ES2711857T3

ES2711857T3 - Cepa variante productora de putrescina y método de producción que la utiliza

Info

Publication number: ES2711857T3
Application number: ES15783187T
Authority: ES
Inventors: Kyoung Min Lee; Hongxian Li; Su Jin Park; Young Lyeol Yang; Hye Won Um; Hee Kyoung Jung
Original assignee: CJ CheilJedang Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2014-04-25
Filing date: 2015-04-24
Publication date: 2019-05-07
Anticipated expiration: 2035-04-24
Also published as: WO2015163718A1; EP3135759B1; KR101723290B1; CN106459888B; CN106459888A; BR112016024954A2; PL3135759T3; EP3135759A4; US9657264B2; TWI688649B; US20170044487A1; RU2653453C1; EP3135759A1; JP2017513530A; AU2015250431A1; TW201546279A; MY169049A; AU2015250431B2; JP6526792B2; KR20150124398A

Abstract

Un microorganismo aislado del género Corynebacterium que tiene productividad de putrescina, en el que se inactiva una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID NO: 2.

Description

DESCRIPCION

Cepa variante productora de putrescina y metodo de produccion que la utiliza

Campo tecnico

La presente invencion se refiere a un microorganismo recombinante para la produccion de putrescina y a un metodo de produccion de putrescina utilizando el mismo.

Antecedentes de la tecnica

Las aminas biogenicas (AB) son compuestos de nitrogeno producidos principalmente por la descarboxilacion de aminoacidos, la aminacion de aldetndo y cetona, y la transaminacion. Dichas aminas biogenicas son compuestos de bajo peso molecular, que se sintetizan durante el metabolismo de microorganismos, plantas y animales, y por tanto se conocen como componentes que se encuentran facilmente en sus celulas. Especialmente, la poliamina, tal como la espermidina, la espermina, la putrescina (o 1,4-butanodiamina), la cadaverina, etc., son sustancias presentes en la mayona de las celulas vivas.

Entre ellas, la putrescina es una materia prima importante que sintetiza poliamina nailon-4,6 al reaccionar con acido adfpico, y se produce principalmente por smtesis qmmica a traves de acrilonitrilo y succinonitrilo a partir de propileno.

Asimismo, se ha desvelado un metodo de produccion de putrescina a alta concentracion mediante la transformacion de la especie E. coli y del genero Corynebacterium (publicacion International No. WO06/005603; publicacion internacional n.° WO09/125924; Qian ZD et al., Biotechnol. Bioeng. 104(4): 651-662, 2009; Schneider et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 88(4): 859-868, 2010; y Schneider et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 95: 169-178., 2012). Ademas, se han realizado investigaciones intensas sobre el transportador de putrescina con respecto a celulas de E. coli, levaduras, plantas y animales (K Igarashi, Plant Physiol. Biochem. 48: 506-512, 2010).

Si bien, los presentes inventores demostraron que las protemas de membrana que codifican NCgl2522 funcionan como un exportador de putrescina en un microorganismo del genero Corynebacterium, que incluye una ruta de smtesis de putrescina, y confirmaron que la putrescina puede producirse a un alto rendimiento potenciando la actividad de NCgl2522 a partir de su actividad endogena (solicitud de patente KR n.° 10-2013-0030020)

Asimismo, el gen NCgl2523 es un factor de transcripcion relacionado con la resistencia a multiples farmacos que pertenece a la familia TetR, y se sabe que actua como un inhibidor de la expresion de NCgl2522 (Hirochi et. al. J Biol. Chem. 280:46, 38711-38719. 2005).

En este sentido, los presentes inventores han realizado incesantemente investigaciones y han confirmado la produccion potenciada de putrescina por empobrecimiento de NCgl2523 que constituye el operon NCgl2522, de manera similar a los efectos de potenciacion de la actividad de NCgl2522, completando de esta forma la presente invencion.

Divulgacion

Problema tecnico

Un objetivo de la presente invencion es proporcionar un microorganismo recombinante capaz de producir putrescina a alto rendimiento.

Otro objetivo de la presente invencion es proporcionar un metodo de produccion de putrescina a alto rendimiento utilizando el microorganismo.

Solucion tecnica

En un aspecto para conseguir los objetivos anteriores, la presente invencion proporciona un microorganismo del genero Corynebacterium que tiene productividad de putrescina, en el que se inactiva una protema que tiene una secuencia de aminoacidos representada por la SEC ID NO: 2.

En una realizacion ilustrativa, la presente invencion proporciona un microorganismo del genero Corynebacterium que tiene productividad de putrescina, en el que en el microorganismo se introduce adicionalmente una actividad de ornitina descarboxilasa (ODC).

En otra realizacion ilustrativa, la presente invencion proporciona un microorganismo del genero Corynebacterium que tiene productividad de putrescina, en el que la ODC tiene una secuencia de aminoacidos representada por la SEC ID NO: 10.

En otra realizacion ilustrativa mas, la presente invencion proporciona un microorganismo del genera Corynebacterium que tiene productividad de putrescina, en el que la actividad de acetiltransferasa se inactiva adicionalmente en el microorganismo.

En otra realizacion mas, la presente invencion proporciona un microorganismo del genero Corynebacterium que tiene productividad de putrescina, en el que la acetiltransferasa comprende un aminoacido representado por la SEC ID NO: 15 o 16.

En otra realizacion mas, la presente invencion proporciona un microorganismo del genero Corynebacterium que tiene productividad de putrescina, en el que el microorganismo es Corynebacterium glutamicum.

En otro aspecto, la presente invencion proporciona un metodo de produccion de putrescina que incluye:

i) cultivar un microorganismo del genero Corynebacterium que tiene productividad de putrescina, en el que en un medio de cultivo se inactiva una protema que tiene una secuencia de aminoacidos representada por la SEC ID NO: 2; y

ii) separar la putrescina de un microorganismo cultivado o del medio de cultivo obtenido en la etapa anterior. En una realizacion ilustrativa, la presente invencion proporciona un metodo de produccion de putrescina, en el que el microorganismo del genero Corynebacterium es Corynebacterium glutamicum.

