccg ctgggtcgca 180

catggatctg gtgatattat tgataatatt aaagttttcc cgacattggc tgaatcgtta 240

cacgatgtcg atttcactgt cgccaccact gcgcgcagtc gggcgaaata tcattactac 300

gccacgccag ttgaactggt gccgctgtta gaggaaaaat cttcatggat gagccatgcc 360

gcgctggtgt ttggtcgcga agattccggg ttgactaacg aagagttagc gttggctgac 420

gttcttactg gtgtgccgat ggtggcggat tatccttcgc tcaatctggg gcaggcggtg 480

atggtctatt gctatcaatt agcaacatta atacaacaac cggcgaaaag tgatgcaacg 540

gcagaccaac atcaactgca agctttacgc gaacgagcca tgacattgct gacgactctg 600

gcagtggcag atgacataaa actggtcgac tggttacaac aacgcctggg gcttttagag 660

caacgagaca cggcaatgtt gcaccgtttg ctgcatgata ttgaaaaaaa tatcaccaaa 720

taatctagag tcgacctgca ggcatgcaag ctt 753

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> plac扩增引物与载体重复序列3

<400> 11

atgatattga aaaaaatatc accaaataat ctaga 35

<210> 12

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> plac-F

<400> 12

atgatattga aaaaaatatc accaaataat ctagaggata accgtattac cgcctttga 59

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> plac-R

<400> 13

agctgtttcc tgtgtgaaat tgtta 25

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> cadA扩增引物与plac区域重复序列4

<400> 14

gcggataaca atttcacaca ggaaacagct 30

<210> 15

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> cadA扩增引物与载体重复序列5

<400> 15

ctgcaggcat gcaagcttgg cactggccgt cgttt 35

<210> 16

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> cadA-F

<400> 16

gcggataaca atttcacaca ggaaacagct atgaacgtta ttgcaatatt gaatc 55

<210> 17

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> cadA-R

<400> 17

aaacgacggc cagtgccaag cttgcatgcc tgcagccact tcccttgtac gagctaatt 59

<210> 18

<211> 343

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PCR扩展获得plac基因序列

<400> 18

atgatattga aaaaaatatc accaaataat ctagaggata accgtattac cgcctttgag 60

tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa 120

gcggaagagc gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc 180

agctggcacg acaggtttcc cgactggaaa gcgggcagtg agcgcaacgc aattaatgtg 240

agttagctca ctcattaggc accccaggct ttacacttta tgcttccggc tcgtatgttg 300

tgtggaattg tgagcggata acaatttcac acaggaaaca gct 343

<210> 19

<211> 2235

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PCR扩展获得cadA基因序列

<400> 19

gcggataaca atttcacaca ggaaacagct atgaacgtta ttgcaatatt gaatcacatg 60

ggggtttatt ttaaagaaga acccatccgt gaacttcatc gcgcgcttga acgtctgaac 120

ttccagattg tttacccgaa cgaccgtgac gacttattaa aactgatcga aaacaatgcg 180

cgtctgtgcg gcgttatttt tgactgggat aaatataatc tcgagctgtg cgaagaaatt 240

agcaaaatga acgagaacct gccgttgtac gcgttcgcta atacgtattc cactctcgat 300

gtaagcctga atgacctgcg tttacagatt agcttctttg aatatgcgct gggtgctgct 360

gaagatattg ctaataagat caagcagacc actgacgaat atatcaacac tattctgcct 420

ccgctgacta aagcactgtt taaatatgtt cgtgaaggta aatatacttt ctgtactcct 480

ggtcacatgg gcggtactgc attccagaaa agcccggtag gtagcctgtt ctatgatttc 540

tttggtccga ataccatgaa atctgatatt tccatttcag tatctgaact gggttctctg 600

ctggatcaca gtggtccaca caaagaagca gaacagtata tcgctcgcgt ctttaacgca 660

