JP2023503218A - アセトヒドロキシ酸シンターゼ新規変異体及びこれを含む微生物 - Google Patents
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Abstract
本出願は、アセトヒドロキシ酸シンターゼ変異体、それをコードするポリヌクレオチド、前記変異体を含む微生物、及び前記微生物を用いたＬ－イソロイシンの生産方法に関する。【選択図】なし
Description
本出願は、アセトヒドロキシ酸シンターゼタンパク質の新規変異体、これをコードするポリヌクレオチド、前記変異体を含む微生物及び前記微生物を用いたＬ－イソロイシンの生産方法に関する。
分岐鎖アミノ酸、すなわちＬ－バリン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－イソロイシンは個体においてタンパク質を増加させる作用をし、運動時のエネルギー源として重要な役割を果たすことが知られており、医薬品、食品などに使用されている。
分岐鎖アミノ酸生産微生物として、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）と大腸菌（Escherichia coli）が代表的な微生物として用いられている。これらの微生物において、分岐鎖アミノ酸のうちＬ－イソロイシンは、他の分岐鎖アミノ酸であるＬ－バリン、Ｌ－ロイシンと主な生合成経路を共有している。Ｌ－イソロイシンの生合成経路を見ると、解糖過程(Glycolysis)で生成されるピルビン酸(pyruvate)とアスパラギン酸(Aspartate; Aspartic acid)由来のアミノ酸であるＬ－トレオニンから生成された２－ケト酪酸(2－ketobutyrate)が前駆体として用いられる。２つの前駆体からアセトヒドロキシ酸シンターゼ(acetohydroxy acid synthase、ＡＨＡＳ)という酵素の作用を通じて２－アセト－２－ヒドロキシ酢酸（2-aceto-2-hydroxyacetate）が合成された後、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ（acetohydroxy acid isomeroreductase）を介して２、３－ジヒドロキシ－３－メチル吉草酸(2,3-dihydroxy-3-methylvalerate)が生成される。その後、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ (dihydroxy acid dehydratase)を介して２－ケト－３－メチル吉草酸(2-keto-3-methylvalerate)を経てアミノトランスフェラーゼ(aminotransferase)反応により、最終的にＬ－イソロイシンが生産される。また、前記アセトヒドロキシ酸シンターゼは、ピルビン酸（pyruvate）のジカルボキシル化（decarboyxlation）と他のピルビン酸分子との縮合反応を触媒して、バリン及びロイシンの前駆体であるアセト乳酸を生成する。
生合成経路を共有する分岐鎖アミノ酸の中で、特にＬ－イソロイシンとＬ－バリンは化学構造と特性が非常に類似しており、ノルバリン(Norvaline)とアミノブチル酸(Alpha amino butyric acid、ＡＡＢＡ)などの副産物もＬ－イソロイシンと生合成経路を共有しているため、Ｌ－イソロイシンの生産が増加すると副産物も多量生成されることになる。この理由で、Ｌ－イソロイシンを高収率、高純度で生産するためには多くの精製コストが要求されるため、副産物の生成は最大に低減されながら目的産物の生成は増加した能力を有する菌株の開発が必須的である。
アセトヒドロキシ酸シンターゼ（acetohydroxy acid synthase、ＡＨＡＳ）は、分岐鎖アミノ酸の生合成経路において重要な役割を果たす酵素であって、微生物の種類に応じてｉｌｖＢＮ、ｉｌｖＧＭ、ｉｌｖＩＨ遺伝子によって暗号化され、コリネバクテリウム・グルタミカムの場合、ｉｌｖＢＮ遺伝子によって暗号化される。ｉｌｖＢＮは最終産物である分岐鎖アミノ酸のうちＬ－イソロイシンによって遺伝子発現と酵素活性が阻害されるフィードバック抑制作用を受けるため、この遺伝子の発現を最適化し酵素の活性を調節することがＬ－イソロイシンの高収率生産菌株を作るのに非常に重要であるが、これに関する先行研究は主に小さな小サブユニット(acetohydroxy acid synthase small subunit；ＩｌｖＮタンパク質)の変異によるフィードバック解除に関する研究がほとんどであり(非特許文献１、特許文献１～４)、関連研究が不足している。
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このような背景下で、本発明者らはＬ－イソロイシン生産能が増加した微生物を開発するために鋭意努力した結果、アセトヒドロキシ酸シンターゼの変異体、具体的には、大きい小サブユニット(ｉｌｖＢ)変異体を開発した。これにより、前記変異体を含む微生物からＬ－イソロイシン生産の増加を確認し、本出願を完成した。
本出願の一つの目的は、配列番号１のアミノ酸配列において１３６番目のアミノ酸であるグルタミンがグルタミン以外の他のアミノ酸に置換された、アセトヒドロキシ酸シンターゼ活性を有するタンパク質変異体を提供することにある。
本出願の他の目的は、前記タンパク質変異体をコードするポリヌクレオチド及びこれを含むベクターを提供することにある。
本出願のまた他の目的は、前記タンパク質変異体を含むＬ－イソロイシンを生産する微生物を提供することにある。
本出願のまた他の目的は、Ｌ－イソロイシンを生産する微生物を培地で培養する段階を含むＬ－イソロイシン生産方法を提供することにある。
本出願のアセトヒドロキシ酸シンターゼ変異体を含む微生物を培養する場合、高収率のＬ－イソロイシン生産が可能である。これにより、産業的な面で生産の利便性及び製造コスト削減の効果が期待できる。
以下では、本出願をさらに詳細に説明する。
一方、本出願で開示される各説明及び実施形態は、それぞれの他の説明及び実施形態にも適用されることができる。つまり、本出願で開示された様々な要素の全ての組み合わせが、本出願の範囲に属する。なお、下記の具体的な記述によって本出願のカテゴリが制限されるとは言えない。
また、当該技術分野の通常の知識を有する者は、通常の実験のみを用いて本出願に記載された本出願の特定態様に対する多数の等価物を認知したり確認することができる。さらに、このような等価物は本出願に含まれるものと意図される。
本出願の一態様は、配列番号１のアミノ酸配列において、アミノ酸配列位置１３６番目のアミノ酸がグルタミン以外の他のアミノ酸に置換されたアセトヒドロキシ酸シンターゼ活性を有するタンパク質変異体を提供する。前記アセトヒドロキシ酸シンターゼ活性を有するタンパク質変異体は、変異体タンパク質、変異型タンパク質、アセトヒドロキシ酸シンターゼ変異体、変異体アセトヒドロキシ酸シンターゼまたは変異型アセトヒドロキシ酸シンターゼなどとして混用して使用することができる。
具体的には、前記ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列において前記１３６番目のアミノ酸であるグルタミンがアスパラギン、アルギニン、フェニルアラニン、セリン、チロシン、メチオニン、システイン、プロリン、ヒスチジン、ロイシン、イソロイシン、トレオニン、リジン、バリン、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシンまたはトリプトファンに置換されたアセトヒドロキシ酸シンターゼ（acetohydroxy acid synthase、ＡＨＡＳ）活性を有するタンパク質変異体であってもよいが、これに制限されない。
本出願において、用語、「アセトヒドロキシ酸シンターゼ（acetohydroxy acid synthase、ＡＨＡＳ）」または「アセトヒドロキシ酸シンターゼ」は、分岐鎖アミノ酸の生合成に関与する酵素であり、分岐鎖アミノ酸生合成の第一段階に関与しうる。具体的には、アセトヒドロキシ酸シンターゼはピルビン酸（pyruvate）のデカルボキシル化（decarboyxlation）と他のピルビン酸分子との縮合反応を触媒し、バリンの前駆体であるアセト乳酸を生産したり、ピルビン酸のデカルボキシル化と２－ケト酪酸（2－ketobutyrate）との縮合反応を触媒してイソロイシンの前駆体であるアセトヒドロキシブチレートを生産することができる。生産されたアセトヒドロキシブチレートから出発し、アセトヒドロキシ酸イソメロリダクターゼ（acetohydroxy acid isomeroreductase）、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（dihydroxy acid dehydratase）、トランスアミナーゼＢ（transaminase B）により触媒された反応を順次に経るとＬ－イソロイシンが生合成されうる。
したがって、アセトヒドロキシ酸シンターゼは分岐鎖アミノ酸の生合成経路にとって重要な酵素である。アセトヒドロキシ酸シンターゼはｉｌｖＢ及びｉｌｖＮ、両方の遺伝子によってコードされ、ｉｌｖＢ遺伝子はアセトヒドロキシ酸シンターゼの大きい小サブユニット（large subunit；ＩｌｖＢ）を、ｉｌｖＮ遺伝子はアセトヒドロキシ酸シンターゼの小さい小サブユニット（small subunit；ＩｌｖＮ）をそれぞれコードする。
本出願の用語、「分岐鎖アミノ酸」とは、側鎖に分岐アルキル基を有するアミノ酸をいい、バリン、ロイシン及びイソロイシンを含む。具体的には、本出願において前記分岐鎖アミノ酸は、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－バリンまたはＬ－ロイシンであってもよいが、これに制限されるものではない。
