BR112014017091A2

BR112014017091A2 - microorganismos recombinantes com uma melhor produtividade de putrescina e método de produção de putrescina que utiliza os mesmos

Info

Publication number: BR112014017091A2
Application number: BR112014017091-6A
Authority: BR
Inventors: Su Jin Choi; Hyang Choi; Min Sun Kang; Sung Hoo Jhon; Kyoung Min Lee; Hye Won Um; Young Lyeol Yang
Original assignee: Cj Cheiljedang Corporation
Priority date: 2012-01-11
Filing date: 2013-01-11
Publication date: 2020-10-27
Also published as: IN2014MN01331A; US9677099B2; DK2803721T3; MY170632A; EP2803721B1; KR101493585B1; WO2013105827A3; AU2016203949B2; JP2015507479A; EP2803721A4; US20150104838A1; JP5878246B2; ES2655764T3; RU2014128243A; KR20130082478A; AU2013208344A1; EP2803721A2; AU2016203949A1; PL2803721T3; CN104066835B

Abstract

microrganismos recombinantes com uma melhor produtividade de putrescina e método de produção de putrescina que utiliza os mesmos. a presente invenção refere-se a um microrganismo recombinante com uma maior capacidade para produzir putrescina com alto rendimento, que é gerado pelo comprometimento da atividade de ncgl1469 num microrganismo do género corynebacterium modificado para produzir putrescina, e refere-se a um método para produzir putrescina utilizando o mesmo.

Description

: 1/29 Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: "MICRORGANISMOS

RECOMBINANTES COM UMA MELHOR PRODUTIVIDADE DE PUTRESCINA E MÉTODO DE PRODUÇÃO DE PUTRESCINA QUE UTILIZA OS MESMOS" CAMPO TÉCNICO

[001] A presente invenção refere-se a microrganismos recombinantes com uma produtividade de putrescina aumentada pela modificação dos mesmos com vista ao comprometimento da sua capacidade de degradação da putrescina e refere-se a um método para produzir putrescina que utiliza os mesmos.

ARTE ANTECEDENTE

[002] A putrescina (ou 1,4-butanodiamina) é um tipo de poliamina, tal como a espermidina e a espermina, que é encontrada em bactérias Gram- negativas e em fungos. Uma vez que a putrescina está presente em várias espécies numa vasta gama de concentrações, prevê-se que desempenhe um papel importante no metabolismo dos microrganismos. A putrescina é produzida principalmente por síntese química com acrilonítrilo e succinonitrilo a partir do propileno. A síntese química emprega como matérias-primas substâncias derivadas de produtos petroquímicos e utiliza produtos químicos tóxicos, pelo que não é respeitadora do ambiente e tem o problema do eventual esgotamento do petróleo.

[003] Com vista à resolução destes problemas, tem-se feito muita investigação para desenvolver um método de biossíntese de putrescina através de microrganismos, que seja mais respeitador do ambiente e apresente menor consumo de energia. De acordo com os conhecimentos atuais, a putrescina pode ser biossintetizada por duas vias que utilizam microrganismos. Numa via, ornitina é primeiro produzida a partir de glutamato e é depois descarboxilada para sintetizar putrescina. Pela outra via, arginina é sintetizada a partir de ornitina, agmatina é produzida a partir da arginina, e em seguida a putrescina é sintetizada a partir da agmatina. Existem também outros métodos de síntese de

- 2/29 putrescina através dos quais conhecidas enzimas envolvidas nas vias sintéticas da putrescina são transformadas num microrganismo alvo. Por exemplo, WO09/125924 divulga um método para produzir putrescina com elevado rendimento, em que a via de degradação e utilização da putrescina presenteemFE.colié inativada através da inativação da via pela qual a ornítina, um precursor da putrescina, é convertida em arginina, e através do reforço da via biossintética da ornitina. Um artigo publicado em 2009 revela um método para produzir putrescina em concentrações elevadas, em que a proteína que converte ornitina a putrescina é inserida em estirpes Corynebacteríum que não têm a capacidade para produzir putrescina e a sua atividade é aumentada (Qian et aí., Biotechnol Biceng, 104:4, 651-662, 2009).

[004] A putrescina produzida pode ser degradada por microrganismos ou utilizada noutro metabolismo. A título de exemplo, a espermidina-sintase (CE:

2.5.1.16, SpeE), que se expressa em E. coli e em Corynebacterium glutamicum, sintetiza espermidina a partir de putrescina, e a acetiltransferase (N- acetiltransferase), que se expressa em Candida boidinii, acetila a putrescina a N-acetilputrescina. É sabido que a putrescina pode ser produzida em alta concentração numa estirpe de E. coli modificada com vista a comprometer a atividade da espermidina-acetiltransferase (CE: 2.3.1.57. speG), a qual apresenta alta homologia com a atrás referida acetiltransferase (Patente Coreana n.º 1188432).

[005] Embora não tenha sido identificada a enzima que acetila a putrescina a N-acetilputrescina no microrganismo do género Corynebacterium, é sabido, no entanto, que quando o gene codificante da NCgl1469, que se define como uma histona-acetiltransferase HPA2 e acetiltransferase relacionadas, é eliminado, a N-acetilação da cadaverina, um tipo de diamina, é especificamente reduzida (Kind ef a/. , Appl Environ Microbiol, 76:15, 5175- 5180, 2010). No entanto, foi relatado que a NCgl1469 não utilizava nem a putrescina nem a 1,3-diaminapropano como substrato. Noutras palavras, presumia-sequea NCgl1469 exercia uma atividade específica apenas sobre a

- | 3/29 cadaverina entre todas as várias diamínas. Por outro lado, sabe-se que a NCglt469 em Corynebacterim glutamicum exibe a atividade da acetilglutamato-sintase e da ornitina-acetiltransferase para produzir ornitina e arginina em alta concentração, e quando a NCgl1469 é superexpressa em Corynebacterium glutamicum, a ornitina e a arginina podem ser produzidas com alto rendimento (Patente Coreana n.º 1174267). Da mesma forma, sabe- se que a atividade de NCgl1469 é específica para o glutamato e para a cadaverina e o efeito de NCgl1469 de aumentar a produtividade da ornitina também é conhecido, mas ainda não foi possível determinar se a NCgl1469 estáassociada à produção de putrescina.

DIVULGAÇÃO PROBLEMAS TÉCNICOS

[006] Os presentes inventores determinaram que a putrescina pode ser produzida com alto rendimento pelo comprometimento da atividade da NCgli469 num microrganismo do género Corynebacterium modificado com vista a produzir putrescina, completando assim a presente invenção.

SOLUÇÃO TÉCNICA

[007] Um dos objetos da presente invenção é proporcionar um microrganismo modificado do género Corynebacterium com a capacidade de produção de putrescina aumentada pelo comprometimento da atividade da NCgl1469 relativamente à sua atividade endógena.

[008] Outro objeto da presente invenção é proporcionar um método para produzir putrescina com alto rendimento utilizando o microrganismo do género Corynebacterium.

EFEITOVANTAJOSO

[009] Na presente invenção, uma estirpe de Corynebacterium glutamicum com uma maior capacida.:e de produção de putrescina é preparada pelo comprometimento da atividade da NCgl1469 relativamente à sua atividade endógena, e a putrescina, que é amplamente utilizada na indústria, pode ser — produzidaem alta concentração por meio da mesma.

. 4/29

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[010] A Fig. 1 é um diagrama esquemático que ilustra a via biossintética da putrescina em Corynebacterium glutamicum e genes relacionados.

MELHORMODO 1011) Para atingir os objetos atrás referidos, a presente invenção proporciona um microrganismo modificado do género Corynebacterium com uma maior capacidade de produção de putrescina, no qual a atividade da proteína NCgl1469 com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ 1DNO:180ouSEQ ID NO: 20 está reduzida ou foi eliminada em comparação com a sua atividade endógena.

