TWI688649B

TWI688649B - 用於製造腐胺之微生物及使用該微生物製造腐胺之方法

Info

Publication number: TWI688649B
Application number: TW104113225A
Authority: TW
Inventors: 李京珉; 李紅仙; 朴壽眞; 梁榮烈; 嚴惠媛; 鄭熙暻
Original assignee: Ｃｊ第一製糖股份有限公司
Priority date: 2014-04-25
Filing date: 2015-04-24
Publication date: 2020-03-21
Also published as: ES2711857T3; WO2015163718A1; EP3135759B1; KR101723290B1; CN106459888B; CN106459888A; BR112016024954A2; PL3135759T3; EP3135759A4; US9657264B2; US20170044487A1; RU2653453C1; EP3135759A1; JP2017513530A; AU2015250431A1; TW201546279A; MY169049A; AU2015250431B2; JP6526792B2; KR20150124398A

Abstract

本發明係關於一種重組微生物，由於在該微生物中具有由SEQ ID NO：2表示之胺基酸序列之蛋白質的活性失活，該重組微生物能夠以高產率製造腐胺；以及一種使用該微生物製造腐胺之方法。

Description

用於製造腐胺之微生物及使用該微生物製造腐胺之方法

本發明係關於製造腐胺之重組微生物及使用該重組微生物製造腐胺之方法。

生物胺(BA)為氮化合物，其主要藉由胺基酸之去羧基作用(decarboxylation)、醛及酮之胺化作用以及轉胺作用來製造。此類生物胺為低分子量化合物，該生物胺在微生物、植物及動物的代謝期間合成，且因此已知為容易在此等細胞中發現之組分。尤其而言，諸如精三胺(spermidine)、精胺(spermine)、腐胺(putrescine)(或1,4-丁二胺)、屍胺(cadaverine)等多胺為大多數活細胞中存在之物質。

在該等多胺當中，腐胺為重要原料，其藉由與己二酸反應來合成多胺尼龍-4,6，且腐胺主要藉由自丙烯經由丙烯腈及丁二腈之化學合成來製造。

另外，已揭示一種藉由大腸桿菌及棒狀桿菌屬(genus Corynebacterium)之轉型作用以高濃度來製造腐胺之方法(國際公開案第WO06/005603號；國際公開案第WO09/125924號；Qian ZD等人，Biotechnol.Bioeng.104(4)： 651-662,2009；Schneider等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.88(4)：859-868,2010；and Schneider等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.95：169-178.,2012)。此外，已積極進行有關大腸桿菌細胞、酵母細胞、植物細胞及動物細胞之腐胺運輸蛋白(transporter)的研究(K Igarashi,Plant Physiol.Biochem.48：506-512,2010)。

同時，本案發明人證實，編碼NCgl2522之膜蛋白在棒狀桿菌屬微生物(其包括腐胺合成路徑)中作為腐胺輸出子(exporter)，且經確定，可藉由將NCgl2522活性增強至其內源性活性，以高產率來製造腐胺(韓國發明專利申請案第10-2013-0030020號)。

另外，NCgl2523基因為多種藥物抗性相關轉錄因子，其屬於TetR家族，且已知作用為NCgl2522表現抑制劑(Hirochi等人J Biol.Chem.280：46,38711-38719.2005)。

對此，本案發明人已進行持續研究，且已確定以類似於增強NCgl2522活性之效果的方式，藉由使構成NCgl2522操縱子之NCgl2523耗竭來增強腐胺製造，從而完成本發明。

本發明之一目的為提供一種能夠以高產率製造腐胺之重組微生物。

本發明之另一個目的為提供一種使用該微生物以高產率製造腐胺之方法。

[最佳模式]

在達成上述目的之一個態樣中，本發明提供一種具有腐胺生產力之棒狀桿菌屬之微生物，其中使具有由SEQ ID NO：2表示之胺基酸序列之蛋白質失活(inactivated)。

在一個示範性實施例中，本發明提供一種具有腐胺生產力之棒狀桿菌屬之微生物，其中進一步將鳥胺酸脫羧酶(ornithine decarboxylase,ODC)之活性引入該微生物中。

在另一個示範性實施例中，本發明提供一種具有腐胺生產力之棒狀桿菌屬之微生物，其中該鳥胺酸脫羧酶(ODC)具有由SEQ ID NO：10表示之胺基酸序列。

在另一個示範性實施例中，本發明提供一種具有腐胺生產力之棒狀桿菌屬之微生物，其中進一步在該微生物中使乙醯基轉移酶活性失活。

在另一個實施例中，本發明提供一種具有腐胺生產力之棒狀桿菌屬之微生物，其中該乙醯基轉移酶包含由SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16表示之胺基酸序列。

在另一個實施例中，本發明提供一種具有腐胺生產力之棒狀桿菌屬之微生物，其中該微生物為麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)。

在另一個態樣中，本發明提供一種製造腐胺之方法，該方法包括以下步驟： i)在培養基中培養具有腐胺生產力之棒狀桿菌屬之微生物，其中使具有由SEQ ID NO：2表示之胺基酸序列之蛋白質失活；及ii)將腐胺與自上述步驟獲得之經培養之微生物或該培養基分離。