本出願において、アセトヒドロキシ酸シンターゼは、コリネバクテリウム属微生物由来であってもよく、具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）由来であってもよい。コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）由来のアセトヒドロキシ酸シンターゼの大きい小サブユニットｉｌｖＢタンパク質は、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよい。前記配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質と混用して使用してもよい。
また、本出願におけるアセトヒドロキシ酸シンターゼの大きい小サブユニットｉｌｖＢタンパク質は、配列番号１のアミノ酸を含むタンパク質と定義したが、配列番号１のアミノ酸配列の前後に無意味な配列の追加または自然に発生できる突然変異、またはその潜在性突然変異（silent mutation）を除外するものではなく、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質と互いに同一または相応する活性を有する場合であれば、本願のアセトヒドロキシ酸シンターゼの大きい小サブユニットｉｌｖＢタンパク質に該当することは当業者には自明である。具体的な例として、本願のアセトヒドロキシ酸シンターゼの大きい小サブユニットｉｌｖＢタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列またはそれと８０％、９０％、９５％、９７％または９９％以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。また、このような相同性または同一性を有し、前記タンパク質に相応する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質も、本出願の変異対象になるタンパク質の範囲内に含まれるのは自明である。
すなわち、本出願において、「特定配列番号で記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質またはポリペプチド」、「特定配列番号で記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質またはポリペプチド」と記載されていても、当該配列番号のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同一または相応する活性を有する場合であれば、一部の配列が欠失、変形、置換または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質も本出願で使用できることは自明である。例えば、「配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド」は、これと同一または相応する活性を有する場合であれば、「配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド」に属しうることは自明である。
本出願で提供するアセトヒドロキシ酸シンターゼ活性を有するタンパク質変異体は、前記で説明したアセトヒドロキシ酸シンターゼ活性を有するタンパク質のうち特異的位置のアミノ酸が置換され、アセトヒドロキシ酸シンターゼ活性が変異前のタンパク質と比較して１００％超過されるか、Ｌ－イソロイシンまたはそのアナログ類似体によるフィードバック阻害が解除された変異体を意味しうる。
本出願において、用語、「変異体（variant）」は、１つ以上のアミノ酸が保存的置換（conservative substitution）及び／または変形（modification）において前記列挙された配列（the recited sequence）と異なるが、前記タンパク質の機能（functions）または特性（properties）が維持されるタンパク質を指す。変異体は、数個のアミノ酸の置換、欠失または付加によって識別される配列（identified sequence）とは相違する。そのような変異体は、一般的に前記タンパク質のアミノ酸配列のうちの１つ以上のアミノ酸を変形し、前記変形されたタンパク質の特性を評価することによって識別されうる。
つまり、変異体の能力は天然のタンパク質（native protein）に比べて増加されたり、変化してなかったり、または減少されうる。他の変異体は、成熟タンパク質（mature protein）のＮ末端及び／またはＣ末端から一部が除去された変異体を含みうる。前記用語、「変異体」は、変異型、変形、変異されたタンパク質、変異型ポリペプチド、変異などの用語（英語表現としては、modifiation, modified protein, modified polypeptide, mutant, mutein, divergent, variantなど)を用いられてもよく、変異された意味で使用される用語であれば、これに制限されない。本出願の目的上、前記変異体は天然の野生型または非変形タンパク質と比較してタンパク質の活性が増加したり、フィードバック阻害が解除されたものであってもよいが、これに制限されない。
本出願において、用語、「保存的置換（conservative substitution）」は、一つのアミノ酸を類似の構造的及び／または化学的性質を有する別のアミノ酸に置換することを意味する。このようなアミノ酸置換は一般的に残基の極性、電荷（塩基性、酸性）、溶解度、疎水性、親水性及び／または両親媒性（amphipathic nature）の類似性に基づいて発生しうる。
また、変異体はポリペプチドの特性及び二次構造に最小の影響を有するアミノ酸の欠失または付加を含んでもよい。例えば、ポリペプチドは翻訳同時（co-translationally）または翻訳後（post-translationally）のタンパク質の移行（transfer）に関与するタンパク質Ｎ末端のシグナル（またはリーダー）配列とコンジュゲートしてもよい。さらに、前記ポリペプチドはポリペプチドを確認、精製または合成できるように他の配列またはリンカーとコンジュゲートしてもよい。
前記「他のアミノ酸に置換」は、置換前のアミノ酸と異なるアミノ酸であれば制限されない。すなわち、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端から１３６番目のアミノ酸であるグルタミンがグルタミン以外の他のアミノ酸残基に置換されたものであれば制限されない。一方、本出願において「特定アミノ酸が置換された」と表現する場合、他のアミノ酸に置換されたと別に表記しなくても、置換前のアミノ酸と異なるアミノ酸に置換されることは自明である。
または、前記タンパク質変異体は配列番号１のアミノ酸配列において、Ｎ末端から１３６番目のアミノ酸が、アスパラギン（Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）、アルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）、セリン（Ｓｅｒｉｎｅ）、チロシン（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ）、メチオニン（Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）、システイン（Ｃｙｓｔｅｎｉｎｅ）、プロリン（Ｐｒｏｌｉｎｅ）、ヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ)、ロイシン(Ｌｅｕｃｉｎｅ)、イソロイシン(Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ)、トレオニン(Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ)、リジン(Ｌｙｓｉｎｅ)、バリン(Ｖａｌｉｎｅ)、アラニン(Ａｌａｎｉｎｅ)、アスパラギン酸(Ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ)、グルタミン酸(Ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ)、グリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）またはトリプトファン（Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）に置換された変異体であってもよいが、これに制限されない。
このような本出願のタンパク質変異体は、変異前タンパク質に比べて活性が強化されたアセトヒドロキシ酸シンターゼ活性を有する。
本出願の配列番号１の配列においてＮ末端から１３６番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたタンパク質変異体は、前記１３６番に相応する位置のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたタンパク質変異体を含むことは自明である。
前記配列番号１の配列において、Ｎ末端から１３６番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたタンパク質変異体は、配列番号１２、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２ 、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２または配列番号６３のうちのアミノ酸配列を含むものであってもよく、具体的には、配列番号１２、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６ 、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２及び配列番号６３のいずれか一つのアミノ酸配列で必須的に構成される（consisting essentially of）ものであってもよく、より具体的には、配列番号１２、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２及び配列番号６３のいずれか一つのアミノ酸配列からなるものであってもよいが、これに制限されない。