[012] Neste documento, o termo "proteína NCgl1469" refere-se às proteínas definidas como histona-acetiltransferase HPA2 ou acetiltransferase relacionadas em Corynebacterium glutamicum, as quais, tal como relatado sem identificação da sua função específica, acetilam o glutamato e a cadaverina (Patente Coreana n.º 10-1174267, Hwang ef al., J Ind Microbiol Biotechnol, 37:11, 1131-1136, 2010, Kind et al., Appl Environ Microbiol, 76:15, 5175-5180, 2010).

[013] A proteína NOgl1469 da presente invenção compreende a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO:18 ou SEQ ID NO:20. No entanto, não lhes está limitada, pois pode haver uma diferença na sequência de aminoácidos da proteína que exibe a referida atividade de acordo com as espécies ou estirpes microbianas. Por outras palavras, pode ser uma muteína ou uma variante sintética com uma sequência de aminoácidos que compreende a substituição, deleção, inserção ou adição de um ou vários aminoácidos em um ou mais locais das sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 20, desde que contribua para aumentar a produtividade da putrescina através do comprometimento da atividade da proteína como proposto na presente invenção. Neste documento, "vários" podem ser diferentes dependendo da localização ou tipo dos resíduos de aminoácidos na estrutura

. 5/29 tridimensional da proteina, mas especificamente significa de 2 a 20, de preferência de 2 a 10, e mais de preferência de 2 a 5. Além disso, os eventos de substituição, deleção, inserção, adição ou inversão do aminoácido também incluem os causados por mutação natural ou por uma variante sintética quando baseados em diferenças nos microrganismos individuais ou nas espécies de microrganismos.

[014] A proteina NCgl1469 derivada da Corynebacterium glutamiícum ATCC18032 da presente invenção tem a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 18 e a proteína NCgl1469 derivada da Corynebacterium glutamicum ATCC13869, que apresenta uma homologia de 99% com a anterior sequência de aminoácidos, tem a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 20.

[015] O polinucleotídeo codificante da sequência de aminoácidos na presente invenção pode compreender a sequência polinucleotídica que codifica à proteína, desde que apresente uma atividade semelhante à da proteína NCgl1469 da presente invenção, com 80% ou mais, de preferência com 90% ou mais, mais de preferência com 95% ou mais, e particularmente de preferência com 97% ou mais, de homologia com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 ou de SEQ ID NO: 20, e de maior preferência com a sequência polinucleotídica representada por SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 19, respectivamente.

[016] "Homologia" retere-se à identidade entre duas sequências de aminoácidos e pode ser determinada pelo método bem conhecido pelos peritos na especialidade, em que BLAST 2.0 é utilizado para calcular parâmetros tais comoa pontuação, a identidade e a semelhança.

[017] Além disso, a sequência polinucleotídica da presente invenção pode ser hibridada com o polinucleotídeo de SEQ ID. NO: 17 ou de SEQ ID. NO: 19 ou com a sonda preparada a partir dos mesmos, sob “condições rigorosas” pode também ser uma variante que codifica a proteína que normalmente funciona. Neste documento, o termo “condições rigorosas” refere-se às

- 6/29 condições que permitem uma particular hibridação entre os polinucleotídeos descrita especificamente, por exemplo, em Molecular Cloning (A Laboratory Manual, J. Sambrok et al., Editores, 2º Edição, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, Nova lorque, 1989) ou em Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et a/., Editores, John Wiley & Sons, Inc., Nova lorque), que descreve, por exemplo, a hibridação em tampão de hibridação a 65 ºC (3,5 x SSC, Ficoll a 6,02%, polivinilpirrolidona a 0,02%, albumina de soro bovino a 0,02%, NaH2PO4 2,5 mM (pH 7), SDS a 0,5%, EDTA 2 mM). SSC é cloreto de sódio 0,15 M/citrato de sódio 0,15 M a pH 7. Após a hibridação, a membrana para a qual o DNA foi transferido, é purificada com 2 X SSC à temperatura ambiente e depois com 0,1 a 0,5 X SSC/0,1 X SDS a uma temperatura de 68 ºC.

[018] Na presente invenção, comprometimento na atividade da NCgl1469 significa que a atividade de NCgli1469 é inferior ou foi eliminada em comparação com a sua atividade endógena. A atividade da proteína NCgl1469 pode ser reduzida por 1) uma deleção parcial ou total de um polinucleotídeo codificante da proteína, 2) redução da expressão polinucleotídica por modificação de uma sequência reguladora de expressão, 3) uma modificação da sequência polinucleotítica no cromossoma com vista a comprometer a atividade da proteína, ou 4) uma combinação dos mesmos.

[019] No método anterior, uma deleção parcial ou total de um polinucleotídeo codificante da proteína pode ser levada a cabo pela substituição cromossómica do polinucleotídeo codificante da proteína alvo endógena por um polinucleotídeo com uma deleção parcial de uma sequência —nucleotídica ou por um gene marcador, através de um vetor para a inserção de genes no cromossoma. O comprimento da deleção "parcial" varia consoante o tipo de polinucleotídeo, mas é especificamente de 2bp a 300bp, de preferência de 2bp a 100bp, e mais de preferência de 2bp a 5bp.

[020] Além disso, a redução da expressão polinucleotídica por modificação de uma sequência reguladora de expressão pode ser realizada através da

A 7/29 indução de mutações na sequência reguladora de expressão por deleção, inserção, substituição conservativa ou não conservativa da sequência nucleotídica, ou por uma sua combinação, a fim de comprometer ainda mais a atividade da sequência roguladora de expressão, ou por substituição da sequência reguladora de expressão pela sequência de atividade mais reduzida. A sequência reguladora de expressão inclui uma sequência promotora, sequência do operador, local de ligação ao ribossoma e a sequência de controlo do fim da transcrição e tradução.

[021] Além disso, a modificação da sequência polinucleotídica no cromossoma com vista a reduzir a atividade da proteína pode ser executada por indução de mutações na sequência através de deleção, inserção, substituição conservativa ou não conservativa da sequência de nucleotídeos, ou de uma sua combinação, a fim de reduzir ainda mais a atividade da sequência, ou através da substituição da sequência polinucleotídica pela sequência modificada com o fim de reduzir a atividade da proteína,

[022] Do mesmo modo, um .mirrorganismo do género Corynebacterium com uma maior capacidade de produção de putrescina de acordo com a presente invenção pode ser ainda mais modificado com vista a reduzir a atividade da ornitina-carbamoíltransferase (ArgF) envolvida na síntese de arginina à partir ornitina e a atividade da proteína (NCgl1221) envolvida na libertação de glutamato relativamente à sua atividade endógena para acumular ormitina, um precursor da putrescina, no interior da célula. Além disso, os microrganismos do género Corynebacterium podem ser modificados pela introdução adicional da atividade da ornitina-descarboxilase (ODC). Do mesmo modo, os microrganismos do género Corynebacterium podem ser mais modificados com vista a melhorar a atividade da acetilglutamato-sintase de conversão de glutamato a acetilglutamato, a atividade da ornitina- acetiltransferase (ArgJ) de conversão de acetilornitina a ornitina, a atividade da acetilglutamato-quinase —(Arg8) de conversão de acetilglutamato a acetilglutamilfosfato, a atividade da acetil-gama-glutamilfosfato-redutase (ArgC)

- l 8/29 de conversão de acetilglutamilfosfato ao semialdeído de acetilglutamato, e a atividade da acetilomitina-aminotransferase (ArgD) de conversão do semialdeído de acetilglutamato a acetilomítina, em comparação com as atividades endógenas, reforçando assim a via biossintética da ornitina, um precursor da putrescina.