A partir de ahora en el presente documento, la presente invencion se describira con detalle.

En un aspecto, la presente invencion se refriere a un microorganismo del genero Corynebacterium que tiene productividad de putrescina, en el que una protema que tiene una secuencia de aminoacidos representada por la SEC ID NO: 2, tal como NCgl2523, se inactiva.

Como se usa en el presente documento, el termino "NCgl2523" se refiere a un factor de transcripcion relacionado con la resistencia a multiples farmacos que pertenece a la familia TetR, y se sabe que actua como un inhibidor de la expresion de Ncgl2522 (Hirochi et. al. Chem. 280(46): 38711-38719, 2005).

En la presente invencion, NCgl2523 es una protema que tiene un aminoacido de SEQ ID NO: 2 o una secuencia de aminoacidos que tiene 70 % o mas, mas espedficamente 80 % o mas, incluso mas espedficamente 90 % o mas, mucho mas espedficamente 98 % o mas, y lo mas espedficamente 99 % o mas de homologfa con la secuencia, y no se limita a ella siempre y cuando sea una protema que tenga la actividad de un inhibidor de la expresion de NCgl2522.

Ademas, dado que las secuencias de aminoacidos de las protemas que muestran la actividad pueden diferir segun la especie o la cepa de microorganismos, no se limita a ellas. Es obvio que una protema que tiene una secuencia de aminoacidos en la que la secuencia esta parcialmente delecionada, modificada, sustituida o insertada, esta incluida en el alcance de la presente invencion, siempre que una secuencia que tenga homologfa con la secuencia muestre una actividad biologica practicamente equivalente o correspondiente a una protema de SEC ID NO: 2.

Como se usa en el presente documento, el termino "homologfa" se refiere a la similitud entre secuencias de aminoacidos o secuencias de nucleotidos dadas y puede representarse en porcentaje. En el presente documento, la secuencia de homologfa que tiene actividad identica o similar con una secuencia de aminoacidos o secuencia de nucleotidos dada se indica mediante "% de homologfa". Por ejemplo, la homologfa puede examinarse utilizando un programa informatico convencional que calcula parametros intermedios tales como puntuacion, identidad, similitud, etc., y mas espedficamente utilizando BLAST 2.0, o comparando secuencias mediante hibridacion Southern en condiciones rigurosas definidas. Las condiciones de hibridacion apropiadas pueden definirse por el alcance de la tecnica, y un experto habitual en la tecnica puede determinarlas utilizando metodos conocidos (es decir, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edicion, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York). Siempre que tenga una actividad similar a la de las protemas NCgl2523, un polinucleotido que codifique la NCgl2523 de la presente invencion puede incluir una secuencia de aminoacidos de SEC ID NO: 2, o un polinucleotido que codifique una protema que tenga 70 % o mas, espedficamente 80 % o mas, mas espedficamente 90 % o mas, mucho mas espedficamente un 95 % o mas de homologfa con la misma, mucho mas espedficamente 98 % o mas, y lo mas espedficamente 99 % o mas de homologfa con la secuencia, y puede incluir especialmente una secuencia de nucleotidos de SEC ID NO: 1 o 3.

Ademas, un polinucleotido que codifique la NCgl2523 de la presente invencion puede hibridarse en condiciones rigurosas con una sonda de una secuencia de nucleotidos representada por la SEC ID NO: 1 o 3, o una sonda derivada de la secuencia de nucleotidos, y puede ser una variante que codifique funcionalmente la NCgl2523 normal. Como se usa en el presente documento, la expresion "condiciones rigurosas" se refiere a las condiciones que permiten una hibridacion espedfica entre polinucleotidos. Por ejemplo, dichas condiciones rigurosas se describen en detalle en la bibliograffa (es dedr, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edicion, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York).

En la presente invencion, se confirmo que cuando NCgl2523, que constituye un operon de NCgl2522, se delecionaba en un microorganismo del genero Corynebacterium con productividad de putrescina, la actividad de putrescina aumentaba, de manera similar a cuando se potenciaba la actividad de NCgl2522. En este sentido, la presente invencion puede proporcionar un microorganismo recombinante que muestra produccion de putrescina a un alto rendimiento al inhibir la expresion de NCgl2522 que resulta de la inactivacion de la actividad de NCgl2523. Por lo tanto, como se desvela en la realizacion de la presente invencion, inactivando la NCgl2523 correspondiente y los genes que codifican aminoacidos similares a los mismos, la productividad de la putrescina puede potenciarse en un microorganismo que tiene secuencias con aminoacidos similares a las de NCgl2523, en el que dichos aminoacidos consisten en NCgl2522 y un operon, o un microorganismo en el que NCgl2523 actua de manera similar a un modulador de la expresion de NCgl2522.

Como se usa en el presente documento, el termino "inactivacion" se refiere a no expresar un gen que codifique un polipeptido correspondiente, mostrando una cierta reduccion en la expresion genica, no produciendo un polipeptido funcional correspondiente, incluso cuando se expresa.

Asimismo, inactivacion se refiere no solo a la inactivacion completa de un gen que codifica un polipeptido correspondiente, sino tambien a una expresion debilitada o significativamente reducida en comparacion con el tipo silvestre, por lo que practicamente no se expresa el gen. Por lo tanto, la inactivacion genica puede ser completa (nuligenica (en ingles knockout)) o parcial (por ejemplo, un hipomorfo que muestra expresion genica por debajo del nivel normal, o un producto de un gen mutante que muestra una reduccion parcial de la actividad en efecto de un hipomorfo).

En particular, en la presente invencion, la inactivacion de NCgl2523 puede inducirse mediante:

1) una delecion parcial o completa de un polinucleotido que codifica la protema;

2) la modificacion de una secuencia reguladora para disminuir una expresion del polinucleotido;

3) la modificacion de la secuencia de polinucleotidos en el cromosoma para debilitar la actividad proteica; y 4) una combinacion de los mismos,

sin estar particularmente limitado a esto.