また、前記タンパク質変異体は、配列番号１２、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２及び配列番号６３のいずれか一つのアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸配列において、Ｎ末端から１３６番目のアミノ酸は固定され、これと８０％以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよいが、これに制限されるものではない。具体的には、本出願の前記変異型ポリペプチドは、配列番号１２、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２及び配列番号６３のいずれか一つ、及び前記配列番号１２、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１ 、配列番号６２及び配列番号６３のいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性または同一性を有するポリペプチドを含んでもよい。さらに、このような相同性または同一性を有し、前記タンパク質に相応する効能を示すアミノ酸配列であれば、１３６番のアミノ酸位置の他に一部の配列が欠失、変形、置換または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質も本出願の範囲内に含まれるのは自明である。
本出願において、用語、「相同性」または「同一性」は２つの与えられたアミノ酸配列または塩基配列に関連する程度を意味し、百分率として表してもよい。用語、相同性及び同一性はしばしば相互交換的に用いられてもよい。保存された（conserved）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列相同性または同一性は標準配列アルゴリズムによって決定され、使用されるプログラムによって確立されたデフォルトギャップペナルティが一緒に用いられてもよい。実質的に、相同性を有するか（homologous）または同一の（identical）配列は、一般的に配列全体または全長の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％または９０％に沿った中間または高い厳しい条件（stringent conditions）でハイブリッドしてもよい。ハイブリッド化は、ポリヌクレオチドでコドンの代わりに縮退コドンを含有するポリヌクレオチドも考慮される。
任意の２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が、相同性、類似性または同一性を有するかどうかは、例えば、非特許文献２と同じデフォルトのパラメータを用いて「ＦＡＳＴＡ」プログラムのような公知のコンピュータアルゴリズムを利用して決定してもよい。または、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルマンプログラム（EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite、非特許文献３）（バージョン５.０.０またはそれ以降のバージョン）で実行されるような、ニードルマン－ウンシュ（Needleman－Wunsch）アルゴリズム（非特許文献４）を用いて決定してもよい。（ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux, J., et al, Nucleic AcidsＲesearch 12: 387（1984））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403（1990）；Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994、及び[CARILLO ETA/.]（1988）SIAM J Applied Math 48: 1073を含む）。例えば、国立生物工学情報データベースセンターのＢＬＡＳＴ、またはＣｌｕｓｔａｌＷを用いて相同性、類似性または同一性を決定してもよい。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの相同性、類似性または同一性は、例えば、非特許文献５に公知されたように、例えば、非特許文献４のようなＧＡＰコンピュータプログラムを利用して配列情報を比較することによって決定してもよい。要約すると、ＧＡＰプログラムは、２つの配列のうち、より短いものからのシンボルの全体数で同様の配列されたシンボル（つまり、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を割った値として定義する。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメータは、（１）一進法の比較マトリックス（同一性のための１及び非同一性のための０の値を含有する）及び非特許文献６に開示されたように、非特許文献７の加重された比較マトリックス（またはＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックス）；（２）各ギャップのための３．０のペナルティ及び各ギャップの各記号のための追加の０．１０ペナルティ（またはギャップ開放ペナルティ１０、ギャップ延長ペナルティ０．５）；及び（３）末端ギャップのための無ペナルティを含んでもよい。
さらに、任意の２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が相同性、類似性または同一性を有するかどうかは、定義された厳しい条件下でサザン混成化実験によって配列を比較することにより確認することができ、定義される適切な混成化は当該技術分野の範囲内であり、当業者に周知の方法（例えば、J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; FM Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley＆Sons、Inc.、New York）で決定してもよい。
本出願の他の態様は、前記タンパク質変異体をコードするポリヌクレオチドを提供する。
本出願において、用語、「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド単量体（monomer）が共有結合によって長く鎖状につながったヌクレオチドの重合体（polymer）で一定の長さ以上のＤＮＡまたはＲＮＡ鎖であり、より具体的には、前記タンパク質変異型をコードするポリヌクレオチド断片を意味する。
本出願のタンパク質変異体をコードするポリヌクレオチドには、アセトヒドロキシ酸シンターゼ活性を有するタンパク質変異体をコードするポリヌクレオチド配列であれば制限なく含んでもよい。
本出願において、前記アセトヒドロキシ酸シンターゼ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする遺伝子はｉｌｖＢ遺伝子であってもよく、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）由来であってもよく、具体的には、配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列であってもよいが、これに制限されない。
本出願のタンパク質変異体をコードするポリヌクレオチドは、具体的には、配列番号１のアミノ酸配列において１３６番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたタンパク質変異体をコードするポリヌクレオチド配列であれば制限なく含んでもよい。例えば、本出願のポリヌクレオチドは、本出願のタンパク質変異体、具体的には、前記配列番号１２、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２及び配列番号６３のいずれか一つのアミノ酸配列を含むタンパク質またはそれと相同性または同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列であってもよいが、これに制限されない。前記相同性または同一性については前述の通りである。
また、前記タンパク質変異体をコードするポリヌクレオチドは、コドンの縮退性（degeneracy）によって、または前記ポリペプチドを発現しようとする生物において好ましいコドンを考慮して、ポリペプチドのアミノ酸配列を変化させない範囲内でコード領域に様々な変形を行うことができる。
さらに、前記タンパク質変異体をコードするポリヌクレオチドは、公知の遺伝子配列から調製することができるプローブ、例えば、前記ポリヌクレオチド配列の全体または一部に対する相補配列と厳しい条件下でハイブリット化できる配列番号１のアミノ酸配列の１３６番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたタンパク質変異体をコードする配列に相応する配列を含むプローブであれば、制限なく含んでもよい。