在一示範性實施例中，本發明提供一種製造腐胺之方法，其中該棒狀桿菌屬之微生物為麩胺酸棒狀桿菌。

下文中，將詳細描述本發明。

在一個態樣中，本發明係關於一種具有腐胺生產力之棒狀桿菌屬之微生物，其中使具有由SEQ ID NO：2表示之胺基酸序列(即NCgl2523)之蛋白質失活。

如本文所用，術語「NCgl2523」係指多種藥物抗性相關轉錄因子，該轉錄因子屬於TetR家族，且已知作用為Ncgl2522表現抑制劑(Hirochi等人，J Biol.Chem.280(46)：38711-38719,2005)。

在本發明中，NCgl2523為一蛋白質，該蛋白質具有SEQ ID NO：2之胺基酸序列，或具有70%或更多、更特定而言80%或更多、甚至更特定而言90%或更多、更特定而言98%或更多及最特定而言99%或更多之與該序列同源性之胺基酸序列，且並不局限於此，只要該蛋白質為具有NCgl2522表現抑制劑活性之蛋白質。

此外，因為顯現該活性之蛋白質之胺基酸序列可能取決於微生物之菌種或菌株而不同，但並不限於此。顯而易見，具有其中胺基酸序列經部分刪除(deleted)、經修飾、經取代、或經插入之該胺基酸序列的蛋白質係包括在本發明之範疇內，只要與該序列具有同源性之序列顯現出實際上等同於或對應於SEQ ID NO：2之蛋白質的生物活性。

如本文所用，術語「同源性」係指給定胺基酸序列或核苷酸序列之間的相似性，且可以百分比來表示。本文中，與給定胺基酸序列或核苷酸序列具有相同或相似活性之同源性序列係由「同源性百分比」來表述。例如，藉由使用計算介導參數如分數、一致性、相似性等之常規軟體，且更特定而言使用BLAST 2.0，或者藉由在經定義的嚴格條件下經由南方氏(Southern)雜交來比較序列，可以檢驗同源性。適當雜交條件可由本領域之範疇來定義，且可藉由一般技藝人士使用已知方法來決定(即，J.Sambrook等人，Molecular Cloning,A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory press,Cold Spring Harbor,New York,1989；F.M.Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.,New York)。

只要蛋白質具有類似於NCgl2523蛋白質之活性，則本發明之編碼NCgl2523的多核苷酸可包括SEQ ID NO：2之胺基酸序列，或者編碼具有70%或更多、特定而言80%或更多、更特定而言90%或更多、更特定而言95%或更多同源性、更特定而言98%或更多以及最特定而言99%或更多之與該序列同源性之蛋白質的多核苷酸，可尤其包括SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3之核苷酸序列。

此外，本發明之編碼NCgl2523的多核苷酸可以在嚴格條件下，與由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3表示之核苷酸序列、或衍生自該核苷酸序列之探針雜交，且可以是編碼在功能上正常的NCgl2523之變體。如本文所用，術語「嚴格條件」係指允許多核苷酸之間特異性雜交之條件。例如，此類嚴格條件在文獻中有詳細描述(即，J.Sambrook等人，Molecular Cloning,A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory press,Cold Spring Harbor,New York,1989；F.M.Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.,New York)。

在本發明中，經確定，當在具有腐胺生產力之棒狀桿菌屬之微生物中刪除(deleted)構成NCgl2522操縱子之NCgl2523時，腐胺製造增加，此狀況與NCgl2522活性增強之情形類似。就此而言，本發明可以提供一種重組微生物，該重組微生物藉由抑制使NCgl2523活性失活所致的NCgl2522表現而顯現出高產率之腐胺製造。因此，如本發明之實施例中所揭示，藉由使對應NCgl2523及編碼與其類似胺基酸之基因失活，可在具有序列上類似於NCgl2523之序列之胺基酸的微生物中，其中此類胺基酸由NCgl2522及操縱子組成、或在其中NCgl2523類似地作為NCgl2522表現調節劑之微生物中，增強腐胺生產力。

如本文所用，術語「失活」係指不表現編碼對應多肽之基因，從而顯現出基因表現之一定減少，甚至在表現時，不製造對應的功能性多肽。

另外，失活不僅係指使編碼對應多肽之基因完全失活，而且指相比於野生型，該基因之表現有所弱化或顯著減少，因而實際上不表現該基因。因此，基因失活可以為完全失活(剔除)，或為部分失活(例如，亞等位基因，其顯現出低於正常水平之基因表現；或突變型基因之產物，其在亞等位基因之作用下顯現出活性的部分降低)。

詳言之，在本發明中，NCgl2523之失活可以由以下誘導：1)部分或完全刪除編碼該蛋白質之多核苷酸；2)修飾調控序列以降低該多核苷酸之表現；3)修飾染色體上之該多核苷酸序列，以便弱化該蛋白質活性；及4)上述者之組合，但並非特別局限於此。