[023] Neste caso, ArgF, NCgl1221, ODC, ArgC, ArgJ, ArgB e ArgD podem ter, mas não lhes estando especificamente limitadas, as sequências de aminoácidos representadas por SEQ ID. NO: 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, respectivamente, ou as sequências de aminoácidos com 80% ou mais, de preferência com 90% ou mais, mais de preferência com 95% ou mais, e de maior preferência com 97% ou mais de homologia com as mesmas.

[024] Neste documento, o termo "ornitina-descarboxilase (ODC)" refere-se a uma enzima que produz putrescina a partir de ornitina. A ODC requer piridoxalfosfato (piridoxal-s fosfato, PLP) como coenzima, está presente na maioria das bactérias Gram-negativas e em algumas das bactérias intestinais, tais como Lactobacillus das bactérias Gram-positivas. À E. coli tem dois tipos de genes que codificam a ODC, um dos quais, o speC que se expressa continuamente a uma certa concentração, e o outro, o speF, cuja expressão é induzida sob condições específicas (a presença de ornitina a um teor superior a determinadas concentrações e a um pH baixo). Dependendo da espécie, algumas espécies, como à E. coli, têm dois tipos de ODC, enquanto outras têm apenas um tipo. Espécies como Escherichia sp., Shigella sp., Citrobacter Sp., Salmonella sp., e Enterobacter sp. apresentam dois tipos de ODC (speC, sperF), e as estirpes de Yersinia Sp., Klebsiella sp., Enwinia sp., têm um tipo de —ODC (speC). No caso de Lactobacillus, a ODC é expressa num tipo de gene (speF) e é sabido que a sus expressão pode ser induzida em condições de pri baixo ou de excesso de ornitina e histidina.

[025] A atividade da ODC pode ser introduzida no microrganismo recombinante do género Corynebacterium da presente invenção utilizando genes que codificama ODC derivados de várias espécies.

: 0-9

[026] O polinucleotídeo que codifica a ODC pode incluir, mas não lhes estando limitado, o polinucleotídeo codificante da proteína que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 da sequência de aminoácidos com 70% ou mais, de preferência com 80% ou mais, de mais preferência com 90% oumaisde homologia com à mesma.

[027] Além disso, a inserção da atividade ornitina-descarboxilase (ODC) nos microrganismos pode ser realizada por vários métodos conhecidos na arte como, por exemplo, o método de inserção cromossómica de um polinucleotídeo consistindo numa sequência nucleotídica codificante da ODC, o método de inserção deste polinucleotídeo num microrganismo utilizando o sistema do vetor, o método para inserir o polinucleotídeo que consiste numa sequência nucleotídica que codifica a ODC e o promotor com atividade melhorada ou a modificação da região superior da sequência nucleotídica codificante da ODC, e o método para inserir um polinucleotídeo no qua! foi introduzida a mutação da sequência nucleotídica codificante da ODC, e mais preferivelmente, se a sequência nucleotídica codificante da ODC tiver sido introduzida, a utilização do conhecido promotor de CJ7 para controlar a expressão da mesma.

[028] Além disso, o aumento na atividade de ArgC, ArgJ, ArgB e ArgD pode ser conseguido por 1) um aumento no número de cópias do polinucleotídeo que codifica a enzima, 2) uma modificação da sequência reguladora de expressão a fim de aumentar a expressão polinucleotídica, 3) uma modificação da sequência polinucleotídica no cromossoma para melhorar a atividade da enzima ou 4) uma combinação dos mesmos.

[029] No método 1), o aumento do número de cópias do polinucleotídeo que codifica a enzima pode ser conseguido ligando funcionalmente o polinucleotídeo ao vetor ou inserindo o mesmo nos cromossomas da célula hospedeira. Mais especificamente, o número de cópias do polinucleotídeo na célula hospedeira pode ser aumentado pela introdução de um vetor capaz de replicar e funcionar independentemente, ao qual o polinucleotídeo que codifica a enzima da presente invenção está funcionalmente ligado, ou pela introdução de um vetor capaz de inserir o polinucleotídeo nos cromossomas da célula hospedeira ao qual o polinucleotídeo está funcionalmente ligado.

[030] Neste documento, o termo “vetor” refere-se à construção de DNA constituída pela sequência nucleotídica do polinucleotídeo codificante da proteína alvo funcionalmente ligada à sequência reguladora apropriada para a expressão da proteína do alvo no hospedeiro adequado. A sequência reguladora Ínclui o promotor que pode iniciar a transcrição, qualquer sequência de operador para controlar a transcrição, a sequência de codificação do apropriado local de ligação do ribossoma ao mRANA e a sequência de controlo do fim da transcrição e tradução. O vetor pode ser transfectado para um hospedeiro adequado e pode depois ser replicado, pode funcionar independentemente do genoma do hospedeiro, ou pode ser integrado no próprio genoma.

[031] Na presente invenção, pode ser utilizado, sem qualquer limitação, qualquer vetor conhecido na arte que possa ser replicado no hospedeiro. Exemplos de vetores comumente usados são plasmídeos e cosmídeos, vírus e bacteriófagos em estado natural ou recombinante. Por exemplo, pWWE15, M13, AMBL3, AMBLA, AIXII, AASHII, AAPII, At1O, At1 1, Charon4A e Charon21A podem ser utiizados como fagos ou cosmídeos e o sistema pBR, sistema pUC, sistema pBluescriptll, sisterra pGEM, sistema pTZ, sistema pCL e sistema pET podem ser utilizados como plasmídeos. O vetor utilizado na presente invenção não tem qualquer limitação especial e conhecidos vetores de expressão podem ser usados. De preferência, os vetores pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, puUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC podem ser usados. Mais de preferência, são utilizados os vetores pACYC177, pCL, pCC1BAC.

[032] Além disso, o vetor que pode inserir o polinucleotídeo codificante da proteína alvo através da sua transformação numa célula hospedeira pode preferivelmente ser, por exemplo, mas não lhe estando limitado, o vetor transportador pECCG112 (Publicação de Patente Coreana n.º 1992-0000933),

” 11/29 que é capaz de reproduzir-se por si próprio em bactérias E. coli e Coryneform.

[033] Além disso, o polinucleotídeo que codifica a proteína alvo no cromossoma pode ser substituído por um novo polinucieotídeo utilizando um vetor para à inserção de genes num cromossoma. A inserção cromossómica do polinucleotídeo pode ser realizada por qualquer método conhecido na arte, por exemplo, por recombinação homóloga. Uma vez que o vetor da presente invenção pode ser inserido no cromossoma por indução de uma recombinação homóloga, o marcador de seleção pode ser adicionalmente incluído para confirmar a inserção bem sucedida do gene no cromossoma. O marcador de seleção serve para avaliar que células foram transformadas com o vetor, ou seja, para determinar se o polinucleotídeo alvo foi inserido. Podem ser utilizados marcadores que proporcionam fenótipos selecionáveis como a resistência a drogas, a auxotrofia, a resistência a agentes tóxicos ou a expressão de proteínas de superfície. Num ambiente tratado com um agente seletivo, apenas as células que expressam o marcador de seleção podem sobreviver ou as células com um fenótipo diferente estarão presentes e, consequentemente, as células transformadas com êxito podem ser selecionadas por esse método.

[034] Como aqui empregue, o termo "transfeção" refere-se à introdução do vetor compreendendo um polinucleotídeo codificante da proteína alvo na célula hospedeira para que a proteína codificada pelo polinucleotídeo possa ser expressa. O polinucleotídeo transfectado inclui todos os polinucleotídeos que codificam proteínas alvo que podem ser expressas na célula hospedeira independentemente do local de inserção, ou Seja, se é inserido nos cromossomas da célula hospedeira ou fora dos cromossomas. Além disso, o polinucleotídeo incluí também o DNA e o RNA codificantes da proteína alvo. O polinucleotídeo pode ser introduzido sob qualquer forma, desde que possa ser inserido na célula hospedeira e expresso. Por exemplo, o polinucleotídeo pode ser introduzido numa célula hospedeira sob a forma de uma cassete de expressão, que é uma construção genética constituída por todos os elementos

- 12/29 necessários para autoexpressão. A cassete de expressão normalmente inclui um promotor funcionalmente ligado ao polinucleotídeo, sinal do fim da transcrição, local de ligação ao ribossoma e sinal do fim de tradução. A cassete de expressão pode estar na forma de vetor de expressão capaz de autorreplicação. Além disso, o polinucleotídeo pode ser introduzido na célula hospedeira na sua própria forma e funcionalmente ligado às sequências necessárias para expressão na célula hospedeira.