前記「厳しい条件」とは、ポリヌクレオチド間の特異的混成化を可能にする条件を意味する。これらの条件は、文献（例えば、J. Sambrook et al.,同上）に具体的に記載されている。例えば、相同性または同一性が高い遺伝子同士、４０％以上、具体的には、９０％以上、より具体的には、９５％以上、さらに具体的には、９７％以上、特に具体的には、９９％以上の相同性を有する遺伝子同士でハイブリッド化する。そして、それより相同性が低い遺伝子同士はハイブリッド化しない条件、または通常のサザンハイブリッド化の洗浄条件である６０℃、１×ＳＳＣ 、０．１％ＳＤＳ、具体的には、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より具体的には、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度で、１回、具体的には、２回～３回洗浄する条件を挙げられる。しかし、これに制限されるものではなく、その目的に応じて当業者によって適切に調節されてもよい。
混成化は、たとえ混成化の厳密度によって塩基間のミスマッチ（mismatch）が可能であっても、２つのポリヌクレオチドが相補的配列を有することを要求する。用語、「相補的」は、互いに混成化が可能であるヌクレオチド塩基間の関係を記述するために用いられる。例えば、ＤＮＡに関すると、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって、本出願は、また、実質的に類似のポリヌクレオチド配列だけでなく、全体配列に相補的な単離されたポリヌクレオチド断片を含みうる。
具体的には、相同性を有するポリヌクレオチドは、５５℃のＴｍ値で混成化段階を含む混成化条件を用い、上述した条件を用いて探知してもよい。また、前記Ｔｍ値は、６０℃、６３℃または６５℃であってもよいが、これに制限されるものではなく、その目的に応じて当業者によって適切に調節されてもよい。
ポリヌクレオチドを混成化する適切な厳密度は、ポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は当該技術分野でよく知られている（非特許文献８参照）。
本出願の他の態様は、前記タンパク質変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
本出願で用いられた用語、「ベクター」は、適合した宿主内で目的タンパク質を発現できるように、適合の調節配列に作動可能に連結された前記目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。前記調節配列は、転写を開始しうるプロモーター、このような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適合のｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び解読の終結を調節する配列を含んでもよい。ベクターは、適切な宿主細胞内に形質転換された後、宿主ゲノムとは無関係に複製されたり機能することができ、ゲノムそのものに統合されてもよい。
本出願で用いられる用語、「作動可能に連結された」というのは、本出願の目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介するようにするプロモーター配列と、前記ポリヌクレオチド配列が機能的に連結されていることを意味する。作動可能な連結は、当業界の公知の遺伝子組換え技術を利用して製造してもよく、部位特異的ＤＮＡ切断及び連結は当業界の切断及び連結酵素などを用いて製作してもよいが、これに制限されない。
本出願で用いられるベクターは、宿主細胞内で複製可能なものであれば特に限定されず、当業界に知られている任意のベクターを用いてもよい。通常用いられるベクターの例としては、天然の状態であるか、組換えされた状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとして、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、及びＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いてもよく、プラスミドベクターとして、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系及びｐＥＴ系などを用いてもよい。具体的には、ｐＤＺ、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを用いてもよい。
一例として、 細胞内の染色体挿入用ベクターを介して染色体内に目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを変異されたポリヌクレオチドに交替してもよい。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当業界で知られている任意の方法、例えば、相同組換えによって行われてもよいが、これに限定されない。前記染色体に挿入されたかどうかを確認するための選別マーカー（selection marker）をさらに含んでもよい。選別マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選別、すなわち目的核酸分子が挿入されたかどうかを確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面タンパク質の発現のような選択可能な表現型を付与するマーカーが用いられてもよい。選択剤（selective agent）が処理された環境では、選別マーカーを発現する細胞のみ生存したり他の表現形質を示すので、形質転換された細胞を選別できる。
本出願において、用語、「形質転換」は、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞内に導入して、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質が発現できるようにすることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは宿主細胞内で発現することさえできれば、宿主細胞の染色体内に挿入され位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、これらをすべて含んでもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、標的タンパク質をコードするＤＮＡ及びＲＮＡを含む。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現できるものであれば、あらゆる形態で導入されるものであっても構わない。例えば、前記ポリヌクレオチドは、それ自体で発現されるのに必要なすべての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（expression cassette）の形態で宿主細胞に導入されてもよい。前記発現カセットは、通常、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーター（promoter）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位及び翻訳終結シグナルを含んでもよい。前記発現カセットは、それ自体の複製が可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入されて、宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されたものであってもよいが、これに限定されない。前記形質転換する方法は、核酸を細胞内に導入するあらゆる方法も含まれており、宿主細胞に応じて当分野で公知のように適合した標準技術を選択して行ってもよい。例えば、電気穿孔法（electroporation）、リン酸カルシウム（Ｃａ（Ｈ２ＰＯ４）２、ＣａＨＰＯ４、またはＣａ３（ＰＯ４）２)沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、微細注入法（microinjection）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、 ＤＥＡＥデキストラン法、陽イオンリポソーム法、及び酢酸リチウムＤＭＳＯ法などがあるが、これに制限されない。
本出願の他の態様は、前記アセトヒドロキシ酸シンターゼ活性を有するタンパク質変異体を含む微生物を提供する。具体的には、前記微生物は本出願のアセトヒドロキシ酸シンターゼ活性を有するタンパク質変異体を発現するＬ－イソロイシンを生産する微生物であってもよい。
本出願において、用語、タンパク質が「発現するように／される」とは、目的のタンパク質が微生物内に導入されるか、微生物内で発現されるように変形された状態を意味する。前記目的タンパク質が微生物内に存在するタンパク質である場合、内在的または変形前に比べてその活性が強化された状態を意味する。本出願の目的上、「目的タンパク質」は、前述したアセトヒドロキシ酸シンターゼの活性を有するタンパク質の変異体であってもよい。
具体的には、「タンパク質の導入」とは、微生物が本来有していない特定タンパク質の活性を示すようになること、または当該タンパク質の内在的活性または変形前の活性に比べて向上した活性を示すようになることを意味する。例えば、特定のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが微生物内の染色体に導入されるか、特定タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターが微生物内に導入されてその活性が示されるものであってもよい。また、「活性の強化」は、微生物が有する特定タンパク質の活性がその内在的活性または変形前の活性に比べて向上したり、特定タンパク質に対するフィードバック阻害効果が解除され、その内在的活性または変形前の活性に比べて活性が阻害されなくなることを意味する。「内在的活性」とは、自然的または人為的な要因による遺伝的変異で微生物の形質が変化する場合、形質変化前の親菌株が本来有していた特定タンパク質の活性をいう。