可以使用將染色體插入微生物中之載體，藉由用部分移除的多核苷酸或標記基因來置換編碼內源性標的蛋白質或染色體之多核苷酸，執行1)部分或完全刪除編碼該蛋白質之多核苷酸。該「部分」可以取決於多核苷酸之類型而變化，但特定而言，係指1至300個，更特定而言指1至100個，且甚至更特定而言指1至50個多核苷酸。

如本文所用，術語「載體」係指DNA構築體，其包括編碼所需蛋白質之核苷酸序列，該DNA構築體可操作地連接至適當表現調控序列，以在合適寄主細胞中表現所需蛋白質。該調控序列包括：啟動子，其可引發轉錄；視需要的操縱子序列，其用於調控該轉錄；編碼合適mRNA 核糖體結合位點之序列；及調控轉錄及轉譯之終止之序列。在將該載體轉型到合適寄主細胞中之後，該載體可複製或獨立於寄主基因組來起作用，且可整合進該基因組本身內。

本發明中所用之載體並無特別限制，只要該載體能夠在寄主細胞中複製，且此項技術中已知的任何載體皆可使用。常規載體之實例可以包括天然或重組質體、黏質體、病毒及噬菌體。例如，pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A、Charon21A等可以用作噬菌體載體或黏質體載體，且pBR型、pUC型、pBluescriptII型、pGEM型、pTZ型、pCL型、pET型等可以用作質體載體。可用於本發明中之載體無特別限制，且任何已知表現載體皆可使用。特定而言，可以使用pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、或pCC1BAC載體。

此外，可以使用用於染色體插入之載體，由突變之多核苷酸來置換在染色體中編碼所需的蛋白質之多核苷酸。該多核苷酸向染色體中之插入可以藉由諸如同源重組之此項技術中已知任何方法來執行，但並非特別局限於此。.

如本文所用，術語「轉型」係指將包括編碼標的蛋白質之多核苷酸之載體引入到寄主細胞中，以使得由該多核苷酸編碼之蛋白質在寄主細胞中表現。只要轉型的多核苷酸可在寄主細胞中表現，則無論該多核苷酸整合進寄主細胞之染色體中或以染色體外方式存在，皆由該術語所包括。此外，該多核苷酸包括編碼標的蛋白質之DNA及RNA。該多核苷酸可以任何形式引入，只要該多核苷酸可引入寄主細胞中且在其中表現。例如，該多核苷酸可以表現卡匣(cassette)之形式引入寄主細胞，該表現卡匣為基因構築體，其包括其自主表現所需之所有元素。通常，該表現卡匣包括：促進劑，其可操作地連接至該多核苷酸；轉錄終止信號；核糖體結合位點；或轉譯終止信號。該表現卡匣可以呈可自複製表現載體之形式。另外，該多核苷酸可以按原樣引入寄主細胞中，且可操作地連接至寄主細胞中表現所需的序列，但並非局限於此。

此外，術語「可操作地連接」係指在編碼所需蛋白質的多核苷酸序列與引發且介導多核苷酸序列之轉錄的啟動子序列之間的功能性連接。

接著，可以在核苷酸序列中藉由刪除、插入、非保守取代或保守取代或上述者之組合來在調控序列中誘導修飾，或者用具有較弱活性之核苷酸來進行置換以便弱化該調控序列之活性，執行2)修飾調控序列以減少多核苷酸表現，但並非特別局限於此。該調控序列可以包括啟動子、操縱子序列、編碼核糖體結合位點之序列及調控轉錄及轉譯之終止之序列，但並非局限於此。

此外，可以在核苷酸序列中藉由刪除、插入、非保守取代或保守取代或上述者之組合來在調控序列中誘導修飾，或者用具有較弱活性之核苷酸來進行置換以便弱化蛋白活性，執行3)修飾染色體上之該多核苷酸序列，但並非局限於此。

如本文所用，術語「具有腐胺生產力之微生物」或「製造腐胺之微生物」係指天然具有腐胺生產力之微生物，或其中在不具腐胺生產力之母體菌株(parent strain)中結合有腐胺生產力之微生物。

製造腐胺之微生物可以為(但並非特別局限於)具有提高的鳥胺酸生產力之微生物，該鳥胺酸將用作腐胺生物合成之原料，其中該微生物經修飾，以相比於該內源性活性而具有以下酶之更高活性：乙醯基麩胺酸合成酶，其將麩胺酸轉換成乙醯基麩胺酸(N-乙醯基麩胺酸)；或鳥胺酸乙醯基轉移酶(Acetyl glutamate synthase or Ornithine acetyl transferase,ArgJ)，其將乙醯基鳥胺酸轉換成鳥胺酸；乙醯基麩胺酸激酶(Acetyl glutamate kinase,ArgB)，其將乙醯基麩胺酸轉換成乙醯基麩胺醯基磷酸(N-乙醯基麩胺醯基磷酸)；乙醯基-γ-麩胺醯基磷酸還原酶(Acetyl-gamma-glutamyl phosphate reductase,ArgC)，其將乙醯基麩胺醯基磷酸轉換成乙醯基麩胺酸半醛(N-乙醯基麩胺酸半醛)；或乙醯基鳥胺酸胺基轉移酶(Acetyl ornithine aminotransferase,ArgD)，其將乙醯基麩胺酸半醛轉換成乙醯基鳥胺酸(N-乙醯基鳥胺酸)；從而增強從麩胺酸至鳥胺酸麩胺酸之生物合成途徑。

