KR102063909B1 - 아세토하이드록시산 신타아제 변이체, 이를 포함하는 미생물 또는 이를 이용하는 l-분지쇄 아미노산 생산 방법 - Google Patents

아세토하이드록시산 신타아제 변이체, 이를 포함하는 미생물 또는 이를 이용하는 l-분지쇄 아미노산 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 출원은 신규한 아세토하이드록시산 신타아제 변이체, 이를 포함하는 미생물 또는 이를 이용하는 L-분지쇄 아미노산의 생산 방법에 관한 것이다.

Description

아세토하이드록시산 신타아제 변이체, 이를 포함하는 미생물 또는 이를 이용하는 L-분지쇄 아미노산 생산 방법 {Acetohydroxy acid synthase variant, microorganism comprising thereof, and method of producing L-branced-chained amino acid using the same}
본 출원은 신규한 아세토하이드록시산 신타아제 변이체 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 아세토하이드록시산 신타아제 변이체, 이를 포함하는 미생물 또는 이를 이용하는 L-분지쇄 아미노산의 생산 방법에 관한 것이다.
분지쇄 아미노산, 즉 L-발린, L-류신, L-이소류신은 개체에서 단백질을 증가시키는 작용을 하며, 운동시 에너지원으로 중요한 역할을 하는 것이 알려져, 의약품, 식품 등에 사용되고 있다. 분지쇄 아미노산들은 유사한 생합성 과정에 동일한 효소를 사용하기 때문에 한 가지의 분지쇄 아미노산을 공업적 규모로 발효를 통해 제조하는 데는 어려움이 있다. 분지쇄 아미노산의 제조에 있어서, 분지쇄 아미노산 생합성의 첫 번째 효소인 아세토하이드록시산 신타아제(acetohydroxy acid synthase)의 역할이 가장 중요하나, 이에 관한 선행연구는 주로 작은 소단위체(acetohydroxy acid synthase small subunit; IlvN 단백질)의 변이로 인한 피드백 해제에 관련된 연구가 대부분으로(Protein Expr Purif. 2015 May;109:106-12., US2014-0335574, US2009-496475, US2006-303888, US2008-245610), 관련 연구가 매우 부족한 실정이다.
아세토하이드록시산 신타아제는 피루브산 두 분자로부터 아세토젖산(acetolactic acid)을 생성하는 역할과, 케토부티르산(ketobutyric acid) 및 피루브산으로부터 아세토하이드록시부티르산(2-aceto-2-hydroxy-butyrate)을 생성하는 역할을 수행하는 효소이다. 상기 아세토하이드록시산 신타아제는 피루브산(pyruvate)의 디카르복실화(decarboyxlation)와 다른 피루브산 분자와의 축합 반응을 촉매하여 발린 및 류신의 전구체인 아세토젖산을 생산하거나 피루브산의 디카르복실화와 2-케토부티레이트(2-ketobutyrate)와의 축합 반응을 촉매하여 이소류신의 전구체인 아세토히드록시부티레이트를 생산할 수 있다. 따라서, 아세토하이드록시산 신타아제는 L-분지쇄 아미노산 생합성의 초기 과정에 관여하는 매우 중요한 효소이다.
이러한 배경 하에 본 출원자들은 L-분지쇄 아미노산을 효과적으로 생산하기 위하여 노력한 결과, 아세토하이드록시산 신타아제의 변이체, 구체적으로 아세토하이드록시산 신타아제 큰 소단위체 변이체를 개발하였다. 이에, 상기 변이체를 포함하는 미생물로부터 고수율로 L-분지쇄 아미노산을 생산할 수 있음을 확인하고, 본 출원을 완성하였다.
본 출원의 하나의 목적은 아세토하이드록시산 신타아제(acetohydroxy acid synthase) 변이체를 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적은 상기 아세토하이드록시산 신타아제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 상기 벡터가 도입된 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 상기 아세토하이드록시산 신타아제 변이체를 포함하거나, 상기 벡터가 도입된, L-분지쇄 아미노산을 생산하는 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 상기 L-분지쇄 아미노산을 생산하는 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 미생물 또는 이의 배지로부터 L-분지쇄 아미노산을 회수하는 단계를 포함하는 L-분지쇄 아미노산 생산 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 출원의 하나의 양태는, 아세토하이드록시산 신타아제의 큰 소단위체(acetolactate synthase large subunit; IlvB 단백질)의 아미노산 서열 위치 96 번의 쓰레오닌이 쓰레오닌 이외의 다른 아미노산으로 치환되거나, 아미노산 서열 위치 503 번의 트립토판이 트립토판 이외의 다른 아미노산으로 치환되거나, 또는 아미노산 서열위치 96 번의 쓰레오닌 및 503 번의 트립토판 모두가 다른 아미노산으로 치환된, 아세토하이드록시산 신타아제 변이체이다.
구체적으로, 상기 아세토하이드록시산 신타아제의 큰 소단위체는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 아세토하이드록시산 신타아제 변이체는 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열에서, 이의 N-말단으로부터 96 번째 쓰레오닌(threonine) 또는 503 번째 트립토판(tryptophan)이 다른 아미노산으로 치환된 것인, 또는 96 번째 쓰레오닌과 503 번째 트립토판이 모두 다른 아미노산으로 치환된, 아세토하이드록시산 신타아제 변이체일 수 있다.
본 출원에서 용어, "아세토하이드록시산 신타아제(acetohydroxy acid synthase)"는 L-분지쇄 아미노산의 생합성에 관여하는 효소로, L-분지쇄 아미노산의 생합성의 첫 번째 단계에 관여할 수 있다. 구체적으로, 아세토하이드록시산 신타아제는 피루브산(pyruvate)의 디카르복실화(decarboyxlation)와 다른 피루브산 분자와의 축합 반응을 촉매하여 발린의 전구체인 아세토젖산을 생산하거나 피루브산의 디카르복실화와 2-케토부티레이트(2-ketobutyrate)와의 축합 반응을 촉매하여 이소류신의 전구체인 아세토히드록시부티레이트를 생산할 수 있다. 구체적으로는 아세토젖산으로부터 출발하여 아세토하이드록시산 이소메로리덕타아제(acetohydroxy acid isomeroreductase), 디하이드록시산 디하이드레타제(dihydroxy acid dehydratase), 트랜스아미나제 B(transaminase B)에 의하여 촉매된 반응을 순차적으로 거치면 L-발린이 생합성된다. 또한, 아세토젖산으로부터 아세토하이드록시산 이소메로리덕타아제(acetohydroxy acid isomeroreductase), 디하이드록시산 디하이드레타제(dihydroxy acid dehydratase), 2-이소프로필말산 신타아제(2-isopropylmalate synthase), 이소프로필말산 이소메라제(isopropylmalate isomerase), 3-이소프로필말산 디하이드로게나제(3-isopropylmalate dehydrogenase), 트랜스아미나제 B (transaminase B)에 의하여 촉매된 반응을 순차적으로 거치면 L-류신이 생합성된다. 한편, 아세토히드록시부티레이트으로부터 출발하여 아세토하이드록시산 이소메로리덕타아제(acetohydroxy acid isomeroreductase), 디하이드록시산 디하이드레타제(dihydroxy acid dehydratase), 트랜스아미나제 B(transaminase B)에 의하여 촉매된 반응을 순차적으로 거치면 L- 이소류신이 생합성된다. 따라서, L-분지쇄 아미노산의 생합성 경로에 있어서 중요한 효소이다.
아세토하이드록시산 신타아제는 ilvB 및 ilvN, 두 유전자에 의하여 코딩되며, ilvB 유전자는 아세토하이드록시산 신타아제의 큰 소단위체(large subunit; IlvB)를, ilvN 유전자는 아세토하이드록시산 신타아제의 작은 소단위체(small subunit; IlvN)를 각각 코딩한다.
본 출원에서 아세토하이드록시산 신타아제는 코리네박테리움 속 미생물 유래일 수 있고, 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 유래일 수 있다. 더욱 구체적으로는 상기 아세토하이드록시산 신타아제 큰 소단위체는 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열뿐만 아니라 상기 서열과 70 % 이상, 구체적으로는 80 % 이상, 더욱 구체적으로는 90 % 이상, 더욱더 구체적으로는 95 % 이상의 상동성을 가지며 IlvB 단백질 활성을 갖는 단백질이라면 제한없이 포함될 수 있다. 또한, IlvB 단백질 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 상기 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있어 상기 서열번호 1의 아미노산 서열은 코딩하는 염기서열이면 제한없이 포함될 수 있으나, 구체적으로 서열번호 2의 염기서열에 의해 코딩된 것일 수 있다.