1) puede realizarse una delecion parcial o completa de un polinucleotido que codifica la protema reemplazando un polinucleotido que codifica protemas o cromosomas diana endogenos con un polinucleotido parcialmente eliminado o un gen marcador utilizando un vector para la insercion cromosomica en un microorganismo. La delecion "parcial" puede variar dependiendo del tipo de polinucleotido, pero espedficamente se refiere a de 1 a 300, mas espedficamente a de 1 a 100, e incluso mas espedficamente a de 1 a 50.

Como se usa en el presente documento, el termino “vector” se refiere a una construccion de ADN que incluye una secuencia de nucleotidos que codifica una protema determinada, que esta unida operativamente a una secuencia reguladora de expresion apropiada para expresar la protema determinada en una celula hospedadora adecuada. La secuencia reguladora incluye un promotor que puede iniciar la transcripcion, una secuencia operadora opcional para regular la transcripcion, una secuencia que codifica un sitio de union al ribosoma de ARNm adecuado y una secuencia que regula la terminacion de la transcripcion y la traduccion. Despues de que el vector se transforma en una celula hospedadora adecuada, este puede replicarse o funcionar independientemente del genoma del hospedador, o puede integrarse en el propio genoma.

El vector utilizado en la presente invencion no esta particularmente limitado, siempre que sea capaz de replicarse en celulas hospedadoras, y puede utilizarse cualquier vector conocido en la tecnica. Los ejemplos de vectores convencionales pueden incluir un plasmido natural o recombinante, un cosmido, un virus y un bacteriofago. Por ejemplo, pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, Charon21A, etc., pueden utilizarse como un vector de fago o vector de cosmido, y los tipos pBR, tipos pUC, tipos pBluescriptll, tipos pGEM, tipos pTZ, tipos pCL, tipos pET, etc., pueden utilizarse como un vector de plasmido. Un vector que puede utilizarse en la presente invencion no esta limitado particularmente y puede utilizarse cualquier vector de expresion conocido. Espedficamente, pueden utilizarse los vectores pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118 o pCC1BAC.

Ademas, el polinucleotido que codifica una protema determinada en los cromosomas puede reemplazarse por un polinucleotido mutado utilizando un vector para la insercion cromosomica. La insercion del polinucleotido en el cromosoma puede realizarse por cualquier metodo conocido en la tecnica, tal como recombinacion homologa, sin estar particularmente limitado a esto.

Como se usa en el presente documento, el termino "transformacion" se refiere a la introduccion de vectores que incluyen un polinucleotido que codifica protemas diana en celulas hospedadoras, de modo que las protemas codificadas por el polinucleotido se expresan en celulas hospedadoras. Mientras que el polinucleotido transformado pueda expresarse en una celula hospedadora, Este incluye todo tanto si esta integrado en los cromosomas de las celulas hospedadoras o si existe extracromosomicamente. Ademas, el polinucleotido incluye ADN y ARN que codifican protemas diana. El polinucleotido puede introducirse en cualquier forma, siempre que pueda introducirse en las celulas hospedadoras y expresarse en ellas. Por ejemplo, el polinucleotido puede introducirse en celulas hospedadoras en forma de un casete de expresion que es una construccion genica que incluye todos los elementos necesarios para su expresion autonoma. Por lo general, el casete de expresion incluye un promotor unido operativamente al polinucleotido, senales de terminacion de la transcripcion, sitios de union al ribosoma, o senales de terminacion de la traduccion. El casete de expresion puede estar en forma de un vector de expresion autorreplicable. Del mismo modo, el polinucleotido puede introducirse en celulas hospedadoras tal cual y unirse operativamente a secuencias necesarias para su expresion en celulas hospedadoras, sin limitarse a esto.

Ademas, La expresion "unido operativamente" se refiere a un enlace funcional entre una secuencia de polinucleotidos que codifica protemas determinadas y una secuencia promotora que inicia y actua como mediadora en la transcripcion de la secuencia de polinucleotidos.

A continuacion, 2) la modificacion de una secuencia reguladora para disminuir una expresion del polinucleotido puede realizarse induciendo una modificacion en una secuencia reguladora mediante delecion, insercion, sustitucion no conservativa o conservativa, o una combinacion de las mismas en una secuencia de nucleotidos o reemplazando con un nucleotido con una actividad mas debil, para debilitar la actividad de la secuencia reguladora, sin estar particularmente limitado a esto. La secuencia reguladora puede incluir un promotor, una secuencia operadora, una secuencia que codifica el sitio de union al ribosoma y una secuencia que regula la terminacion de la transcripcion y la traduccion, sin limitarse a esto.

Ademas, 3) la modificacion de la secuencia de polinucleotido en el cromosoma puede realizarse induciendo una modificacion en una secuencia reguladora mediante delecion, insercion, sustitucion no conservativa o conservativa, o una combinacion de las mismas en una secuencia de nucleotidos, o reemplazando con un nucleotido con una actividad mas debil, para debilitar la actividad proteica, sin limitarse a esto,

Como se usa en el presente documento, la expresion "un microorganismo que tiene productividad de putrescina" o "un microorganismo productor de putrescina" se refiere a un microorganismo que, de manera natural, tiene productividad de putrescina, o a un microorganismo, en el que se incorpora productividad de putrescina en una cepa precursora que no tiene productividad de putrescina.