此外，該微生物經修飾以使以下之內源性活性失活：鳥胺酸胺甲醯基轉移酶(Ornithine carbamoyl transfrase,ArgF)，其參與由鳥胺酸合成精胺酸；麩胺酸輸出子 (NCgl1221)；及/或乙醯基轉移酶，其使腐胺乙醯化；及/或經修飾以引入鳥胺酸脫羧酶(ODC)之活性。

此處，鳥胺酸胺甲醯基轉移酶(ArgF)、麩胺酸輸出子(NCgl1221)、鳥胺酸脫羧酶(ODC)、乙醯基-γ-麩胺醯基磷酸還原酶(ArgC)、乙醯基麩胺酸合成酶或鳥胺酸乙醯基轉移酶(ArgJ)、乙醯基麩胺酸激酶(ArgB)及乙醯基鳥胺酸胺基轉移酶(ArgD)可特定地包括各自由SEQ ID NO：8、9、10、11、12、13及14表示之胺基酸序列；或具有70%或更多、更特定而言80%或更多、甚至更特定而言90%或更多之與該序列同源性之胺基酸序列，但並非特別局限於此。

此外，使腐胺乙醯化之乙醯基轉移酶可以特定地包括由SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16表示之胺基酸序列或具有70%或更多、更特定而言80%或更多、甚至更特定而言90%或更多之與該序列同源性之胺基酸序列，但並非特別局限於此。

詳言之，在本發明中提高活性可以藉由以下來進行：1)增加編碼該酶之多核苷酸之副本數；2)修飾調控序列以增加多核苷酸表現；3)修飾染色體上之多核苷酸序列以增強該酶之活性；或4)藉由上述者之組合來進行修飾，以增強該活性，但並非局限於此。

可以可操作地連接於載體之形式，或藉由向寄主細胞中進行染色體插入，執行1)增加多核苷酸之副本數，但並非特別局限於此。詳言之，該增加可藉由將一載體引入寄主細胞中來執行，該載體可操作地連接至編碼本發明酶之酶，且可複製並獨立於寄主細胞而發揮功能，或者藉由將另一載體引入寄主細胞中來執行，該載體可操作地連接至該多核苷酸，且能夠在寄主細胞中將該多核苷酸插入染色體中，從而增加該寄主細胞之染色體中多核苷酸之副本數。

接著，可以在序列中藉由刪除、插入、非保守取代或保守取代或上述者之組合來誘導修飾，或者用具有增強活性之核苷酸序列來進行置換以便增強調控序列之活性，執行2)修飾調控序列以增加多核苷酸表現，但並非特別局限於此。該調控序列可以包括啟動子、操縱子序列、編碼核糖體結合位點之序列、調控轉錄及轉譯之終止之序列等，但並非特別局限於此。

在該多核苷酸表現單元之上游中，可連接強異源性啟動子，而非連接初始啟動子。強啟動子之實例為CJ7啟動子、lysCP1啟動子、EF-Tu啟動子、groEL啟動子、aceA或aceB啟動子等，且更特定而言，可以可操作地連接至源自棒狀桿菌之啟動子、lysCP1啟動子(WO2009/096689)、或CJ7啟動子(韓國發明專利第0620092號及WO2006/065095)，且增加編碼該酶之多核苷酸之表現，但並非局限於此。

此外，可以藉由在核苷酸序列中刪除、插入、非保守取代或保守取代或上述者之組合來在調控序列中誘導修飾，或藉由用經修飾而具有增強活性之多核苷酸序列進行置換以便增強多核苷酸序列之活性，執行3)修飾染色體上之多核苷酸序列，但並非特別局限於此。

此外，可以藉由如先前所述使NCgl2523失活之方法，執行鳥胺酸胺甲醯基轉移酶(ArgF)、麩胺酸輸出子及乙醯基轉移酶之失活：1)部分或完全刪除編碼該蛋白質之多核苷酸；2)修飾調控序列以降低該多核苷酸之表現；3)修飾染色體上之該多核苷酸序列，以便弱化該蛋白質活性；及4)上述者之組合，但並非特別局限於此。