본 출원에서 "아세토하이드록시산 신타아제 변이체"란 상기 아세토하이드록시산 신타아제 단백질의 아미노산 서열상 하나 또는 그 이상의 아미노산이 변이 (예, 추가, 제거 또는 치환)된 단백질을 의미한다. 구체적으로 상기 아세토하이드록시산 신타아제 변이체는 아세토하이드록시산 신타아제 단백질이 본 출원의 변이에 의해서 그 활성이 야생형 또는 변형 전과 비교하여 효율적으로 증가된 단백질이다. 본 출원에서 변이는 일반적으로 효소를 개량하기 위한 방법으로 당업계의 알려진 공지된 방법들이 제한없이 사용될 수 있으며, 이에는 합리적 설계(rational design)와 유도 진화(directed evolution) 등의 전략이 있다. 예를 들어, 합리적 설계 전략에는 특정 위치의 아미노산을 위치-지정 돌연변이도입(site-directed mutagenesis 또는 site-specific mutagensis)하는 방법 등이 있고, 유도 진화 전략에는 무작위적 변이(random mutagenesis)를 일으키는 방법 등이 있다. 또한, 자연적인 돌연변이에 의해 외부의 조작 없이 돌연변이된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 아세토하이드록시산 신타아제 변이체는 분리된 것이거나, 재조합 단백질일 수 있으며, 비자연적으로 발생된 것일 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 아세토하이드록시산 신타아제 변이체는 이에 제한되는 것은 아니나, 구체적으로 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 갖는 IlvB 단백질의 N-말단으로부터 96 번째 쓰레오닌(threonine) 또는 503 번째 트립토판(tryptophan)이 돌연변이된 IlvB 단백질일 수 있으며, 또는, 이에 제한되는 것은 아니나, 96 번째 쓰레오닌 및 503 번째 트립토판이 동시에 다른 아미노산으로 치환된 IlvB 단백질일 수 있다. 그 예로 상기 96 번째 쓰레오닌이 세린(serine), 시스테인(cystein) 또는 알라닌(alanine)으로 치환된 것이거나, 상기 503 번째 트립토판이 글루타민(glutamine), 아스파라긴(asparagine) 또는 류신(leucine)으로 치환된 IlvB 단백질일 수 있다. 또한, 상기 96번째 또는 503번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환됨과 동시에 아미노산 서열 중 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 경우도 본 출원의 아세토하이드록시산 신타아제 변이체와 동일하거나 상응하는 활성을 나타낸다면 본 출원의 범주에 포함되는 것은 자명하다.
아울러, 본 출원의 아세토하이드록시산 신타아제 변이체의 범주에는 상기 기술된 변이를 가지는 아세토하이드록시산 신타아제 큰 소단위체 변이체 자체, 상기 아세토하이드록시산 신타아제 큰 소단위체 변이체를 포함하는 아세토하이드록시산 신타아제, 또는 아세토하이드록시산 신타아제 큰 소단위체 변이체와 작은 소단위체를 모두 가지는 아세토하이드록시산 신타아제가 포함되나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서는 아세토하이드록시산 신타아제 단백질의 96 번째 및 503 번째 아미노산을 다양한 다른 아미노산으로 치환하여 L-분지쇄 아미노산 생산량이 증가하는 것을 확인함으로써, L-분지쇄 아미노산 생산 증가와 관련한 아세토하이드록시산 신타아제 단백질의 변이에 있어서 상기 96 번째 및 503 번째 위치가 중요한 위치임을 확인하였다. 다만, 본 출원의 실시예에서 치환된 아미노산은 본 출원의 효과를 보여주는 대표적인 일 예시에 불과한 것으로 본 출원의 범위가 실시예에 한정되는 것은 아니며, 96 번째 쓰레오닌을 쓰레오닌 이외의 다른 아미노산으로, 503 번째 트립토판을 트립토판 이외의 다른 아미노산으로, 또는 96 번째 쓰레오닌과 503 번째 트립토판을 모두 다른 아미노산으로 치환할 경우 실시예에 기재된 효과와 대응되는 효과를 기대할 수 있음이 자명하다.
또한, 본 출원의 아세토하이드록시산 신타아제 변이체는 서열번호 28 내지 33 중 어느 하나로 기재되는 아미노산 서열을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 출원의 변이를 포함하여 실질적으로 아세토하이드록시산 신타아제 변이체와 동일하거나 상응하는 활성을 가지는 한, 상기 서열들과 70 %, 80 %, 90 %, 95 % 또는 99 % 이상의 상동성을 가지는 폴리펩티드를 제한없이 포함할 수 있다. 본 출원에서 용어, "상동성"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 모이티 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 하나의 모이티로부터 다른 하나의 모이티까지의 서열간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 동일하거나 유사한 활성을 가지는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 예를 들면, 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 구체적으로 BLAST 2.0을 이용하거나, 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있다. 상기에서 용어 "엄격한 조건"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다.
본 출원의 또 하나의 양태는, 본 출원의 아세토하이드록시산 신타아제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다.
본 출원에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 DNA 그리고 RNA 분자를 포함하는 의미를 가지며, 이의 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 천연 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다. 본 출원에서 상기 폴리뉴클레오티드는 세포로부터 분리된 폴리뉴클레오티드 또는 인위적으로 합성된 폴리뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 아세토하이드록시산 신타아제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 본 출원의 아세토하이드록시산 신타아제 변이체 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 염기서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 구체적으로 상기 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 상기 서열번호 28 내지 33의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열이면 제한없이 포함될 수 있으나, 구체적인 예를 들어, 서열번호 34 내지 39 중 어느 하나로 기재되는 염기서열을 가지는 것일 수 있다. 또한, 본 출원의 변이를 포함하여 실질적으로 아세토하이드록시산 신타아제의 활성을 가지는 한, 코돈의 축퇴성으로 인하여, 상기 서열들과 70 %, 75 %, 80 %, 85 %. 90 %, 95 %, 97 %, 또는 99 % 이상의 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드를 제한없이 포함할 수 있다.
또는 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 염기 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화하여, 서열번호 28 내지 33의 아미노산 서열로 이루어진 단백질의 활성을 가지는 단백질을 암호화하는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 상기 "엄격한 조건"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌(예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성이 높은 유전자끼리, 80 % 이상, 구체적으로는 90 % 이상, 보다 구체적으로는 95 % 이상, 더욱 구체적으로는 97 % 이상, 특히 구체적으로는 99 % 이상의 상동성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화의 세척 조건인 60 ℃, 1×SSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60 ℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68 ℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다. 혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 상기 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원은 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55 ℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60 ℃, 63 ℃ 또는 65 ℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).
본 출원의 또 하나의 양태는, 본 출원의 변이된 아세토 하이드록시산 신타아제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터이다.
본 출원에서 용어, "벡터"는 숙주 세포로 염기의 클로닝 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말한다. 벡터는 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위(replicon)일 수 있다. "복제단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제가능한, 임의의 유전적 단위를 말한다. 구체적으로는, 천연상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스일 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λMBL3, λMBL4, λIXII, λASHII, λAPII, λt10, λt11, Charon4A 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 본 출원에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다. 또한 상기 벡터에 트랜스포존, 또는 인공 염색체를 포함할 수 있다.
본 출원에서 벡터는 본 출원의 아세토하이드록시산 신타아제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 한 특별히 제한되지 않으나, 포유류 세포(예를 들어, 사람, 원숭이, 토끼, 래트, 햄스터, 마우스 세포 등), 식물 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 박테리아 세포(예를 들어, 대장균 등)를 포함하는 진핵 또는 원핵세포에서 상기 핵산 분자를 복제 및/또는 발현할 수 있는 벡터가 될 수 있고, 구체적으로는 숙주세포에서 상기 폴리뉴클레오티드가 발현될 수 있도록 적절한 프로모터에 작동가능하도록 연결되며, 적어도 하나의 선별마커를 포함하는 벡터가 될 수 있다.
또한, 상기에서 용어, "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
본 출원의 또 하나의 양태는, 본 출원의 벡터가 도입된 형질전환체이다.
본 출원에서 형질전환체는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 벡터가 도입되어 본 출원의 아세토하이드록시산 신타아제 변이체를 발현할 수 있으면 모든 형질전환 가능한 세포가 포함될 수 있다. 구체적으로 형질전환된 에스케리키아속, 코리네박테리움 속, 스트렙토미세스, 브레비박테리움속, 세라티아속, 프로비덴시아속, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO(중국 햄스터 난소 세포, chinese hamster ovary cells), SP2/0(마우스 골수종), 인간 림프아구(human lymphoblastoid), COS, NSO(마우스 골수종), 293T, 보우 멜라노마 세포, HT-1080, BHK(베이비 햄스터 신장세포, baby hamster kidney cells), HEK(인간 배아신장 세포(human embryonic kidney cells), PERC.6(인간망막세포) 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있다.
본 출원의 또 하나의 양태는, 상기 아세토하이드록시산 신타아제 변이체를 포함하거나, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 도입된, L-분지쇄 아미노산을 생산하는 미생물이다.