具体的には、本出願において活性の強化は目的とするタンパク質をコードするポリヌクレオチドの細胞内にコピー数の増加、目的とするタンパク質を暗号化するポリヌクレオチドの発現調節配列に変異を導入する方法、目的とするタンパク質を暗号化するポリヌクレオチド発現調節配列を活性が協力な配列に交替する方法、染色体上の目的とするタンパク質をコードするポリヌクレオチドを活性が強化されたタンパク質変異体を暗号化するポリヌクレオチドで代替するか変異をさらに導入させれることと同じようなポリヌクレオチド配列を変形させる方法及び微生物にタンパク質変異体を導入する方法からなる群から選択されるいずれか一つ以上の方法で成ってもよいが、これに制限されない。前記目的とするタンパク質をコードするポリヌクレオチドは目的遺伝子を意味してもよい。
前記ポリヌクレオチドのコピー数の増加は、特にこれに制限されないが、ベクターに作動可能に連結された形態で行われるか、宿主細胞内の染色体内に挿入されることによって行なわれてもよい。具体的には、本出願のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結されて宿主と無関に複製及び機能しうるベクターが宿主細胞に導入されるものであってもよい。または、前記ポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主細胞内の染色体内に前記ポリヌクレオチドを挿入させうるベクターが宿主細胞の染色体内に導入されるものであってもよい。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当業界に公知の任意の方法、例えば、相同組換えによって行われてもよい。
次に、ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列を変形するのは、特にこれに制限されないが、前記発現調節配列の活性をさらに強化するように核酸配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組み合わせで配列上の変異を誘導して行うか、さらに強い活性を有する核酸配列に交替することによって行われてもよい。前記発現調節配列は、特にこれに制限されないが、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、転写及び解読の終結を調節する配列などを含んでもよい。
前記発現調節配列の活性をさらに強化するためにより強い活性を有する核酸配列に交替することは本来のプロモーターの代わりにより強力なプロモーターが連結されるものであってもよいが、これに限定されるものではない。公知の強力なプロモーターの例としては、ＣＪ１～ＣＪ７プロモーター（特許文献５）、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ｇａｐＡプロモーター、ＳＰＬ７プロモーター、ＳＰＬ１３（ｓｍ３）プロモーター（特許文献６）、Ｏ２プロモーター（特許文献７）、ｔｋｔプロモーター及びｙｃｃＡプロモーターなどがあるが、これに限定されものではない。
また、染色体上のポリヌクレオチド配列の変形は、特にこれに制限されないが、前記ポリヌクレオチド配列の活性をさらに強化するように核酸配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換、またはこれらの組み合わせで発現調節配列上の変異を誘導して行うか、より強い活性を有するように改良されたポリヌクレオチド配列に交替することによって行われてもよい。
このようなタンパク質活性の導入及び強化は、相応するタンパク質の活性または濃度が野生型または非変異微生物株におけるタンパク質の活性または濃度を基準として、一般的に最小１％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％または５００％、最大１０００％または２０００％まで増加するものであってもよいが、これに制限されるものではない。
本出願において、用語、「Ｌ－イソロイシンを生産する微生物」とは、培地中の炭素源からＬ－イソロイシンを野生型や非変型微生物と比較して過量に生産できる微生物をいう。また、前記Ｌ－イソロイシンを生産する微生物は組換え微生物であってもよい。具体的には、Ｌ－イソロイシンを生産することができれば、その種類が特に制限されないが、エンテロバクター（Enterbacter）属、エシェリキア（Escherichia）属、エルウィニア（Erwinia）属、セラチア（Serratia）属、プロビデンシア（Providencia）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属及びブレビバクテリウム（Brevibacterium）属に属する微生物であってもよい。より具体的には、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属またはエシェリキア（Escherichia）属に属する微生物であってもよい。
より具体的には、エシェリキア属（Escherichia）微生物は大腸菌（Escherichia coli）であってもよく、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属微生物はコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）であってもよいが、アセトヒドロキシ酸シンターゼ活性を有するタンパク質が導入または強化されてＬ－イソロイシン生産量を増加させうるエシェリキア属またはコリネバクテリウム属に属する微生物は制限なく含まれてもよい。
本出願においてアセトヒドロキシ酸シンターゼ活性を有するタンパク質変異体が発現されるように変形されたＬ－イソロイシンを生産する微生物の親菌株は、Ｌ－イソロイシンを生産する微生物であれば特に限定されない。Ｌ－イソロイシンを生産する微生物は天然型微生物自体または外部Ｌ－イソロイシン生産機序に関連する遺伝子が挿入されたり、内在的遺伝子の活性を強化させたり不活性化させて向上されたＬ－イソロイシン生産能を有するようになった微生物であってもよい。
本出願の他の態様は、前記アセトヒドロキシ酸シンターゼ活性を有するタンパク質変異体を発現するＬ－イソロイシンを生産する微生物を培地で培養することを含む、Ｌ－イソロイシンの生産方法に関する。
前記Ｌ－イソロイシン、配列番号１のアミノ酸配列を含むアセトヒドロキシ酸シンターゼ活性を有するタンパク質、タンパク質の発現、及び微生物については、上述した通りである。
本出願の「Ｌ－イソロイシン」は、Ｌ－イソロイシン自体の形態だけでなく、その塩形態の両方を含むことができる。
本出願において、用語、「培養」は、前記微生物を適当に調節した環境条件で生育させることを意味する。本出願の培養過程は当業界に知られている適当な培地と培養条件によって行ってもよい。このような培養過程は、選択される菌株によって当業者が容易に調整して用いてもよい。具体的には、前記培養は、回分式、連続式及び流加式であってもよいが、これに制限されるものではない。
本出願において、用語、「培地」は、前記微生物を培養するために必要とする栄養物質を主成分と混合した物質を意味し、生存及び発育に不可欠な水を含む栄養物質及び発育因子などを供給する。具体的には、本出願の微生物の培養に用いられる培地及びその他の培養条件は、通常の微生物培養に使用される培地であれば特に制限なくいずれも用いられてもよいが、本出願の微生物を適当な炭素源、窒素源、リン源、無機化合物、アミノ酸及び／またはビタミンなどを含有する通常の培地内で好気性条件下、温度、ｐＨなどを調節しながら培養することができる。
本出願において、前記炭素源としては、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトースなどの炭水化物；マンニトール、ソルビトールなどの糖アルコール、ピルビン酸、乳酸、クエン酸などの有機酸；グルタミン酸、メチオニン、リジンなどのアミノ酸などが含まれてもよい。また、澱粉加水分解物、糖蜜、ブラックストラップ糖蜜、米ぬか、キャッサバ、バガス及びトウモロコシ浸漬液などの天然の有機栄養源が用いられてもよく、具体的には、グルコース及び殺菌された前処理糖蜜（すなわち、還元糖に転換された糖蜜）などの炭水化物が用いられてもよく、その他の適正量の炭素源を制限なく多様に用いてもよい。これら炭素源は、単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよく、これに限定されるものではない。
前記窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源；グルタミン酸、メチオニン、グルタミンなどのアミノ酸、ペプトン、ＮＺ－アミン、肉類抽出物、酵母抽出物、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、カゼイン加水分解物、魚類またはその分解生成物、脱脂大豆ケーキまたはその分解生成物などの有機窒素源が用いられてもよい。これら窒素源は、単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよく、これに限定されるものではない。
前記リン源としては、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、またはそれに対応するナトリウム含有塩などが挙げられる。無機化合物としては、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化鉄、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウムなどが用いられてもよく、その他にアミノ酸、ビタミン及び／または適切な前駆体などを含んでもよい。これらの構成成分または前駆体は、培地に回分式または連続式で添加されてもよい。しかし、これに限定されるものではない。