El microorganismo productor de putrescina puede ser, sin estar particularmente limitado a esto, un microorganismo que tiene una productividad mejorada de ornitina para utilizarse como materia prima para la biosmtesis de putrescina, En el que el microorganismo se modifica para tener una mayor actividad de la acetilglutamato sintasa que convierte el glutamato en acetilglutamato (W-acetilglutamato) o de la ornitina acetiltransferasa (ArgJ), que convierte la acetilornitina en ornitina, acetilglutamato quinasa (ArgB), que convierte el acetilglutamato en acetilglutamil fosfato (W-acetilglutamil fosfato), acetil-gamma-glutamil fosfato reductasa (ArgC) que convierte la acetil glutamil fosfato en acetil glutamato semialdehfdo (N-acetil glutamato semialdehfdo), o acetilornitina aminotransferasa (ArgD) que convierte la acetil glutamato semialdehndo en acetilornitina (N-acetilornitina), en comparacion con la actividad endogena, para potenciar la ruta de biosmtesis de glutamato en glutamato de ornitina.

Ademas, el microorganismo se modifica para inactivar la actividad endogena de la ornitina carbamoiltransferasa (ArgF) involucrada en la smtesis de arginina a partir de la ornitina, el exportador de glutamato (NCgl1221) y/o la acetiltransferasa que acetila la putrescina y/o se modifica para introducir actividad de ornitina descarboxilasa (ODC). En este caso, la ornitina carbamoiltransferasa (ArgF), el exportador de glutamato (NCgl1221), la ornitina descarboxilasa (ODC), la acetil-gamma-glutamil-fosfato reductasa (ArgC), la acetilglutamato sintasa u ornitina acetiltransferasa (ArgJ), la acetilglutamato quinasa (ArgB) y la acetilornitina aminotransferasa (ArgD), pueden incluir, espedficamente, una secuencia de aminoacidos, representada cada una de ellas por la SEQ ID NO: 8, 9, 10, 11, 12, 13 y 14 o una secuencia de aminoacidos que tiene 70 % o mas, mas espedficamente 80 % o mas, incluso mas espedficamente 90 % o mas de homologfa con la secuencia, sin estar particularmente limitado a esto.

Ademas, una acetiltransferasa, que acetila la putrescina, puede incluir, espedficamente, una secuencia de aminoacidos representada por la SEQ ID NO: 15 o 16 o una secuencia de aminoacidos que tiene 70 % o mas, mas espedficamente 80 % o mas, incluso mas espedficamente 90 % o mas de homologfa con la secuencia, sin estar particularmente limitado a esto.

En particular, en la presente invencion, un aumento en la actividad puede llevarse a cabo mediante:

1) un aumento en el numero de copias de polinucleotidos que codifican la enzima;

2) la modificacion de una secuencia reguladora para aumentar la expresion del polinucleotido;

3) la modificacion de una secuencia de polinucleotidos en el cromosoma para potenciar la actividad de la enzima; o

4) la modificacion para potenciar mediante una combinacion de los mismos,

sin limitarse a esto.

1) puede realizarse un aumento en el numero de copias de polinucleotidos en forma unida operativamente a un vector, o por insercion cromosomica en las celulas hospedadoras, sin estar particularmente limitado a esto. En particular, esto puede realizarse introduciendo un vector, a un polinucleotido que codifica una enzima de la presente invencion, una enzima unida operativamente y que puede copiarse y funcionar independientemente de las celulas hospedadoras en celulas hospedadoras, o introduciendo un vector al cual el polinucleotido esta unido operativamente y que es capaz de insertar el polinucleotido en cromosomas en las celulas hospedadoras en celulas hospedadoras, aumentando de esta manera el numero de copias de polinucleotidos en los cromosomas de las celulas hospedadoras.

A continuacion, 2) para aumentar la expresion del polinucleotido puede realizarse una modificacion de una secuencia reguladora induciendo una modificacion en una secuencia mediante delecion, insercion, sustitucion no conservativa o conservativa, o una combinacion de las mismas, o reemplazando con una secuencia de nucleotidos con actividad potenciada, para potenciar la actividad de la secuencia reguladora, sin estar particularmente limitado a esto. La secuencia reguladora puede incluir un promotor, una secuencia operadora, una secuencia que codifica el sitio de union al ribosoma, una secuencia que regula la terminacion de la transcripcion y la traduccion, etc., sin estar particularmente limitado a esto.

En la direccion 5' (upstream) de la unidad de expresion del polinucleotido, en lugar del promotor original puede ligarse un promotor heterologo fuerte. Son ejemplos de promotor fuerte el promotor de CJ7, el promotor de lysCPI, el promotor de EF-Tu, el promotor de groEL, el promotor de aceA o aceB, etc., y mas espedficamente, puede unirse operativamente a un promotor originado en Corynebacterium, el promotor de lysCP1(WO2009/096689) o el promotor de CJ7 (patente KR n.° 0620092 y documento WO2006/065095) y aumentar la expresion de un polinucleotido que codifica la enzima, aunque no de forma limitativa.

Ademas de esto, 3) la modificacion de una secuencia de polinucleotidos en el cromosoma puede realizarse induciendo la modificacion en una secuencia reguladora por delecion, insercion, sustitucion no conservativa o conservativa, o una combinacion de las mismas, en una secuencia de nucleotidos, o reemplazando con una secuencia de polinucleotidos que esta modificada para tener una actividad potenciada, para potenciar la actividad de la secuencia de polinucleotidos, sin estar particularmente limitado a esto.

Ademas, la inactivacion de la ornitina carbamoiltransferasa (ArgF), del exportador de glutamato y de la acetil transferasa puede realizarse mediante metodos de inactivacion de NCgl2523, como se ha mencionado anteriormente:

sin estar particularmente limitado a esto.

Si bien, un microorganismo de la presente invencion es un microorganismo que tiene productividad de putrescina e incluye microorganismos procariotas que expresan protemas que incluyen un aminoacido representado por la SEC ID NO: 2. Son ejemplos de dichos microorganismos Escherichia sp., Shigella sp., Citrobacter sp., Salmonella sp., Enterobacter sp., Yersinia sp., Klebsiella sp., Erwinia sp., Corynebacterium sp., Brevibacterium sp., Lactobacillus sp., Selenomanas sp., Vibrio sp., Pseudomonas sp., Streptomyces sp., Arcanobacterium sp., Alcaligenes sp., etc. En particular, Un microorganismo de la presente invencion puede ser uno del genero Corynebacterium, y mas espedficamente Corynebacterium glutamicum, pero sin limitacion a estos.