본 출원에서 용어, "L-분지쇄 아미노산"이란 곁사슬에 분지알킬기가 있는 아미노산을 말하며, 발린, 류신 및 이소류신을 포함한다. 구체적으로, 본 출원에서 상기 L-분지쇄 아미노산은 L-발린 또는 L-류신일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 상기 "미생물"은 야생형 미생물이나, 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함하며, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 약화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물을 모두 포함하는 개념이다. 본 출원의 아세토하이드록시산 신타아제 변이체를 발현할 수 있는 모든 미생물을 지칭하며, 구체적으로는 코리네박테리움속 미생물일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 암모니아게네스, 브레비박테리움 락토퍼멘텀(Brevibacterium lactofermentum), 브레비박테리움 플라범(Brevibacterium flavum), 코리네박테리움 써모아미노게네스(Corynebacterium thermoaminogenes), 코리네박테리움 에피션스(Corynebacterium efficiens) 등일 수 있다. 보다 더욱 구체적으로는 코리네박테리움 글루타미쿰이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, "L-분지쇄 아미노산을 생산하는 미생물"이란 천연형 또는 변이를 통하여 L-분지쇄 아미노산 생산능을 가지고 있는 미생물을 의미하며, 구체적으로 비자연적으로 발생한(non-natural occuring) 재조합 미생물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 L-분지쇄 아미노산을 생산하는 미생물은 본 출원의 아세토하이드록시산 신타아제 변이체를 포함하거나, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 도입된 것으로, 야생형 미생물, 천연형 아세토하이드록시산 신타아제 단백질을 포함하는 미생물, 아세토하이드록시산 신타아제 단백질을 포함하는 비변형 미생물 또는 아세토하이드록시산 신타아제 단백질을 포함하지 않는 미생물에 비하여 L-분지쇄 아미노산 생산능이 현저히 증가될 수 있다.
본 출원의 또 하나의 양태는, 본 출원의 L-분지쇄 아미노산을 생산하는 미생물을 배양하는 단계; 및 상기 단계에서 수득되는 미생물 또는 배지로부터 L-분지쇄 아미노산을 회수하는 단계를 포함하는, L-분지쇄 아미노산 생산 방법이다.
본 출원에서 용어, "배양"은 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원에서 L-분지쇄 아미노산 생산능을 가지는 미생물을 이용한 L-분지쇄 아미노산 생산 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로, 상기 배양은 배치 공정, 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 예를 들어, 코리네박테리움 속 균주에 대한 배양 배지는 공지되어 있다(예를 들면, Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981). 사용될 수 있는 당원으로는 글루코즈, 사카로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함될 수 있다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산 암모늄 및 질산암모늄이 포함될 수 있다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함될 수 있다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유할 수 있다. 추가적으로, 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다. 또한, 배양배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것은 아니다.
수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입할 수 있다. 배양물의 온도는 20 내지 45 ℃, 구체적으로는 25 내지 40 ℃일 수 있다. 배양은 원하는 L-분지쇄 아미노산의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속될 수 있다. 이러한 목적으로 배양시간은 10 내지 160 시간일 수 있다. L-분지쇄 아미노산은 배양 배지 중으로 배출되거나, 세포 중에 포함되어 있을 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것은 아니다.
미생물 또는 배지로부터 L-분지쇄 아미노산을 회수하는 방법은 당업계에 알려진 적합한 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 예컨대 원심분리, 여과, 결정화 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 추출, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피, HPLC 및 이들의 방법을 조합하여 사용될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 또한 상기 L-분지쇄 아미노산을 회수하는 단계는 추가적인 정제단계를 포함할 수 있으며, 당해분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 수행될 수 있다.
본 출원에 따른 아세토하이드록시산 신타아제 변이체는 미생물에 그 활성이 도입되는 경우, 상기 미생물의 L-분지쇄 아미노산 생산능을 현저히 증가시키므로, L-분지쇄 아미노산의 대량 생산에 널리 활용될 수 있다.
이하 본 출원을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 출원의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 인공 돌연변이법을 이용한 변이된 아세토하이드록시산 신타아제 (acetohydroxy acid synthase)를 코딩하는 DNA 라이브러리 제작
본 실시예에서는 아세토하이드록시산 신타아제 변이체를 획득하기 위하여 하기의 방법으로 염색체 내 1 차 교차 삽입용 벡터 라이브러리를 제작하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067 유래의 아세토하이드록시산 신타아제(서열번호 1)를 암호화하는 ilvB 유전자(서열번호 2)를 대상으로 Error-prone PCR 법을 수행하여 염기 치환 변이가 무작위적으로 도입된 ilvB 유전자 변이체(2395bp)들을 획득하였다. Error-prone PCR은 GenemorphII Random Mutagenesis Kit(Stratagene)를 사용하여 수행하였으며, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067 게놈 DNA를 주형으로 하여 프라이머 1(서열번호 3) 및 프라이머 2(서열번호 4)를 사용하였다.
프라이머 1(서열번호 3): 5'- AACCG GTATC GACAA TCCAA T -3'
프라이머 2(서열번호 4): 5'- GGGTC TCTCC TTATG CCTC -3'
증폭된 유전자 단편 내에 변이가 1 kb당 0 내지 3.5 개가 도입되도록 하였으며, PCR 조건은 변성 96 ℃, 30 초; 어닐링 53 ℃, 30 초; 및 중합반응 72 ℃, 2 분을 30 회 반복하였다.
증폭된 유전자 단편을 pCR2.1-TOPO TA 클로닝 키트(Invitrogen 社)를 이용하여 pCR2.1-TOPO 벡터(이하 'pCR2.1')에 연결하였고, 대장균 DH5α에 형질전환하여 카나마이신(25 mg/ℓ)이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. 형질전환된 콜로니 20 종을 선별한 후 플라스미드를 획득하여 염기서열을 분석한 결과 2.1 mutations/kb 빈도로 서로 다른 위치에 변이가 도입된 것을 확인하였다. 약 20,000 개의 형질전환된 대장균 콜로니를 취하여 플라스미드를 추출하였고, 이를 pCR2.1-ilvB(mt) 라이브러리로 명명하였다.
또한, 대조군으로 사용하기 위한 야생형의 ilvB 유전자를 갖는 플라스미드를 제작하였다. 프라이머 1(서열번호 3) 및 프라이머 2(서열번호 4)를 이용하여 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067 게놈 DNA를 주형으로 상기와 같은 조건으로 PCR하였다. 중합효소는 PfuUltra High-Fidelity DNA 중합효소(Stratagene)를 사용하였다. 제작된 플라스미드를 pCR2.1-ilvB(WT)으로 명명하였다.
실시예 2: ilvB 결손 균주 제작
KCCM11201P(대한민국 등록특허 제10-1117022호) 균주를 모균주로 하여 pCR2.1-ilvB(mt) 라이브러리를 도입하기 위한 ilvB 결손 균주를 제작하였다.
ilvB 결손 벡터를 제작하기 위하여 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067의 염색체를 주형으로 하여 프라이머 3(서열번호 5) 및 프라이머 4(서열번호 6), 프라이머 5(서열번호 7) 및 프라이머 6(서열번호 8)을 이용하여 PCR을 수행하였다.
프라이머 3(서열번호 5): 5'- GCGTC TAGAG ACTTG CACGA GGAAA CG -3'
프라이머 4(서열번호 6): 5'- CAGCC AAGTC CCTCA GAATT GATGT AGCAA TTATC C -3'
프라이머 5(서열번호 7): 5'- GGATA ATTGC TACAT CAATT CTGAG GGACT TGGCT G -3'
프라이머 6(서열번호 8): 5'- GCGTC TAGAA CCACA GAGTC TGGAG CC -3'
PCR 조건은 95 ℃에서 5 분간 변성 후, 95 ℃ 30 초 변성, 55 ℃ 30 초 어닐링, 72 ℃ 30 초 중합을 30 회 반복한 후, 72 ℃에서 7 분간 중합반응을 수행하였다.
그 결과 ilvB 유전자 프로모터 앞 부분과 ilvB 유전자 3'말단을 각각 포함하는 731bp의 서열번호 9의 DNA 단편과 712bp의 서열번호 10의 DNA 단편을 수득하였다.
증폭된 서열번호 9과 서열번호 10을 주형으로 하여, 프라이머 3(서열번호 5) 및 프라이머 6(서열번호 8)으로 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95 ℃에서 5 분간 변성 후, 95 ℃ 30 초 변성, 55 ℃ 30 초 어닐링, 72 ℃ 60 초 중합을 30 회 반복한 후, 72 ℃에서 7 분간 중합반응을 수행하였다.
그 결과, ilvB 유전자의 프로모터 앞 부분을 포함하는 DNA 단편과 3'말단을 포함하는 DNA 단편이 연결된 1407bp의 서열번호 11의 DNA 단편(이하 ilvB 단편)이 증폭되었다.