[035] No presente documento, o termo "funcionalmente ligado" refere-se à ligação funcional entre a sequência promotora de iniciação ou mediação da transcrição do polinucleotídeo codificante da proteína alvo e o polinucleotídeo.

[036] Além disso, o método 2) modificação da sequência reguladora de expressão a fim de aumentar a expressão do polinucleotídeo de acordo com a presente invenção pode ser realizado por indução da mutação da sequência através de deleção, inserção, substituição conservativa ou não conservativa da sequência nucleotídica ou de uma sua combinação, ou por substituição pela sequência nucleotídica cem uma atividade maior. A sequência reguladora de expressão inclui promotor, sequência do operador, sequência de codificação dos sítios de ligação ao ribossoma e sequência de controlo do fim da transcrição e tradução.

[037] Em vez dos promotores originais, um promotor heterólogo forte pode ser ligado à parte superior da unidade de expressão do polinucleotídeo e um exemplo de um promotor forte é o promotor de poj7, o promotor de IysCP1, o promotor de EF-Tu, o promotor de groEL, o promotor de aceAÃ ou aceB, etc., e mais de preferência o promotor de IysCP1 ou o promotor de pcj7 derivado Corynebacterium está funcionalmente ligado para aumentar a expressão do polinucleotídeo codificante da enzima. Neste documento, o promotor de IysCP1, que consiste num promotor melhorado através da substituição da sequência nucleotídica da região promotora do polinucleotídeo codificante da aspartato-quinase e da semialdeíido de aspartato-desidrogenase, é suficientemente forte para aumentar a atividade da correspondente enzima 5

- 18/29 vezes relativamente ao tipo selvagem, através do aumento da expressão do gene da aspartato-quinase (Publicação de Patente Internacional n.º 2009- 096689). Além disso, determinou-se que o promotor de pcj7 expressa-se em Corynebacterium ammoniagenes e em Escherichia e exibe uma forte atividade promotora, ao pesquisar a região com uma sequência promotora forte de Corynebacterium ammoniagenese, e pode também expressar-se em Corynebacterium glutamicum a um nível elevado (Patente Coreana nº 0620092).

[038] Além disso, o método 3) modificação da sequência polinucleotídica no cromossoma que codifica a enzima de acordo com a presente invenção pode ser levada a cabo por indução da mutação da sequência através de deleção, inserção, substituição conservativa ou não conservativa da sequência nucleotídica ou de uma sua combinação para aumentar a atividade da sequência, ou pela substituição da sequência nucleotídica com uma atividade maior.

[039] O microrganismo na presente invenção, que consiste num microrganismo com um maior capacidade de produção de putrescina, inclui microrganismos procariotas nos quais se expressa a proteína com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO; 20, e podem ser, por exemplo, os microrganismos Escherichia sp., Shigella Sp., Citrobacter Sp., Salmonella sp., Enterobacter sp., Yersínia sSp., Klebsiella Sp., Enwinia sp., Corynebacterium sp., Brevibacterium Sp., Lactobacillus sp., Silenomanas Sp., e Vibrio sp.

[040] O microrganismo da presente invenção é preferencialmente o microrganismo do género Corynebacterium, e mais de preferência de Corynebacterium glutamicum.

[041] Num exemplo da presente invenção, mutou-se o microrganismo do género Corynebacterium com o número de acesso KCCM11138P (Publicação de Patente Coreana n.º 2012-0064046), que tem à capacidade de produzir putrescina em alta concentração através de uma via de geração de putrescina

” 14/29 melhorada. Especificamente, a estirpe produtora de putrescina KCCM11138P é a estirpe de sobreprodução de putrescina, na qual o gene codificante da ornitina- carbamoíliransferase (ArgF) para a acumulação de ornitina e o gene codificante do exportador de glutamato (NCgl1221) para o aumento do glutamato intracelular são eliminados das estirpes de ATCC13032, enquanto o gene codificante da ornitina-descarboxilase (speC) é introduzido e o nível de expressão dos genes de biossíntese de ornitina (argCJBD) é aumentado.

[042] Noutro exemplo da presente invenção, foi mutada a estirpe produtora de putrescina DAB12-a de Corynebacterium glutamicum ATCCISB69, baseada no mesmo genótipo que KCCM11138P, mais especificamente, a estirpe produtora de putrescina DAB1I2 consistindo da estirpe ATOC13869 obtida da American Type Culture Collection (ATCC), em que o gene codificante da ornitina-carbamoíltransferase (ArgF) e o gene codificante da proteína NCgl1221 de libertação de glutamato foram eliminados, ogene (speC) codificante da ornitina-descarboxilase (ODC) derivado de E. coli foi introduzido, e o promotor do gene do operão de biossíntese da ornitina (argCJBD) foi substituído pelo promotor melhorado.

[043] Num exemplo da presente invenção, uma estirpe de Corynebacteríum glutamicum com uma maior capacidade de produção de putrescina foi preparada através do comprometimento ou remoção da atividade da proteína NCgl1469 representada por SEQ ID NO: 18 no microrganismo Corynebacteriumgalutamicum KCCM1138P (Publicação de Patente Coreana n.º 2012-0064046), em que a maior capacidade de produção de putrescina em alta concentração foi obtida pela deleção de argrF e NOgl1221, introdução de speC eaumentode argCJBD (consulte a Figura 1).

[044] A estirpe com a atividade da proteina NOgl1469 eliminada foi denominada Corynebacterium glutamicum CC01-0163, depositada no Korean Culture Center of Microorganisms (doravante referido como “KCCM”) com o número de acesso KCCM11240P, em 26 de dezembro de 2011. O resultado da cultura da estirpe mostrou que não há produção de N-acetilputrescina, que a o 15/29 produtividade da putrescina aumenta com um nível de melhoria semelhante ao nível de N-acetilputrescina não produzida e, portanto, a NCgl1469 apresenta atividade de acetilação de putrescina.

[045] Do mesmo modo, preparou-se a estirpe DAB12-aANCgl1469 de Corynebacterium glutamicum com uma maior capacidade de produção de putrescina pela eliminação da atividade da proteína NCgl1469 representada por SEQ ID NO: 20 na estirpe produtora de putrescina DAB12-a e o resultado da cultura da estirpe mostrou que não havia produção de N-acetilputrescina enquanto a produtividade de putrescina aumentava.

[046] Por outro lado, a presente invenção refere-se ao método de produção de putrescina que compreende a cultura do microrganismo do género Corynebacterium com uma maior capacidade de produção de putrescina, em que a atividade da proteína NCgl1469 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 ou de SEQ ID NO: 20 foi comprometida; e a separação da putrescina da cultura obtida.

[047] O processo de cultura da presente invenção pode ser conduzido em condições e meio de cultura apropriados conhecidos na arte. Os peritos na especialidade podem facilmente ajustar e utilizar o processo de cultura de acordo com as estirpes selecionadas. Exemplos do processo de cultura incluem processos descontínuos. contínuos e semicontínuos, mas não estão limitados aos mesmos. O meio de cultura utilizado deve satisfazer adequadamente as exigências de uma específica estirpe.