En una realizacion ilustrativa, la presente invencion utiliza cepas que tienen una productividad de putrescina de alta concentracion debido a una ruta de biosmtesis de putrescina potenciada a partir de glutamato, que son microorganismos del genero Corynebacterium depositados con los numeros de registro KCCM11138P (Patente KR No. 2012-0064046) y KCCM11240P (Patente KR No. 2012-0003634).

En otra realizacion ilustrativa, la presente invencion utiliza KCCM11138P y KCCM11240P, que son cepas productoras de putrescina derivadas de Corynebacterium glutamicum ATCC13032, y DAB12-a (Patente KR No.

2013-0082478) y DAB12-b (KR No. 2013-0082478; DAB12-a ANCgl1469), que son cepas productoras de putrescina derivadas de Corynebacterium glutamicum ATCC13869, teniendo cada una de ellas genotipos identicos. La cepa ATCC13869 puede obtenerse en la Coleccion Americana de Cultivos Tipo (ATCC).

En particular, los presentes inventores denominaron un microorganismo del genero Corynebacterium que tema una productividad de putrescina potenciada debido a la inactivacion de la actividad de NCg12523 en Corynebacterium glutamicum KCCM11240P, que es una cepa productora de putrescina, como Corynebacterium glutamicum CC01-0844, y lo depositaron el 25 de febrero de 2014 en el Centro de cultivo de microorganismos de Corea (KCCM, del ingles Korean Culture Center of Microorganisms) conforme al Tratado de Budapest como numero de Registro KCCM11520P.

i) cultivar un microorganismo del genero Corynebacterium que tiene productividad de putrescina potenciada, en el que en un medio de cultivo se inactiva una protema que tiene una secuencia de aminoacidos representada por la SEC ID NO: 2; y

ii) separar la putrescina del microorganismo cultivado o del medio de cultivo obtenido en la etapa anterior.

En el metodo, el cultivo del microorganismo puede realizarse mediante metodos conocidos de cultivo discontinuo, cultivo continuo, cultivo semicontinuo, etc., sin estar particularmente limitado a esto. En este caso, las condiciones de cultivo pueden mantenerse a un pH optimo (por ejemplo, a un pH de 5 a 9, espedficamente a un pH de 6 a 8, y mas espedficamente a un pH de 6,8) utilizando compuestos basicos (por ejemplo, hidroxido de sodio, hidroxido de potasio o amoniaco) o compuestos acidos (por ejemplo, acido fosforico o acido sulfurico), y en una condicion aerobia por oxfgeno o mezcla de gases que contiene oxfgeno, en un cultivo celular, sin estar particularmente limitado a esto. La temperatura del cultivo puede mantenerse de 20 °C a 45 °C y, espedficamente, de 25 °C a 40 °C, y el cultivo puede realizarse durante aproximadamente 10 horas a 160 horas. La putrescina producida por el cultivo puede exportarse al medio de cultivo o permanecer en las celulas.

Ademas, el medio de cultivo utilizado puede incluir azucar e hidratos de carbono (por ejemplo, glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melaza, almidon y celulosa), aceite y grasa (por ejemplo, aceite de soja, aceite de semillas de girasol, aceite de cacahuete y aceite de coco), acidos grasos (por ejemplo, acido palmftico, acido estearico y acido linoleico), alcohol (glicerol y etanol), y acidos organicos (por ejemplo, acido acetico) individualmente o en combinacion como fuente de carbono; compuestos organicos que contienen nitrogeno (por ejemplo, peptona, extracto de levadura, jugo de carne, extracto de malta, solucion de mafz, harina de soja en polvo y urea) o compuestos inorganicos (por ejemplo, sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio) individualmente o en combinacion como fuente de nitrogeno; dihidrogenofosfato de potasio, fosfato de dipotasio o una sal que contenga sodio correspondiente al mismo, individualmente o en combinacion, como una fuente de fosforo; y otras sustancias esenciales que estimulan el crecimiento, incluidas las sales metalicas (por ejemplo, sulfato de magnesio o sulfato de hierro), aminoacidos y vitaminas, sin limitarse a esto. La separacion de putrescina producida en la etapa de cultivo de la presente invencion puede realizarse utilizando un metodo adecuado conocido en la tecnica, dependiendo de metodos de cultivo tales como los metodos de cultivo discontinuo, continuo o semicontinuo, etc., recogiendo asf del cultivo los aminoacidos determinados.

Efectos ventajosos

Para inactivar la actividad de una protema que incluye una secuencia de aminoacidos de la SEC ID NO: 2 se modifica un microorganismo del genero Corynebacterium que tiene una productividad de putrescina potenciada de la presente invencion, induciendo asf una actividad potenciada de una protema que se espera que sea un exportador de putrescina, espedficamente NCgl2522, y el aumento de la exportacion de putrescina al exterior de las celulas, y por lo tanto puede producir eficazmente la putrescina.

Descripcion de los dibujos

La figura 1 es un diagrama esquematico que muestra las estructuras combinadas de NCgl2523 y las adyacentes. En particular, La figura 1 es un diagrama esquematico que muestra una estructura de NCgl2522-NCgl2523-NCgl2524 combinada que es una estructura combinada de genes adyacentes de un microorganismo que incluye NCgl2523 (Tipo 1); una estructura combinada de NCgl2522-NCgl2523 y NCgl2524 (Tipo 2) individual; o una estructura de NCgl2522-NCgl2523 (Tipo 3) combinada.