코리네박테리움 글루타미쿰 내에서 복제가 불가능한 pDZ 벡터(대한민국 등록특허 제10-0924065호)와 상기 증폭된 ilvB 단편을 제한효소 Xba로 처리한 뒤, DNA 접합 효소를 이용하여 연결한 후, 클로닝함으로써 플라스미드를 획득하였고 이를 pDZ-ilvB라 명명하였다.
pDZ-ilvB를 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P에 전기펄스법(Appl. Microbiol. Biothcenol.(1999) 52:541-545)으로 각각 형질전환한 후 카나마이신(kanamycin) 25 mg/ℓ 및 L-발린, L-류신, L-이소류신을 각각 2 mM씩 함유한 선별배지에서 형질전환균주를 획득하였다. 2 차 재조합과정(cross-over)으로 게놈상에 삽입된 ilvB 단편에 의하여 ilvB 유전자가 불활성화된 균주를 획득하였고, 이를 KCCM11201PilvB로 명명하였다.
실시예 3: 아세토하이드록시산 신타아제 변이 균주 라이브러리 제작 및 L-아미노산 생산능 증가 균주 선별
상기 제작된 KCCM11201PilvB 균주를 모균주로 하여 상기 제작된 pCR2.1-ilvB(mt) 라이브러리를 상동염색체 재조합에 의해 형질전환하고 카나마이신(25 mg/L)이 포함된 복합평판배지에 도말하여 약 10,000 개의 콜로니를 확보하였으며, 각 콜로니를 KCCM11201PilvB/pCR2.1-ilvB(mt)-1부터 KCCM11201PilvB/pCR2.1-ilvB(mt)-10000까지로 명명하였다.
또한, 상기 제작된 pCR2.1-ilvB(WT) 벡터를 KCCM11201PilvB 균주에 형질전환하여 대조군 균주를 제작하였으며, KCCM11201PilvB/pCR2.1-ilvB(WT)으로 명명하였다.
<복합평판배지(pH 7.0)>
포도당 10 g, 펩톤 10 g, 소고기 추출물 5 g, 효모 추출물 5 g, 뇌심장침출액(brain heart infusion) 18.5 g, NaCl 2.5 g, 요소 2 g, 소르비톨(sorbitol) 91 g, 한천 20 g (증류수 1 리터 기준)
확보된 약 10,000개의 콜로니를 각각 300 ㎕의 선별배지에 접종하여 96-딥 웰 플레이트에서 32 ℃, 1000 rpm으로 약 24 시간 동안 배양하였다. 배양액에 생산된 L-아미노산의 생산량을 분석하기 위하여 닌하이드린 방법을 이용하였다(J. Biol. Chem. 1948. 176:367-388). 배양이 완료된 후 배양 상층액 10 ㎕와 닌하드린 반응용액 190 ㎕를 65 ℃에서 30 분간 반응시킨 후 파장 570 nm에서 분광광도계(spectrophotometer)로 흡광도를 측정하고 대조군 KCCM11201PilvB/pCR2.1-ilvB(WT) 균주의 흡광도와 비교해 10 % 이상 증가된 흡광도를 보이는 변이 균주 약 213개의 콜로니를 선별하였다. 그 외 콜로니들은 대조구 대비 유사 또는 감소한 흡광도를 나타내었다.
<선별배지(pH 8.0)>
포도당 10 g, 황산암모늄 5.5 g, 황산마그네슘7수염 1.2 g, 제1인산칼륨 0.8 g, 제2인산칼륨 16.4 g, 비오틴 100 ㎍, 티아민-HCl 1000 ㎍, 판토텐산칼슘 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)
선별된 213 개의 균주는 상기와 같은 방법으로 닌하이드린 반응을 반복 수행하였으며, KCCM11201PilvB/pCR2.1-ilvB(WT) 균주 대비 L-아미노산 생산능이 향상된 균주 상위 60종을 선별하였다.
실시예 4: 아세토하이드록시산 신타아제 변이 균주 라이브러리 선별주의 L-발린 생산능 확인
상기 실시예 3에서 선별한 60종 균주들의 L-발린 생산능을 비교하고자 아래와 같은 방법으로 배양하여 배양액 성분을 분석하였다.
생산 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 1백금이 접종하고, 30 ℃에서 72 시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. HPLC를 이용하여 L-발린의 농도를 분석하였다.
<생산배지(pH 7.0)>
포도당 100 g, 황산암모늄 40 g, 대두단백질 2.5 g, 옥수수침지고형분 Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, 제2인산칼륨 1 g, 황산마그네슘7수염 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민-HCl 1000 ㎍, 판토텐산칼슘 2000 ㎍, 니코틴아마이드 3000 ㎍, 탄산칼슘 30 g (증류수 1리터 기준)
60종의 균주 중 L-발린 농도가 향상된 균주 2종을 선별하여 상기 배양 및 분석을 반복수행 하였으며, 분석된 L-발린의 농도는 하기 표 1과 같다. 나머지 58종의 균주는 L-발린 농도가 오히려 하락하는 결과를 보였다.
선별된 2종의 KCCM11201PilvB/pCR2.1-ilvB(mt) L-발린 생산 농도
균주 L-발린 (g/ℓ)
배치 1 배치 2 배치 3 평균
대조군 KCCM11201PilvB/pCR2.1-ilvB(WT) 2.7 2.9 2.9 2.8
1 KCCM11201PilvB/pCR2.1-ilvB(mt)-5602 3.1 3.5 3.4 3.3
2 KCCM11201PilvB/pCR2.1-ilvB(mt)-7131 2.9 3.3 3.1 3.1
L-발린 농도 분석 결과, 상기 2종 선별주의 L-발린 수율이 대조군 KCCM11201PilvB/pCR2.1-ilvB(WT) 균주 대비 최대 20.7 % 증가함을 확인하였다.
실시예 5: 아세토하이드록시산 신타아제 변이 균주 라이브러리 선별주의 ilvB 유전자 변이 확인
상기 실시예 4에서 선별된 2종 균주들의 아세토하이드록시산 신타아제에 도입된 무작위 변이를 확인하기 위하여 ilvB 유전자의 염기서열을 분석하였다. 염기서열을 결정하기 위해 프라이머 7(서열번호 12) 및 프라이머 8(서열번호 13)을 사용하여 PCR을 수행하였다.
프라이머 7(서열번호 12): 5'- CGCTT GATAA TACGC ATG -3'
프라이머 8(서열번호 13): 5'- GAACA TACCT GATAC GCG -3'
확보된 각각의 변이형 ilvB 유전자 단편들의 염기서열 분석을 통하여, 서열번호 2의 야생형 ilvB 유전자 염기서열과 비교하여 변이형 ilvB 유전자의 염기서열을 확인하였으며, 이를 통해 변이된 아세토하이드록시산 신타아제 단백질의 아미노산 서열을 확인하였다. 선별된 균주 2종의 변이된 아세토하이드록시산 신타아제 단백질의 정보는 하기 표 2와 같다.
선별 2종 KCCM11201P/pCR2.1-ilvB(mt) 변이된
아세토하이드록시산 신타아제 단백질 정보
균주 아세토하이드록시산 신타아제 아미노산 변이
KCCM11201PilvB /pCR2.1-ilvB(mt)-5602 W503Q
KCCM11201PilvB /pCR2.1-ilvB(mt)-7131 T96S
실시예 6: 아세토하이드록시산 신타아제 변이 도입용 벡터 제작
상기 실시예 5에서 확인된 변이된 아세토하이드록시산 신타아제 단백질의 효과를 확인하기 위하여 이를 염색체상에 도입할 수 있는 벡터를 제작하였다.
확인된 염기서열에 근거하여 5' 말단에 Xba 제한효소 부위를 삽입한 프라이머 9(서열번호 14)와 프라이머 10(서열번호 15), 및 프라이머 11(서열번호 16)과 프라이머 12(서열번호 17)를 합성하였다. 이 프라이머 쌍을 이용하여, 상기 선별된 2종의 염색체를 각각 주형으로 PCR을 수행하여 2종의 변이형 ilvB 유전자 단편을 증폭하였다. PCR 조건은 94 ℃에서 5 분간 변성 후, 94 ℃ 30 초 변성, 56 ℃ 30 초 어닐링, 72 ℃ 2 분 중합을 30 회 반복한 후, 72 ℃에서 7 분간 중합반응을 수행하였다.
프라이머 9(서열번호 14): 5'- CGCTC TAGAC AAGCA GGTTG AGGTT CC -3'
프라이머 10(서열번호 15): 5'- CGCTC TAGAC ACGAG GTTGA ATGCG CG -3'
프라이머 11(서열번호 16): 5'- CGCTC TAGAC CCTCG ACAAC ACTCA CC -3'
프라이머 12(서열번호 17): 5'- CGCTC TAGAT GCCAT CAAGG TGGTG AC -3'
PCR로 증폭된 2종의 유전자 단편을 제한효소 Xba로 처리하여 각각의 DNA 절편을 획득한 후, 이를 제한효소 Xba 말단을 가지는 염색체 도입용 pDZ 벡터에 연결한 후 대장균 DH5α에 형질전환하고 카나마이신(25 mg/ℓ)이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다.