同時，本發明之微生物為具有腐胺生產力之微生物，且包括表現包括由SEQ ID NO：2表示之胺基酸之蛋白質的原核微生物。此類原核微生物之實例為埃希氏菌(Escherichia sp.)、志賀氏菌(Shigella sp.)、檸檬酸菌(Citrobacter sp.)、沙門氏菌(Salmonella sp.)、腸桿菌(Enterobacter sp.)、耶氏桿菌(Yersinia sp)、克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)、歐文氏菌(Erwinia sp.)、棒狀桿菌(Corynebacterium sp.)、麩胺酸發酵菌(Brevibacterium sp.)、乳桿菌(Lactobacillus sp.)、月形單胞菌(Selenomanas sp.)、弧菌屬(Vibrio sp.)、假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)、鏈黴菌屬(Streptomyces sp.)、隱秘桿菌(Arcanobacterium sp.)、產鹼菌(Alcaligenes sp.)微生物等。詳言之，本發明之微生物可以為棒狀桿菌屬之微生物，且更特定而言，為麩胺酸棒狀桿菌，但並不局限於此。

在一個示範性實施例中，本發明使用因增強的經麩胺酸之腐胺生物合成途徑而具有高濃度腐胺生產力之菌株，該等菌株為以寄存號KCCM11138P(韓國發明專利第2012-0064046號)及KCCM11240P(韓國發明專利第2012-0003634號)寄存之棒狀桿菌屬之微生物。

在另一個示範性實施例中，本發明使用KCCM11138P及KCCM11240P(其為源於麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032之腐胺製造菌株)，以及DAB12-a(韓國發明專利第2013-0082478號)及DAB12-b(韓國發明專利第2013-0082478；DAB12-a △NCgl1469)(其為源於麩胺酸棒狀桿菌ATCC13869的腐胺製造菌株)，上述者各自具有相同基因型。ATCC13869菌株可以得自美國菌種中心(American Type Culture Collection,ATCC)。

詳言之，本案發明人將因麩胺酸棒狀桿菌中NCgl2523活性失活而具有增強腐胺生產力之棒狀桿菌屬的微生物命名為KCCM11240P，該KCCM11240P為腐胺製造菌株，如麩胺酸棒狀桿菌CC01-0844，且根據布達佩斯條約(Budapest Treaty)在2014年2月25日以登錄號KCCM11520P，寄存至韓國微生物培養中心(Korean Culture Center of Microorganisms；KCCM)。

在另一個態樣中，本發明提供一種製造腐胺之方法，該方法包括以下步驟： i)在培養基中培養具有增加的腐胺生產力之棒狀桿菌屬之微生物，其中使具有由SEQ ID NO：2表示之胺基酸序列之蛋白質失活；及ii)將腐胺與自上述步驟獲得之經培養之微生物或該培養基分離。

在該方法中，可以藉由已知分批培養法、連續培養法、分批補料培養法等來執行該微生物之培養，但並非特別局限於此。此處，培養物條件可以使用鹼性化合物(例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、或氨氣)或酸性化合物(例如磷酸或硫酸)來維持在最佳pH(例如pH 5至9，特定而言pH 6至8，且最特定而言pH 6.8)下，且藉由向細胞培養物提供氧或含氧氣體混合物來維持在需氧條件下，但並非特別局限於此。培養物溫度可以維持在20℃至45℃下，且特定而言，在25℃至40℃下，且培養約10至160小時。藉由該培養製造之腐胺可以輸出至培養基或保留在細胞中。

此外，所用培養基可以包括：個別地或以組合方式作為碳源之糖及碳水化合物(例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、澱粉及纖維素)、油及脂肪(例如大豆油、向日葵籽油、花生油及椰子油)、脂肪酸(例如棕櫚酸、硬脂酸及亞油酸)、醇(例如甘油及乙醇)及有機酸(例如乙酸)；別地或以組合方式作為氮源之含氮有機化合物(例如蛋白腖、酵母提取物、肉汁、麥芽提取物、玉米溶液、豆粉粉及尿素)、或無機化合物(例如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨及硝酸銨)；個別地或以組合方式作為磷源之磷酸二氫鉀、磷酸二鉀、或與其對應之含鈉鹽；以及其他必需生長刺激物質，包括金屬鹽(例如硫酸鎂或硫酸鐵)、胺基酸及維生素，但並非局限於此。

取決於培養方法，例如分批、連續或分批補料培養法等，可以使用此項技術中已知之合適方法來執行對本發明之培養步驟中製造之腐胺的分離，從而自培養物中收集所需胺基酸。

對具有本發明之增強的腐胺生產力之棒狀桿菌屬之微生物進行修飾，以使包括SEQ ID NO：2之胺基酸序列之蛋白質之活性失活，從而誘導出預期為腐胺輸出子之蛋白質(特定而言NCgl2522)的增強活性，且增加對細胞外部之腐胺輸出，且因此可以有效地製造腐胺。

圖1為顯示NCgl2523及鄰近物之組合結構的示意圖。詳言之，圖1為一示意圖，其顯示：NCgl2522-NCgl2523-NCgl2524之組合結構(1型)，其為微生物之鄰近基因之組合結構，其包括NCgl2523；組合的NCgl2522-NCgl2523及個體NCgl2524之結構(2型)；或NCgl2522-NCgl2523之組合結構(3型)。