Modo para llevar a cabo la invencion

A partir de ahora en el presente documento, la presente invencion se describira con mas detalle con referencia a los ejemplos. Sin embargo, los ejemplos solo tienen fines ilustrativos, y por lo tanto no pretenden limitar la invencion. Ejemplo 1: Preparación de cepas con delecion de NCgl2523 y verificacion de su productividad de putrescina <1-1> Preparación de cepas con delecion de NCgl2523 en cepas productoras de putrescina derivadas de ATCC13032

Para verificar si la delecion de NCgl2523 derivada de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 tema un efecto en la productividad de putrescina, se prepararon vectores para la delecion de un gen que codificaba NCgl2523.

En particular, basandose en la secuencia de nucleotidos de un gen que codifica NCgl2523 representado por la SEC ID NO: 1, se construyo un par de cebadores las SEQ ID NO: 4 y 5 para obtener fragmentos de recombinacion homologos en la region N terminal de NCgl2523 y un par de cebadores de las SEQ ID NO: 6 y 7 para obtener fragmentos de recombinacion homologos en la region C terminal de NCgl2523, como se muestra en la Tabla 1.

T l 1

La PCR se realizo utilizando, como molde, el ADN genomico de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 y dos pares de cebadores, amplificando asf los fragmentos de PCR en las regiones N y C terminales del gen NCg12523. Los fragmentos determinados se obtuvieron a traves de electroforesis de los fragmentos de PCR. En este caso, la reaccion de PCR se repitio durante 30 ciclos, incluyendo 30 segundos de desnaturalizacion a 95 °C, 30 segundos de hibridacion a 55 °C y 30 segundos de extension a 72 °C. Los fragmentos asf obtenidos de las regiones N y C terminales se trataron con las enzimas de restriccion BamHI y Sail, y con las enzimas de restriccion Sail y Xbal, respectivamente. Los fragmentos tratados se clonaron en vectores pDZ tratados con las enzimas de restriccion BamHI y Xbal, construyendo asf los plasmidos pDZ-1'NCgl2523(K/O).

Para obtener los transformantes, cada uno de los plasmidos pDZ-1'NCgl2523 (K/O) se transformo en KCCM11138P (patente KR No. 10-1348461) y KCCM11240P (patente KR No. 2013-0082478) a traves de electroporacion. Para la formacion de colonias, los transformantes se sembraron en placas y se cultivaron en medio de placa BHIS (infusion de cerebro y corazon, del ingles Braine Heart Infusion a (37 g/l), sorbitol (91 g/l) y agar (2%)) que contema kanamicina (25 pg/ml) y X-gal(5-bromo-4-cloro-3-indolm-D-galactosido). A partir de las colonias formadas, se seleccionaron colonias azules como cepas introducidas con los plasmidos pDZ-1'NCgl2523(K/O).

Las cepas seleccionadas se cultivaron en un medio CM (glucosa 10 g/l), polipeptona (10 g/l), extracto de levadura (5 g/l), extracto de carne (5 g/l), NaCl (2,5 g/l), urea (2 g/l), a un pH de 6,8) a 30 °C durante 8 horas. Despues de diluir en serie cada cultivo celular de 10‘4 a 10‘10, para formar las colonias, las muestras diluidas se sembraron en placas y se cultivaron en un medio solido que contema X-gal. A partir de las colonias formadas, las colonias blancas, que aparecieron a una frecuencia relativamente baja, se seleccionaron finalmente como cepas con delecion de un gen que codificaba NCgl2523 a traves de un cruce secundario.

Utilizando un par de cebadores de las SEQ ID NO: 4 y 7, se realizo PCR para confirmar la delecion de un gen que codificaba NCgl2523 en las cepas finalmente seleccionadas. Cada uno de los mutantes de Corynebacterium glutamicum recibio el nombre de KCCM11138P ANCgl2523 y KCCM11240P ANCgl2523.

<1-2> Preparación de cepas con delecion de NCgl2523 en cepas productoras de putrescina derivadas de ATCC13869

A partir de DAB12-a (patente KR No. 2013-0082478) y DAB12-b (patente KR No. 2013-0082478; DAB12-a ANCgl1469) que son cepas productoras de putrescina derivadas de Corynebacterium glutamicum ATCC13869, se construyeron cepas con delecion de NCgl2523.

En particular, para verificar una secuencia del gen NCgl2523 y la protema expresada del mismo, derivada de Corynebacterium glutamicum ATCC13869, se realizo PCR se realizo utilizando, como molde, ADN genomico de Corynebacterium glutamicum ATCC13869 y un par de cebadores de las SEQ ID NO: 4 y 7. En este caso, la reaccion de PCR se repitio durante 30 ciclos, incluyendo 30 segundos de desnaturalizacion a 95 °C, 30 segundos de hibridacion a 55 °C y 1 minuto 30 segundos de extension a 72 °C.

Al separar los productos de la PCR asf obtenidos mediante electroforesis y analizarlos mediante secuenciacion, se encontro que un gen que codificaba NCgl2523 derivado de Corynebacterium glutamicum ATCC13869, inclrna una secuencia de nucleotidos representada por la SEC ID NO: 3. Ademas, se comparo una secuencia de aminoacidos de protemas codificadas por el gen, con una secuencia de aminoacidos de NCgl2523 (SEC ID NO: 2) derivada de Corynebacterium glutamicum ATCC13032, y el resultado mostro una homologfa de 100 %.

Para delecionar un gen que codifica NCgl2523 derivado de Corynebacterium glutamicum ATCC13869, Se realizo PCR utilizando, como molde, el ADN genomico de Corynebacterium glutamicum ATCC13869 y dos pares de cebadores descritos en la Tabla 1 como en el Ejemplo <1-1>, y los fragmentos de PCR de las regiones C y N terminales del gen NCgl2523 se amplificaron, obteniendo asf los fragmentos determinados mediante electroforesis.