PCR을 통해 목적한 유전자가 삽입된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별한 후 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였고 이 플라스미드의 ilvB 유전자에 삽입된 변이에 따라 각각 pDZ-ilvB(W503Q), pDZ- ilvB(T96S)로 명명하였다.
실시예 7: KCCM11201P 유래 아세토하이드록시산 신타아제 변이 도입 균주 제작 및 L-발린 생산능 비교
상기 실시예 6에서 제조한 신규 변이 도입 벡터 2종을 각각 2 단계 상동염색체 재조합에 의해 L-발린 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P에 형질전환시켰다. 그 후 염색체 상의 ilvB 변이가 도입된 균주를 염기서열 분석에 의하여 선별하였으며, 상기 ilvB 변이가 도입된 균주를 각각 KCCM11201P::ilvB(W503Q) 및 KCCM11201P::ilvB(T96S)로 명명하였다. 그리고 상기 변이 도입 벡터 중 pDZ- ilvB(T96S)를 상기 제작한 균주 KCCM11201P::ilvB(W503Q)에 형질전환시켰다. 그 후 염색체 상의 ilvB 변이 2종이 모두 도입된 균주를 각각 KCCM11201P::ilvB(W503Q/T96S)로 명명하였다.
실시예 4과 동일한 방법으로 배양하여, 이로부터 L-발린의 농도를 분석하였다 (표 3).
KCCM11201P 균주 유래 변이된 아세토하이드록시산 신타아제 도입 균주 L-발린 생산 농도 (g/ℓ)
균주 배치 1 배치 2 배치 3 평균
대조군 KCCM11201P 2.9 2.8 2.8 2.8
1 KCCM11201P::ilvB(W503Q) 3.3 3.2 3.3 3.3
2 KCCM11201P::ilvB(T96S) 3.2 3.0 3.1 3.1
3 KCCM11201P::ilvB(W503Q/T96S) 3.3 3.4 3.4 3.4
2종의 신규 변이 도입 균주(KCCM11201P::ilvB(W503Q), KCCM11201P::ilvB(T96S))는 모균주 대비 L-발린 생산능이 최대 17.8 % 증가하였으며, 2종 변이가 모두 도입된 균주 (KCCM11201P::ilvB(W503Q/T96S))는 모균주 대비 L-발린 생산능이 21.4 % 증가하였다.
이에, 본 발명의 아세토하이드록시산 신타아제 큰 소단위체의 변이체는 L-분지쇄 아미노산의 생합성 경로중 첫번째 효소이므로, L-발린뿐만 아니라, L-이소류신 및 L-류신의 생산능 증가에도 영향을 미칠 것으로 예상된다.
본 발명자들은 상기 L-발린이 향상된 균주인 KCCM11201P::ilvB(W503Q) 및 KCCM11201P::ilvB(T96S)를 코리네박테리움 글루타미쿰 KCJ-0793 및 KCJ-0796라 명명하였고, 한국미생물보존센터(KCCM)에 2016년 1월 25일자로 기탁하여 수탁번호 KCCM11809P 및 KCCM11810P를 부여받았다.
실시예 8: 변이된 아세토하이드록시산 신타아제를 코딩하는 DNA가 포함된 L-발린 생합성 과발현 벡터의 제작
대조군으로서 L-발린 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P으로부터 L-발린 생합성 과발현 벡터를 제작하였다. 또한 상기 실시예 7에서 제조한 각각의 KCCM11201P::ilvB(W503Q), KCCM11201P::ilvB(T96S)로부터 변이된 아세토하이드록시산 신타아제를 코딩하는 DNA가 포함된 L-발린 생합성 과발현 벡터를 제작하였다.
상기 벡터의 제작을 위해 5' 말단에 BamH 제한효소 부위를 삽입한 프라이머 13(서열번호 18)과 3' 말단에 Xba 제한효소 부위를 삽입한 프라이머 14(서열번호 19)를 합성하였다. 이 프라이머 쌍을 이용하여, L-발린 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P 및 상기 실시예 7에서 제조한 KCCM11201P::ilvB(W503Q), KCCM11201P::ilvB(T96S)의 염색체를 각각 주형으로 PCR을 수행하여 2종의 변이형 ilvBN 유전자 단편을 증폭하였다. PCR 조건은 94 ℃에서 5 분간 변성 후, 94 ℃ 30 초 변성, 56 ℃ 30 초 어닐링, 72 ℃ 4 분 중합을 30 회 반복한 후, 72 ℃에서 7 분간 중합반응을 수행하였다.
프라이머 13(서열번호 18): 5'- CGAGG ATCCA ACCGG TATCG ACAAT CCAAT -3'
프라이머 14(서열번호 19): 5'- CTGTC TAGAA ATCGT GGGAG TTAAA CTCGC -3'
상기 PCR로 증폭된 2종의 유전자 단편을 제한효소 BamH와 Xba로 처리하여 각각의 DNA 절편을 획득한 후, 이를 제한효소 BamH와 Xba 말단을 가지는 과발현 벡터 pECCG117에 연결한 후 대장균 DH5α에 형질전환하고 카나마이신(25 mg/ℓ)이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다.
PCR을 통해 목적한 유전자가 삽입된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별한 후 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였고 이 플라스미드의 ilvB 유전자에 삽입된 변이에 따라 각각 pECCG117-ilvBN, pECCG117-ilvB(W503Q)N, pECCG117-ilvB(T96S)N으로 명명하였다.
실시예 9: 동일 변이 위치에서 다른 아미노산으로 치환된 아세토하이드록시산 신타아제를 코딩하는 DNA가 포함된 L-발린 생합성 과발현 벡터의 제작
실시예 5에서 확인된 변이된 아세토하이드록시산 신타아제 단백질에 있어서, 변이 위치의 효과를 확인하고자, 96 번째 아미노산이 쓰레오닌 또는 세린 이외의 아미노산으로, 503 번째 아미노산이 트립토판 또는 글루타민 이외의 아미노산으로 치환된 변이를 포함하는 벡터를 제작하였다.
구체적으로, L-발린 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P으로부터 아세토하이드록시산 신타아제의 503 번째 아미노산이 아스파라긴 또는 류신으로 치환된 형태의 변이 또는 96 번째 아미노산이 알라닌 또는 시스테인으로 치환된 형태의 변이가 포함된 L-발린 생합성 과발현 벡터를 제작하였다. 상기 치환된 아미노산은 치환할 수 있는 아미노산의 대표적인 예시일 뿐, 이에 제한 되는 것은 아니다.
상기 벡터의 제작을 위해 먼저, 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P 균주의 염색체를 주형으로 프라이머 13(서열번호 18) 및 프라이머 15(서열번호 20), 프라이머 16(서열번호 21) 및 프라이머 14(서열번호 19)를 이용해 PCR을 수행하여, 5' 말단에 BamH 제한효소 부위를 가지는 약 2041bp의 DNA 단편과 3' 말단에 Xba 제한효소 부위를 가지는 1055bp의 DNA 단편을 증폭하였다. PCR 조건은 94 ℃에서 5 분간 변성 후, 94 ℃ 30 초 변성, 56 ℃ 30 초 어닐링, 72 ℃ 2 분 중합을 30 회 반복한 후, 72 ℃에서 7 분간 중합반응을 수행하였다.
프라이머 15(서열번호 20): 5'- CTTCA TAGAA TAGGG TCTGG TTTTG GCGAA CCATG CCCAG -3'
프라이머 16(서열번호 21): 5'- CTGGG CATGG TTCGC CAAAA CCAGA CCCTA TTCTA TGAAG -3'
그 후, 증폭된 두 DNA 단편을 주형으로 하여, 프라이머 13(서열번호 18) 및 프라이머 14(서열번호 19)로 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 94 ℃에서 5 분간 변성 후, 94 ℃ 30 초 변성, 56 ℃ 30 초 어닐링, 72 ℃ 4 분 중합을 30 회 반복한 후, 72 ℃에서 7 분간 중합반응을 수행하였다.
그 결과, 아세토하이드록시산 신타아제의 503 번째 아미노산이 아스파라긴으로 치환된 형태의 변이가 포함된 ilvBN 유전자 단편을 수득하였다.
동일한 방법으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P 균주의 염색체를 주형으로 프라이머 13(서열번호 18) 및 프라이머 17(서열번호 22), 프라이머 18(서열번호 23) 및 프라이머 14(서열번호 19)를 이용해 PCR을 수행하여, 5' 말단에 BamH 제한효소 부위를 가지는 약 2041bp의 DNA 단편과 3' 말단에 Xba 제한효소 부위를 가지는 1055bp의 DNA 단편을 증폭하였다.
프라이머 17(서열번호 22): 5'- CTTCA TAGAA TAGGG TCTGC AGTTG GCGAA CCATG CCCAG -3'
프라이머 18(서열번호 23): 5'- CTGGG CATGG TTCGC CAACT GCAGA CCCTA TTCTA TGAAG -3'
그 후, 증폭된 두 DNA 단편을 주형으로 하여, 프라이머 13(서열번호 18) 및 프라이머 14(서열번호 19)로 PCR을 수행하였다.