[048] O meio de cultura utilizado deve satisfazer adequadamente as exigências das específicas estirpes. São conhecidos meios de cultura específicos para vários microrganismos (por exemplo, "Manual of Methods for General Bacteriology" da American Society for Bacteriology (Washington D.C., EUA, 1981)). Como fonte de carbono do meio, açúcar e hidratos de carbono (por exemplo, glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, melaço, amido e celulose), manteiga e gorduras (por exemplo, óleo de soja, óleo de sementes de girassol, óleo de amendoim e óleo de coco), ácidos gordos (por exemplo,

o 16/29 ácido palmítico, ácido esteárico e ácido linoleico), álcool (por exemplo, glicerol e etanol) e ácido orgânico (por exemplo, ácido acético), etc., podem ser utilizados. Estas substâncias podem ser usadas individualmente ou misturadas. Como fonte de azoto, compostos orgânicos contendo azoto (por exemplo, peptona, extrato de levedura, extrato de carne, extrato de maite, água de maceração de milho, pó de farinha de soja e ureia), ou compostos inorgânicos (por exemplo, sulfato de amónio, cloreto de amónio, fosfato de amónio, carbonato de amónio e nitrato de amónio) podem ser usados, e estas substâncias também podem ser usadas individualmente ou misturadas. Como fonte de fósforo, fosfato monopotássico, fosfato dipotássico ou o correspondente sal de sódio podem ser usados. Além disso, o meio de cultura pode incluir sais metálicos (por exemplo, sulfato de magnésio ou sulfato de ferro) essenciais para o crescimento, e, por fim, pode recorrer-se a substâncias promotoras de crescimento essenciais como aminoácidos e vitaminas, além das substâncias supracitadas. Para além do meio de cultura, pode adicionar-se o precursor apropriado. As substâncias nutrientes podem ser acrescentadas à cultura de uma só vez ou podem ser adicionadas adequadamente durante a cultura.

[049] O pH da cultura pode ser ajustado pelo uso apropriado de um composto básico (por exemplo, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio ou amónia aquosa) ou de um composto ácido (por exemplo, ácido fosfórico ou ácido sulfúrico). A formação de espuma pode ser controlada por um agente espumante tal como ésteres poliglicólicos de ácidos gordos. Condições aeróbias podem ser mantidas pela introdução na cultura de oxigénio ou de misturas de gases compostas por oxigénio, por exemplo, ar. A temperatura da cultura é normalmente de 20 a 45 ºC, de preferência de 25 a 40 ºC, A cultura continua até a geração de putrescina atingir o máximo desejado. Esta meta é normalmente alcançada após 10 a 160 horas. A putrescina pode ser libertada para o meio de cultura, ou pode ser contida na célula.

[050] No método de ;=colha da putrescina produzida no processo de

- 17/29 cultura da presente invenção, o produto desejado pode ser recolhido do meio de cultura pelo método conhecido na arte apropriado ao processo de cultura, por exemplo, descontínuo, cóntínuo ou semicontínuo.

MODO DA INVENÇÃO

[051] A seguir, a presente invenção será descrita mais detalhadamente com referência a exemplos. No entanto, estes exemplos são apenas para fins ilustrativos e não devem ser considerados como limitativos do âmbito de aplicação da invenção. Exemplo 1: Estirpe com a atividade de NCgl1469 removida Exemplo 1-4: Preparação de uma estirpe com NCgl1469 eliminado a partir da estirpe produtora de putrescina ATCC13032

[052] Com vista a bloquear a via de síntese de N-acetilputrescina a partir de putrescina na célula, uma estirpe mutante com o gene codificante de NCgl1469 eliminado foi preparada a partir de um microrganismo do género Corynebactetrrm com. ,. a capacidade de produzir putrescina (KCCM11138P(ATCC13032AargFANCgl1221P(CJ7)-argCJBDbioAD::P(CJ7)- speC(Ec)) divulgado no pedido de patente dos presentes inventores (Publicação de Patente n.º 2012-0064046), o qual foi preparado pela deleção do gene endógeno codificante da ornitina-carbamoíltransferase (ArgF) e do gene endógeno codificante do exportador de glutamato (NCgl1221) envolvido na libertação de glutamato, assim como pela inserção cromossómica do gene codificante da ornitina-descarboxilase (SpeC) derivado de um tipo selvagem de Escherichia coli W3110, e pela substituição de um promotor do grupo de genes argCJBD que codificam a enzima envolvida na síntese de ornitina a partir de glutamato na estirpe de Corynebacterium glutamícum do tipo selvagem ATCC13032.

[053] Especificamente. NCg!1469-del-F1 BamHIl e NCgl1469-del-R1 Sall foram preparados como iniciadores para se obter um fragmento de recombinação homóloga do domínio N-terminal de NCgl1469, e NCgl1469-del- F2 Salle NCgli469-del-R2 Xbal foram preparados como iniciadores para se

- 18/29 obter um fragmento de recombinação homóloga do domínio C-terminal de NCgl1469 a partir da sequência nucleotídica do gene NCgl1469 da estirpe ATCC13032 ID (SEQ. NO: 17) (Tabela 1). [Tabela 1] Iniciadores para obtenção da estirpe com NCgl1469 eliminado a partir de ATCC13032

CGGGATCCAACCTTCAGAAC NCgl1469-del-F1 BamH1 (SEQ ID NO: 1) | GCGAATAÇ

CGCGTCGACTTGGCACTGTG NCgl1469-del-R1 Sall (SEQ ID NO: 2) ATTACCATC

CGCGTCGACTTGGGTTATATC NCgl1469-del-F2 Sall (SEQ ID NO: 3) CCCTCAGA

TGCTCTAGATAGTGAGCCAAG NCgl1469-del-R2 Xbal (SEQ ID NO: 4) ACATGGAA

[054] Com vista à obtenção do fragmento N-terminal e do fragmento C- terminal do gene NCgl1469, realizou-se uma PCR utilizando um conjunto de iniciadores (NCgl1469-del-F1 BamHI & NCgl1469-del-Rt Sall e NCgl1469-del- F2 Sall & NCgII469-del-R2 Xbal) e como molde o cromossoma da estirpe ATCC13032. A reação de PCR foi realizada com 30 ciclos de desnaturação a 95 ºC por 30 segundos, hibridação à 53 ºC por 30 segundos, e extensão a 72 ºC por 30 segundos.

[055] Após submeter os produtos de PCR a eletroforese em gel de agarose a 0,8%, uma banda de DNA do tamanho desejado foi isolada e purificada. A seguir, o produto do PCR do domínio N-terminal e o produto do PCR do domínio C-terminal foram tratados com BamHI & Sall e Sall & Xbal, respectivamente, e foram clonados no vetor pDZ tratado com BamHlI & Xbal. O plasmídeo resultante para ser usado na deleção de NCgl1469 foi designado pDZ-NCgl1469 (K/O).

[056] A fim de se obter a estirpe KCCM11138PANCgI1469, o vetor pDZ-

- 19/29 NCgl1469(K/O0) atrás preparado foi introduzido na estirpe KCCM11138P por eletroporação e plaqueado numa placa com meio BHIS (infusão de cérebro e coração a 37 g/L, sorbitol a 91 g/L e ágar a 2% por 1 L) contendo canamicina (25 ug/mL).

[057] A inserção bem sucedida do vetor no cromossoma foi confirmada por observação da cor azul no meio sólido contendo 5-bromo-4-cloro-3-indolil- B-D-galactósido (X-gal). As estirpes de sobrecruzamento (crossover) simples foram cultivadas sob vibração num meio nutritivo (30 ºC, 8 horas), e cada uma delas foi diluída sequencialmente de 10* a 107º e plaqueada num meio sólido contendo X-Gal. Enquaniu a maioria das colónias apresentava-se como colónias azuis, uma baixa proporção de colónias apresentava-se como colónias brancas e ao selecionar as colónias brancas, as estirpes com o gene NCgl1469 eliminado de sobrecruzamento duplo foram selecionadas. Uma eliminação bem sucedida do gene da estirpe foi confirmada por PCR utilizando os iniciadores NCgli469-del-Fi BamHI e NCgli469-del-R2 Xbal. A estirpe confirmada por PCR foi designada KCCM11138PANCgl1469.