gaccgcagct acatggtgac caacggtact tccactgcga acaaaattgt tggtatgtac 720

tctgctccag caggcagcac cattctgatt gaccgtaact gccacaaatc gctgacccac 780

ctgatgatga tgagcgatgt tacgccaatc tatttccgcc cgacccgtaa cgcttacggt 840

attcttggtg gtatcccaca gagtgaattc cagcacgcta ccattgctaa gcgcgtgaaa 900

gaaacaccaa acgcaacctg gccggtacat gctgtaatta ccaactctac ctatgatggt 960

ctgctgtaca acaccgactt catcaagaaa acactggatg tgaaatccat ccactttgac 1020

tccgcgtggg tgccttacac caacttctca ccgatttacg aaggtaaatg cggtatgagc 1080

ggtggccgtg tagaagggaa agtgatttac gaaacccagt ccactcacaa actgctggcg 1140

gcgttctctc aggcttccat gatccacgtt aaaggtgacg taaacgaaga aacctttaac 1200

gaagcctaca tgatgcacac caccacttct ccgcactacg gtatcgtggc gtccactgaa 1260

accgctgcgg cgatgatgaa aggcaatgca ggtaagcgtc tgatcaacgg ttctattgaa 1320

cgtgcgatca aattccgtaa agagatcaaa cgtctgagaa cggaatctga tggctggttc 1380

tttgatgtat ggcagccgga tcatatcgat acgactgaat gctggccgct gcgttctgac 1440

agcacctggc acggcttcaa aaacatcgat aacgagcaca tgtatcttga cccgatcaaa 1500

gtcaccctgc tgactccggg gatggaaaaa gacggcacca tgagcgactt tggtattccg 1560

gccagcatcg tggcgaaata cctcgacgaa catggcatcg ttgttgagaa aaccggtccg 1620

tataacctgc tgttcctgtt cagcatcggt atcgataaga ccaaagcact gagcctgctg 1680

cgtgctctga ctgactttaa acgtgcgttc gacctgaacc tgcgtgtgaa aaacatgctg 1740

ccgtctctgt atcgtgaaga tcctgaattc tatgaaaaca tgcgtattca ggaactggct 1800

cagaatatcc acaaactgat tgttcaccac aatctgccgg atctgatgta tcgcgcattt 1860

gaagtgctgc cgacgatggt aatgactccg tatgctgcat tccagaaaga gctgcacggt 1920

atgaccgaag aagtttacct cgacgaaatg gtaggtcgta ttaacgccaa tatgatcctt 1980

ccgtacccgc cgggagttcc tctggtaatg ccgggtgaaa tgatcaccga agaaagccgt 2040

ccggttctgg agttcctgca gatgctgtgt gaaatcggcg ctcactatcc gggctttgaa 2100

accgatattc acggtgcata ccgtcaggct gatggccgct ataccgttaa ggtattgaaa 2160

gaagaaagca aaaaataatt agctcgtaca agggaagtgg ctgcaggcat gcaagcttgg 2220

cactggccgt cgttt 2235

Claims

1.L-赖氨酸耐受菌，其是保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)的保藏编号为CCTCCNO：M 2018456的大肠杆菌(Escherichia coli)M11-A3菌株。

2.L-赖氨酸生产菌，其通过在权利要求1的L-赖氨酸耐受菌中过表达tRNA甲基转移酶而获得，其中所述tRNA甲基转移酶基因是yjtD基因、yfhQ基因、yibK基因或spoU基因。

3.如权利要求2的L-赖氨酸生产菌，其中所述tRNA甲基转移酶来源于大肠杆菌(Escherichia coli)、嗜热菌(Thermus thermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)、沙雷菌(Shewanella oneidensis)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、弗氏单胞菌(Aeromonas fluvialis)、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)或鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)。

4.如权利要求2的L-赖氨酸生产菌，其中所述tRNA甲基转移酶基因是SEQ ID No:1的yjtD基因、SEQ ID No:3的yfhQ基因、SEQ ID No:4的yibK基因或者SEQ ID No:5的spoU基因。

5.如权利要求2的L-赖氨酸生产菌，其中所述tRNA甲基转移酶基因是来自大肠杆菌的与SEQ ID No:1具有至少98％同一性的yjtD基因、来自大肠杆菌的与SEQ ID No:3具有至少98％同一性的yfhQ基因、来自大肠杆菌的与SEQ ID No:4具有至少98％同一性的yibK基因或者来自大肠杆菌的与SEQ ID No:5具有至少98％同一性的spoU基因。

6.生产L-赖氨酸的方法，所述方法包括使用权利要求2-5任一项所述的L-赖氨酸生产菌。

7.生产1,5-戊二胺的方法，所述方法包括使用权利要求2-5任一项所述的L-赖氨酸生产菌。

8.根据权利要求7的方法，所述L-赖氨酸生产菌中包含赖氨酸脱羧酶。

9.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述tRNA甲基转移酶基因经密码子优化后，通过质粒导入L-赖氨酸耐受菌中或通过基因工程手段整合到L-赖氨酸耐受菌染色体上。