그 결과, 아세토하이드록시산 신타아제의 503 번째 아미노산이 류신으로 치환된 형태의 변이가 포함된 ilvBN 유전자 단편을 수득하였다.
동일한 방법으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P 균주의 염색체를 주형으로 프라이머 13(서열번호 18) 및 프라이머 19(서열번호 24), 프라이머 20(서열번호 25) 및 프라이머 14(서열번호 19)를 이용해 PCR을 수행하여, 5' 말단에 BamH 제한효소 부위를 가지는 약 819bp의 DNA 단편과 3' 말단에 Xba 제한효소 부위를 가지는 2276bp의 DNA 단편을 증폭하였다.
프라이머 19(서열번호 24): 5'- GGTTG CGCCT GGGCC AGATG CTGCA ATGCA GACGC CAAC -3'
프라이머 20(서열번호 25): 5'- GTTGG CGTCT GCATT GCAGC ATCTG GCCCA GGCGC AACC -3'
그 후, 증폭된 두 DNA 단편을 주형으로 하여, 프라이머 13(서열번호 18) 및 프라이머 14(서열번호 19)로 PCR을 수행하였다.
그 결과, 아세토하이드록시산 신타아제의 96 번째 아미노산이 알라닌으로 치환된 형태의 변이가 포함된 ilvBN 유전자 단편을 수득하였다.
동일한 방법으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P 균주의 염색체를 주형으로 프라이머 13(서열번호 18) 및 프라이머 21(서열번호 26), 프라이머 22(서열번호 27) 및 프라이머 14(서열번호 19)를 이용해 PCR을 수행하여, 5' 말단에 BamH 제한효소 부위를 가지는 약 819bp의 DNA 단편과 3' 말단에 Xba 제한효소 부위를 가지는 2276bp의 DNA 단편을 증폭하였다.
프라이머 21(서열번호 26): 5'- GGTTG CGCCT GGGCC AGAGC ATGCA ATGCA GACGC CAAC -3'
프라이머 22(서열번호 27): 5'- GTTGG CGTCT GCATT GCATG CTCTG GCCCA GGCGC AACC -3'
그 후, 증폭된 두 DNA 단편을 주형으로 하여, 프라이머 13(서열번호 18) 및 프라이머 14(서열번호 19)로 PCR을 수행하였다.
그 결과, 아세토하이드록시산 신타아제의 96 번째 아미노산이 시스테인으로 치환된 형태의 변이가 포함된 ilvBN 유전자 단편을 수득하였다.
실시예 8과 같은 방법으로, PCR로 증폭된 상기 4 종의 변이형 유전자 단편을 제한효소 BamH와 Xba으로 처리하여 각각의 DNA 절편을 획득한 후, 이를 제한효소 BamH와 Xba 말단을 가지는 과발현 벡터 pECCG117에 연결한 후 대장균 DH5α에 형질전환하고 카나마이신(25 mg/ℓ)이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다.
PCR을 통해 목적한 유전자가 삽입된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별한 후 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였고 이 플라스미드의 ilvB 유전자에 삽입된 변이에 따라 각각 순서대로 pECCG117-ilvB(W503N)N, pECCG117-ilvB(W503L)N, pECCG117-ilvB(T96A)N, pECCG117-ilvB(T96C)N으로 명명하였다.
실시예 10: 야생형 유래 변이된 아세토하이드록시산 신타아제 도입 균주 제작 및 L-발린 생산능 비교
상기 실시예 8 및 실시예 9에서 제조한 L-발린 생합성 과발현 벡터 pECCG117-ilvBN, pECCG117-ilvB(W503Q)N, pECCG117-ilvB(T96S)N 및 pECCG117-ilvB(W503N)N, pECCG117-ilvB(W503L)N, pECCG117-ilvB(T96A)N, pECCG117-ilvB(T96C)N를 코리네박테리움 글루타미쿰 야생형 균주 ATCC13032에 전기천공법으로 각각 삽입하였다. 제작된 균주는 각각 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032::pECCG117-ilvBN, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032::pECCG117-ilvB(W503Q)N, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032::pECCG117-ilvB(T96S)N, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032::pECCG117-ilvB(W503N)N, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032::pECCG117-ilvB(W503L)N, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032::pECCG117-ilvB(T96A)N 및 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032::pECCG117-ilvB(T96C)N으로 명명하였다. 벡터가 형질전환 될 경우 카나마이신 내성을 가지게 되므로 카나마이신이 25 mg/ℓ의 농도로 포함된 배지에서의 생장여부를 통해 형질 전환을 확인하였다.
제작된 균주를 평가하기 위해 실시에 4에서 사용한 배지와 동일한 방법으로, 생산배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 접종하고, 30 ℃에서 72 시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. HPLC를 이용하여 L-발린의 농도를 분석하였다(표 4).
야생형 유래 변이된 아세토하이드록시산 신타아제 도입 균주의 L-발린 생산 농도
균주 L-발린 (g/ℓ)
배치 1 배치 2 배치 3 평균
대조군 ATCC13032::pECCG117-ilvBN 0.1 0.1 0 0.1
1 ATCC13032::pECCG117-ilvB(W503Q)N 0.8 0.8 0.7 0.8
2 ATCC13032::pECCG117-ilvB(T96S)N 0.4 0.5 0.5 0.5
3 ATCC13032::pECCG117-ilvB(W503N)N 0.7 0.6 0.5 0.6
4 ATCC13032::pECCG117-ilvB(W503L)N 0.7 0.7 0.5 0.5
5 ATCC13032::pECCG117-ilvB(T96A)N 0.2 0.3 0.2 0.2
6 ATCC13032::pECCG117-ilvB(T96C)N 0.4 0.3 0.5 0.4
그 결과, 아세토하이드록시산 신타아제의 96 번째 또는 503 번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 신규 변이는 대조군 대비 L-발린 생산능이 최대 700 % 증가된 것을 확인하였다. 이로부터 상기 96번째 503번째 위치의 중요성을 확인하였으며, 또한, L-발린 뿐만 아니라 다른 분지쇄 아미노산의 생산능에도 영향을 미칠 것으로 예상된다.
실시예 11: 변이된 아세토하이드록시산 신타아제 도입 균주 제작 및 L-류신 생산능 비교
본 출원의 아세토하이드록시산 신타아제 큰 소단위체의 변이체가 다른 L-분지쇄 아미노산의 생산능 증가에도 영향을 미치는지 확인하기 위하여, L-분지쇄 아미노산의 또 다른 예로서 L-류신의 생산능을 확인하였다.
구체적으로 상기 실시예 6에서 제조한 신규변이 도입 벡터 2종을 각각 2단계 상동염색체 재조합에 의해 L-류신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11661P(대한민국 특허 출원번호 제10-2015-0119785호, 대한민국 공개특허 제10-2017-0024653호)에 형질전환시켰다. 그 후 염색체 상의 ilvB 변이가 도입된 균주를 염기서열 분석에 의하여 선별하였으며, 상기 ilvB 변이가 도입된 균주를 각각 KCCM11661P::ilvB(W503Q) 및 KCCM11661P::ilvB(T96S)로 명명하였다.
상기 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11661P은 노르류신(Norleucine, NL)에 대한 내성을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 14067 유래 돌연변이주로서 다음과 같은 방법에 의해 수득되었다.
구체적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 14067을 활성화 배지에서 16시간 동안 배양하여 활성화된 균주를 121 ℃에서 5분간 멸균한 종배지에 접종하여 14시간 동안 배양한 후, 배양액 5 ㎖를 회수하였다. 회수한 배양액을 100 mM 시트르산 완충용액(citric buffer)으로 세척한 후, NTG(N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)를 최종농도 200 mg/L가 되게 첨가한 후, 20분 동안 처리하고, 100 mM 인산 완충용액(phosphate buffer)으로 세척하였다. NTG로 처리된 균주를 최소배지에 도말하여 사멸율을 계산해본 결과 사멸율은 85 %였다. L-류신의 유도체에 해당하는 노르류신(Norleucine, NL)에 대한 내성 변이주를 구하기 위해서, NTG가 처리된 균주를 NL의 최종농도가 각각 20 mM, 30mL, 40 mM 및 50 mM이 되게 첨가된 최소배지에 도말하고, 30 ℃에서 5일간 배양하여 NL 내성 변이주를 획득하였다.
<활성화배지>
육즙 1 %, 폴리펩톤 1 %, 소듐클로라이드 0.5 %, 효모엑기스 1 %, 한천 2 %, pH 7.2
<종배지>
포도당 5 %, 박토펩톤 1 %, 소듐클로라이드 0.25 %, 효모엑기스 1 %, 요소 0.4 %, pH 7.2
<최소배지>
포도당 1.0 %, 황산암모늄 0.4 %, 황산마그네슘 0.04 %, 인산제1칼륨 0.1 %, 요소 0.1 %, 티아민 0.00 1%, 비오틴 200 ㎍/L, 한천 2 %, pH 7.0
상기의 방법으로 얻어진 변이주는 코리네박테리움 글루타미쿰 KCJ-24(Corynebacterium glutamicum KCJ-24)라 명명하였고, 2015년 1월 22일자로 부다페스트 조약하의 국제 기탁기관인 한국미생물보존센터에 기탁하여 각각 수탁번호 KCCM11661P를 부여받았다.