Exemplo 1-2. Preparação da estirpe com NCgl1469 eliminado a partir da estirpe produtora de putrescina ATCC13869

[058] Com o mesmo método utilizado na preparação da estirpe produtora de putresciha KCCM111388p a partir da Corynebacterium glutamicum ATCC13032, outra estirpe produtora de putrescina foi preparada no presente exemplo a partir da Corynsbactenum glutamicum ATCC13869, pela deleção do gene endógeno codificante da ornitina-carbamoíltransferase (ArgF) e do gene endógeno codificante do exportador de glutamato (NCgl1221) envolvido na libertação de glutamato, pela inserção cromossómica do gene codificante da ornitina-descarboxilase (SpeC) derivado da E. coli W3110 do tipo selvagem, e pela substituição do promotor do grupo de genes argCJBD de codificação da enzima envolvida na síntese de ornitina a partir de glutamato. A estirpe produtora de putrescina preparada foi designada DAB12-a (estirpe de argF eliminado, NCgl1221 eliminado, E. coli speC inserido, e promotor do operão arg

” 20/29 substituído), e as estirpes com NCgl1469 eliminado foram preparadas a partir da mesma.

[059] Mais especificamente, para se identificar o gene codificante de NCgl1469 derivado de Corynebacterium glutamicum ATCC1I3869 e a sequência de aminoácidos da correspondente proteína expressa, uma reação de PCR foi realizada utilizando DNA genómico de Corynebacterium glutamícum ATCC13869 como molde º um conjunto de iniciadores, SEQ ID NO: 56 6 (NCgl1469-F e NCgl1469-R) (Tabela 2). Neste caso, a reação de PCR foi realizada com 30 ciclos de desnaturação a 95 *C por 30 segundos, hibridação aS3ºC por3o segundos, e extensão a 72 “C por 30 segundos. Os produtos de PCR foram separados por eletroforese e as suas sequências foram analisadas. Através da análise de sequências, determinou-se que o gene codificante de NCgl1469 derivado da Corynebacterium glutamicum ATCC13869 compreende uma sequência nucleotídica representada por SEQ ID NO: 19 e a proteína codificada compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 20. Quando as sequências de aminoácidos de NCgl1469 derivado de Corynebacterium glutamíicum ATCC1I3032 e de NCgli469 derivado de Corynebacterium glutamicum ATCC13869 foram comparadas, apresentavam uma homologia de sequências de 59%.

[Tabela2] Iniciador para identificar o gene codificante de NCgli469 derivado de ATCC13869

[060] Com vista a eliminar o gene codificante de NCgl1469 derivado de Corynebacterium glutamicum ATCC1I3869, preparou-se um plasmídeo designado pDZ-2'NCglt469(K/O). Primeiro, o domínio N-terminal e o domínio C-terminal do gene NCgl1469 foram amplificados por PCR utilizando DNA genómico de Corynebacterium glutamicum ATCC13869 como molde e dois pares de iniciadores listados na Tabela 3 conforme descrito no Exemplo <1-1>, Em seguida, os produtos de PCR dos domínios N-terminal e C-terminal foram digeridos com as enzimas de restrição BamHI & Sail e Sall & Xbal respectivamente e foram clonados no vetor pDZ digerido com BamHlI & Xbal, gerando assim o plasmídeo pDZ-2'NCgl1469(K/O). [Tabela 3] Iniciadores para a produção da estirpe com NCgl1469 eliminado a partir de ATCC13869 2'NCgl1469-del-F1 BamHI (SEQ ID NO: 7) CEGGATCCGTGEGCTGCCAGGAATGGCTCC NCgl1469-del-H1-SAII (SEQ ID NO:2) CGCETCGACTTGGCACTGTGATTACCATC NCgl1469-del-F2 Sall (SEQ ID NO: 3) CGCGTCGACTTGGGTTATATCCCCTCAGA 2'NCgl1469-del-R2 Xbal (SEQ 1D NO: 8) TGCTCTAGACCCAAAACATCCTGGCEGEGC

[061] O plasmídeo pDZ-2'NCgl1469(K/O) foi transfectado para DAB12-a de Corynebacterium glutamicum do mesmo modo que no Exemplo <1-1> e foi selecionada à estirpe da qual o gene codificante de NCgl1469 foi eliminado. A estirpe mutante de Corynebacterium glutamicum foi denominada DAB12- umMANCgl1469, Exemplo 2: A estirpe com a atividade de NCgI1469 comprometida

[062] A fim de comprometer a via de síntese de N-acetilputrescina a partir de putrescina num microrganismo do género Corynebacterium KCCM11138P com capacidade de produção de putrescina (Publicação de Patente Coreana n. º 2012-0064046), uma estirpe com substituição de um codão de iniciação de NCgl1469 foi preparada.

[063] Mais especificamente, com base na sequência nucleotídica de NCgl1469 derivado da estirpe ATCC13032, um conjunto de iniciadores,

i 22/29 NCgl1469-gta-F1 e NCgli469-gtg-R1, foi preparado para se obter um fragmento de recombinação homólogo do domínio N-terminal de NCgl1469 e um outro conjunto de iniciadores, NCgl1469-gtga-F2 e NCgl1469-gtg-R2, foi preparado para se obter um fragmento de recombinação homóloga do domínio Cdterminal de NCgl1469 (Tabela 4). O local onde o fragmento N-terminal e o fragmento C-terminal são combinados foi concebido de modo que um codão de iniciação de NCgl1469, ATG, fosse substituído por GTG. [Tabela 4] Iniciador para produzir uma estirpe com substituição do codão de iniciação em NCgli469 NCgl1469-gta-F1 — (SEQ ID NO: 9) CGGGATCCTGGATTGTATACTGCGACCAC NCgl1469-gtg-Ri —(SEQ ID NO: 10) : CARAACGGTGGGACTCACGGATACCAGAATAGC NCgli469-9tg-F2 —(SEQ ID NO: 11) GCTATTCTGGTATCCGTGAGTCCCACCGTTTTG NCgli469-gtg-R2 — (SEQ ID NO: 12) TGCTCTAGATTAAACAGTTGGCATCGCTGG

[064] Com vista à obtenção do fragmento N-terminal e o fragmento C- terminal do gene NCgl1469 da estirpe ATCC13032, realizou-se uma reação de PCR utilizando dois conjuntos de iniciadores (F1-gtg-NCgl1469 & NCgl1469- gtga-R1 e NCgl1469-gtg-F2 & NCgl1469-gta-R2) e o cromossoma da estirpe ATCCISO32 como molde, A reação de PCR foi realizada com 30 ciclos de desnaturação à 95 ºC por 40 segundos, hibridação a 52 ºC durante 40 segundos e extensão a 72 “C por 30 segundos, utilizando uma polimerase pfu (Stratagene).

[065] Após realização de electroforese dos produtos PCR em gel de agarose à 0,8%, uma banda de DNA do tamanho desejado foi isolada e purificada. Em seguida, os produtos de PCR do domínio N-terminal e do

. 23/29 domínio C-terminal do gene NCgl1469 da estirpe ATOC13032 foram clonados por fusão num vetor pDZ digerido com BamH!I & Xbal. Para a clonagem por fusão, utilizou-se o kit de clonagem In-Fusion HD (Clontech). O plasmídeo preparado para ser utilizado na substituição do codão de iniciação de —NCgli469foidenominado pDZ-NCgl1469 (gtg).