本出願において、微生物の培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸、硫酸などの化合物を培地に適切な方法で添加して、培地のｐＨを調整してもよい。また、培養中には脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いて気泡生成を抑制してもよい。また、培地の好気状態を維持するために、培地内に酸素または酸素含有気体を注入したり、嫌気及び微好気状態を維持するために気体の注入なしにあるいは窒素、水素または二酸化炭素ガスを注入してもよいが、これに限定されるものではない。
培地の温度は２０℃～５０℃、具体的には、３０℃～３７℃であってもよいが、これに制限されない。培養期間は、有用物質の所望の生成量が得られるまで継続させてもよく、具体的には、１０時間～１００時間であってもよいが、これに制限されない。
前記生産方法は、前記培養による培地または前記微生物からＬ－イソロイシンを回収することをさらに含んでもよい。
前記Ｌ－イソロイシンを回収することは、本出願の微生物の培養方法、例えば回分式、連続式または流加式培養方法などにより当該技術分野で公知の適切な方法を用いて培地から目的とするＬ－イソロイシンを回収してもよい。例えば、遠心分離、ろ過、結晶化タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、抽出、超音波破砕、限外ろ過、透析法、分子体クロマトグラフィー（ゲルろ過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、親和度クロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ及びこれら方法を組み合わせて用いてもよいが、これらの例に限定されるものではない。
前記生産方法は精製工程を含んでもよい。前記精製工程は当該技術分野で公知の適切な方法を用いて、回収されたＬ－イソロイシンを精製することができる。
本出願の他の態様は、配列番号１のアミノ酸配列において１３６番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された、アセトヒドロキシ酸シンターゼ活性を有するタンパク質変異体が発現されるように微生物を変形することを含む、Ｌ－イソロイシン生産性を増加させる方法を提供する。
本出願の他の態様は、前記タンパク質変異体のＬ－イソロイシン生産能の増加のための使用を提供する。
前記タンパク質変異体、他のアミノ酸については上述の通りである。
以下、本出願の実施例に通じてより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本出願を例示的に説明するためのものであり、本出願の範囲がこれらの実施例により制限されるものではない。
実施例１．人工変異法によるランダム突然変異株の選別
本実施例では、Ｌ－イソロイシンの生産能が向上された微生物変異株を得るために、下記方法を用いて微生物の変異を誘導した。
まず、野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ １３０３２菌株にイソロイシン生合成において重要な酵素として作用するL-threonine dehydratase（ｉｌｖＡ）のフィードバック阻害（feedback inhibition）解消のためのｉｌｖＡ（Ｆ３８３Ａ）変異を導入するため、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、及び配列番号７５のプライマーを製作した。
コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＡＴＣＣ １３０３２のゲノムＤＮＡを鋳型として配列番号７２と配列番号７３及び、配列番号７４と配列番号７５のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ高信頼ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を用いてＰＣＲし、ＰＣＲ条件は、変性、９５℃で３０秒；アニーリング、５５℃で３０秒；及び重合反応、７２℃で１分を２５回繰り返した。その結果、１０００ｂｐのｉｌｖＡ遺伝子の上端部位と１０００ｂｐ ｉｌｖＡ遺伝子の下端部位の遺伝子断片をそれぞれ獲得し、ＱＩＡＧＥＮ社のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔを用いて各増幅産物を精製し、ベクター製作のための挿入ＤＮＡ断片として用いた。制限酵素ｓｍａＩで処理した後、６５℃で２０分間熱処理したｐＤＺ（特許文献８）ベクターとＤＮＡ断片をモル濃度（Ｍ）１：２となるようにタカラ（ＴａＫａＲａ）のＩｎｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用い、提供されたマニュアルに従ってクローニングすることによりＦ３８３Ａ変異を染色体上に導入するためのベクターｐＤＺ－Ｆ３８３Ａを製作した。
製作したベクターを電気穿孔法によりコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ １３０３２に形質転換し、二次交差過程を経て染色体上でそれぞれ変異型塩基に置換された菌株を得た。適切な置換の有無は、下記のプライマー組み合わせを用いてＭＡＳＡ（Mutant Allele Specific Amplification）ＰＣＲ技法(非特許文献９)を用い、変異型配列に付合するプライマーの組み合わせ（配列番号６８及び配列番号７６）から増幅された菌株を選別することにより一次決定し、選別された菌株のｉｌｖＡ配列分析は、配列番号７７及び配列番号７８のプライマー組み合わせを用いて変異型配列分析することにより二次確認した。
次に、前記ｉｌｖＡ(Ｆ３８３Ａ)変異が導入された菌株にｈｏｍ（Ｒ４０７Ｈ）(特許文献９)変異がさらに導入された菌株を製作するために、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６及び配列番号６７のプライマーを製作した。
コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＡＴＣＣ１３０３２から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号６４と配列番号６５及び配列番号６６と配列番号６７のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ高信頼ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を用いてＰＣＲし、ＰＣＲ条件は、変性、９５℃で３０秒；アニーリング、５５℃で３０秒；及び重合反応７２℃で１分を２５回繰り返した。その結果、１０００ｂｐのｈｏｍ遺伝子上端部位と１０００ｂｐ ｈｏｍ遺伝子下端部位の遺伝子断片をそれぞれ獲得した。増幅産物をＱＩＡＧＥＮ社のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔを用いて精製し、ベクター製作のための挿入ＤＮＡ断片として用いた。一方、制限酵素ｓｍａＩで処理した後、６５℃で２０分間熱処理したｐＤＺ（特許文献８）ベクターと前記ＰＣＲを介して増幅した挿入ＤＮＡ断片のモル濃度（Ｍ）比が１：２となるようにタカラ（ＴａＫａＲａ）のＩｎｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて提供されたマニュアルに従ってクローニングすることにより、Ｒ４０７Ｈ変異を染色体上に導入するためのベクターｐＤＺ－Ｒ４０７Ｈを製作した。
製作したベクターを電気穿孔法によりコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ １３０３２ ｉｌｖＡ（Ｆ３８３Ａ）に形質転換し、二次交差過程を経て染色体上でそれぞれ変異型塩基に置換されている菌株を得た。適切な置換の有無は、下記のプライマー組み合わせを用いてＭＡＳＡ（Mutant Allele Specific Amplification）ＰＣＲ技法(非特許文献９)を用いて変異型配列に付合するプライマー組み合わせ（配列番号６８及び配列番号６９）から増幅された菌株を選別することにより一次決定し、選別された菌株のｈｏｍ配列分析は、配列番号７０及び配列番号７１のプライマー組み合わせを用いて変異型配列分析することにより二次確認した。
具体的には、親菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ １３０３２ ｈｏｍ（Ｒ４０７Ｈ）ｉｌｖＡ(Ｆ３８３Ａ)を活性化培地で１６時間培養し活性化された菌株を１２１℃で１５分間滅菌した種培地に接種して１４時間培養後、培養液５ｍｌを回収した。回収した培養液を１００ｍＭクエン酸緩衝溶液(citric buffer)で洗浄した後、ＮＴＧ(N－Methyl－N'－nitro－N－nitrosoguanidine)を最終濃度２００ｍｇ／Ｌになるように添加した後、２０分間処理し、１００ｍＭリン酸緩衝溶液（phosphate buffer）で洗浄した。ＮＴＧが処理された菌株を最小培地に塗抹して死滅率を求めたところ、死滅率は８５％であり、生存した細胞を種培地に接種培養、最終的に優れたイソロイシン生産能を示す変異株を選別してコリネバクテリウム・グルタミカム ＣＪＩＬＥ－４２（Corynebacterium glutamicum、CJILE‐42）と命名した。