下文中，將參考實例來更詳細描述本發明。然而，該等實例僅用於示範性目的，且因此本發明之範疇並不意欲受該等實例限制。

實例1：製備NCgl2523經刪除之菌株及驗證其腐胺生產力

<1-1>在源自ATCC13032的腐胺製造菌株中製備NCgl2523經刪除之菌株

為了驗證刪除源於棒狀桿菌ATCC13032之NCgl2523是否對腐胺生產力具有效果，製備載體以用於刪除編碼NCgl2523之基因。

詳言之，基於由SEQ ID NO：1表示之編碼NCgl2523之基因的核苷酸序列，構築SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：5之一對引子以用於在NCgl2523之N-端區獲得同源重組片段，以及SEQ ID NO：6及SEQ ID NO：7之一對引子以用於在NCgl2523之C-端區獲得同源重組片段，如表1所示。

使用棒狀桿菌ATCC13032之基因組DNA作為模板及兩對引子執行PCR，從而在NCgl2523基因之N-端區及C-端區擴增PCR片段。經由PCR片段之電泳，獲得所需片段。此處，PCR反應重複30個循環，包括95℃下變性30秒、55℃下退火30秒以及72℃下延伸30秒。如此獲得之N-端區及C-端區片段分別用限制性酶BamHI及SalI及限制性酶SalI及XbaI進行處理。將經處理片段選殖到經限制性酶BamHI及XbaI處理之pDZ載體中，從而構築pDZ-1'NCgl2523(K/O)質體。

藉由電穿孔，將該等pDZ-1'NCgl2523(K/O)質體各自轉型到KCCM11138P(韓國發明專利第10-1348461)及KCCM11240P(韓國發明專利第2013-0082478)內以獲得轉型體。為了菌落形成，在含有卡那黴素(25μg/mL)及X-gal(5-溴-4-氯-3-二氫吲哚-D-半乳糖苷)之BHIS平板培養基(腦心浸液(37g/L)、山梨糖醇(91g/L)及瓊脂(2%))上，接種並培養該等轉型體。自所形成之菌落中，將藍色菌落選擇為引入pDZ-1'NCgl2523(K/O)質體之菌株。

所選菌株在CM培養基(葡萄糖(10g/L)、多蛋白腖(10g/L)、酵母提取物(5g/L)、牛肉提取物(5g/L)、NaCl(2.5g/L)、尿素(2g/L)及pH 6.8)中30℃下培養8小時。在各細胞培養物自10^-4至10^-10系列稀釋之後，在含X-gal固體培養基中接種且培養稀釋樣品，以形成菌落。自所形成菌落中，將出現頻率相對低之白色菌落最終選擇為藉由二次交換(secondary crossover)來刪除編碼NCgl2523之基因的菌株。

使用SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：7之一對引子來執行PCR，以確定在最終所選菌株中編碼NCgl2523之基因被刪除。該等棒狀桿菌突變型各自命名為KCCM11138P △NCgl2523及KCCM11240P △NCgl2523。

<1-2>在源自ATCC13869的腐胺製造菌株中製備NCgl2523經刪除之菌株

NCgl2523經刪除之菌株由DAB12-a(韓國發明專利第2013-0082478號)及DAB12-b(韓國發明專利第2013-0082478號；DAB12-a △NCgl1469)構築，DAB12-a及DAB12-b源於棒狀桿菌ATCC13869之腐胺製造菌株。

詳言之，為了驗證源於麩胺酸棒狀桿菌ATCC13869之NCgl2523基因之序列及由其表現之蛋白質，使用棒狀桿菌ATCC13869之基因組DNA作為模板以及SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：7一對引子來執行PCR。此處，PCR反應重複30個循環，包括95℃下變性30秒、55℃下退火1分30秒以及72℃下延伸30秒。

藉由經電泳分離如此獲得的PCR產物且藉由定序來分析，發現源於棒狀桿菌ATCC13869之編碼NCgl2523之基因包括由SEQ ID NO：3表示之核苷酸序列。此外，將由該基因編碼之蛋白質之胺基酸序列與源於棒狀桿菌ATCC13032之NCgl2523(SEQ ID NO：2)之胺基酸序列進行比較，且結果顯示100%同源性。

為了刪除源於棒狀桿菌ATCC13869之編碼NCgl2523之基因，使用棒狀桿菌ATCC13869之基因組DNA作為模板及實例<1-1>中表1所述之兩對引子執行PCR，且擴增NCgl2523基因之N-端區及C-端區之PCR片段，從而經由電泳獲得所需片段。此處，PCR反應重複30個循環，包括95℃下變性30秒、55℃下退火30秒以及72℃下延伸30秒。所得之N-端區及C-端區片段分別用限制性酶BamHI及SalI及限制性酶SalI及XbaI進行處理。將經處理片段選殖到經限制性酶BamHI及XbaI處理之pDZ載體中，從而構築pDZ-2'NCgl2523(K/O)質體。

藉由以與實例<1-1>中所述之相同方式，將pDZ-2'NCgl2523(K/O)轉型到棒狀桿菌DAB12-a及DAB12-b之每一者中，選擇將刪除編碼NCgl2523之基因之菌株。將所選擇之棒狀桿菌突變型命名為DAB12-a△NCgl2523及DAB12-b △NCgl2523。