[066] Com vista à obtenção da estirpe KCCM11138P NCgli469(gtg), o vetor preparado pDZ-NCgl1469(gta) foi introduzido na estirpe KCCM11138P por eletroporação e as células transformadas foram plaqueadas numa placa com meio BHIS (infusão de cérebro e coração a 37 g/L, sorbitol a 91 g/L, ágar a2%, basede1L) contendo canamícina (25 ug/ml). A inserção bem sucedida do vetor no cromossoma da estirpe foi confirmada pela observação de colónias azuis no meio sólido coxnendo 5-bromo-4-cloro-3-indolil-B-D-galactósido (X- gal). As estirpes de sobrecruzamento simples foram cultivadas sob vibração num meio nutritivo (80 ºC, 8 horas), e cada uma delas foi diluída sequencialmente de 10º a 10º e plaqueada em meio sólido contendo X-Gal. Enquanto a maioria das colónias apresentava-se como colónias azuis, uma baixa proporção de colónias consistia em colónias brancas e ao selecionar as colónias brancas, as estirpes com substituição do codão de iniciação de NCgl1469 por sobrecruzamento duplo foram selecionadas. Além disso, a sequência das estirpes selecionadas foi confirmada por PCR usando um conjunto de iniciadores, NCgl1469-del-F1 BamHI e NCgl1469-del-R2 Xbal. A estirpe confirmada foi designada KCCOM11138P NCgl1469(gtg). Exemplo 3: A estirpe com uma maior atividade de NCgl1469

[067] Tendo em conta que produtividade da ornitina é mais elevada numa estirpe mutante da estirpe Corynebacterium glutamicum produtora de ornitina com maior atividade de NCgl1469 (Hwang et al., J Ind Microbio! Biotechnol, 87:11, 1181-1136, 2010), um polinucleotídeo codificante de NCgl 1469 foi introduzido na forma de plasmídeo ou sob outra forma adequada à inserção no cromossoma com vista a aumentar a produtividade de ornitina, e oseu&efeitofoianalisado,

Exemplo 3-1: Clonagem do gene codificante de NCgI1469 e preparação de um transformante com o mesmo

[068] A fim de confirmar o efeito do aumento do número de cópias do gene NCgl1469 (incluindo uma região promotora) na produção elevada de omitina e putrescina, uma estirpe mutante foi gerada pela introdução de NCgl1469 na forma de plasmídeo na estirpe KCCM11138P descrita no exemplo 1.

[069] Mais especificamente, um polinucleotídeo codificante de NCgl1469 foi amplificado por PCR usando o gene NCgl1469 da estirpe ATOC 13032 como molde ecos iniciadores NCgl1469-300-F Kpnl e NCgl1469-R Xbal sob as mesmas condições que no Exemplo 1. Por PCR, obteve-se um fragmento de gene com um tamanho de cerca de 900 bp (Tabela 5). [Tabela 5] Iniciador para obtenção do gene NCgl1469 NCgl1469-3800-F Kpnl (SEQ ID NO: 13) CGGEGGTACCTTCCAACGCTGCTCGGATGAC NCgli469-R Xbal (SEQ |D NO: 14) TGCTCTAGATTAAACAGTTGGCATCGCTGG

[070] Os fragmentos de gene obtidos foram digeridos com as enzimas de restrição Kpnl e Xbal e clonados num vetor pHC139T-gfp que foi tratado com as mesmas enzimas de restrição (Patente Coreana n.º 620092), obtendo-se deste modo o vetor de expressão pHC139T-NCgl1469.

[071] O vetor pHC139T-NCgl1469 assim preparado foi introduzido na estipe KCCM11138P produtora de putrescina com vista a aumentar a produtividade de ornitina e de putrescina numa estirpe. O vetor foi introduzido na estirpe por eletroporação, as células transformadas foram plaqueadas numa placa com meio BHIS contendo 25 ug/ml de canamicina e os transformantes bem sucedidos foram selecionados. A estirpe selecionada foi denominada KCOM111838P/pHC139T-NCgl1469.

. 25/29 Exemplo 3-2: A estirpe mutante com inserção cromossómica do gene codificante de NCgl1469

[1072] Para confirmar o efeito da adicional inserção cromossómica do gene NCgl1469 (incluindo uma região promotora) na produção elevada de ornitina e putrescina, uma estirpe mutante foi gerada pela introdução de NCgl1469 nos cromossomas de KCCM11138P como descrito no Exemplo 1.

[073] Um vetor pDZTn para transformação (Publicação Coreana n.º 2008- 0033054), que permite a inserção cromossómica de um gene por meio de localização do gene transposão em microrganismos do género Corynebacterium, foi desenvolvido pelos presentes inventores e pode ser usado de modo idêntico ao utilizado na introdução de genes por meio do vetor PpDZ.

[074] Um fragmento de gene de NCgl1469 com um tamanho de cerca de 900 bp foi obtido por PCR utilizando o gene NCgl1469 da estirpe ATCC130382 como molde e o conjunto de iniciadores NCgl1469-300-F Spel e NCgl1469- R Xhol (Tabela 6). [Tabela 6] Iniciador || para obtenção do gene NCgl1469 NCg!1469-800- NO F Spel Th (SEQ TGTCGGGCCCACTAGTTTCCAACGCTGCTCGGATGAC ID NO: 15) NCgl1469- R Xhol Tn GAATGAGTTCCTCGAGTTAAACAGTTGGCATCGC (SEQ ID NO: 16)

[075] A reação de PCR foi realizada com 30 ciclos de desnaturação a 95 ºC por40 segundos, hibridação a 52 ºC por 40 segundos e extensão a 72 “C por 60 segundos, usando uma polimerase pfu (Stratagene). Após electroforese dos produtos de PCR em gel de agarose 0,8%, uma banda de DNA do tamanho desejado foi isolada e purificada. O fragmento de gene purificado de

: 26/29 NCgl1469 foi clonado por fusão num vetor pDZTn, que foi digerido com as enzimas de restrição Spel & Xhol. Para a clonagem por fusão, utilizou-se o kit de clonagem In-Fusion HD (Clontech). O plasmídeo preparado foi denominado PDZTnN-NCgl1469.

[076] Para se obter a estirpe KCCM11138P Tn::NCgl1469, o vetor preparado pDZ-NCgl1469 foi introduzido na estirpe KCCM11138P por eletroporação e as células transformadas foram plaqueadas numa placa com meio BHIS contendo canamicina (25 ug/m!). A inserção bem sucedida do vetor nos cromossomas foi confirmada pelo método descrito no Exemplo 1 e, consequentemente, selecionou-se a estirpe na qual o gene NCgl1469 foi inserido na posição do gene transposão t. Além disso, a sequência da estirpe mutante foi confirmada por PCR utilizando o conjunto de iniciadores NCgl1469- 300-F Spel Tn e NCgl1469-R Xhol Tn. A estirpe confirmada foi designada KCOM11188P Tn::NCgl1469.

Exemplo4: Comparação da capacidade de produção de putrescina

[077] A fim de investigar o, feitos causados pela deleção do gene NCgl1469, avaliou-se a substituição do codão de iniciação, a melhoria no nível de expressão e a inserção cromossómica do gene, bem como a capacidade das estirpes preparadas anteriormente para produzir putrescina.

[078] Mais especificamente, as estirpes preparadas foram cultivadas numa placa com meio CM contendo arginina 1 MM (glicose a 1%, polipeptona a 1%, extrato de levedura a 0,5%, extrato de came a 0,5%, NaCl a 0,25%, ureia a 0,2%, 100 ul de NaOH a 50%, ágar a 2%, pH 6,8, por 1 L) a 30 ºC por 16 horas. A seguir, uma ansa de inoculação com cultura de células foi inoculada em2s5 mldo meio de titulação da Tabela 7 e a cultura foi conduzida sob agitação a 200 rpm e a 30 ºC, durante 96 horas. Todas as estirpes preparadas foram cultivadas com a adição de arginina 1 MM ao meio durante a fermentação. .