実施例１で使用した培地の組成は下記の通りである。
＜活性化培地＞
牛肉抽出物１％、ポリペプトン１％、塩化ナトリウム０．５％、酵母抽出物１％、寒天２％、ｐＨ７．２
牛肉抽出物１％、ポリペプトン１％、塩化ナトリウム０．５％、酵母抽出物１％、寒天２％、ｐＨ７．２
＜種培地＞
グルコース５％、バクトペプトン１％、塩化ナトリウム０．２５％、酵母抽出物１％、尿素０．４％、ｐＨ７．２
グルコース５％、バクトペプトン１％、塩化ナトリウム０．２５％、酵母抽出物１％、尿素０．４％、ｐＨ７．２
＜最小培地＞
グルコース１．０％、硫酸アンモニウム０．４％、硫酸マグネシウム０．０４％、リン酸第１カリウム０．１％、尿素０．１％、チアミン０．００１％、ビオチン２００μｇ／Ｌ、寒天２％、ｐＨ７．２
グルコース１．０％、硫酸アンモニウム０．４％、硫酸マグネシウム０．０４％、リン酸第１カリウム０．１％、尿素０．１％、チアミン０．００１％、ビオチン２００μｇ／Ｌ、寒天２％、ｐＨ７．２
実施例２：Ｌ－イソロイシン生産用ランダム突然変異株のＬ－イソロイシン生産性調査
前記実施例１で得られた変異株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪＩＬＥ－４２のＬ－イソロイシン生産性を確認するために、下記の方法で培養した。生産培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに親菌株及び前記変異株を接種した後、３２℃で６０時間、２００ｒｐｍで振とう培養してＬ－イソロイシンを製造した。
本実施例２で用いた生産培地の組成は下記の通りである。
＜生産培地＞
グルコース１０％、酵母抽出物０．２％、硫酸アンモニウム１．６％、第１リン酸カリウム０．１％、硫酸マグネシウム７水塩０．１％、硫酸鉄７ 水塩 １０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン１水塩１０ｍｇ／Ｌ、ビオチン２００μｇ／Ｌ 、ｐＨ７．２
グルコース１０％、酵母抽出物０．２％、硫酸アンモニウム１．６％、第１リン酸カリウム０．１％、硫酸マグネシウム７水塩０．１％、硫酸鉄７ 水塩 １０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン１水塩１０ｍｇ／Ｌ、ビオチン２００μｇ／Ｌ 、ｐＨ７．２
培養終了後、液体高速クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いてＬ－イソロイシンの生産量を測定し、実験した各菌株に対する培養液中のＬ－イソロイシン濃度を下記表１に示す。
前記の結果に基づいてＬ－トレオニンからＬ－イソロイシンが合成される経路にある遺伝子をゲノムシークエンシングした結果、アセトヒドロキシ酸シンターゼ(acetohydroxy acid synthase、ＡＨＡＳ)活性を示すｉｌｖＢＮのｉｌｖＢ遺伝子でランダム変位が確認され、変異型ｉｌｖＢ遺伝子を配列番号２で示した。
前記の結果でランダム突然変異法により得られた変異株は結果的にフィードバック阻害を受けず、Ｌ－イソロイシンを高効率及び高収率で生産できることを確認した。
実施例３：アセトヒドロキシ酸シンターゼ（acetohydroxy acid synthase、ＡＨＡＳ）活性を比較するためのｉｌｖＢＮＣ欠損株の製作
アセトヒドロキシ酸シンターゼ（acetohydroxy acid synthase、ＡＨＡＳ）活性を有する変異型ｉｌｖＢの活性を評価するために、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（acetohydroxy acid synthase、ＡＨＡＳ）活性がなくてピルビン酸（pyruvate）と２－ケト酪酸（2-ketobutyrate）を基質として２－アセト－２－ヒドロキシアセテート（2-aceto-2-hydroxyacetate）に転換不可能なｉｌｖＢＮＣが欠損された菌株を製作した。ｉｌｖＢの活性を測定するものであるが、コリネバクテリウム・グルタミカムは、ｉｌｖＢ、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＮ遺伝子がオペロンに互いに隣接しているため、３つの遺伝子の発現が統一的に調節される。したがって、ｉｌｖＢＮＣ遺伝子を欠損するためにＷＴ由来のｉｌｖＢＮＣ遺伝子の塩基配列情報に基づいてｉｌｖＢＮＣ遺伝子の５’上端部位を増幅するためのプライマー対（配列番号３及び４）、及び３’下端部位を増幅するためのプライマー対（配列番号５及び６）を考案した。配列番号３及び６のプライマーは、各末端にＸｂａＩ制限酵素部位（下線で示す）を挿入した。各配列を下記表２に示した。
増幅された２つのＤＮＡ断片を鋳型として、配列番号３及び配列番号６のプライマーでＰＣＲを行った。重合酵素はＳｏｌｇＴＭ Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼ(SolGent co.,Ltd.)を用い、ＰＣＲ条件は、９５℃で１０分間変性した後、９５℃ 変性、５６℃ アニーリング、７２℃で１分重合を３０回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を行った。その結果、ｉｌｖＢＮＣ遺伝子が欠損され、上端と下端のみを含む１００６ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。
ｐＤＺベクターと１００６ｂｐのＤＮＡ断片を制限酵素ＸｂａＩで処理した後、ＤＮＡコンジュゲート酵素を用いて連結した後、クローニングすることによりプラスミドを獲得し、これをｐＤＺ－ΔｉｌｖＢＮＣと命名した。
ｐＤＺ－△ｉｌｖＢＮＣベクターをコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ １３０３２ ｈｏｍ（Ｒ４０７Ｈ） ｉｌｖＡ(Ｆ３８３Ａ)菌株に電気パルス法で導入した後、カナマイシン(kanamycin)２５ｍｇ／Ｌを含む選別培地で形質転換菌株を獲得した。二次組換え過程（cross-over）で染色体上に挿入されたＤＮＡ断片によりｉｌｖＢＮＣ遺伝子が欠損した菌株であるＷＴΔｉｌｖＢＮＣを獲得した。
実施例４：アセトヒドロキシ酸シンターゼ（acetohydroxy acid synthase、ＡＨＡＳ）活性を有する野生型ｉｌｖＢＮＣプラスミドの製作
アセトヒドロキシ酸シンターゼ（acetohydroxy acid synthase、ＡＨＡＳ）（ｉｌｖＢＮＣ）をコードする遺伝子を増幅するために、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ １３０３２ ｈｏｍ（Ｒ４０７Ｈ）ｉｌｖＡ（Ｆ３８３Ａ）由来の配列（配列番号７）に基づいて、プロモーター部位（開始コドン上端約３００ｂｐ）からターミネーター部位（終止コドン下端約１００ｂｐ）まで増幅するためのプライマー（配列番号８及び９）の両末端にＢａｍＨＩ（下線で示す）制限酵素部位を挿入して考案した。当該の配列を以下の表３に示した。
実施例５：アセトヒドロキシ酸シンターゼ（acetohydroxy acid synthase、ＡＨＡＳ）活性を有する変異型ｉｌｖＢＮＣプラスミドの製作
Ｌ－イソロイシンを過量生産する変異型ｉｌｖＢの活性を比較するために、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ １３０３２ ｈｏｍ（Ｒ４０７Ｈ） ｉｌｖＡ(Ｆ３８３Ａ)由来のアセトヒドロキシ酸シンターゼ(acetohydroxy acid syntha、ＡＨＡＳ)（配列番号７）をコードするｉｌｖＢ遺伝子を対象に変異導入ベクターを製作するために、変異位置を中心に５’上端部位を増幅するためのプライマー対（配列番号８及び１０）と、３’下端部位を増幅するためのプライマー対（配列番号１１及び９）を考案した。配列番号８及び９のプライマーは各末端にＢａｍＨＩ制限酵素部位（下線で示す）を挿入し、配列番号１０及び１１のプライマーは互いに交差するように考案した部位にヌクレオチド置換変異（下線で示す）が位置するようにした。
増幅した２つのＤＮＡ断片を鋳型として、配列番号８及び配列番号９のプライマーでＰＣＲを行った。 ＰＣＲ条件は、９５℃で１０分間変性した後、９５℃で３０秒変性、５６℃で３０秒アニーリング、７２℃で４分重合を３０回繰り返した後、７２℃で７分間重合反応を行った。
その結果、１３６番目のグルタミンがアスパラギンに置換されたアセトヒドロキシ酸シンターゼ(acetohydroxy acid synthase、ＡＨＡＳ)変異体（配列番号１２）をコードするｉｌｖＢ遺伝子の変異(配列番号２)を含む４０１０ｂｐのＤＮＡ断片端が増幅された。
ｐＥＣＣＧ１１７（特許文献１０）ベクターとｉｌｖＢＮ ＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩで処理し、ＤＮＡコンジュゲート酵素を用いて連結した後、クローニングすることによりプラスミドを獲得し、これをｐＥＣＣＧ１１７－ｉｌｖＢ（Ｑ１３６Ｎ）ＮＣと命名した。
実施例６：アセトヒドロキシ酸シンターゼ（acetohydroxy acid synthase、ＡＨＡＳ）活性を有する野生型及び変異型ｉｌｖＢの活性比較実験
前記の実施例４及び５で製作したｐＥＣＣＧ１１７－ｉｌｖＢＮＣ ＷＴ、ｐＥＣＣＧ１１７－ｉｌｖＢ（Ｑ１３６Ｎ）ＮＣベクターを実施例３で製作したＷＴ△ｉｌｖＢＮＣ菌株に電気パルス法で導入した後、カナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含有した選択培地に塗抹し、それぞれの形質転換株を獲得した。
前記に製作された菌株のＬ－イソロイシン生産能を比較するため、以下のような方法で培養し、培養液中のＬ－イソロイシン濃度を分析した。
下記の培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに菌株を１白金耳を接種し、３２℃で５０時間、２００ｒｐｍで振とう培養した。ＨＰＬＣを用いてＬ－イソロイシン濃度を分析し、分析した濃度は表５のようであった。