<1-3>評估NCgl2523經刪除之菌株之腐胺生產力

為了驗證在腐胺製造菌株中NCgl2523經刪除對腐胺生產之效果，比較實例<1-1>及<1-2>中構築之麩胺酸棒狀桿菌突變型之腐胺生產力。

詳言之，4種不同類型之麩胺酸棒狀桿菌突變型(KCCM11138P △NCgl2523、KCCM11240P △NCgl2523、DAB12-a △NCgl2523及DAB12-b △NCgl2523)及4種不同類型之母體菌株(KCCM11138P、KCCM11240P、DAB12-a及DAB12-b)各自接種在1mM含精胺酸CM平板培養基(1%葡萄糖、1%多蛋白腖、0.5%酵母提取物、0.5%牛肉提取物、0.25% NaCl、0.2%尿素、100μL 50% NaOH及2%瓊脂，pH 6.8，基於1L計)上，且在30℃下培養24小時。在用鉑環於25mL滴定培養基(8%葡萄糖、0.25%大豆蛋白、0.50%玉米浸泡固體(corn steep solid)、4%(NH₄)₂SO₄、0.1% KH₂PO₄、0.05% MgSO₄．7H₂O、0.15%尿素、100g生物素、3mg硫胺素鹽酸鹽、3mg泛酸鈣、3mg菸醯胺及5% CaCO₃，基於1L計)中接種各個所培養菌株之後，在30℃下且以200rpm進行振盪培養98小時。添加1mM精胺酸至該培養基以培養所有菌株。量測由各培養物製造之腐胺之濃度，且結果顯示於表2中。

如表2所示，在4種NCgl2523經刪除之麩胺酸棒狀桿菌突變型中，增加腐胺製造。

實例2：量測NCgl2523經刪除之菌株中之細胞間腐胺濃度

為檢驗具有失活NCgl2523活性之麩胺酸棒狀桿菌突變型中之細胞間腐胺濃度的變化，藉由使用有機溶劑進行提取，在麩胺酸棒狀桿菌突變型KCCM11240P △NCgl2523及母體菌株KCCM11240P中量測細胞間腐胺濃度。根據文獻(Nakamura J等人，Appl.Environ.Microbiol.,73(14)：4491-4498,2007)中所述方法，進行細胞內代謝物分析。

首先，在25ml之1mM含精胺酸CM液體培養基(1%葡萄糖、1%多蛋白腖、0.5%酵母提取物、0.5%牛肉提取物、0.25% NaCl、0.2%尿素及100μL之50% NaOH，pH 6.8，基於1L計)中接種麩胺酸棒狀桿菌突變型KCCM11240P △NCgl2523及母體菌株KCCM11240P中之各者之後，在30℃下以200rpm進行振盪培養。當在培養期間，細胞生長達到指數期時，藉由快速真空過濾(Durapore HV,0.45m；Millipore,Billerica,MA)，將細胞與該培養物培養基分離。將吸附有細胞的過濾器用10ml之冷水洗滌兩次，且浸入含甲醇的5M嗎啉乙磺酸及5M甲硫胺酸碸中10分鐘。由此所得之提取液體與等體積之氯仿及0.4倍體積之水充分混合。僅將水相進行離心柱處理以除去蛋白質污染物。藉由毛細管電泳質譜分析來分析所過濾之提取液體，並且結果顯示於表3中。

如表3所示，與母體菌株KCCM11240P相比，在具有失活NCgl2523活性之麩胺酸棒狀桿菌突變型中，該細胞間腐胺濃度顯著降低。

此狀況表明，當在麩胺酸棒狀桿菌突變型KCCM11240P中刪除NCgl2523時，對NCgl2522表現之抑制作用消退，且NCgl2522活性增強，從而增強腐胺輸出能力，且隨後有效地將細胞內部製造之腐胺輸出至細胞外部。

實例3：NCgl2523基因之異種同源物(Ortholog)搜索及基因背景分析

使用KEGG、MetaCyc數據庫及NCBI blastP，對 NCgl2523進行異種同源物搜索，該NCgl2523源於棒狀桿菌ATCC13032。經由基因簇來檢驗NCgl2523及NCgl2522及NCgl2524之組合結構，該NCgl2523及該NCgl2522及該NCgl2524構成各微生物之基因組中之操縱子。

NCgl2522之基因名為cgmA，其為屬於DHA2家族之主要易化因子超家族(major facilitator superfamily)通透酶，且NCgl2523之基因名為cgmR，其為TetR-家族轉錄調控子。NCgl2524尚無功能，但為屬於UMF1家族之主要易化因子超家族通透酶。

根據該分析結果，雖然NCgl2522及NCgl2523大多數情況下構成相同操縱子，但取決於微生物，NCgl2524可存在於相同操縱子中(1型)，存在於基因組中之不同位置(2型)，或不存在於基因組中(3型)。