상기 KCCM11661P::ilvB(W503Q) 및 KCCM11661P::ilvB(T96S)를 실시예 4와 동일한 방법으로 배양하여, 이로부터 L-류신의 농도를 분석하였다 (표 5).
KCCM11661P 균주 유래 변이된 아세토하이드록시산 신타아제 도입 균주의 L-류신 생산 농도 (g/ℓ)
균주 배치 1 배치 2 배치 3 평균
대조군 KCCM11661P 2.7 2.6 2.9 2.7
1 KCCM11661P::ilvB(W503Q) 3.1 3.3 3.3 3.2
2 KCCM11661P P::ilvB(T96S) 3.0 3.2 3.1 3.1
2종의 신규 변이 도입 균주(KCCM11661P::ilvB(W503Q), KCCM11661P::ilvB(T96S))는 모균주 대비 L-류신 생산능이 최대 26.9 % 증가하였다.
실시예 12: KCCM11662P 유래 변이된 아세토하이드록시산 신타아제 도입 균주 제작 및 L-류신 생산능 비교
상기 실시예 6에서 제조한 신규변이 도입 벡터 2종을 각각 2단계 상동염색체 재조합에 의해 다른 L-류신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11662P(대한민국 특허 출원번호 제10-2015-0119785호, 대한민국 공개특허 제10-2017-0024653호)에 형질전환시켰다. 그 후 염색체 상의 ilvB 변이가 도입된 균주를 염기서열 분석에 의하여 선별하였으며, 상기 ilvB 변이가 도입된 균주를 각각 KCCM11662P::ilvB(W503Q) 및 KCCM11662P::ilvB(T96S)로 명명하였다.
상기 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11662P은 노르류신(Norleucine, NL)에 대한 내성을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869 유래 돌연변이주로서 다음과 같은 방법에 의해 수득되었다.
구체적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869를 모균주로 하여, 실시예 11의 KCCM11662P를 수득하는 방법과 동일한 방법으로 배양하였으며, 최종적으로 NL 내성 변이주를 획득하였다.
상기의 방법으로 얻어진 변이주는 코리네박테리움 글루타미쿰 KCJ-28(Corynebacterium glutamicum KCJ-28)라 명명하였고, 2015년 1월 22일자로 부다페스트 조약하의 국제 기탁기관인 한국미생물보존센터에 기탁하여 각각 수탁번호 KCCM11662P를 부여받았다.
상기 KCCM11662P::ilvB(W503Q) 및 KCCM11662P::ilvB(T96S)를 실시예 4과 동일한 방법으로 배양하여, 이로부터 L-류신의 농도를 분석하였다 (표 6).
KCCM11662P 균주 유래 변이된 아세토하이드록시산 신타아제 도입 균주의 L-류신 생산 농도 (g/ℓ)
균주 배치 1 배치 2 배치 3 평균
대조군 KCCM11662P 3.1 3.0 3.1 3.1
1 KCCM11662P::ilvB(W503Q) 3.5 3.4 3.3 3.4
2 KCCM11662P P::ilvB(T96S) 3.3 3.3 3.2 3.3
상기 2종의 신규 변이 도입주(KCCM11662P::ilvB(W503Q), KCCM11662P::ilvB(T96S))는 모균주 대비 L-류신 생산능이 최대 13.3 % 증가하였다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM11809P 20160125 한국미생물보존센터(국외) KCCM11810P 20160125
<110> CJ CheilJedang Corporation <120> Acetohydroxy acid synthase variant, microorganism comprising thereof, and method of producing L-branced-chained amino acid using the same <130> KPA151321-KR-D1 <160> 39 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 626 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> acetohydroxy acid synthase <400> 1 Met Asn Val Ala Ala Ser Gln Gln Pro Thr Pro Ala Thr Val Ala Ser 1 5 10 15 Arg Gly Arg Ser Ala Ala Pro Glu Arg Met Thr Gly Ala Gln Ala Ile 20 25 30 Val Arg Ser Leu Glu Glu Leu Asn Ala Asp Ile Val Phe Gly Ile Pro 35 40 45 Gly Gly Ala Val Leu Pro Val Tyr Asp Pro Leu Tyr Ser Ser Thr Lys 50 55 60 Val Arg His Val Leu Val Arg His Glu Gln Gly Ala Gly His Ala Ala 65 70 75 80 Thr Gly Tyr Ala Gln Val Thr Gly Arg Val Gly Val Cys Ile Ala Thr 85 90 95 Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val Thr Pro Ile Ala Asp Ala Asn 100 105 110 Leu Asp Ser Val Pro Met Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Gly Ser Gly 115 120 125 Leu Leu Gly Thr Asp Ala Phe Gln Glu Ala Asp Ile Arg Gly Ile Thr 130 135 140 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<213> Artificial Sequence <220> <223> T96C <400> 36 gtgaatgtgg cagcttctca acagcccact cccgccacgg ttgcaagccg tggtcgatcc 60 gccgcccctg agcggatgac aggtgcacag gcaattgttc gatcgctcga ggagcttaac 120 gccgacatcg tgttcggtat tcctggtggt gcggtgctac cggtgtatga cccgctctat 180 tcctccacaa aggtgcgcca cgtcctggtg cgccacgagc agggcgcagg ccacgcagca 240 accggctacg cgcaggttac tggacgcgtt ggcgtctgca ttgcatgctc tggcccaggc 300 gcaaccaact tggttacccc aatcgctgat gcaaacttgg actccgttcc catggttgcc 360 atcaccggcc aggtcggaag tggcctgctg ggtaccgatg ctttccagga agccgatatc 420 cgcggcatca ccatgccagt gaccaagcac aacttcatgg tcaccgaccc caacgacatt 480 ccacaggcat tggctgaggc attccacctc gcgattactg gtcgccctgg ccctgttctg 540 gtggatattc ctaaggatgt ccaaaacgct gaattggatt tcgtctggcc accaaagatc 600 gacctgccag gctaccgccc agtttctact ccgcatgctc gacagattga gcaggctgtc 660 aaactgatcg gtgaagccaa aaagccagtc ctttacattg gcggcggcgt tatcaaggct 720 gatgcacacg aagaactgcg tgcatttgct gagtacaccg gcatcccagt tgtcaccacc 780 ttgatggcat tgggtacctt cccagagtcc 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gtggatattc ctaaggatgt ccaaaacgct gaattggatt tcgtctggcc accaaagatc 600 gacctgccag gctaccgccc agtttctact ccgcatgctc gacagattga gcaggctgtc 660 aaactgatcg gtgaagccaa aaagccagtc ctttacattg gcggcggcgt tatcaaggct 720 gatgcacacg aagaactgcg tgcatttgct gagtacaccg gcatcccagt tgtcaccacc 780 ttgatggcat tgggtacctt cccagagtcc cacgagctgc acatgggtat gccaggcatg 840 cacggcaccg tgtccgctgt tggcgcactg cagcgcagtg acctgctgat tgctatcggt 900 tcccgcttcg acgaccgcgt caccggtgac gttgacacct tcgcacctga tgccaagatc 960 attcacgctg acattgatcc tgccgaaatc ggcaagatca agcaggttga ggttccaatc 1020 gtgggcgatg cccgcgaggt tcttgctcgt ctgctggaaa ccaccaaggc aagcaaggca 1080 gagaccgagg acatctccga gtgggttgat tacctcaagg gcctcaaggc acgtttccca 1140 cgtggctacg acgagcagcc aggcgatctg ctggcaccac agtttgtcat tgaaaccctg 1200 tccaaggaag ttggccccga cgcaatttac tgcgccggcg ttggccagca ccagatgtgg 1260 gcagctcagt tcgttgactt tgaaaagcca cgcacctggc tcaactctgg cggcctgggc 1320 accatgggct acgcagttcc tgcggctctt ggagcaaagg ctggcgcacc tgacaaggaa 1380 gtctgggcta tcgacggcga cggctgtttc cagatgacca accaggaact caccaccgcc 1440 gcagttgaag gtttccccat taagatcgca ctaatcaaca acggaaacct gggcatggtt 1500 cgccaacagc agaccctatt ctatgaagga cggtactcaa atactaaact tcgtaaccag 1560 ggcgagtaca tgcccgactt tgttaccctt tctgagggac ttggctgtgt tgccatccgc 1620 gtcaccaaag cggaggaagt actgccagcc atccaaaagg ctcgagagat caacgaccgc 1680 ccagtagtca tcgacttcat cgtcggtgaa gacgcacagg tatggccaat ggtgtctgct 1740 ggatcatcca actccgatat ccagtacgca ctcggattgc gcccattctt tgatggtgat 1800 gaatctgcag cagaagatcc tgccgacatt cacgaagccg tcagcgacat tgatgccgcc 1860 gttgaatcga ccgaggcata a 1881 <210> 38 <211> 1881 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> W503N <400> 38 gtgaatgtgg cagcttctca acagcccact cccgccacgg ttgcaagccg tggtcgatcc 60 