En este caso, la reaccion de PCR se repitio durante 30 ciclos, incluyendo 30 segundos de desnaturalizacion a 95 °C, 30 segundos de hibridacion a 55 °C y 30 segundos de extension a 72 °C. Los fragmented asf obtenidos de las regiones N y C terminates se trataron con las enzimas de restriccion BamHI y Sail, y con las enzimas de restriccion Sail y Xbal, respectivamente. Los fragmentos tratados se clonaron en los vectores pDZ tratados con las enzimas de restriccion BamHI y Xbal, construyendo asf los plasmidos pDZ-2'NCgl2523(K/O).

Transformando pDZ-2'NCgl2523 (K / O) en cada uno de Corynebacterium glutamicum DAB12-a y DAB12-b de la misma manera que se describe en el Ejemplo <1-1>, se seleccionaron cepas con delecion de un gen que codificaba NCgl2523. Los mutantes seleccionados de Corynebacterium glutamicum recibieron el nombre de DAB12-a ANCgl2523 y DAB12 -b ANCgl2523.

<1-3> Evaluacion de la productividad de putrescina de cepas con delecion de NCgl2523

Para verificar los efectos de la delecion de NCg12523 sobre la produccion de putrescina en cepas productoras de putrescina, los mutantes de Corynebacterium glutamicum construidos en el Ejemplo <1-1> y <1-2> se compararon con respecto a la productividad de putrescina.

En particular, Cada uno de los 4 tipos diferentes de mutantes de Corynebacterium glutamicum (KCCM11138P ANCgl2523, KCCM11240P ANCgl2523, DAB12-a ANCgl2523 y DAB12-b ANCgl2523) y de los 4 tipos diferentes de cepas precursoras (KCCM11138P, KCCM11240P, DAB12-a y DAB12-b) se sembraron en medios de placa CM que contema arginina 1 mM (glucosa al 1 %, polipeptona al 1 %, extracto de levadura al 0,5 %, extracto de carne al 0,5%, NaCl al 0,25%, urea al 0,2%, 100 pl de NaOH al 50% y agar al 2%, a un pH de 6,8, en 1 litro) y se cultivaron a 30 °C durante 24 horas. Despues de inocular cada una de las cepas cultivadas utilizando un asa de platino en 25 ml de medio de titulacion (glucosa al 8 %, protemas de soja al 0,25 %, solidos de macerado de mafz al 0,50 %, (NH4)2SO4 al 4 %, KH2PO4 al 0,1 %, MgSO4 ■ 7H2O al 0,05 %, urea al 0,15 %, 100 g de biotina, 3 mg de clorhidrato de tiamina, 3 mg de calcio-acido pantotenico, 3 mg de nicotinamida y CaCO3 al 5 %, en 1 litro), el cultivo se realizo con agitacion a 30 °C y a 200 rpm durante 98 horas. Para cultivar todas las cepas, se anadio al medio arginina 1 mM. La concentracion de putrescina producida a partir de cada cultivo se midio y los resultados se muestran en la Tabla 2.

T l 21

Como se muestra en la Tabla 2, la produccion de putrescina se incremento en 4 tipos de mutantes de Corynebacterium glutamicum con delecion de NCgl2523.

Ejemplo 2: Medicion de las concentraciones de putrescina intercelular en cepas con delecion de NCgl2523 Para examinar los cambios en la concentracion de putrescina intercelular en mutantes de Corynebacterium glutamicum que tenten actividad NCgl2523 inactivada, las concentraciones de putrescina intercelular se midieron en el mutante de Corynebacterium glutamicum KCCM11240P ANCgl2523 y en la cepa precursora KCCM11240P por extraccion utilizando un disolvente organico. El analisis de metabolito intracelular se llevo a cabo segun un metodo descrito en la bibliografte (Nakamura J et al., Appl. Environ. Microbiol., 73(14): 4491-4498, 2007).

En primer lugar, despues de inocular cada uno del mutante de Corynebacterium glutamicum KCCM11240P ANCgl2523 y la cepa precursora KCCM11240P en 25 ml de medio lfquido CM que contema arginina 1 mM (glucosa al 1 %, polipeptona al 1 %, extracto de levadura al 0,5 %, extracto de carne al 0,5 %, NaCl al 0,25 %, urea al 0,2 % y 100 pl de NaOH al 50 %, a un pH de 6,8, en 1 litro), el cultivo se realizo con agitacion a 30 °C y a 200 rpm. Cuando el crecimiento celular alcanzo la fase exponencial durante el cultivo, las celulas se aislaron de los medios de cultivo mediante filtracion rapida al vacte (Durapore HV, 0,45 m; Millipore, Billerica, MA). El filtro adsorbido de celulas se lavo dos veces con 10 ml de agua enfriada y se sumergio durante 10 minutos en acido morfolino etanosulfonico 5 M que contema metanol y metionina sulfona 5 M. El Ifquido de extraccion obtenido del mismo se mezclo bien con un mismo volumen de cloroformo y un volumen de agua de 0,4 veces. Para retirar los contaminantes proteicos, se aplico solo la fase acuosa a una columna de centrifugado. El lfquido de extraccion filtrado se analizo mediante espectrometna de masas con electroforesis capilar, y los resultados se muestran en la Tabla 3.

T l 1

Como se muestra en la Tabla 3, la concentracion de putrescina intercelular se redujo significativamente en los mutantes de Corynebacterium glutamicum que teman actividad de NCgl2523 inactivada en comparacion con la de la cepa precursora KCCM11240P.

Se sugiere que cuando en el mutante KCCM11240P de Corynebacterium glutamicum se deleciona NCgl2523, la inhibicion de la expresion de NCgl2522 se elimina y se potencia la actividad de NCgl2522, potenciando asf, de una manera eficaz, la capacidad de exportacion de putrescina y posteriormente exportando la putrescina producida dentro de la celula al exterior de las celulas.

Ejemplo 3: Busqueda del ortologo del gen NCgl2523 y analisis del contexto genico

La busqueda del ortologo se realizo para NCgl2523, que deriva de Corynebacterium glutamicum ATCC13032, utilizando las bases de datos KEGG y MetaCyc y el programa blastP del NCBI. A traves del grupo de genes, se examino una estructura combinada de NCgl2523 y NCgl2522 y NCgl2524, que constituye un operon en el genoma de cada microorganismo.