就此而言，根據鄰近於NCgl2523之基因之組合結構，將所分析之微生物中之各者分類為3種類型。詳言之，將預期具有NCgl2523之微生物分類為NCgl2522-NCgl2523-NCgl2524之組合結構(1型)；組合的NCgl2522-NCgl2523及個體NCgl2524(2型)之結構；或NCgl2522-NCgl2523之組合結構(3型)(圖1)。分類結果顯示於表4中。

從該等結果中，應預期到，在本發明中，對於具有胺基酸之微生物，可藉由使編碼NCgl2523及與其相似之胺基酸序列之基因失活來增強腐胺生產力，該微生物具有包括類似於NCgl2523之序列之胺基酸，且由操縱子與預期為腐胺輸出子之蛋白質(例如NCgl2522)組成，如在分類中所述。

基於上文描述，一般技藝人士應當理解，在不脫離本發明之技術構思或必需特徵之情況下，在實踐本發明時可以使用其他特定實施例。就此而言，上述實例僅用於示範性目的，且本發明並不意欲受該等實例所限制。本發明之範疇應理解為包括所有源於以下申請專利範圍或其等同概念之含義及範疇的修改或修改形式，而非包括以上詳述。

【生物材料寄存】

國內寄存資訊【請依寄存機構、日期、號碼順序註記】

1.財團法人食品工業發展研究所、2015.06.22、

BCRC910685

國外寄存資訊【請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記】

1.韓國、韓國微生物培養中心、2014.02.25、KCCM11520P

【無須寄存之生物材料】

所屬技術領域中具有通常知識者易於獲得之生物材料

1.KCCM11138P

2.KCCM11240P

<110> CJ第一製糖股份有限公司

<120> 用於製造腐胺之微生物及使用該微生物製造腐胺之方法

<130> 104113225

<150> KR10-2014-0049766

<151> 2014-04-25

<160> 16

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 534

<212> DNA

<213> 麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032 NCgl2523

<400> 1

<210> 2

<211> 177

<212> PRT

<213> 麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032 NCgl2523

<400> 2

<210> 3

<211> 534

<212> DNA

<213> 麩胺酸棒狀桿菌ATCC13869 NCgl2523

<400> 3

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NCgl2523-del-F1_BamHI引子

<400> 4

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NCgl2523-del-R1_SalI引子

<400> 5

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NCgl2523-del-F2_SalI引子

<400> 6

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NCgl2523-del-R2_XbaI引子

<400> 7

<210> 8

<211> 319

<212> PRT

<213> 鳥胺酸胺甲醯基轉移酶(ArgF)

<400> 8

<210> 9

<211> 533

<212> PRT

<213> 麩胺酸輸出子(NCgl1221)

<400> 9

<210> 10

<211> 711

<212> PRT

<213> 鳥胺酸脫羧酶(ODC)

<400> 10

<210> 11

<211> 357

<212> PRT

<213> 乙醯基-γ-麩胺醯基磷酸還原酶(ArgC)

<400> 11

<210> 12

<211> 388

<212> PRT

<213> 鳥胺酸乙醯基轉移酶(ArgJ)

<400> 12

<210> 13

<211> 317

<212> PRT

<213> 乙醯基麩胺酸激酶(ArgB)

<400> 13

<210> 14

<211> 391

<212> PRT

<213> 乙醯基鳥胺酸胺基轉移酶(ArgD)

<400> 14

<210> 15

<211> 203

<212> PRT

<213> 麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032 NCgl1469

<400> 15

<210> 16

<211> 203

<212> PRT

<213> 麩胺酸棒狀桿菌ATCC13869 NCgl1469

<400> 16

Claims

一種具有增強的腐胺生產力之棒狀桿菌屬之微生物，其係相較於非經修飾之微生物，其中在能夠製造腐胺之該棒狀桿菌屬之微生物中使具有由SEQ ID NO：2表示之胺基酸序列之蛋白質的活性失活。
如請求項1所記載之具有增強的腐胺生產力之棒狀桿菌屬之微生物，其中進一步將鳥胺酸脫羧酶(ODC)之活性引入該微生物中。
如請求項2所記載之具有增強的腐胺生產力之棒狀桿菌屬之微生物，其中該鳥胺酸脫羧酶(ODC)具有由SEQ ID NO：10表示之胺基酸序列。
如請求項1所記載之具有增強的腐胺生產力之棒狀桿菌屬之微生物，其中進一步在該微生物中使乙醯基轉移酶活性失活。
如請求項4所記載之具有增強的腐胺生產力之棒狀桿菌屬之微生物，其中該乙醯基轉移酶包含由SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16表示之胺基酸序列。
如請求項1所記載之具有增強的腐胺生產力之棒狀桿菌屬之微生物，其中該微生物為麩胺酸棒狀桿菌。
一種製造腐胺之方法，其包含以下步驟：在培養基中培養如請求項1所記載之具有增強的腐胺生產力之棒狀桿菌屬之微生物；及自上述步驟獲得之該經培養之微生物或該培養基回收腐胺。
如請求項7所記載之製造腐胺之方法，其中該棒狀桿菌屬之微生物為麩胺酸棒狀桿菌。