gccgcccctg agcggatgac aggtgcacag gcaattgttc gatcgctcga ggagcttaac 120 gccgacatcg tgttcggtat tcctggtggt gcggtgctac cggtgtatga cccgctctat 180 tcctccacaa aggtgcgcca cgtcctggtg cgccacgagc agggcgcagg ccacgcagca 240 accggctacg cgcaggttac tggacgcgtt ggcgtctgca ttgcaacctc tggcccaggc 300 gcaaccaact tggttacccc aatcgctgat gcaaacttgg actccgttcc catggttgcc 360 atcaccggcc aggtcggaag tggcctgctg ggtaccgatg ctttccagga agccgatatc 420 cgcggcatca ccatgccagt gaccaagcac aacttcatgg tcaccgaccc caacgacatt 480 ccacaggcat tggctgaggc attccacctc gcgattactg gtcgccctgg ccctgttctg 540 gtggatattc ctaaggatgt ccaaaacgct gaattggatt tcgtctggcc accaaagatc 600 gacctgccag gctaccgccc agtttctact ccgcatgctc gacagattga gcaggctgtc 660 aaactgatcg gtgaagccaa aaagccagtc ctttacattg gcggcggcgt tatcaaggct 720 gatgcacacg aagaactgcg tgcatttgct gagtacaccg gcatcccagt tgtcaccacc 780 ttgatggcat tgggtacctt cccagagtcc cacgagctgc acatgggtat gccaggcatg 840 cacggcaccg tgtccgctgt tggcgcactg cagcgcagtg acctgctgat tgctatcggt 900 tcccgcttcg acgaccgcgt caccggtgac gttgacacct tcgcacctga tgccaagatc 960 attcacgctg acattgatcc tgccgaaatc ggcaagatca agcaggttga ggttccaatc 1020 gtgggcgatg cccgcgaggt tcttgctcgt ctgctggaaa ccaccaaggc aagcaaggca 1080 gagaccgagg acatctccga gtgggttgat tacctcaagg gcctcaaggc acgtttccca 1140 cgtggctacg acgagcagcc aggcgatctg ctggcaccac agtttgtcat tgaaaccctg 1200 tccaaggaag ttggccccga cgcaatttac tgcgccggcg ttggccagca ccagatgtgg 1260 gcagctcagt tcgttgactt tgaaaagcca cgcacctggc tcaactctgg cggcctgggc 1320 accatgggct acgcagttcc tgcggctctt ggagcaaagg ctggcgcacc tgacaaggaa 1380 gtctgggcta tcgacggcga cggctgtttc cagatgacca accaggaact caccaccgcc 1440 gcagttgaag gtttccccat taagatcgca ctaatcaaca acggaaacct gggcatggtt 1500 cgccaaaacc agaccctatt ctatgaagga cggtactcaa atactaaact tcgtaaccag 1560 ggcgagtaca tgcccgactt tgttaccctt tctgagggac ttggctgtgt tgccatccgc 1620 gtcaccaaag cggaggaagt actgccagcc atccaaaagg ctcgagagat caacgaccgc 1680 ccagtagtca tcgacttcat cgtcggtgaa gacgcacagg tatggccaat ggtgtctgct 1740 ggatcatcca actccgatat ccagtacgca ctcggattgc gcccattctt tgatggtgat 1800 gaatctgcag cagaagatcc tgccgacatt cacgaagccg tcagcgacat tgatgccgcc 1860 gttgaatcga ccgaggcata a 1881 <210> 39 <211> 1881 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> W503L <400> 39 gtgaatgtgg cagcttctca acagcccact cccgccacgg ttgcaagccg tggtcgatcc 60 gccgcccctg agcggatgac aggtgcacag gcaattgttc gatcgctcga ggagcttaac 120 gccgacatcg tgttcggtat tcctggtggt gcggtgctac cggtgtatga cccgctctat 180 tcctccacaa aggtgcgcca cgtcctggtg cgccacgagc agggcgcagg ccacgcagca 240 accggctacg cgcaggttac tggacgcgtt ggcgtctgca ttgcaacctc tggcccaggc 300 gcaaccaact tggttacccc aatcgctgat gcaaacttgg actccgttcc catggttgcc 360 atcaccggcc aggtcggaag tggcctgctg ggtaccgatg ctttccagga agccgatatc 420 cgcggcatca ccatgccagt gaccaagcac aacttcatgg tcaccgaccc caacgacatt 480 ccacaggcat tggctgaggc attccacctc gcgattactg gtcgccctgg ccctgttctg 540 gtggatattc ctaaggatgt ccaaaacgct gaattggatt tcgtctggcc accaaagatc 600 gacctgccag gctaccgccc agtttctact ccgcatgctc gacagattga gcaggctgtc 660 aaactgatcg gtgaagccaa aaagccagtc ctttacattg gcggcggcgt tatcaaggct 720 gatgcacacg aagaactgcg tgcatttgct gagtacaccg gcatcccagt tgtcaccacc 780 ttgatggcat tgggtacctt cccagagtcc cacgagctgc acatgggtat gccaggcatg 840 cacggcaccg tgtccgctgt tggcgcactg cagcgcagtg acctgctgat tgctatcggt 900 tcccgcttcg acgaccgcgt caccggtgac gttgacacct tcgcacctga tgccaagatc 960 attcacgctg acattgatcc tgccgaaatc ggcaagatca agcaggttga ggttccaatc 1020 gtgggcgatg cccgcgaggt tcttgctcgt ctgctggaaa ccaccaaggc aagcaaggca 1080 gagaccgagg acatctccga gtgggttgat tacctcaagg gcctcaaggc acgtttccca 1140 cgtggctacg acgagcagcc aggcgatctg ctggcaccac agtttgtcat tgaaaccctg 1200 tccaaggaag ttggccccga cgcaatttac tgcgccggcg ttggccagca ccagatgtgg 1260 gcagctcagt tcgttgactt tgaaaagcca cgcacctggc tcaactctgg cggcctgggc 1320 accatgggct acgcagttcc tgcggctctt ggagcaaagg ctggcgcacc tgacaaggaa 1380 gtctgggcta tcgacggcga cggctgtttc cagatgacca accaggaact caccaccgcc 1440 gcagttgaag gtttccccat taagatcgca ctaatcaaca acggaaacct gggcatggtt 1500 cgccaactgc agaccctatt ctatgaagga cggtactcaa atactaaact tcgtaaccag 1560 ggcgagtaca tgcccgactt tgttaccctt tctgagggac ttggctgtgt tgccatccgc 1620 gtcaccaaag cggaggaagt actgccagcc atccaaaagg ctcgagagat caacgaccgc 1680 ccagtagtca tcgacttcat cgtcggtgaa gacgcacagg tatggccaat ggtgtctgct 1740 ggatcatcca actccgatat ccagtacgca ctcggattgc gcccattctt tgatggtgat 1800 gaatctgcag cagaagatcc tgccgacatt cacgaagccg tcagcgacat tgatgccgcc 1860 gttgaatcga ccgaggcata a 1881

Claims (12)

  1. 서열번호 1의 아세토하이드록시산 신타아제의 큰 소단위체(acetolactate synthase large subunit; IlvB 단백질)의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 503 번째 트립토판이 글루타민(glutamine), 아스파라긴(asparagine), 또는 류신(leucine)으로 치환된, 아세토하이드록시산 신타아제 변이체.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 아세토하이드록시산 신타아제 변이체는 서열번호 31 내지 서열번호 33 중 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되는, 아세토하이드록시산 신타아제 변이체.
  4. 제1항 또는 제3항의 아세토하이드록시산 신타아제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  5. 제1항 또는 제3항의 아세토하이드록시산 신타아제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
  6. 제5항의 벡터가 도입된 형질전환체.
  7. 제1항 또는 제3항의 아세토하이드록시산 신타아제 변이체; 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 선택된 어느 하나 이상을 포함하여, L-분지쇄 아미노산을 생산하는 코리네박테리움 속 (Corynebacterium sp.) 미생물.
  8. 삭제
  9. 제7항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인, L-분지쇄 아미노산을 생산하는 미생물.
  10. 제7항에 있어서, 상기 L-분지쇄 아미노산은 L-발린, 또는 L-류신인, L-분지쇄 아미노산을 생산하는 미생물.
  11. (a) 제7항의 L- 분지쇄 아미노산을 생산하는 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계의 미생물 또는 배지로부터 L-분지쇄 아미노산을 회수하는 단계를 포함하는, L-분지쇄 아미노산 생산 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 L-분지쇄 아미노산은 L-발린, 또는 L-류신인, L-분지쇄 아미노산 생산 방법.
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