El nombre del gen NCgl2522 es cgmA, que es una permeasa importante de la superfamilia de transportadores facilitadores que pertenece a la familia DHA2, y el nombre del gen NCgl2523 es cgmR, que es el regulador de la transcripcion de la familia TetR. A NCgl2524 no se le ha atribuido ninguna funcion, pero es una permeasa importante de la superfamilia de transportadores facilitadores que pertenece a la familia UMF1.

De acuerdo con los resultados del analisis, mientras que NCgl2522 y NCgl2523 constituyen en su mayona el mismo operon, NCgl2524 puede estar presente en los mismos operones (Tipo 1), presente en una posicion diferente en el genoma (Tipo 2), o no presente en el genoma (Tipo 3), dependiendo de los microorganismos.

En este sentido, cada uno de los microorganismos analizados se clasifico en 3 tipos segun una estructura combinada de genes adyacentes a NCgl2523. En particular, los microorganismos que se esperaba que tuvieran NCg12523 se clasificaron en una estructura combinada de NCgl2522-NCgl2523-NCgl2524 (Tipo 1); una estructura combinada de NCgl2522-NCgl2523 y NCgl2524 (Tipo 2) individual; o una estructura combinada de NCgl2522-NCgl2523 (Tipo 3) (Figura 1). En la Tabla 4 se muestran los resultados de la clasificacion.

Tabla 4

A partir de estos resultados, se espera que la productividad de la putrescina pueda potenciarse como en la presente invencion al inactivar los genes que codifican NCgl2523 y una secuencia de aminoacidos similar a la misma, para microorganismos que tienen un aminoacido que incluye una secuencia similar a NCgl2523 y que consiste en un operon con una protema que se espera que sea un exportador de putrescina, tal como NCgl2522, como en la clasificacion.

Denominacion del deposito

Autoridad depositaria: Centro de cultivo de microorganismos de Corea

N.° de registro: KCCM11520P

Fecha de deposito: 20140225

<110> CJ CHEILJEDANG CORPORATION

<120> MICROORGANISMOS PARA LA PRODUCCION DE PUTRESCINA Y PROCEDIMIENTO PARA LA PRODUCCION DE PUTRESCINA UTILIZANDO LOS MISMOS

<130> OPA15053-PCT

<150> KR10-2014-0049766

<151> 25/04/2014

<160> 16

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 534

<212> ADN

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032 NCgl2523

<400> 1

<210>2

<211>177

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032 NCgl2523

<400> 2

<210>3

<211> 534

<212> ADN

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13869 NCgl2523

<400> 3

<211> 29

<212>ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador NCgl2523-del-F1_BamHI <400>4

cgggatccat gactacctcg cagcgtttc 29 <210> 5

<211> 31

<212>ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador NCgl2523-del-R1_SalI <400>5

acgcgtcgac ctagtgcgca ttattggctc c 31 <210>6

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador NCgl2523-del-F2_SalI <400>6

acgcgtcgac agccatgctg gaaacaattc teg 33 <210>7

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador NCgl2523-del-R2_XbaI <400>7

etagtetaga gagagctgcg catagtactg 30 <210>8

<211> 319

<212> PRT

<213> Ornitina carbamoiltransferasa (argF) <400> 8

<210>9

<211> 533

<212> PRT

<213> Exportador de glutamato (NCgl1221)

<400>9

<210> 10

<211> 711

<212> PRT

< 213> Ornitina decarboxilasa (ODC)

<400> 10

<210> 11

<211> 357

<212> PRT

<213> Acetil gamma glutamil fosfato reductasa (ArgC)

<400> 11

<210> 12

<211> 388

<212> PRT

<213> Acetilglutamato sintasa u Ornitina acetiltransferasa (ArgJ)

<400> 12

<210> 13

<211> 317

<212> PRT

<213> Acetilglutamato quinasa (ArgB)

<400> 13

<210> 14

<211> 391

<212> PRT

<213> Acetilornitina aminotransferasa (ArgD)

<400> 14

<210> 15

<211> 203

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032 NCgl1469

<400> 15

<210> 16

<211> 203

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13869 NCgl1469

<400> 16

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un microorganismo aislado del genera Corynebacterium que tiene productividad de putrescina, en el que se inactiva una protema que tiene una secuencia de aminoacidos representada por la SEC ID NO: 2.

2. El microorganismo del genero Corynebacterium que tiene productividad de putrescina segun la reivindicacion 1, en el que en el microorganismo se introduce adicionalmente una actividad de ornitina descarboxilasa (ODC).

3. El microorganismo del genero Corynebacterium que tiene productividad de putrescina segun la reivindicacion 2, en el que la ODC tiene una secuencia de aminoacidos representada por la SEC ID NO: 10.

4. El microorganismo del genero Corynebacterium que tiene productividad de putrescina segun la reivindicacion 1, en el que la actividad de acetiltransferasa se inactiva adicionalmente en el microorganismo.

5. El microorganismo del genero Corynebacterium que tiene productividad de putrescina segun la reivindicacion 4, en el que la acetiltransferasa comprende un aminoacido representado por la SEC ID NO: 15 o 16.

6. El microorganismo del genero Corynebacterium que tiene productividad de putrescina segun la reivindicacion 1, en el que el microorganismo es Corynebacterium glutamicum.

7. Un metodo de produccion de putrescina, que comprende:

cultivar un microorganismo del genero Corynebacterium que tiene productividad de putrescina, en el que en un medio de cultivo se inactiva una protema que tiene una secuencia de aminoacidos representada por la SEC ID NO: 2; y separar la putrescina del microorganismo cultivado o del medio de cultivo obtenido en la etapa anterior.

8. El metodo de produccion de putrescina segun la reivindicacion 7, en el que el microorganismo del genero Corynebacterium es Corynebacterium glutamicum.