＜培地組成（ｐＨ ７．０）＞
グルコース１００ｇ、(ＮＨ４)２ＳＯ４ ４０ｇ、 大豆タンパク質２．５ｇ、トウモロコシ浸漬固形分（Corn Steep Solids）５ｇ、尿素３ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１０００μｇ、パントテン酸カルシウム２０００μｇ、ニコチンアミド３０００μg、ＣａＣＯ３ ３０ｇ（ 蒸留水1リットルあたり）。
グルコース１００ｇ、(ＮＨ４)２ＳＯ４ ４０ｇ、 大豆タンパク質２．５ｇ、トウモロコシ浸漬固形分（Corn Steep Solids）５ｇ、尿素３ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１０００μｇ、パントテン酸カルシウム２０００μｇ、ニコチンアミド３０００μg、ＣａＣＯ３ ３０ｇ（ 蒸留水1リットルあたり）。
ＫＣＣＭ１１２４８Ｐ株は、コリネバクテリウム・グルタミカムＫＦＣＣ １１０４０（Corynebacterium glutamicum KFCC 11040、特許文献１１）にＬ－トレオニン誘導体であるα－アミノ－β－ヒドロキシノルバリン（α-amino-β-hydroxynorvaline)とＬ－イソロイシン誘導体である４－チアイソロイシン(4‐thiaisoleucine)及びイソロイシン－ヒドロキサメート(isoleucine‐hydroxamate)の共通耐性を示す変異株(Corynebacterium glutamicum ＫＣＪＩ－３８、ＫＣＣＭ１１２４８Ｐ、特許文献１２)であって、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ １３０３２ ｈｏｍ（Ｒ４０７Ｈ） ｉｌｖＡ(Ｆ３８３Ａ)より高い収率でＬ－イソロイシンを生産することが確認された。
より多量のＬ－イソロイシンを生産する菌株におけるｉｌｖＢ変異体の効果を確認するため、前記実施例３と同様の方法でＫＣＣＭ１１２４８ＰΔｉｌｖＢＮＣ菌株を製作した。また、前記の実施例４及び５で製作したｐＥＣＣＧ１１７－ｉｌｖＢＮＣ ＷＴ、ｐＥＣＣＧ１１７－ｉｌｖＢ（Ｑ１３６Ｎ）ＮＣベクターをイソロイシン生産能が増大した菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＪＩ－３８（ＫＣＣＭ１１２４８Ｐ）に電気パルス法で導入した後、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含む選別培地に塗抹し、それぞれの形質転換株を獲得した。
前記製作した菌株のＬ－イソロイシン生産能を比較するため、実施例６と同様の方法で培養して、培養液中のＬ－イソロイシン濃度を分析し、分析した濃度は表６の通りである。
実施例７：アセトヒドロキシ酸シンターゼ（acetohydroxy acid synthase、ＡＨＡＳ）活性を有する変異型ｉｌｖＢＮＣプラスミドの製作
前記実施例６を通して、Ｌ－イソロイシン生産能の高いｉｌｖＢ変異位置である１３６番目の位置が生産能増加に重要な位置であることを確認するために、他のアミノ酸が置換された変異型を製作してその効果を確認した。ｉｌｖＢの１３６番目のアミノ酸位置に他のアミノ酸が置換された１７種をさらに製作し、実施例４で製作したプラスミドを鋳型として用いた。それぞれの変異型、置換されたアミノ酸及び各変異型に用いられたプライマー配列番号を以下の表７に示す。
増幅した２つのＤＮＡ断片を鋳型として、配列番号８及び配列番号９のプライマーでＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で１０分間変性した後、９５℃で３０秒変性、５６℃で３０秒アニーリング、７２℃で４分重合を３０回繰り返した後、７２℃で７分間重合反応を行った。その結果、１３６番目のグルタミンが表７の各アミノ酸に置換されたアセトヒドロキシ酸シンターゼ（acetohydroxy acid synthase、ＡＨＡＳ）変異体をコードするｉｌｖＢ遺伝子の変異を含む４０１０ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。ｐＥＣＣＧ１１７（特許文献１０）ベクターとＰＣＲにより収得した４０１０ｂｐのｉｌｖＢＮＣ ＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩで処理し、ＤＮＡコンジュゲート酵素を用いて連結した後、クローニングすることによりプラスミドを獲得した。これにより、１３６番目のグルタミンが表７に示されたアミノ酸に置換された１７種のｉｌｖＢ変異ベクターが製作され、表８のように命名した。
実施例７で製作した変異プラスミド１７種を実施例３で製作したＷＴ△ｉｌｖＢＮＣ菌株に電気パルス法で導入した後、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含む選別培地に塗抹し、各々の形質転換株を獲得した。その後、実施例６と同様の方法でフラスコ評価を行った。その結果を下記表９の通りである。
前記結果を見ると、本出願の変異体がＬ－イソロイシンの生産を増加させることを確認した。
以上の説明から、本出願が属する技術分野の当業者は、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形態で実施されうることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はすべての面で例示的なものであり、限定的なものではないものと理解しなければならない。本出願の範囲は、前記詳細な説明より、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導き出されるすべての変更または変形された形態が本出願の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
寄託機関名：韓国微生物保存センター
受託番号：ＫＣＣＭ１２４１５Ｐ
受託日：２０１８１２０３
寄託機関名：韓国微生物保存センター
受託番号：ＫＣＣＭ１２４１５Ｐ
受託日：２０１８１２０３
Claims (10)
- 配列番号１のアミノ酸配列においてアミノ酸配列の１３６番目のアミノ酸であるグルタミン（Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）がグルタミン以外の他のアミノ酸に置換された、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（acetohydroxy acid synthase、ＡＨＡＳ）活性を有するタンパク質変異体。
- 前記第１３６番目のアミノ酸が、アスパラギン（Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）、アルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）、セリン（Ｓｅｒｉｎｅ）、チロシン（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ）、システイン（Ｃｙｓｔｅｎｉｎｅ）、プロリン（Ｐｒｏｌｉｎｅ）、ヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ)、ロイシン(Ｌｅｕｃｉｎｅ)、イソロイシン(Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ)、トレオニン(Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ)、リジン(Ｌｙｓｉｎｅ)、バリン(Ｖａｌｉｎｅ)、アラニン(Ａｌａｎｉｎｅ)、アスパラギン酸(Ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ)、グルタミン酸(Ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ)、グリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）またはトリプトファン（Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）に置換された、請求項１に記載のアセトヒドロキシ酸シンターゼ（acetohydroxy acid synthase、ＡＨＡＳ）活性を有するタンパク質変異体。
- 前記タンパク質変異体が、配列番号１２、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２または配列番号６３のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のタンパク質変異体。
- 請求項１～３のいずれか一項に記載のタンパク質変異体をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項４に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項１～３のいずれか一項に記載のタンパク質変異体を含む微生物。
- 前記微生物が、Ｌ－イソロイシンを生産する、請求項６に記載の微生物。
- 前記微生物が、コリネバクテリウム（Corynebacterium sp.）属またはエシェリキア属(Escherichia sp.)である、請求項６に記載の微生物。
- 請求項６に記載の微生物を培地で培養する段階を含む、Ｌ－イソロイシンの生産方法。
- 前記培養された微生物または培地からＬ－イソロイシンを回収する段階をさらに含む、請求項９に記載のＬ－イソロイシンの生産方法。
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