[Tabela 7]

" 27/29 Proteína de soja 0,25% Sólidos de maceração do milho | 0,50% KH;PO, MgSOs.7H25O 0,05% Biotina 100 pg Cloridrato ve tiamina 3000 ug Cálcio-Ácido Pantoténico 3000 ug

[079] Como se pode ver pelos resultados da Tabela 8, quando a função do gene NCgl1469 foi inativada por deleção do mesmo da estirpe KCOM11138P produtora de putrescina, não houve produção de N-acetilputrescina. Além disso, o nível de produção de putrescina foi 2,6 g/L superior ao do grupo controlo, demonstrando que a produtividade de putrescina aumentou na estirpe após deleção do gene NCgl1469.

[080] Além disso, quando a função do gene NCgl1469 foi comprometida pela substituição do seu codão de iniciação, o nível de produção da N- acetilputrescina, a qual é normalmente produzida num microrganismo da estirpe de KCCM11138P com a capacidade de produzir putrescina, diminuiu em tanto como cerca de 3g/L. Isto demonstra que a produtividade da N- acetilputrescina foi reduzida para metade.

[081] Semelhante ao caso de KCCM11138P, quando a função do gene NOCgl1469 foi inativada pela sua deleção da estirpe produtora de putrescina DAB12 derivada de ATOC13869, não houve produção de N-acetilputrescina, mas a produtividade da putrescina melhorou.

[082] Estes resultados mostram que a via de síntese de N-acetilputrescina a partir da putrescina ficou comprometida ou bloqueada pelo comprometimento ou eliminação do gene NCgl1469, e que a proteína expressa a partir do gene NOCgl1469 atua no sentido de acetilar a putrescina.

[083] Por outro lado, quando à atividade de NCgl1469 aumenta, a proporção de N-acetilputrescina na cultura de células é superior à do grupo controlo e, no que se refere ao aumento da atividade de NCgl1469, não se observa qualquer diferença entre a expressão do gene no plasmídeo e a adicional inserção cromossómica do gene.

[084] Quando a atividade do gene NCgl1469 foi de um modo geral reforçada na estirpe produtora de ornitina, a via de conversão de glutamato a acetilglutamato foi intensificada e a produção de ornitina aumentou (Publicação de Patente Coreana n.º 2011-0080475). No entanto, na presente invenção, a maior parte da ornitina foi convertida em putrescina e, portanto, não houve acumulação de ornitina.

[085] A diferença em relação aos resultados obtidos por um método convencional pode dever-se ao facto de a proteína expressada a partir do gene NCgl1469 reconhecer a putrescina mais facilmente do que o glutamato, e assim a produção de N-acetiltutrescina é mais elevada do que a do acetilglutamato, [Tabelas] Tipo de estirpe (LL) |[(9L) (9/L) ser e e lv mer o e e

Ú 29/29 KCCM11138P NCgl1469(gta) e 111 KCCM11138P Tn::NCgl1469 e 5,8 EN KCCM11188P / pHC139T o es 61 KCCM11138P / pHC139T-NCgl1469 o ss 9,2

[086] Os presentes inventores prepararam a estirpe de Corynebacterium glutamicum com uma maior produtividade de putrescina e sem produção de N- acetilputrescina através da deleção do gene NCgl1469 no microrganismo de GCorynebacterium sp. transformado KCCM11138P tendo a capacidade de produzir putrescina (Publicação de Patente Coreana n.º 2012-0064046) conforme descrito no Exemplo 1-1, denominaram esta estirpe Corynebacterium glutamicum CC01-01683 e depositaram-na com o número de depósito KCCM11240P no Korean Culture Center of Microorganisms (doravante designado “KCCM”), que é uma autoridade internacional de depósito de acordo como Tratado de Budapeste de 26 de dezembro de 2011.

[087] Com base nas descrições anteriores, os peritos na especialidade reconhecerão que a presenta invenção pode ser realizada noutras formas sem que haja alteração na ideia técnica ou nas características técnicas essenciais. A este respeito, os Exemplos descritos anteriormente destinam-se a ilustrar a invenção em todos os aspetos, mas não limitam o âmbito da invenção. Entende-se que o âmbito da presente invenção compreende quaisquer alterações ou formas modificadas derivadas do significado, alcance e conceito equivalente das seguintes reivindicações, em vez das anteriores descrições detalhadas.

Claims

U 1/2 REIVINDICAÇÕES

1. Microrganismo modificado do género Corynebacterium com uma maior capacidade de produção de putrescina, caracterizado por à atividade de uma proteína com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 180ouSEQID NO: 20 ter sido comprometida ou removida em comparação com a sua atividade endógena.

2. Microrganismo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a atividade da ornitina-descarboxilase (ODC) ser ainda nele introduzida.

3. Microrganismo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por aODCtera sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23.

4. Microrganismo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por as atividades de um ou mais selecionados do grupo constituído por ornitina- carbamoiltransferase (ArgF) e exportador de glutamato (NCgli221) serem ainda mais comprometidas em comparação com as suas atividades endógenas.

5. Microrganismo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por ArgF ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e NCgl1221 ter a sequência de aminoácidos ca SEU ID NO: 22.

6. Microrganismo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por as atividades de uma ou mais selecionadas do grupo constituído por acetil- gama-glutamilfosfato-redutase (ArgC), acetilglutamato-sintase ou omitina- acetiltransferase (ArgJ), acetilglutamato-quinase (ArgB) e acetilornitina- aminotransferase (ArgD) serem ainda mais aumentadas.

7. Microrganismo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por ArgC, ArgJ, ArgB e ArgD terem as sequências de aminoácidos das SEQ |D NOs: 24, 25, 26 e 27, respetivamente.

8. Microrganismo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a atividade da proteína ter sido comprometida por 1) uma deleção parcial ou total de um polinucleotídeo codificante da proteína, 2) uma redução da expressão polinucleotídica 3) uma modificação da sequência polinucleotídica

: 2/2 no cromossoma com vista a comprometer a atividade da proteína ou 4) uma sua combinação.

9. Microrganismo ú= acorão com a reivindicação 1, caracterizado por ser Corynebacterium glutamicum.

10. Método para produzir putrescina, que compreende a cultura de um microrganismo modificado do género Corynebacterium com uma maior capacidade para produzir putrescina, caracterizado por a atividade de uma proteína com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 20 ter sido comprometida ou removida em comparação com a sua atividade endógena; e separação da putrescina da cultura de células obtida,

11. Método para produzir putrescina de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por o microrganismo do género Corynebacterium ser Corynebacteríum glutamícum.

N | * argF | [| | ! | X |. Ncgi1221 L-Arginina É Se DO ——— —. a

" 1 Resumo da Patente de Invenção para! “MICRORGANISMOS

RECOMBINANTES COM UMA MELHOR PRODUTIVIDADE DE

PUTRESCINA E MÉTODO DE PRODUÇÃO DE PUTRESCINA QUE UTILIZA OS MESMOS".

A presente invenção refere-se a um microrganismo recombinante com uma maior capacidade para produzir putrescina com alto rendimento, que é gerado pelo comprometimento da atividade de NCgl1469 num microrganismo do género Corynebacterium modificado para produzir putrescina, e refere-se a um método para produzir putrescina utilizando o mesmo.

Este anexo apresenta o código de controle da listagem de sequências biológicas de que trata a Resolução INPI 228 de 11/11/2009: Código de Controle Campo 1 OD nAO Campo 2 | Menino one on 2F7D3AOEB716F4AD Outras Informações: - Nome do Arquivo: List.

Seg. - PCT.KR2012.003920 - P2286.txt - Data de Geração do Código: 09-07-2014 - Hora de Geração do Código: 19:05:32 - Código de Controle: - Campo 1: 1C8C22013686E204 - Campo 2: 2F7D3AO0EB716F4A0 Gerado pelo Sistema de Listagem de Sequências Biológicas (SisBioList) :: Versão 2.1.0